JPH09504273A

JPH09504273A - Ｈｉｖに対して使用するための多分岐ペプチド構築物

Info

Publication number: JPH09504273A
Application number: JP7509049A
Authority: JP
Inventors: マルクサバティエ，ジャン; ベンジュワード，アブデラジズ; ヤヒ，ヌアラ; ファニュイエ，エマニュエル; マブルーク，カメル; グルックマン，ジャン・クロード; リエショータン，ジュルファースヴァン; ロシャ，エルヴ
Original assignee: アルメルソシエテアノニム
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1994-09-13
Publication date: 1997-04-28
Also published as: US5622933A; GB9318901D0; JP3725899B2; ZA947053B

Abstract

(57)【要約】ＨＩＶ−１のgp120タンパク質のＶ３ループから誘導されるペプチドから形成され、０から４個のアミノ酸が先行しており、２から４個のアミノ酸が後に続いているコンセンサス配列ＧＰＧＲを含有し、好ましくはＧＰＧＲの直前の３個のアミノ酸中にＩを含有しておらず、そして最も好ましくはＧＰＧＲＡＦである多分岐ペプチド構築物はレセプター親和性の増強を示し、細胞と細胞の融合を防止する。これら構築物は、直接的なウイルス抑制効果を有している。これら構築物は、同じペプチド配列が数倍存在しているので、これらのＭＢＰＣは、ＨＩＶ−１及ひＨＩＶ−２の幾つかの株のウイルスエンベロープ／細胞膜融合及び感染細胞膜／非感染細胞膜融合の種々の段階をインビトロで中和することができる。注目すべきは、これら構築物はリンパ球及びマクロファージに対してはＣＤ４レセプターを、結腸上皮細胞に対してはＧalＣerレセプターの両方を遮断するのに有効である。これらの結果は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２感染の治療において使用できる可能性を開くものである。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶに対して使用するための多分岐ペプチド構築物発明の背景ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、恐らく後天性免疫不全症候群（エイズ）の病因学的作用物である。ＨＩＶは種々の細胞タイプに持続的な感染をもたらす。細胞の多くは細胞表面の結合部位として抗原、ＣＤ４レセプターを発現する。このような細胞では、細胞感染の第１段階は、細胞のＣＤ４表面抗原とＨＩＶの外部エンベロープ糖タンパク質との結合によるウイルス結合で示される。この結合の後にウイルスエンベロープと標的細胞膜の融合及び内在化に係わる一連の現象が続き、これによって細胞が感染する。次に、ＨＩＶ感染細胞は他の細胞を感染させ、合胞体（巨大多核細胞）を形成することができる。ＨＩＶ−１感染細胞と非感染ＣＤ４⁺細胞（ＣＤ４レセプターを有する細胞）間の合胞体形成はＣＤ４レセプターとＨＩＶ表面エンベロープ糖タンパク質間の相互作用に係わっている。この過程は可溶性ＣＤ４、抗ＣＤ4及び抗Ｖ３抗体によって阻止される。インビボ(in vivo)で細胞から細胞へのウイルス拡散に関与する細胞融合過程は血漿中和抗体を使えないようにし、リンパ球枯渇によって既に損傷した免疫系からウイルスを脱出させる。ＨＩＶによって活性化されたＢリンパ球は異なる抗体集団を産生させる。抗体のなかにはgp120−ＣＤ４の相互作用を妨げないで、膜融合、即ち細胞感染に関与する過程を阻止するものもある。これらの抗体は主としてエンベロープ糖タンパク質Ｖ３ループに対して向けられている。種々のＨＩＶ−１単離体でのＶ３ループの可変性が非常に高いため、抗Ｖ３抗体は一般的に、抗体を産生させた単離体を中和するにすぎない。それ故、中和は当該単離体に限定され、そして単離体特異的と称される。これらの抗体は細胞融合阻止に関して有効であり、細胞−ウイルス結合に対する活性はない。Ｖ３ループ関連ペプチドによってＨＩＶ感染を阻止する幾つかの試みがなされており、このようなペプチドの有効性に関する問題が提起されている。例えば、ドゥロッシ（De Rossi）等[Virology、184、187-196(1991年)]は或るＶ３ペプチドがウイルス感染を高めることを見出した。Ｖ３ループから得られる環状又は非環状の他の合成ペプチドは細胞融合の重要な段階で無効であった。それ故、ウイルス単離体と関係のないウイルス−細胞融合や細胞対細胞融合を阻止できるアンタゴニストペプチドは開発されていない。更に最近では、幾つかの研究によってＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の両者についてＣＤ４と無関係の細胞感染経路が証明されており、少なくとも１つの別のウイルスレセプターの存在が示唆されている。これらの推定上の非ＣＤ４ＨＩＶレセプターのうちの１つが最近ＣＤ４^-脳由来細胞及び結腸上皮細胞で同定された。このレセプターは中性糖タンパク質であり、ガラクトシルセラミド（ＧalＣer）と呼ばれる。脳や腸のＣＤ４^-／ＧalＣer⁺細胞のＨＩＶ感染によってこれらの器官におけるＨＩＶ関連疾患の幾つかを説明することができる。更に、或る粘膜上皮細胞の頂部面にＧalＣerが存在すると性交中にウイルスの侵入を促進する可能性がある。Ｖ３ループから誘導されたペプチドはＧalＣerレセプターを阻止する能力が未だ明らかにされていない。これらの問題の幾つかに応えて、担体を使用しない抗原を開発するために、ポリマー中でリジン骨格を使用する放射状に枝分かれした系がジェイ・ピー・タム（J．P．Tam）[Proc．Natl．Acad．Sci．USA、85、54 09-5413(1988年)]によって使用された。これらの抗原は種々の疾病に対するワクチンを産生させるように設計された。特に、ＨＩＶ感染に対するワクチンを産生させる抗原はＰＣＴ出願第ＷＯ93／03766号にタムが記載しており、そして本質的に配列ＩＧＰＧＲ（アミノ酸に関するＩＵＰＡＣ協定の一文字表記）を含み、有用な免疫応答を発揮するのに有効な配列は11個のアミノ酸長の配列である。同上の13頁、29-31行。しかしながら、このような抗原は疾病に対する可能性のある直接的な治療方法と考えられているのではなくて、身体の免疫学的応答を誘発するように意図されている。発明の要約本発明にはＨＩＶ感染患者を治療するための方法及びペプチド構築物とその製法が含まれる。本発明の方法によれば、治療投与用の多分岐ペプチド構築物は２から64個までのペプチドと結合したコアマトリックスを含み、上記の各ペプチドは０から４個までのアミノ酸残基が先行しており、２から４個までのアミノ酸残基が後に続いているアミノ酸配列ＧＰＧＲ(Gly Pro Gly Arg)を含んでいる。図面図１は、ＨＩＶとＣＤ４⁺又はＣＤ４^-細胞について提案される結合メカニズムである。図２は、３つの異なるＨＩＶ株に関してヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の感染に与える多分枝ペプチド構築物（ＭＢＰＣ）の効果の試験結果を示したものであり、３つの異なるＭＢＰＣに対するｐ24の量（pg／ml）又は逆転写酵素（ＲＴ）活性をプロットしており、１はなし；２は[ＧＰＧＲＡＦ]₈−多リジン核（ＭＬＣ）;３は[ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ]₄−ＭＬＣ; ４は[ＰＰＹＶＥＰＴＴＴＱＣ]₄−ＭＬＣである。