JPH0989774A

JPH0989774A - 微小物質検鏡装置

Info

Publication number: JPH0989774A
Application number: JP24432895A
Authority: JP
Inventors: Toshio Ando; 敏夫安藤; Yoshiaki Hayashi; 美明林
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1995-09-22
Publication date: 1997-04-04

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、磁気力を利用した磁性を有する試
料粒子などの微小物質の固定を確実に行うことができる
微小物質検鏡装置を提供する。【解決手段】対物レンズ１３先端部に永久磁石２１を設
け、この永久磁石２１を、蛍光性を有する磁性ビーズ２
０を収容したディシュ１８を載置するテーブル１０１の
透穴１０１ａ中に挿入し、ディシュ１８の外側底面に十
分に近接して配置するようにしている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、磁気力を利用して
磁性を有する微小物質を固定し検鏡を行う微小物質検鏡
装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】最近、ＤＮＡや蛋白質の研究が盛んに行
われるようになっており、これら研究には、ＤＮＡや蛋
白質の蛍光反応を観察する蛍光観察などが用いられてい
る。図７は、このような蛍光観察を行うための顕微鏡を
用いた微小物質検鏡装置の一例を示すもので、図示しな
い顕微鏡本体のテーブル１にＤＮＡや蛋白質などの試料
粒子が浮遊する液を収容したディシュ２を載置してい
る。そして、このようなディシュ２を載置したテーブル
１の下部に対物レンズ３を配置するとともに、この対物
レンズ３周囲に固定枠４により磁石５を設けている。

【０００３】そして、ディシュ２の液中に浮遊する試料
粒子を磁性ビーズ６に結合させ、この状態で対物レンズ
３周囲に配置した磁石５に磁界を形成させて磁性ビーズ
６をディシュ２の底面に引き寄せて２次元的に分布した
状態から、対物レンズ３を介した顕微鏡による観察を行
うようにしている。

【０００４】この場合、顕微鏡による観察は、蛍光観察
が採用され、磁性ビーズ以外に蛍光ビーズを結合させた
り、磁性ビーズに蛍光性を持たせるようにして、ディシ
ュ２底面付近に限定されるエバネッセント照明などに基
づき蛍光性を有する磁性ビーズから発生する蛍光の状態
を観察するようになる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ところで、このような
蛍光観察に用いられる磁性ビーズ６は、直径１μｍ程度
のものが用いられている。ところが、試料粒子のサイズ
が小さくなって、例えば、粒子径が数１０ｎｍ程度のも
のになると、磁性ビーズ６との大きさが著しく異なるた
め、１つの磁性ビーズ６に複数個の試料粒子が結合する
ことがあり、正確な蛍光反応を観察できないことがあ
る。また、直径１μｍの磁性ビーズ６では、ディシュ２
底面に局在的に分散させて蛍光観察するために試料粒子
の場所を決定することも難しい。

【０００６】そこで、磁性ビーズ６の径を試料分子と同
じ程度にして、１つの磁性ビーズ６に対して１つの試料
分子を結合させることが考えられるが、このような径の
小さな磁性ビーズを使用すると、磁石５の磁界によっ
て、磁性ビーズ６自身にＳ、Ｎの分極が発生しても、こ
れら極間の距離が極めて小さいことから磁束密度の勾配
による吸引力は小さく、さらに、磁石５は、対物レンズ
３周囲に設けられていてディシュ２底面より遠く離れて
いることから、大きな吸引力も期待できず、磁性ビーズ
６に効果的な吸引力を作用させるのが難しいことから、
磁性ビーズ６をディシュ２底面に引き寄せて拘束できな
いことがあった。また、径の小さな粒子の場合、ブラウ
ン運動により液中に浮遊し易い傾向があるため、さらに
試料粒子を結合した磁性ビーズの引き寄せが難しくな
る。

