JPH01108975A - 多重中空糸式の動物細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、有用物質の生産を行なう動物細胞培養装置に
係り、特に、高効率、高濃度での培養に好適な中空糸式
動物細胞培養装置に関するものである。

〔従来の技術〕

動物細胞培養は、その分子構造か極めて複雑であり、し
かも不安定であるために、有機合成が事実上不可能であ
り、なおかつ、分子内に糖鎖等をる 持つがゆえに、バクテリアを使用す麿遺伝子組換え技術
によっても、その生産が内錐であるような、生理活性物
質の生産法として、注目されている。

このような状勢において、動物ｉｔｔ＋胞培養装置は。

棟々の方式が提案、製品化されているが、いずれも−長
一矩が有り、生産用の実機として稼動しているものは極
めてまれであり、動物細胞培１１！ｌ！置として確立さ
れたものは、依然として現存しない言える。

しかしながら１種々の培１１ｍｆｆ１群の中でも、中空
糸の外部・こ細胞を保持し、中空糸の内部に、培地を潅
流させ、該中空糸の膜を通して、栄養物の供給、老廃物
の回収を行なう、いわゆる中空糸式の細胞培養装置は、
機械的攪拌による細胞破壊がさせない、膜で隔てられて
いるため、微生物汚染の危険性が少ないこと等の特徴を
有し、理論的に、高効率、高濃度の細胞培養に好適であ
ると考えられる。すなわち、該装置は１ｍ胞を通過させ
ず、細胞以外の溶質を通過せしめるような膜を経由して
培地の供給と１回収を交互に繰返すことによりて無菌条
件下で長時間連続の培地交換を行ない。

先 ｌｉ前記膜を中空糸状に成形して、細胞糸に多数設置す
ることによって技術的攪拌無しに、系内の均一化を図り
、さらに、培地の潅流によって細胞系のモニターと、ガ
ス供給を細胞系外で行ない、高効率、高濃度の細胞培養
を達成しようとするものである。なお、この種の装置と
して関連するものに。

例えば、特開昭５７−１４６５６７号「菌体処理装置」
が挙げられる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記従来技術の中空糸式の細胞培養装置は、−種類の膜
を中空糸として使用しており、培地中暑こ含まれる各種
物質の区分ができないため、栄養源の供給、産生物の回
収の双方において同一の培地を媒体として使用せざるを
得す、必要以上に多量の培地を要していた。また、産生
物を連続的に回収しようとする場合は、前記中空糸膜の
孔径を、目的産生物が通過し得る大きさに設定すれば良
いが、この場合、回収液中の産生物濃度は、媒体である
培地によって希釈された状態となる。一方、産生物を濃
縮させようとするならば、中空糸膜の孔径な、目的産生
物が通過し得ない大きさに設定すれば良いが、この場合
、連続的な回収ができない上、蓄積された産生物が、細
胞生育に対して阻害的であることも考えられる。さらに
、細胞を高効率で培養するために、各細胞周辺の微小ツ
境の制御を考えた場合、従来の装置では、培地中の低分
子物質、特に０３ｔ　ｃｏ２等のガス供給が均一にでき
ず、濃度分布を生ずる。すなわち、細胞系外で培地中に
供給、溶解した０２ｅ　ｃｏ２等のガスは、細胞系内に
入った時点で、培地中に溶解した形で中空糸膜を通して
細胞系へ供給されるが、このとき、細胞系内の細胞濃度
、つまりガス消費速度にかかわらず、同一量が供給され
る。ところが、実際の細胞系は、機械攪拌を行なわない
当然の結果として、細胞濃度の分布を生じており、ガス
消費速度にも分布がある。従って、このような分布を持
つ、系内に同一量のガスを均一に供給することは、結果
としてガスｍ度の分布を生せしめることとなる。

以上、述べてきたように、上記従来技術においては、１
）培地の効率的な活用、２）産生物質の効率的な回収、
３）微小培養環境の制御、の３点について配慮が不足し
ており、結果として、有用物質生産のための、高効率、
高濃度の細胞培養が十分できない、という問題点があっ
た。