図３は、ヒトマクロファージ感染に対するＭＢＰＣの試験結果であり、ＭＢＰＣをｐ24の量（pg／ml）に対してプロットしている。５つの異なるＭＢＰＣを使用しており、１はなし; ２は[ＧＰＧＲＡＦ]₈-ＭＬＣ; ３は[ＧＰＧＲＡＦ]₈− ＭＬＣ_D；４は[ＧＰＧ(Ｒ)_DＡＦ]₈−ＭＬＣ; ５は[ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ]₄−ＭＬＣ; 及び６は[ＰＰＹＶＥＰＴＴＴＱＣ]₄−ＭＬＣである。図４Ａは、ＭＢＰＣなしで感染させた培養物における合胞体形成を示している。図４Ｂは、[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣで処理したマクロファージでは合胞体が形成されていないことを示している。図５Ａは、ＧalＣerレセプターを介したヒト上皮細胞感染に与えるＭＢＰＣの効果を示す。図５Ｂは、ＧalＣerレセプターに対するgp120の結合を阻止するＭＢＰＣの能力を示す。図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは全て、より長いＭＢＰＣで免疫化したウサギ血清と比較したとき、短いＭＢＰＣで免疫化したウサギ血清は相対的に活性がないことを示している。発明の詳細な説明Ｉ構造本発明は、ＨＩＶ感染並びにＨＩＶ感染の拡散及び拡大を阻止できる多分枝ペプチド構築物（ＭＢＰＣ）に関するものである。ＭＢＰＣはペプチドが共有結合しているコアマトリックスを有している。コアマトリックスは天然(in nature) で枝分かれしており、好ましくはその各分枝が同一である樹枝状ポリマーである。このコアマトリックスは、末端官能基を有する分子分枝が共有結合している少なくとも２つの官能基を有するコア分子に基づいている。適当なコア分子にはアンモニア又はエチレンジアミンが含まれる。適当な分子分枝には、コア分子上で重合化されているアクリル酸エステルモノマーが含まれる。このような分子は、コア分子から技分かれしたモノマーの数に依存して種々の分技数を提供するように創製することができる。２から64個の分岐、好ましくは４から16個の間の分岐を有するＭＢＰＣが本発明で使用されるように意図されている。コアマトリックスを形成するために使用される代表的な例はリジンである。中心リジン残基を２個のリジン残基に、各々のカルボキシル基を介して中心リジン残基のアミノ基の１つに結合させる。これによって４個のアミノ基を持つ分子が提供され、これは４個のペプチドを有するＭＢＰＣ用のコアマトリックスとなることができる。或いは、リジン残基のカルボキシル基を介して４個のリジン残基を中心リジンに結合しているリジン残基のアミノ基の１つに結合させることによって８個の分技を有する分子を提供することができる。この分子は８個のペプチドを有するＭＢＰＣ用のコアマトリックスとして役立つか、或いは８個のリジン残基を受け入れて16個のペプチドを有するＭＢＰＣ用のコアマトリックスを形成することができる。容易に理解されるように、より大きいＭＢＰＣ、例えば32個の分技を有するＭＢＰＣを、必要に応じて同様に構築することができる。ペプチドのＣ末端をコアマトリックスの各分岐と共有結合させてＭＢＰＣを形成させる。これらのペプチドは、好ましくは同一であることができ、又は互いに異なっていることができる。得られた分子は表面のペプチド集団と、表面に出ず、それ故抗原とならない内部コアマトリックスを有する。本明細書で意図されているペプチドと異なるペプチドを有する類似構造の例についてはジェイ・ピー・タム[Proc．N atl．Acad．Sci．USA、85、5409-5413(1988年)]並びにタムに付与された米国特許第5229490号及びそこで引用された参照文献を参照されたい。スペーサーは、所望の場合、ペプチドとコアマトリックスの間に含めることができる。最初のリジン残基のカルボキシル基は遊離のままであるか、アミド化されているか又はβ−アラニン若しくは別の封鎖化合物と結合していることができる。ペプチドにはＤ又はＬ−アミノ酸残基を含めることができる。Ｄアミノ酸の方がペプチダーゼによって切断され難いのでインビボではより長く持続するが、Ｌアミノ酸は、以下で考察するように、より良い活性を有している。更に、ペプチド類似体、即ちペプチドの炭素骨格を使用しているが−ＣＯＮＨ −ペプチド結合を有していない合成構築物をペプチドの代わりに使用することができる。かくして、本明細書でペプチドと言うときには、ペプチド類似体も含めるように考えていると理解すべきである。ペプチド類似体の方がペプチダーゼに対して耐性であり、そしてインビボでより長く持続すると考えられる。本発明のＭＢＰＣにはＨＩＶ−１ウイルスの表面エンベロープ糖タンパク質gp 120のＶ３ループから誘導されるペプチドが含まれ、そして該ペプチドから得られるコンセンサスアミノ酸配列ＧＰＧＲ（ＩＵＰＡＣの一文字アミノ酸表記、即ちＧly−Ｐro−Ｇly−Ａrg）が含まれる。上記ＭＢＰＣは種々の細胞タイプのヒト細胞培養物中でＨＩＶ感染を阻止するのに有効である。この阻止はウイルス株には関係がなく、ＨＩＶ−２株に対してさえ有効であると思われる。かくして、上記ＭＢＰＣは全く驚くべき治療特性を有している。対応するモノマーペプチドは治療効果を有していないことに注目すべきである。この差は、コアマトリックスがペプチドのコンホーメーションを変化させるために生じると思われる。特異的に、かつ予想されなかったことに、ＧＰＧＲモノマーがコアマトリックスに結合しているとき、ペプチド中のＧＰＧＲの後の２個のアミノ酸が折り曲がることが見出された。それ故、コアマトリックスに結合したペプチド中のＧＰＧＲの後に続く少なくとも２個のアミノ酸残基が存在することが好ましい。しかしながら、ペプチドが長すぎる場合、ＭＢＰＣは抗原性となるので、ＧＰＧＲ配列の後に４個より多いアミノ酸を有し、該配列の前に４個より多いアミノ酸を有していることは望ましくない。それ故、ペプチドは12個もしくはそれ以下のアミノ酸を有しているであろう。ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２レトロウイルスによる感染の阻止に活性を示す特定のＭＢＰＣには以下のものが含まれ、これらをアミノ酸のＩＵＰＡＣ表記法を使用して記載する。 β−アラニンに接続する上記で示したＯＨ末端は、そのカルボキシル基を示し、アミノ基はリジン残基のカルボキシル基と結合している。ＮＨ₂末端はβ−アラニンのカルボキシル基が修飾されてカルボキサミド末端を形成していることを示し、β−アラニンは、そのアミノ基がリジン残基のカルボキシル基と結合している。以下に記載する実施例では、ＯＨ体を使用した。所望の治療効果を有するためにペプチドはコンセンサス配列ＧＰＧＲを含有すべきであるが、例えばＩＧＰＧＲ又はＩＸＸＧＰＧＲ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）のように、ＧＰＧＲの前にイソロイシンのコンホーメーション配列が含有されたり、Ｖ３ループからイソロイシンのコンホーメーション配列が含有されたりすると、ＩＧＰＧＲ配列を含有するペプチドが12個又はそれより少ないアミノ酸残基のものであるとき、ＭＢＰＣが治療処置として殆ど有効でなくなるか、又は無効になることが見出されているので、本発明で使用するには好ましくない。