【０００７】本発明は、上記事情に鑑みてなされたもの
で、磁気力を利用した磁性を有する試料粒子などの微小
物質の固定を確実に行うことができる微小物質検鏡装置
を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
磁気力を利用して磁性を有する微小物質を固定し対物レ
ンズを介して検鏡を行う微小物質検鏡装置において、前
記対物レンズの前記微小物質側に位置する先端部に磁石
を設けるようにしている。

【０００９】請求項２記載の発明は、請求項１記載にお
いて、磁石は、永久磁石により構成している。請求項３
記載の発明は、請求項１記載において、磁石は、電磁石
により構成している。

【００１０】この結果、本発明によれば、磁性微小物質
に近接して磁石を配置できるので、ＤＮＡや蛋白質など
の試料粒子に相当する極めて微小な物質に対しても十分
大きな吸引力を期待できて、効果的な吸引力を作用させ
ることができ、これら微小物質のブラウン運動を制限し
て強い力で拘束できる。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を図面
に従い説明する。（第１の実施の形態）図１は、本発明の微小物質検鏡装
置に適用される倒立型顕微鏡の概略構成を示している。
図において、１０は顕微鏡本体で、この顕微鏡本体１０
には、透過照明用光源１１、励起光源１２、対物レンズ
１３、コンデンサレンズ１４、鏡筒１５および接眼レン
ズ１６などを有している。

【００１２】この場合、励起光源１２からの励起光を顕
微鏡本体１１内の光学系、対物レンズ１３およびエバネ
ッセント照明用のプリズム（図示せず）を通してテーブ
ル１０１上の蛍光性を有する磁性ビーズを収容したディ
シュ（図示せず）の外側底面から照射し、このディシュ
の内側底面付近にエバネッセント照明によるエバネッセ
ント場を形成させ、このエバネッセント場を利用し磁性
ビーズに蛍光を発生させる。そして、この蛍光の状態を
透過照明用光源１１よりコンデンサレンズ１４を通して
与えられる透過照明光により対物レンズ１３による観察
像として顕微鏡本体１１内の光学系、鏡筒１５を通して
接眼レンズ１６に送り、試料粒子の蛍光反応を観察でき
るようにしている。

【００１３】この場合、対物レンズ１３は、レボルバ１
７に各種倍率のものが複数個設けられていて、所望する
倍率のものを選択できるようになっている。図２は、本
発明の要部の概略構成を示すもので、図１と同一部分に
は、同符号を付している。

【００１４】この場合、顕微鏡本体１０のテーブル１０
１には、透穴１０１ａを有していて、この透穴１０１ａ
上にディシュ１８を載置している。このディシュ１８
は、上述したようにＤＮＡや蛋白質などの試料粒子が浮
遊する液１９とともに蛍光性を有する磁性ビーズ２０を
収容し、これら磁性ビーズ２０に液１９中を浮遊する試
料粒子を結合させるようにしている。また、ここでの磁
性ビーズ２０は、試料粒子径が数１０ｎｍとすると、３
０ｎｍ程度の径のものを使用している。

【００１５】顕微鏡本体１０のテーブル１０１下部に、
対物レンズ１３を配置している。この対物レンズ１３
は、先端部に位置する光学レンズ１３１の周囲に円筒状
の永久磁石２１を一体に設けている。この永久磁石２１
は、フェライトなど磁性材料が用いられ、円筒体の両端
部、つまり図示上下方向両端部に極性を有するようにな
っている。この永久磁石２１は、例えばネジ込み構造に
より着脱可能にすることも可能である。

【００１６】そして、このような対物レンズ１３は、上
下方向に駆動されて焦点を移動し、ディシュ１８の外側
底面に合焦させるようにしている。この場合、対物レン
ズ１３には、高倍率で作動距離（ＷＤ）の短いものを使
用することで、対物レンズ１３先端の永久磁石２１部分
をテーブル１０１の透穴１０１ａ中に挿入してディシュ
１８の外側底面に十分に近接するようにしている。