本発明の目的は、上記問題点を解決し、有用物質生産の
ために、より高効率、高濃度の多重中空糸式動物細胞培
養装置を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的は、中空糸式の細胞培養装置の中空糸を、多重
中空糸１例えば細胞分離膜、高分子分離膜およびガス供
給膜の３種より成る同心円状の３重中空糸とし、各層に
よって区分けされる部分をおのおの独立の系とし、各県
の静圧力制御によって、膜を通過する物質の移動方向お
よび速度を制御することにより、達成される。

〔作　　　用〕 例えば、二こで中空糸を外側から第１腺：孔径０．２μ
の親水性膜、第２１に部分画分子量１万の親水性膜、の
２重中空糸とし、第１膜の外側の細胞系（系ｌ）の静圧
なＰｌ、第１膜と第２３１Ｉの間の系（系２）の静圧を
Ｐ　２　ｅ第２膜内部の系（系３）の静圧をＰｓとして
、系３および系２をおのおの低分子培地循環系、高分子
培地循環系とする。

培養中、培地供給の場合は、ＰＩ＜Ｐ２＜Ｐｓとすれば
、系１には第１膜、第２膜を介して、低分子培地および
高分子培地が均一に供給される。−方、培地の回収の場
合、系２，３をおのおの閉鎖循環系としてＰｌ　＞　Ｐ
２　＞　Ｐｓ　　とすれば、系ｌ内の高分子物質と低分
子物質とがおのおの、系２．系３に移動するため、系ｌ
内の物質を、分子量によって分割して回収できる。

これによって、細胞の生育を阻害する乳酸、アンモニア
等の低分子物質は、比較的安価な低分子培地とともに排
出され、高価な血清等の蛋白質を必要以上に消費するこ
とが無い。さらに、細胞が産生ずる高分子物質は系１お
よび基２内で保持。

濃縮され、系２より連続的に回収可能である。

次に、前記の中空糸膜に第３膜：孔径０．２μの疎水性
膜を内側に追加し、３１１１中空糸とし第３膜内部の系
（系４）の静圧をＰ４として系４を０２゜ＣＯ２等のガ
ス循環系とした場合、このと、％　、ｐ４　＜Ｐｓとす
れば、系４内のガスは、系４内に保持され、第３Ｍの孔
部分で系３の液相と接触する。この気液界面においては
、系４の気相中のガス分圧と、系３の液相中のガス濃度
によって、次式のように気相一液相間の物質移動が起る
。

Ｇ　Ｔ　Ｒ＝　ｋＬａ　（Ｃ”−Ｃ）　　　−−−ｆｉ
ｌＧＴＲ：ガス移動速度 ＣＩ：液相の飽和ガス濃度 Ｃ：液相中のガス濃度 ｋｐｍ　　：液相基準の物質移動の係数ここに、　ｋＬ
ａは、系内の温度、流動状態、有効接触面積の三つの物
理量によって決まる係数であり、この三つの物理量が不
変であるとき、つまり系内が定常状態であるとき、定数
となる。

従って、（１）式により、気相から液相へのガス移動２
１１ＩｇＬは、液中のガス濃度Ｃによって決まり、飽和
ガス濃度と実際のガス濃度の差（ｃ”−ｃ）によつて決
定される。

すなわち、液相中の細胞ｍ度が高く、ガス消費速度が速
いため、ガス濃度の低い部分には、速い速度でガスが供
給、溶解し、ガス濃度の高い部分には、緩慢なガス供給
が行なわれることとなる。

結果として、細胞系内の細胞濃度の分布にかかわらず、
各部分に対して必要にして十分な量のガスが供給される
ことになるわけである。

〔実　施　例〕 以下１本発明の一実施例を第１図〜第３図により説明す
る。第１図に培養装置全体の構成を、第２図に細胞を培
養する中空糸モジュールの構造を、第３図にモジュール
内部の中空糸の構造をおのおの示している。第３図に示
す如く、培養装置の中空糸は、内側から、孔径０．２μ
程度の微孔を有する。疎水性のガス供給中空糸Ｊｌｉｕ
、分画分子Ｍ１万で親水性の高分子分離中空糸ＩＩＩ　
ｔｏ　＊孔径０．２μ程度の微孔を有する親水性の細胞
分離中空糸膜９の３重中空糸であり、第２図に示す如く
モジュール化されている。