ＧＰＧＲに先行する３個のアミノ酸のなかにイソロイシン（Ｉ）が存在している配列は比較的保持(conserve)されている配列であり、ＨＩＶゲノムの約 98％に見られるが、驚くべきことに、望ましくないことが発見された。ＩＧＰＧＲ又はＩＸＸＧＰＧＲ配列を含有するＭＢＰＣは好ましくないにも拘わらず、このペプチド配列を有するＭＢＰＣは、複製されたペプチドが12個のアミノ酸残基より長い場合、合胞体の形成を阻止することが見出された。例えば、合胞体の形成を阻止するこのようなより大きいＭＢＰＣの１つは、４つに枝分かれしたＭＢＰＣの各分枝に結合したペプチドがＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴであるＭＢＰＣである。しかしながら、このような大きいＭＢＰＣは、このような大きい分子が、たとえ低濃度（10^-4Ｍ）であっても抗体を誘発し、ＨＩＶ感染患者の抗体によって認識され、阻止されることが示されており、そしてこれら両方のためにＨＩＶ感染患者に長期間に亘って上記ＭＢＰＣを使用できなくなることが示されているので、望ましくない。これらのＭＢＰＣはまた、それらの有効濃度に近い濃度で細胞培養物に対して毒性を示す。更に、これらＭＢＰＣの大きさのためにＭＢＰＣの構築が困難、かつ高価となり、プロテアーゼ分解に対して一層感受性となる。それ故、本発明は２から64個まで、好ましくは４から32個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含むＭＢＰＣを提供し、その際各ペプチドは０から４個までのアミノ酸残基で先行され、２から４個までのアミノ酸残基で後続されている配列ＧＰＧＲを含んでいる。好ましくは、該ペプチドはＩＧＰＧＲ又はＩＸＸＧＰＧＲ（式中、Ｘはアミノ酸残基である）のような、Ｇの前の３個のアミノ酸の中にＩの配列を含むべきでない。好ましくは、８又は16に枝分かれしたコアマトリックスに結合したペプチドはＧＰＧＲＡＦである。しかしながら、ＡＦはペプチダーゼの影響を受け易く、それ故インビボで分解し易いように思われるので、置換されたアミノ酸が同一の特性を有する場合、ＡＦを置換することは可能であり、望ましいと考えられる。 II ＭＢＰＣの調製ＭＢＰＣ構造の製造、即ちペプチドが結合している技分かれしたコア（これは、これまで多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）と称されていた）の製造は当該技術分野で既に知られている。タム等、J．Immun.148、914-920(1992年)及びワン(Wang) 等、Science、254、285-288(1991年)参照。好ましくは、少量（１キログラム未満）では、固相法を使用してＭＢＰＣを得る。ペプチド鎖の段階的組立ては４− （オキシメチル）−フェニルアセトアミドメチルコポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）上で自動的に実施することができる。ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステル(Boc−アミノ酸−OBt)との系統的ダブルカップリングスキームを含むBoc/ベンジル法を使用することができる。樹脂からの最終分離は無水フッ化水素を用いて実施する（０℃で１時間）ことができる。次に、ＭＢＰＣをジエチルエーテルで洗浄し、水に溶解する。凍結乾燥後、ＭＢＰＣを0.1Ｎ酢酸で平衡化したＰ２又はＧ15タイプの分子ろ過カラムで予め精製することができる。次に、溶出フラクションを回収することができる。精製段階は、Ｃ₈又はＣ₁₈逆相ＨＰＬＣを使用して達成される。ＭＢＰＣは、酸加水分解（６ＮＨＣｌ、115℃ 、24時間）及びエレクトロスプレーマススペクトル法によるアミノ酸含量によって特徴を決定することができる。 III 治療効果及び用途本発明は、２から64個まで、好ましくは４から32個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含むＭＢＰＣを患者に投与するＨＩＶ感染の治療方法を提供し、その際各ペプチドは０から４個までのアミノ酸残基で先行され、２から４個までのアミノ酸残基で後続されている配列ＧＰＧＲを含んでいるが、好ましくは配列ＩＧＰＧＲ又はＩＸＸＧＰＧＲ（式中、Ｘはアミノ酸残基である）ではない。ＭＢＰＣは、10^-3Ｍから10^-7Ｍの間、好ましくは約10^-6Ｍの血清値で投与すべきである。本発明に従って製造されるＭＢＰＣはＨＩＶ感染とＨＩＶ誘発細胞変性効果の両方をインビトロで阻止し、そしてその結果宿主生物内のウイルス増殖及びウイルス拡散を阻止することができる。本発明に従って製造されるＭＢＰＣはウイルスエンベロープ−細胞膜融合段階、そしてまた合胞体形成に必須の感染細胞膜−非感染細胞膜の融合段階も中和し、これらの段階はいずれも細胞感染、宿主生物内でのウイルス増殖及びウイルス拡散に不可欠であると考えられる。ＭＢＰＣは、明らかにＣＤ４レセプターのＣＤＲ３ドメインに結合することによって、ＨＩＶの89.6株を含有しているリンパ球やマクロファージのような細胞に存在するＣＤ４レセプターを遮断することができる。かくして、本発明のＭＢＰＣはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２によって誘発される合胞体の形成を遮断し、そしてヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）やマクロファージの感染を阻止する。このような遮断は細胞が他の抗原又は分裂誘発因子により活性化される能力を喪失させない、即ちリンパ球の機能性はＭＢＰＣによって保持される。リンパ球の機能性の保持がなされるならば、人為的エイズの潜在的な問題は本発明で回避される。それ故、本発明のＭＢＰＣが、Ｔ細胞を活性化するレセプターではなく、融合レセプターに結合していることは、ＨＩＶに対するこれまでのいかなる治療法を超える１つの主要な進歩である。ＨＩＶ感染の予防に加えて、本発明のＭＢＰＣは処置前に感染している細胞内のＨＩＶ産生を抑制することが示されている。本発明のＭＢＰＣ、そして特に、好ましい８×ＧＰＧＲＡＦ及び16×ＧＰＧＲＡＦＭＢＰＣの全く予想されなかった１つの特性は、これらＭＢＰＣがＨＩＶのレセプターであるＧalＣerレセプターに結合する能力を示したことである。このレセプターは結腸上皮細胞及び中枢神経系ＣＤ４^-細胞中に存在することが示されている。この結合によって、ＭＢＰＣは関連の少ないＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両単離体によるヒト腸細胞の感染を阻止する。本発明のＭＢＰＣのもう１つの利点は、これらＭＢＰＣが囓歯類、ウサギ及びサルで高投与量で非毒性であり、そしてそれ故治療的に使用されたとき、現在の多数のエイズ治療法とは対照的に、患者に危害を与えないことが見出されたことである。本発明のＭＢＰＣのもう１つの利点は、これらＭＢＰＣが10^-4Ｍ又はそれ未満の濃度で免疫原性でなく、それ故、Ｖ３ループから誘導されたペプチド又はそれらの構築物に関する全ての先行技術の方法とは異なって、ワクチンでないことである。