【００１７】また、ディシュ１８と対物レンズ１３との
間には、エバネッセント照明用プリズム１８１を配置し
ている。このエバネッセント照明用プリズム１８１は、
ディシュ１８の対物レンズ１３側の外側底面にマッチン
グオイルで着脱自在に固定されている。これにより、対
物レンズ１３を透過した励起光源１２からの励起光は、
エバネッセント照明用プリズム１８に入射し全反射さ
れ、ディシュ１８の内側底面付近にエバネッセント場が
形成される。

【００１８】なお、本発明に用いられる３０ｎｍ径の蛍
光性を有する磁性ビーズ２０は、具体的に、以下の調製
法により作られている。（１）まず、ＷａｔｅｒｉｎＯｉｌマイクロエマル
ジョン法によりポリアクリルアミドビーズを作る。

【００１９】（２）エチレンジアミン処理を行いビーズ
にアミノ基を導入する。（３）アミノ基反応性蛍光色素をビーズに反応させて蛍
光性ビーズを作る。次に、（４）１．４ＭＦｅＣｌ₃ １００μｌとポリエチレ
ングリコール（Ｍ．Ｗ＝２００）６００μｌを混ぜる。

【００２０】（５）アンモニア水１００μｌを（４）の
溶液に激しく攪拌しながら加え、マグネタイトを作成す
る。（６）水１ｍｌを（５）のマグネタイトに加え、４００
０ｒｐｍで２分間遠心力を加えマグネタイトを集める。

【００２１】（７）さらに沈殿に水を数ｍｌ加えて、同
様に遠心力を加え、この操作を複数回繰り返して洗浄を
行なう。（８）（７）により得られた沈殿を０．２Ｍ硝酸１ｍｌ
に懸濁し、３０分放置した後、１５０００ｒｐｍで３０
分間遠心力を加え，上澄みを集める。

【００２２】（９）上澄みの吸光度（ａｔ３１０ｎｍ）
を測定する。この時の吸光度は４０になる。（１０）（３）までに作成された蛍光性ビーズ（約１ｍ
ｇ／ｍｌに調整）０．３ｍｌに、ポリエチレングリコー
ル（Ｍ．Ｗ＝２００）０．３ｍｌ、０．２Ｍ硝酸に溶か
したマグネタイト（ＯＤａｔ３１０＝４０）１５μｌを
混ぜる。

【００２３】（１１）１．５トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．８）６μｌを（１０）に加える。このｐＨの中和
で、マグネタイトがビーズ中に導入される。（１３）さらに４０００ｒｐｍで２分間遠心力を加え、
磁性ビーズを集める。

【００２４】（１４）磁性ビーズを水０．３ｍｌに懸漏
し、水に透析する。このような調製により、（１４）で最終的な蛍光性を有
する３０ｎｍ径の磁性ビーズが得られる。このビーズ
は、２〜３日は磁性を強く保っているが、酸化が徐々に
進むことでマグネタイトがマグヘマイトになって磁性が
弱くなってくる。磁性が弱くなったビーズでも顕微鏡側
に設けた磁石により十分に補足できる。酸化させないた
めには、酸素を酵素で置き換えて保存すればよい。ま
た、マグネタイトがビーズに入ったことで、蛋白質は、
ビーズに吸収し易くなるが、これを避けるには、中世活
性剤を少量加えておけばよい。

【００２５】しかして、このようによれば、対物レンズ
１３先端部に設けられる永久磁石２１は、蛍光性を有す
る磁性ビーズ２０を収容したディシュ１８を載置するテ
ーブル１０１の透穴１０１ａ中に挿入され、ディシュ１
８の外側底面に十分に近接しているので、磁性ビーズ２
０に３０ｎｍ径の試料粒子径とほぼ同じ径のものを使用
しても永久磁石２１より磁性ビーズ２０に対して十分大
きな吸引力を期待できるようになり、磁性ビーズ２０に
効果的な吸引力を作用させ、これら磁性ビーズ２０をデ
ィシュ１８底面に引き寄せ、強い力で拘束でき、さら
に、この時の強い力の拘束により磁性ビーズ２０や試料
粒子のブラウン運動も制限できることになる。これによ
り、試料粒子の固定を確実に行うことができ、精度の高
い蛍光観察を実現できる。