すなわち、ガス供給ヘッド４にガス用ノズル５を通して
供給されるガスは、ガス供給中空糸膜１１内へ導入され
、低分子培地供給ヘッド３に低分子培地用ノズル６を通
して供給される低分子培地はガス供給中空糸膜１１と高
分子分離中空糸Ｍ１０との間の空間に導入され、さらに
、高分子培地供給ヘッド２に高分子培地用ノズル７を通
して供給される高分子培地は高分子分離中空糸膜１０と
、細胞分離中空糸膜９との間の空間に導入される。また
。

細胞分離中空糸膜９の外側、つまり本体１の内部空間（
細胞系）１′には細胞懸濁液用ノズル８を通して、目的
とする細胞懸濁液が投入される。

上記のモジュールは＠１図に示す構成にて培養装置を構
成する。つまり１本体ｌ内の内部空間１′の細胞懸濁液
は、併設される圧力室兼モニター室１６と閉鎖系を構成
し、低分子培地は紙分、子培地循環ポンプ乙による循環
系を、′した高分子培地は高分子培地循環ポンプｎによ
る循環系を構成し、おのおの、低分子培地貯槽１３．低
分子液廃棄槽１５と高分子培地貯槽稔、高分子液回収槽
１４とを系内に備える。培養用のガスは酸素ボンベ１７
と、二酸化炭素ボンベ１８とから供給され、また圧力室
兼七二ター室１６の圧力制御用として圧縮空気（以下Ｐ
Ａと呼ぶ）が除菌フィルター１９．美を通して圧力室兼
モニター室１６に通気、Ｆｌ＃気される。

次に１本装置の動作を説明する。

１）培養中、定常状態においては、ガス、低分子培地、
高分子培地が全て細胞系五′へ供給される。

まず、ガス系においては、酸素ボンベ１７と、二酸化炭
素ボンベ１８とから、ｏ２．ｃｏ２がおのおのバルブア
、３６で分１ｌｌＩ調整された上、ガス供給膜１１内部
に導入され、バルブ荀閉、３８開として閉鎖系をつくる
。二のとき、圧力計かの指示を圧力計器の指示以下に設
定することにより、（１）式によって気相から液相への
ガス供給が行なわれる。

次に、低分子培地系においては、バルブ２９，３０゜３
１開、３２閉、循環ポンプ４をＯＮＬ／て供給循環系が
つくられる。このとき、圧力計器の指示を圧力計２５．
２３の指示以上に設定することにより、高分子分離中空
糸膜１０、および細胞分離中空糸膜９を経由して１ｍ胞
系ｌ′へ、低分子培地が供給される。

次・こ高分子培地系においては、バルブ２７．２８゜（
開、３４閉、循環ポンプ４をＯＮＬ、て供給循環系がつ
くられる。このとき、圧力計３の指示を、圧力計器の指
示以上に設定することにより、細胞分離中空糸膜９を経
由して、細胞系１′へ高分子培地が供給される。

また、このとき、圧力室兼モニター室１６と連続してい
る細胞系１′は、バルブ荀閉、３９開として。

無圧系に設定され、培地の供給による液量の増加分は、
圧力室兼モニター室１６内の液量増加により吸収される
。

２）細胞系１′のＰＨ２ＤＯ（溶存酸素）濃度が。

設定範囲を外れた場合には、ガスの分圧を変化させるこ
とにより制御が行なわれる。

具体的には、バルブ３５．３６．　３７の開度調節によ
り、ガス供給膜１１内に保持されるガスの０２．　ＣＯ
２分圧を制御し、各ガスの液相への移動速度を制御する
。なお、細胞系のＰＨ，Ｄｏ等は圧力室兼モニター室１
６に、おのおのセンサーを設置することにより、測定す
る。

３）細胞系１′内に細胞の代謝による阻害物質。

例えば乳酸、アンモニア等の低分子阻害物質の蓄積がみ
られる場合には、低分子液の廃棄が行なわれる。具体的
には、バルブ２７．２９．３９閉とし、バルブ禮、３２
開とする。この状態で圧力計るの指示〉圧力計６の指示
〉圧力計８の指示となるように設定すると、まず、細胞
系１′内の高分子物質および低分子物質が、細胞分離中
空糸膜９を通過して高分子培地系へ移動する。さらに高
分子培地系が、閉鎖系となっているために、低分子物質
のみが。