ＭＢＰＣの免疫原性欠如は、免疫反応によってＭＢＰＣを阻止するか又は破壊する抗体が生じるので有利である。上記したＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴのような免疫原性ＭＢＰＣは、同一の個体に２，３回しか使用できず、そしてその後このＭＢＰＣは無効になるであろう。ＡＣＤ４レセプターの遮断実験データは、本発明のＭＢＰＣ、特にＭＢＰＣ.3及びＭＢＰＣ.12による、ＣＤ４⁺細胞のＨＩＶ感染過程に与える特異的な阻止効果及びＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２誘発性合胞体形成の総合的な遮断を証明している。インビトロで阻止効果が観察されたＭＢＰＣ濃度はＭＢＰＣ.3及びＭＢＰＣ.12で約10^-6Ｍ、他のＭＢＰＣではより高い濃度である。中和は試験した全てのＨＩＶ株、即ちＨＩＶ− １のＭＮ、Ｌai、ＮＤＫ及び89.6並びにＨＩＶ−２のＲodで観察された。対照的に、ＭＢＰＣで使用した個々のペプチドフラグメントは、非常に高濃度、例えば５×10^-4Ｍでさえ、合胞体形成阻止に対して不活性である。かくしてＭＢＰＣは、細胞感染に必要な結合後の現象、即ち融合段階に関与し、そしてＶ３ループが相違している関連の少ないＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２単離体によって使用される細胞分子と相互作用することができる。この仮定上のＶ３結合部位の良好な候補はＣＤ４のＶ１領域のＣＤＲ３ドメインである。その理由は、ｉ）この領域に特異的な抗ＣＤ4抗体(例えば、13Ｂ8-2)がＨＩＶ−１感染中の融合過程を遮断し、ii）ＣＤＲ３由来の合成ペプチドが融合アッセイで或る程度の阻止効果を有しており、そしてiii)ＭＢＰＣがＣＤ４のＣＤＲ３ドメインに対応する合成ペプチドを認識するからである。本発明のＭＢＰＣはウイルスエンベロープの結合を変化させることなくリンパ球に結合し（ＣＤＲ２ドメインを介して）、そして一方ＨＩＶ感染効果を防止する。ＭＢＰＣは可溶性ＣＤ４にも結合する。それ故、ＭＢＰＣ結合は可溶性ＣＤ４の存在下で阻止される。自然環境下での領域特異的な抗ＣＤ４抗体とＣＤ４レセプター間の相互作用に与える本発明のＭＢＰＣの効果を試験した。マクロファージで発現されたＣＤ４に対する抗ＣＤＲ３モノクローナル抗体(ＭＡb)13Ｂ8-2の本来的(in situ)結合は本発明のＭＢＰＣの存在下で劇的に、かつ特異的に低下した。gp120結合部位を認識する抗ＣＤ４ＭＡb(Leu3a及びＯＫＴ4aＭＡb)を含む他の抗ＣＤ４ＭＡbの結合は、ＭＢＰＣの非存在下と存在下で同一であった。これらのデータは、ＭＢＰＣがＣＤ４のＣＤＲ３領域に結合し、その結果、少なくとも１部、gp120Ｖ３ループとＣＤ４のこの領域間の相互作用を遮断することによって作用することを証明している。ＨＩＶ−１のＶ３ループは、ＨＩＶ−１とその標的細胞間の融合過程の重要な決定基であると考えられているにも拘わらず、本発明までは未だこの特性を治療的に使用することは可能になっていなかった。この主な理由は、Ｖ３がＨＩＶ− １単離体間で高度の多様性を示す高可変領域であるということである。抗Ｖ３中和抗体は一般的にタイプ特異性であり、そして最良の場合でも密接に関連した単離体しか中和することができない。本発明のＭＢＰＣは、細胞を標的とし、ウイルス決定基を標的としないので、該ＭＢＰＣはエンベロープ可変性に固有の問題を迂回する。それ故、本発明で使用されるＭＢＰＣは、ＨＩＶ−１Ｖ３ループのコンセンサス配列から誘導されるけれども、非常に多様性のＨＩＶ−１（ＮＤＫ）を含む種々のＨＩＶ−１株、そして更には関連のないＨＩＶ−２ＲＯＤ株も中和することができる。驚くべきことに、本発明のＭＢＰＣは、ＡＺＴに耐性の株、Ｊ−１を含む初期ＨＩＶ−１単離体、即ち患者から直接集めた単離体による感染を阻止することも見出された。以下の実施例は、ＨＩＶ感染に関して本発明のＭＢＰＣの有効性、利用性及び用途の広範さ、並びにこれらＭＢＰＣとＣＤ４⁺リンパ球及びマクロファージとの結合及び融合を説明するものであって、限定を意図するものではない。実施例１合胞体形成遮断細胞は、５％ウシ胎児血清、１％グルタミン、１％ストレプトマイシン−ペニシリンを補充したＲＰＭＩ1640培地(スコットランドアービンのGibco)中、５％ＣＯ₂を有する湿潤化雰囲気下で培養した。ＣＥＭ又はＣ8166細胞はＨＩＶ−１Ｌai、ＨＩＶ−２Ｒod又はＨＩＶ−１ＭＮでそれぞれ長期に感染させた。感染細胞（１×10⁴個）は種々の濃度のＭＢＰＣと共に96ウェルのプレート中で２時間インキュベートした。次に、感染していないＭolt−４細胞（４×10⁴個）を10 0μlの培地に加えた。合胞体は37℃で18時間後に計数した。結果は下記の表に示す。ＭＢＰＣ.4は(ＩＧＰＧＲＡＦ)₄−(Ｋ)₂−Ｋ−βＡ−ＯＨである。Ｍono.３はヘキサペプチドＧＰＧＲＡＦであり、ＭＢＰＣ.5はテトラデカペプチドＭＢＰＣ( ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ)₄−(Ｋ)₂−Ｋ−βＡ−ＯＨである。ＭＢＰＣ.3 は上記で述べたとおりである。合胞体の存在は、計数した量に概ね比例して配分した＋印で示す。ＭＢＰＣ.3は、ＨＩＶによって誘発された合胞体形成に対して約10^-6Ｍの濃度でインビトロ阻止効果を示し、そしてＭＢＰＣ.5は僅かに高い濃度で阻止効果を示した。ＭＢＰＣ.12（結果は示していない）はＭＢＰＣ.3の結果に類似した結果を示した。比較すると、モノマ一体Ｍono.３は全体的に不活性であり、このことは10^-4Ｍのより高い濃度のＭono.３でも確認されている。実施例２ＰＢＬの感染防止ＲＴ−欠失ＨＩＶ−１（IIIＢ）単離体で長期感染させた50×10³個の8Ｅ5細胞を、96ウェルのプレート中で表示したペプチドの存在下で150×10³個のフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）剌激ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と共培養した。使用したＭＢＰＣは、ＭＬＣと呼称されるコアリジンマトリックスに結合したペプチドとペプチド数によって記載する。この実験で使用したアミノ酸は全て右旋性であった。ＭＢＰＣの化学合成は上記したようにして固相技術で行った。ペプチド鎖は最適のｔ−ブチルオキシカルボニル／ベンジル化学を使用して４−(オキシメチル) −ＰＡＭ樹脂上で段階的に延長した。精製ＭＢＰＣのアミノ酸分析は推定されるアミノ酸比率と一致した。 [ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣはエレクトロスプレーマススペクトル法によって更に特徴化した(実験的Ｍ_r＝5672Ｄa)。合胞体数はペプチドの継続的な存在下での24時間インキュベーション後に測定し、そしてこれらの結果は下記表３に示す。表中、＋＋＋は、ウェル中に存在する合胞体数が未処理対照ウェルと類似していたことを示し、−はウェル中に合胞体が全く存在していないことを示し、±はウェル中に少数の合胞体がまれに存在していたことを示す。この試験での合胞体形成は抗ＣＤ４抗体ＯＫＴ４Ａ（抗ＣＤＲ２）及び13Ｂ8-2(抗ＣＤＲ３)によって遮断され、これまでの報告と一致した。コアリジン構造（「ＭＬＣ」と称する）自体はこの試験で合胞体形成を誘発しなかった。