【００２６】なお、ディシュ１８に対向位置にある永久
磁石２１を有する対物レンズ１３をレボルバ１７操作に
より一時的に取り除くと、ディシュ１８中の磁性ビーズ
２０は、永久磁石２１の磁界から解放するようにできる
ので、一旦対物レンズ１３を取り除いて磁性ビーズ２０
を液中で自由に飛散させ、その後、対物レンズ１３をデ
ィシュ１８の対向位置に戻して、永久磁石２１の磁界に
より磁性ビーズ２０の動きを拘束するようにすれば、新
たな試料粒子をディシュ１８底面に拘束できるようにな
り、このような操作を繰り返すことで、目的とする試料
粒子のみを拘束できるようになるとともに、時間的経過
をおいての試料粒子の蛍光反応を観察することができ
る。（第２の実施の形態）図３は、第２の実施の形態の概略
構成を示すもので、図２と同一部分には、同符号を付し
ている。なお、図３では、図２で述べたディシュ１８と
対物レンズ１３との間のエバネッセント照明用プリズム
１８１の図示が省略されているが、実際は、ディシュ１
８の対物レンズ１３側の外側底面にマッチングオイルに
より着脱自在に固定されている。

【００２７】ところで、蛍光観察では、試料サイズが小
さくとも、必ずしも高倍率の対物レンズが必要でなく、
むしろ低倍率（例えば４０倍程度のもの）で明るい対物
レンズを用いることがある。

【００２８】このような場合、対物レンズの作動距離
（ＷＤ）が長くなってしまうが、この対策として、図示
のように対物レンズ１３の先端部に円筒状の連結筒体２
２を設けて、この連結筒体２２の先端部に円筒状の永久
磁石２１を一体に設け、この永久磁石２１部分をテーブ
ル１０１の透穴１０１ａ中に挿入してディシュ１８の外
側底面に十分に近接するように構成する。なお、ここで
の永久磁石２１も、例えばネジ込み構造により連結筒体
２２より着脱可能にすることも可能である。

【００２９】このようにしても、第１実施の形態と同様
な効果を期待できる。（第３の実施の形態）図４は、第３の実施の形態の概略
構成を示すもので、図２と同一部分には、同符号を付し
ている。なお、図４では、図２で述べたディシュ１８と
対物レンズ１３との間のエバネッセント照明用プリズム
１８１の図示が省略されているが、実際は、ディシュ１
８の対物レンズ１３側の外側底面にマッチングオイルに
より着脱自在に固定されている。

【００３０】この場合、対物レンズ１３先端部に設けら
れる永久磁石２１をコイルを有する電磁石２３に置き換
え、この電磁石２３に駆動回路２４より駆動電流を供給
することにより所定の吸引力を発生させるようにしてい
る。この場合、電磁石２３のコイルの巻き数をｎ、コイ
ルに流れる電流をＩとすると、磁界の強さＨは、Ｈ＝ｎ×Ｉになる。

【００３１】しかして、このようにしても、第１実施の
形態と同様な効果を期待でき、さらにコイル巻数ｎは一
定であるのに対してコイルに流れる電流Ｉは可変にでき
るので、駆動回路２４によりコイルに流れる電流Ｉを変
化させることによって、電磁石２３の吸引力の強さを磁
性ビーズ２０のサイズに合わせて変えたり、電磁石２３
の吸引力の強さを調整してディシュ１８底面での粒子の
濃度を調整するようなこともできる。また、駆動回路２
４による電磁石２３の付勢を入切することで、第１の実
施の形態で述べた対物レンズ１３をレボルバ１７操作に
より一時的に取り除くのと同じ効果を得ることもでき
る。