高分子分離中空糸膜ｌＯを通過して低分子培地系へ移動
し、低分子液廃棄檜１５に廃棄される。従って。

高価な高分子物質（蛋由、核酸等）を無駄にすることな
く、低分子の阻害物質を除去でき、同時に細胞が産生ず
る有用代謝産物としての高分子物質の濃縮が行なわれる
。

４）細胞系内に、目的とする有用代謝物、例えば、イン
ターフェロン、インターロイキン等の高分子物質が蓄積
された場合には、高分子液の回収が行なわれる。具体的
にに朋項３）と同様の操作を行なって、ｌ［ＩＩ胞系の
低分子物質を除去した後。

バルブｎ閉、バルブ調開として、高分子液を高分子液回
収槽１４に回収する。

ここに、上記の一連の操作は、２１１当な装置構成例え
ば、圧力センサー等のセンサー類と、シーケンサ−、パ
ソコン等の制御器類および圧力調節弁等のアクチュエー
ター類の設Ａ“により、容易に自動化が可能である。

本実施例では同心円状の３重中空糸で説明したが、内側
の疎水性のガス供給中空糸膜を省略した２重中空糸でも
良く（この場合、細胞への栄養分の供給は低分子培地で
兼用）、多血中空糸は適宜設計変更可能であり本実に限
定するものではない。

なお、本実施例によれば、ガスをガス供給中空糸膜１１
内に保持して、気液界面からガス供給を行なうため、無
駄にガスを流す必要がなく、ガス消費量を大幅に削減で
きる効果がある。

〔発明の効果〕

本発明によれば、阻害物質である乳酸、アンモニア等の
低分子物質を高価な高分子物質を浪費することなく除去
でき、ｆｉｌｌ胞が産生ずる有用物質を濃縮した状態で
連続的に回収でき、さらに、細胞に必要な低分子物質、
特・こガス（ｏ２．　Ｃ０２ｅｔｃ、）を細胞系の濃度
分布によらず、効率的に必要かつ十分な量のガス供給が
可能であるため、ｍｓの微小環境をより好適に制御し、
有用物質の生産を目的とした。高効率、高濃度の細胞培
養が可能になるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の培養装置の全体構成図、第
２図は！Ｊ１図における細胞培養モジ、−ルの構造図、
ｆｉ３図はモジュール内の中空糸の構造を示す詳細図で
ある。 ｌ・・・・・・本体、１′・・・・・・内部空間、９・
・・・・・細胞分離中空糸膜、１０・・・・・・高分子
分離中空糸膜、１１・・・・・・ガス供給中空糸膜、認
・・・・・・高分子培地貯槽、１３・・・・・・低分子
培地貯槽、１４・・・・・・高分子液回収槽、巧・・・
・・・第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞以外の各溶質を通過させる微孔を有し、特性の
   異なる複数の膜からなる多重中空糸と、該中空糸の外部
   に細胞を培養する空間と、前記中空糸の内部より栄養分
   を細胞に供給する手段とを設け、前記多重中空糸をおの
   おの独立の系とし、各系の静圧を静御するように構成し
   たことを特徴とする多重中空糸式の動物細胞培養装置。 ２、特許請求の範囲第１項において、多重中空糸は、分
   画分子量が数万〜数十万、望ましくは一万程度で親水性
   のある膜を内側に設け、孔径が０．１μ〜１０μ、望ま
   しくは０．２μ程度で親水性のある膜を外側に設けたこ
   とを特徴とする多重中空糸式の動物細胞培養装置。 ３、特許請求の範囲第１項において、多重中空糸は、外
   側から順に、孔径が０．１μ〜１０μ、望ましくは０．
   ２μ程度の親水性の膜と、分画分子量が数万〜数十万、
   望ましくは、一万程度の親水性の膜と、孔径が０．１μ
   〜１０μ、望ましくは０．２μ程度の疎水性の膜とから
   構成したことを特徴とする多重中空糸式の動物細胞培養
   装置。