毒性はＭＴＴアッセイ（以下に記載する）か又はトリパンブルー排除技術のどちらかで評価した。これらの実験条件下で、[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣは５×10^-7Ｍほどの低濃度で合胞体形成の著しい阻止を誘発し、一方対応するモノマーペプチドＧＰＧＲＡＦは使用した濃度範囲（５×10^-5Ｍ）で活性でなかった。Ｎ末端のアセチル化（ [Ａｃ−ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣ）、イソロイシン（Ｉ）残基の付加（[ＩＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣ）及びＧＰＧＲＡＦ配列へのＤ−アミノ酸の導入によって活性が顕著に失われた。６個より少ない残基を有するＭＢＰＣ（即ち、 [ＧＰＧＲＡ]₈−ＭＬＣ又は[ＧＰＧＲ]₈−ＭＬＣ）並びに非関連配列を有するＭＢＰＣは細胞融合を阻止せず、コアマトリックスが生物学的活性に関与していないことを示していた。 [ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ]₄−ＭＬＣは５×10^-6Ｍの濃度で合胞体形成を阻止することができた。ＧＰＧＲＡＦモチーフに先行するイソロイシン残基はＨＩＶ−１単離体のなかで高度に保持されているので、イソロイシンの代わりにリジン又はスレオニンを用いて２つの関連構築物を合成した。これら３つの構築物の抗融合活性に顕著な差異は見られなかった。しかしながら、[ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ]₄−ＭＬＣ及びその誘導体は、５×10^-5Ｍの濃度で使用したとき8Ｅ5細胞で毒性を幾らか誘発したので、ヒト治療法で使用するには望ましくないことに注目すべきである。これらの結果に基づいて、より強力な抗ＨＩＶＭＢＰＣは[ＧＰＧＲＡＦ]₈ −ＭＬＣであるように思われた。別の試験で、この分子はＨＩＶ−1(ＬＡＩ)、ＨＩＶ−1(ＮＤＫ)又はＨＩＶ−2(ＲＯＤ)で長期に感染させたＴリンパ芽球様ＣＥＭ細胞とＨＴＬＶ形質転換ＭＴ−２細胞間の融合を阻止することもできた。実施例３リンパ球の機能性に与えるＭＢＰＣの効果ａ）抗原及び分裂誘発因子誘発細胞増殖に与えるＭＢＰＣの影響３人の健常なＨＩＶ血清反応陰性ドナーから得た末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、フィコール・ハイパク技術によってヘパリン添加血液から単離した。培地は１％グルタミン、１％抗生物質及び10％加熱不活性化ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ1640培地であった。細胞（10⁵個）は、抗原（カンジジン、ＰＰＤ）又は分裂誘発因子（ＰＨＡ）と共に又はこれらを用いないでＭＢＰＣ（５×10^-6Ｍ）の存在下でインキュベートした。抗原又は分裂誘発因子で処理した細胞は、１mCiの[³Ｈ]チミジンを８時間パルス投与した。次いで、細胞を採取しそしてＤＮＡ中の[³Ｈ]チミジン取込みを計数した。ｂ）混合リンパ球応答（ＭＬＲ）このアッセイでは、３人の健常ドナーから得た末梢血リンパ球（105個）を、微量滴定プレートウェル中で種々の濃度のＭＢＰＣの存在下又は非存在下で200 μlの最終容量で10人の血清反応陰性ドナーの混合物から得た105個の細胞と共にインキュベートした。リンパ球混合物は６日目に１μlの[³Ｈ]チミジンを８時間パルス投与した。細胞を採取し、ＤＮＡ中への[³Ｈ]チミジン取込みをベータカウンターで計数した。結果は、最初の試験で述べたＭＢＰＣ.5と共に下記表４に示す。細胞のチミジン取込みは、処理プレートと対照プレートで類似している。ＰＢＬの機能性が否定的な影響を受けていた場合、細胞再生産のマーカーであるチミジンの取込みはＭＢＰＣ処理プレートでかなり増加したであろう。かくして、これらの結果は、ＰＢＬが抗原又は分裂誘発因子に応答する能力を失っっているときに見られるように、ＰＢＬが増殖していないことを示している。実施例４ヒトＰＢＬの感染に与えるＭＢＰＣの効果末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を健常ドナーから取得し、フィトヘマグルチニンで剌激し、そして10％ウシ胎児血清及びインターロイキン−２を含有するＲＰＭＩ 1640（完全培地）中で培養した。６× 10⁶個の細胞／mlの試料は、10^-5Ｍの濃度の指示されたＭＢＰＣで処理するか又は処理しないかのどちらかであり、そしてＭＢＰＣを継続して存在させてＨＩＶ −１又はＨＩＶ−２（100ＴＣＩＤ₅₀）に37℃で１時間暴露した。完全に洗浄した後、ＰＢＬは10^-5Ｍの対応するＭＢＰＣを有する完全培地中で培養した。感染状態は、ＲＴ活性を測定すること（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２単離体の両方について）によって、またＨＩＶ−１単離体の場合には、感染10日後にＨＩＶ−１ｐ24^gag測定（Coulter kit、10pg／mlでカットする）によって評価した。使用したＭＢＰＣ処理は次のとおりであった: １なし; ２ [ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣ; ３ [ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ]₄−ＭＬＣ; ４ [ＰＰＰＹＶＥＰＴＴＴＱＣ]₄−ＭＬＣ（非−ＨＩＶ関連ＭＢＰＣ）（ＭＬＣはコアリジン構造を示す）。図２に示した結果は３つの別個の実験を表わす。使用したウイルス単離体の性質は、ＰＣＲ（ＨＩＶ−１対ＨＩＶ−２単離体）で、ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）とＨＩＶ−１（ＮＤＫ）間の区別に関してはＲＩＰＡによって調べた。 [ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣ及び[ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ]₄−ＭＬＣ処理は、培養上清液中の逆転写酵素（ＲＴ）活性の測定によって評価するとき、ウイルス子孫の産生遅延を一貫して生じさせた: 感染後10日目及び13日目に、ＲＴ活性はＭＢＰＣ処理試料では対照試料より90％以上も低かった。ペプチドはＲＴアッセイを妨げなかったので、上記の活性はＭＢＰＣ誘発性のウイルス産生阻止と一致する。ウイルス産生後に培養上清液中のｐ24^gag濃度を測定したとき同様な結果が得られた。ＨＩＶ−２感染の阻止については、[ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ]₄−ＭＬＣは[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣより能力が低かった。Ｖ３ループから得られるコンセンサス配列を含有していないＭＢＰＣはＰＢＬの感染を阻止しなかった。実施例５マクロファージにおける合胞体形成のＭＢＰＣ阻止ＭＢＰＣは、高度に細胞変性のマクロファージ向性単離体、ＨＩＶ−１（89.6 ）によるヒト原始マクロファージの感染を遮断する能力についても評価した。