【００３２】なお、上述では、対物レンズ１３の先端部
に電磁石２３を設けるようにしたが、対物レンズ１３の
一部または全部を磁性材料で形成し、これの周囲にコイ
ルを巻いて電磁石を構成するようにしてもよい。（第４の実施の形態）図５は、第４の実施の形態の概略
構成を示すもので、図３と同一部分には、同符号を付し
ている。なお、図５では、図２で述べたディシュ１８と
対物レンズ１３との間のエバネッセント照明用プリズム
１８１の図示が省略されているが、実際は、ディシュ１
８の対物レンズ１３側の外側底面にマッチングオイルに
より着脱自在に固定されている。

【００３３】この場合、対物レンズ１３先端部に設けら
れる電磁石２３の他に、さらにディシュ１８底面の上方
にも電磁石２５を配置し、磁性ビーズ２０に対するディ
シュ１８底面側への引き寄せ力をさらに強めるようにし
ている。

【００３４】ここでの電磁石２５は、リング状のコイル
部２５１の内側に中空コーン（円錐状など）形状の鉄心
（Ｎｉなどの磁性金属でも可）２５２を設けるようにし
たもので、この鉄心２５２先端をディシュ１８底部の磁
性ビーズ２０に近接させて、この磁性ビーズ２０付近に
磁束を集中させ磁界を強くするようにしている。

【００３５】なお、このような電磁石２５の鉄心２５２
は、ディシュ１８の液中に浸漬されることもあるので、
鉄心表面には、防錆処理や溶出処理を施している。ま
た、電磁石２５は、支持台２６に取り付けられていて、
上下駆動機構２７を介して支柱２８に上下動可能に設け
られている。これは、テーブル１０１上のディシュ１８
の出し入れを容易にするためと、詳細は後述する対物レ
ンズ１３側の電磁石２３との関係で磁力線の分布境界面
Ｐの上下方向の位置を調整するためである。

【００３６】そして、このような電磁石２５に、電磁石
２３とともに駆動回路２４より駆動電流を供給するよう
にしている。なお、鉄心２５２の中心部には、コンデン
サレンズ２９を通してディシュ１８底面に照射される透
過照明光３０が通過するようにしている。

【００３７】しかして、このような構成において、駆動
回路２４より電磁石２３、２５の磁界が逆向きになるよ
うに、例えば、図６に示すように電磁石２３のＮ極と電
磁石２５のＮ極が向かい合うように、それぞれの電磁石
２３、２５のコイルに電流を流すようにすれば、これら
電磁石２３、２５の磁力線による分布境界面Ｐが形成さ
れ、この分布境界面Ｐより対物レンズ１３側に磁力線の
密度勾配が大きな空間ｄを作ることが可能になる。そし
て、この空間ｄが磁性ビーズ２０の位置するディシュ１
８の内側底面に一致するように電磁石２５の高さを調整
すれば、磁性ビーズ２０を強い力で拘束できるようにな
り、さらに、この時の拘束により磁性ビーズ２０や試料
粒子のブラウン運動も制限でき、より精度の高い蛍光観
察を実現できる。

【００３８】また、駆動回路２４により電磁石２３、２
５の磁界方向を同じにしたり、供給する電流を小さくす
ると、磁性ビーズ２０に対する引き寄せ力を弱くできる
ので、一旦磁性ビーズ２０に対する引き寄せ力を弱め
て、磁性ビーズ２０を液中で自由に飛散させ、その後、
磁性ビーズ２０に対する引き寄せ力を強めて、磁性ビー
ズ２０を拘束するようにすれば、新たな試料粒子をディ
シュ１８底面に拘束できるようになり、このような操作
を繰り返すことで、目的とする試料粒子のみを拘束でき
るようになるとともに、時間的経過をおいての試料粒子
の蛍光反応を観察することもできる。