単核細胞は、フィコール・ハイパク密度分離によって単細胞に富む白血球泳動ユニットから単離した。マクロファージは10％ウシ胎児血清及び５％ヒトＡＢ血清を補充したＲＰＭＩ1640培地中でプラスチックに付着させて精製した。付着細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ（１ng／ml）の存在下で５日間培養し、ヒトマクロファージマーカー（Boehringer Mannheim、クローン25Ｆ9）について陽性であった。５×10⁵ 個の細胞を、５×10^-5Ｍの濃度の指示されたＭＢＰＣで45分間処理し、そしてその後10,000ＴＣＩＤ₅₀のマクロファージ向性単離体ＨＩＶ−1(89.6)に暴露した。使用したＭＢＰＣは次のとおりであった: １無し;２[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣ_D; ４ [ＧＰＧ(Ｒ)_DＡＦ]₈−ＭＬＣ; ５ [ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ]₄ −ＭＬＣ; ６ [ＰＰＰＹＶＥＰＴＴＴＱＣ]₄−ＭＬＣ、その際アミノ酸はＤ体であると記載しない限りＬ体である。完全に洗浄した後、細胞に再度培地を与え、そして感染４日後にＨＩＶ−1 ｐ24^gag産生及び合胞体形成について分析した。結果は、ｐ24の量（ng／ml）に対してＭＢＰＣをプロットして図３に示す。図３に示したように、ウェル当たりの相対的な合胞体数（＋＋＋は阻止なし; ＋＋は50％阻止; ±は＞95％の阻止を示す）はｐ24^gagの濃度と相関関係にあった。図４Ａに示したマクロファージは未処理対照であり、感染培養物中での多数の合胞体の存在を示している。図４Ｂに100倍で示される、[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣて予め処理したマクロファージは巨大細胞が非常に少ないことを示した。[ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ]₄−ＭＬＣ及び[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣは、ｉ）ＭＢＰＣの存在下で10,000ＴＣＩＤ₅₀のＨＩＶ−1(89.6)に暴露したマクロファージ培養物における可視性の細胞変性効果の大きな低下並びにii)培養上清液におけるＨＩＶ−1 ｐ24^gag濃度及びＲＴ活性の測定によって評価したとき、感染を阻止することができた。対照ＭＢＰＣはＨＩＶ−1(89.6)によるマクロファージの感染率に顕著には影響を与えなかった。興味深いことに、[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣ_D（即ち、Ｄ−アミノ酸残基を有する[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣ）及び［ＧＰＧ(Ｒ)_D ＡＦ]₈−ＭＬＣは[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣよりマクロファージ感染に対する活性が顕著に低かった。ＢＧalＣerレセプター本発明のＭＢＰＣ、特にＭＢＰＣ.3及びＭＢＰＣ.12並びにこれらの誘導体は第２のレセプター、ガラクトシルセラミドレセプター（Harouse等、Science、25 3 、320-323参照）にも結合し、そしてヒト結腸細胞に対するＨＩＶの感染性を完全に遮断する。対応するモノマーペプチドはこのレセプターに対して不活性である。ＭＢＰＣ中でＧＰＧＲＡＦペプチドを使用して腸細胞のＧalＣer感染経路の全体的な遮断を得るためには、ＭＢＰＣの重合度は少なくとも８でなければならない。これは、ＧalＣer認識に対するＶ３ループのコンホーメーション要求がＣＤ４のＣＤＲ３ドメインへの結合に対する要求より厳格であることを示唆している。ＣＤＲ３は酸性の領域（融合過程に必須であると報告されている87位にグルタミン酸残基を含んでいる）であり、そしてこの領域は多分静電的相互作用によってＶ３ループの塩基性アミノ酸と相互作用する。対照的に、gp120結合に関与することが知られているＧalＣerのガラクトースヘッド基は中性極性であるので、最適に相互作用するためにはＶ３構造で原子の別の空間配置を必要とする可能性がある。かくして、ＣＤ４経路のＨＩＶ感染を遮断する治療法がＧalＣerレセプターとも作用することは驚くべきことである。ＭＢＰＣの活性は次のようにしてこの代替的感染経路に対して評価した: ＨＴ −29細胞（５×10⁵個の細胞）をＭＢＰＣ（５×10^-6Ｍ）と共に45分間インキュベートし、その後100ＴＣＩＤ₅₀のＨＩＶ−1(ＬＡＩ)、ＨＩＶ−1(ＮＤＫ)又はＨＩＶ−2(ＲＯＤ)に37℃で１時間暴露した。残っている接種物を３連続トリプシン化で不活性化し、感染は次のようにして評価した：ｉ）培養上清液中のＨＩＶ−1 ｐ24^gag（ＨＩＶ−１単離体について）及びＲＴ活性（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２単離体について）の直接測定； ii）ヒトＰＢＬとの共培養。細胞は次のようにしてＭＢＰＣで処理した：１無し: ２ [ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣ; ３ [ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣ_D；４ [ＧＰＧ(Ｒ)_DＡＦ]₈−ＭＬＣ; ５ [ＧＰＧＲＡＦ]₁₆−ＭＬＣ; ６ [ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ]₄−ＭＬＣ; 及び７ [PＰＰＹＶＥＰＴＴＴＱＣ]₄-ＭＬＣ、その際他に記載しない限りアミノ酸は全てＬ体である。ＨＩＶ−１（ＮＤＫ）による感染に対応する図５Ａに示した結果は別個の３つの実験の代表例であり、使用したＭＢＰＣはＸ軸の数字で示される。ｐ24^gag（pg／ml）の濃度はＰＢＬとの共培養実験中に測定した（＋＋＋は感染10日後に＞10ng／ml; ＋＋は感染13日後に＞１ng／ml; ＋は感染16日後に＞１ng／ml; −は感染１ヶ月後に検出可能なｐ24^gagなしを示す。）。ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）及びＨＩＶ−２（ＲＯＤ）で同様な結果が得られた。同じＭＢＰＣによる別の実験で、ＧalＣerに対するgp120の結合に与えるＭＢＰＣの効果を、高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）結合アッセイを使用して分析した。ＭＢＰＣ（10^-4Ｍ）をＧalＣerと共に室温で１時間予めインキュベートした。完全に洗浄した後、ＨＰＴＬＣプレートをＨＩＶ−１組換え体gp120(2.5μg／ml)、続いてウサギ抗gp120 及び¹²⁵Ｉ−ヤギ抗ウサギＩｐＧと共にインキュベートした。これらのプレートをＰＢＳ中で洗浄し、アマーシャムハイパーフィルム（Amersham hyperfilm）ＭＰに８時間暴露した。図５Ｂに示されるように、活性ＭＢＰＣでＨＴ−29細胞を処理すると、細胞はＨＩＶ−１（ＮＤＫ単離体）による感染から保護された。この抗ウイルス効果は、活性ＭＢＰＣがＧalＣerに対するgp120の結合を遮断する能力と相関関係があった。モノマーＶ３ペプチドも対照ＭＢＰＣも抗ウイルス活性を示さず、ＧalＣerに対するgp120の結合を阻止しなかった。それ故、本発明は更に、各々がＨＩＶ−１ウイルスの表面エンベロープ糖タンパク質gp120のＶ３ループから誘導される２から64個（好ましくは４から32個）のペプチドが結合しているコアマトリックスを含むＭＢＰＣを提供し、このＭＢＰＣはＣＤ４⁺／ＧalＣer^-及びＣＤ４^-／ＧalＣer⁺細胞でＨＩＶウイルスの感染性を阻止することができる。Ｃ．抗原性、毒性及び免疫原性本発明のＭＢＰＣは、ヒトＰＢＬに対してはインビトロで又は10^-3Ｍの濃度のＭＢＰＣを腹腔内、静脈内又は皮下的のいずれかで反復注入したマウスに対してはインビボで毒性でない。１mgのＭＢＰＣの反復投与量を腹腔内及び静脈内に投与したマウスは副作用を何も示さなかった。更に、５mg／kgの投与量を１回静注し、その後毎日皮下注射したサル（macaca sylvana）は30日後に毒性効果の徴候を何も示していなかった。更に、[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣを注射したウサギ及びマウスは抗ＧＰＧＲＡＦ抗体の有意な力価をもたらさず、ペプチドの各分枝のアミノ酸残基が10個未満であるＭＢＰＣは意図された使用濃度の10^-3Ｍ未満の濃度で免疫原性でないという概念と一致していた。更に、インビトロでは、ＰＢＬは他の抗原又は分裂誘発因子によって活性化される能力を保持している。１．抗原性ＭＢＰＣの免疫原性に関する酵素免疫検査法（エリザ法）ＭＢＰＣ.1、ＭＢＰＣ.2及びモノマーＶ３コンセンサスペプチドを、ＨＩＶ− １⁺血清又はＨＩＶ−１^-血清に対する免疫反応性についてエリザ法で試験した。この試験で、ＭＢＰＣ.2は(ＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ)₄−(Ｋ)₂−Ｋ−βＡ −ＯＨであり、ＭＢＰＣ.1は(ＧＰＧＲＡＦ)₈−(Ｋ)₄−(Ｋ)₂−Ｋ−βＡ−ＯＨである。血清の陽性は先ず、血清／血漿中の抗ＨＩＶ−１抗体を検出するためにＮＥＷＬＡＶ−ＢＬＯＴキット（Diagnostic Pasteur）を使用してウェスターンブロット分析で確認した。96ウェルの微量滴定プレートを500ng／ウェルのペプチドで被覆した。飽和させ、洗浄した後、50μlのＨＩＶ−１⁺血清（１/100希釈）を37℃で２時間添加した。パーオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギＩｐＧを用いて染色した。30個のＨＩＶ−１陽性血清及び３個のＨＩＶ−１陰性血清を、北アメリカ人／ヨーロッパ人のコンセンサス(Ｖ3 Ｃons)配列から誘導されたＶ３ペプチド及びＶ３ＭＢＰＣに対してエリザ法で比較分析した。結果は下記表５に記載する。 30個のＨＩＶ−１陽性血清のうち、26個はＶ３Ｃons及びＭＢＰＣ.2と強く反応し、１個は両ペプチドと弱く反応し、１個はＭＢＰＣ.2と選択的に反応し、そして２個の血清はこれらペプチドのいずれとも反応しなかった。興味深いことに、ＭＢＰＣ.1はＨＩＶ−１陽性血清のいずれとも反応しなかった。ＭＢＰＣ.2と比較するとき、ＭＢＰＣ.1はＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２感染の遮断で一層有効であり、毒性が少ないことが示された。ＭＢＰＣ.1 がＨＩＶ−１陽性血清によって認識されないということは、このＭＢＰＣが抗Ｖ３抗体の中和活性を妨げ得ないことを示唆している可能性がある。それ故、これらは相乗的に作用してＨＩＶ−１感染を中和することができよう。２．毒性ＭＴＴアッセイ、即ち3−[4,5−ジメチルチアゾール−２−イル]2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミドを使用する細胞生存性比色分析アッセイを使用して細胞の生存性に対するＭＢＰＣの効果を評価した。ＣＥＭ又はＣ8166細胞（５ ×10⁴個）は、５％ウシ胎児血清、１％グルタミン、１％ストレプトマイシン− ペニシリンを補充した200μlの最終容量のＲＰＭＩ1640培地（スコットランドアービンのGibcoから入手可能）中５％ＣＯ₂を有する湿潤化雰囲気下96ウェルの微量滴定プレート中種々の濃度のＭＢＰＣの存在下で連続（15日）培養した。３乃至４日毎に、100μlの細胞懸濁物についてＭＴＴアッセイを実施し、そして細胞培養物にＭＢＰＣを加え、容量を200μlとした。10^-7から10^-4Ｍの濃度の[ＧＰＧＲＡＦ]⁸−ＭＬＣは、この試験では細胞に対して毒性でなかった。他の結果は上記表３に示す。表に示されているように、ＩＧＰＧＲ配列を含有するテトラデカペプチドＭＬＣは毒性であるので、本発明で意図される治療用途には適切でない。３．抗原性−ＭＢＰＣに関する免疫原性試験４匹のＣ57／ＢＬ６ブラックマウスに４mg／mlのＭＢＰＣ.3を250μl(１mg)36 日間毎日注射した。注射経路は腹腔内であった。血液試料は眼窩下眼穿刺で集めた。血液試料を37℃で１時間、その後４℃で一夜放置し、このようにして得られた上清液（血清試料）をペレットから分離した。血清はエリザ法で試験し、特異的な抗ＭＢＰＣ.3抗体を検索した。更に、２匹のニュージーランドウサギを[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣで免疫化した：１mlのＰＢＳ、ｐＨ７．４中400μgの[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣを等量の完全フロイントアジュバントと混合し、０日目に各ウサギの皮内に注射した。この方法を30、60、90及び120日目に不完全フロイントアジュバントを用いて皮下に反復注入した。血清はエリザ法で試験し、特異的な抗ＭＢＰＣ.3抗体を検索した。本明細書に提示したデータは最後の血清試料（120＋7日）のものである。 96ウェルの微量滴定プレート（Nunc、デンマーク国ロッツキルド）は、種々の濃度の[ＧＰＧＲＡＦ]₈−ＭＬＣ（50μlのＰＢＳ中500から25ngの[ＧＰＧＲＡＦ ]₈−ＭＬＣ、ｐＨ7.4、ウェル当たり）を用いて37℃で２時間被覆した。400μl のカゼイン（５g／100ml）で飽和させた後、種々の血清希釈物を37℃で２時間添加した。対照は免疫化していないウサギ及びマウスから得た血清であった。洗浄（５回）後、１：5000のパーオキシダーゼ標識ブタ抗ウサギＩｇＧ又は抗マウスＩｇＧ（Dakopatts、デンマーク国コペンハーゲン）50μlを37℃で１時間添加した。更に洗浄（５回）した後、100μlのオルト−フェニレンジアミンを室温で暗所で30分間添加した。反応は、４Ｎ硫酸50μl を添加して停止させ、492/620nm で光学密度（ＯＤ）比率を測定した。下記表６〜10はこれらの結果を記載し、表６は光学密度比率(×10³)を使用してウサギで達成された結果の要約を記載している。Ｍoは10μg/mlのＧＰＧＲＡＦモノマーである。結果のいくつかで観察されたバックグランド反応性の量が高いことを考慮して、ＭＢＰＣ.1で免疫化した血清の非反応性を証明するために更に試験を実施した。ＭＢＰＣ.1か又はＭＢＰＣ.2で免疫化したウサギから得た血清はＭＢＰＣ.1、ＭＢＰＣ.2、Ｍono.