【００３９】また、電磁石２３、２５の磁界が同方向の
まま電流を維持すると、例えば、棒状の試料の場合に
は、これら試料を磁力線方向に向かせるようにもでき
る。以上、実施の形態について述べたが、本発明中には
以下の発明も含まれる。

【００４０】（１）請求項１記載において、対物レンズ
の一部または全部を磁性材料で形成し、これの周囲にコ
イルを巻いて電磁石を構成している。このようにすれ
ば、電磁石の構成を簡単にできる。

【００４１】（２）請求項１記載において、さらに対物
レンズ側の磁石に対し微小物質を挟んで他の磁石を設
け、これら磁石より反対方向の磁界を発生させる。この
ようにすれば、これら磁石の磁力線による分布境界面に
磁力線の密度勾配が大きな空間を作ることが可能にな
る。

【００４２】（３）（２）において、これら磁石は、電
磁石からなり、これら電磁石から同方向または反対方向
の磁界を発生可能にする。このようにすれば、微小物質
に対する引き寄せ力を強めたり弱めたりでき、この動作
を繰り返すことで、目的とする微小物質のみを拘束でき
るとともに、時間的経過をおいての微小物質の反応を観
察できる。

【００４３】（４）電磁石は、リング状のコイル部の内
側に中空コーン形状の鉄心を有している。このようにす
れば、微小物質付近に磁束を集中させ、強い磁界を与え
ることができる。

【００４４】なお、上述した実施の形態では、試料粒子
をディシュ１８底面に拘束して試料粒子の蛍光反応を観
察する場合について述べたが、走査プローブ顕微鏡にお
いて、試料粒子をディシュ底面に拘束させた状態で、特
定粒子に対し反応物質を付着させたり、試料粒子の形状
変化や電気的変化の観察を行うなどにも適用することが
できる。

【００４５】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば磁性
を有する微小物質に近接して磁石を配置できるので、極
めて微小な物質対しても十分大きな吸引力を期待でき、
効果的な吸引力を作用させることができ、これら微小物
質のブラウン運動を制限して強い力で拘束でき、これに
より、試料粒子の固定を確実に行うことができ、精度の
高い蛍光観察を実現できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施の形態に適用される倒立型
顕微鏡の概略構成を示す図。

【図２】第１の実施の形態の要部の概略構成を示す図。

【図３】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す
図。

【図４】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す
図。

【図５】本発明の第４の実施の形態の概略構成を示す
図。

【図６】第４の実施の形態を説明するための図。

【図７】従来の微小物質検鏡装置の一例の概略構成を示
す図。

【符号の説明】

１０…顕微鏡本体、１０１…テーブル、１０１ａ…透穴、１１…透過照明用光源、１２…励起光源、１３…対物レンズ、１３１…光学レンズ、１４…コンデンサレンズ、１５…鏡筒、１６…接眼レンズ、１７…レボルバ、１８…ディシュ、１９…液、２０…磁性ビーズ、２１…永久磁石、２２…連結筒体、２３…電磁石、２４…駆動回路、２５…電磁石、２５１…コイル部、２５２…鉄心、２６…支持台、２７…上下駆動機構、２８…支柱、２９…コンデンサレンズ、３０…透過照明光。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】磁気力を利用して磁性を有する微小物質
を固定し対物レンズを介して検鏡を行う微小物質検鏡装
置において、前記対物レンズの前記微小物質側に位置する先端部に磁
石を設けたことを特徴とする微小物質検鏡装置。
【請求項２】磁石は、永久磁石であることを特徴とす
る請求項１記載の微小物質検査装置。
【請求項３】磁石は、電磁石であることを特徴とする
請求項１記載の微小物質検鏡装置。