１（ＭＢＰＣ.1のモノマー）及び北アメリカ人／ヨーロッパ人のコンセンサスＶ３配列(Ｖ3 Ｃons、又はＣs)と結合する能力についてエリザ法で試験した。図６Ａは、ＭＢＰＣ.2で免疫化したウサギから得た血清がＭＢＰＣ.2及びＶ3 Ｃonsを顕著に認識したが、ＭＢＰＣ.1又はその対応するモノマーペプチドに対する反応性は観察されなかったことを示している。図６Ｂは、ＭＢＰＣ.1で免疫化したウサギから得た血清がＭＢＰＣ.１（ウサギＡから得た血清の弱い反応性を除く）、ＭＢＰＣ.2、Ｖ3 Ｃons又はＭono.1に対して反応しなかったことを示している。陰性対照として使用した前免疫血清も同様にＭＢＰＣ、Ｖ3 Ｃons又はＭono.1のいずれに対しても反応しなかった。もう１つの実験セットで、ＭＢＰＣ.1又はＭＢＰＣ.2のどちらかで免疫化したウサギから得た血清を種々の濃度のＭＢＰＣ.1、ＭＢＰＣ.2及びＶ3 Ｃonsに対して試験した（１／100及び１／1000希釈で）。図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは、ＭＢＰＣ.2で免疫化したウサギから得た血清がＭＢＰＣ.2及びＶ3 Ｃonsに対して投与量依存性態様で反応したことを明白に示している。ＭＢＰＣ.1に対する反応性は検出されなかった。対照的に、ＭＢＰＣ.1で免疫化したウサギから得た血清はＭＢＰＣ.2に対しては反応しなかったが、ＭＢＰＣ.1に対しては弱く反応した（ＭＢＰＣ.1に対するウサギＡから得た血清の反応性は弱く、ウサギＢから得た血清は反応性がなかったことに注意されたい）。興味深いことに、これら後者の血清はモノマーＶ3 Ｃons、即ちgp120に存在するコンセンサス配列に似せた34個アミノ酸の直鎖エピトープとは反応しなかった。これらの結果は、ＭＢＰＣ.1、即ち短いＶ3 ＭＢＰＣはウサギで顕著な抗体応答を誘発しなかったが、ＭＢＰＣ.2、即ち最も長いＶ3 ペプチド構築物は上記のような応答を誘発したことを示している。これらの観察は、ＭＢＰＣ.1とＨＩＶ −１感染患者血清との免疫反応性の結果と一致している。 10^-3Ｍを反復注入したマウスでは、非常に弱い抗体力価を１:100希釈の血清で時々検出することができ、そしてより低い血清希釈では抗体は本質的に検出することができなかった。ウサギでは、１:100血清希釈の１羽の動物で抗体を検出できる。他の全ての血清希釈物では、抗体の力価は対照動物で得られた力価に匹敵している。このような弱い抗原性は、本発明のＭＢＰＣが有効な抗体応答を引き出し得る抗原（これが、これまでに知られているペプチド構築物の用途である）として使用される可能性を有していないことを示している。実際、本発明のＭＢＰＣの意図された治療濃度は約10^-6Ｍであり、この濃度では抗体応答は期待されない。しかしながら、抗原性がないものとすれば、10^-3ＭまでのＭＢＰＣを投与することができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１１月２１日【補正内容】請求の範囲１．４から16個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物であって、その際上記各ペプチドは０から４個までのアミノ酸残基が先行しており、２から４個までのアミノ酸残基が後に続いているアミノ酸配列ＧＰＧＲを含んでいるが、本質的にアミノ酸配列ＩＧＰＧＲ又はＩＸＸＧＰＧＲ（式中、Ｘはアミノ酸残基である）を有していない多分岐ペプチド構築物。２．各ペプチドが同一である請求項１に記載のペプチド構築物。３．各ペプチドがＧＰＧＲＡＦである請求項１に記載のペプチド構築物。４．８又は16個のペプチドＧＰＧＲＡＦが存在している請求項３に記載のペプチド構築物。５．コアマトリックスがリジン残基を含むものである請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド構築物。６．コアマトリックスとペプチドの間にスペーサーが存在している請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド構築物。７．すべてのペプチド又はいくつかのペプチドが１個又は複数個の右旋性アミノ酸残基を含んでいる請求項１に記載のペプチド構築物。８．請求項１〜７のいずれか１項に記載の多分岐ペプチド構築物を製薬的に許容可能な希釈剤又は担体と混合して含んでいる医薬品。９．２から64個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物であって、その際上記各ペプチドは０から４個までのアミノ酸残基が先行しており、２から４個までのアミノ酸残基が後に続いているアミノ酸配列ＧＰＧＲを含んでいるが、本質的にアミノ酸配列ＩＧＰＧＲ又はＩＸＸＧＰＧＲ（式中、Ｘはアミノ酸残基である）を有していない多分岐ペプチド構築物。１０．４から32個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む請求項９に記載のペプチド構築物。１１．各ペプチドが同一である請求項９又は１０に記載のペプチド構築物。１２．各ペプチドがＧＰＧＲＡＦである請求項９又は１０に記載のペプチド構築物。１３．８又は16個のペプチドＧＰＧＲＡＦが存在している請求項１２に記載のペプチド構築物。１４．コアマトリックスがリジン残基を含むものである請求項９〜１３のいずれか１項に記載のペプチド構築物。１５．コアマトリックスとペプチドの間にスペーサーが存在している請求項９〜１４のいずれか１項に記載のペプチド構築物。１６．ペプチドがペプチド類似体である請求項９に記載のペプチド構築物。１７．すべてのペプチド又はいくつかのペプチドが１個又は複数個の右旋性アミノ酸残基を含んでいる請求項９に記載のペプチド構築物。１８．ＨＩＶウイルスの表面エンベロープ糖タンパク質gp120のＶ３ループから誘導される、アミノ酸配列ＧＰＧＲを含んでいるが、アミノ酸配列ＩＧＰＧＲ又はＩＸＸＧＰＧＲ（式中、Ｘはアミノ酸残基である）を有していない、２から 64個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物であって、該多分岐ペプチド構築物は10^-4モル未満の血清濃度で非免疫原性であり、結合したＣＤ4⁺／ＧalＣer^-及びＣＤ4^-／ＧalＣer⁺細胞の両方でＨＩＶウイルスの感染性を阻止できる多分岐ペプチド構築物。１９．４から16個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む請求項１８に記載のペプチド構築物。２０．請求項９〜１９のいずれか１項に記載の多分岐ペプチド構築物を製薬的に許容可能な希釈剤又は担体と混合して含んでいる医薬品。２１．各ペプチドは０から４個のアミノ酸残基が先行しており、２から４個のアミノ酸残基が後に続いているアミノ酸配列ＧＰＧＲを含んでいる、２から64個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物の、ＨＩＶ感染治療用の医薬品を製造するための用途。２２．各ペプチドは０から４個のアミノ酸残基が先行しており、２から４個のアミノ酸残基が後に続いているアミノ酸配列ＧＰＧＲを含んでいる、２から64個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物を患者に投与することを含むＨＩＶ感染の治療方法。２３．請求項９〜１９のいずれか１項に記載の多分岐ペプチド構築物を患者に投与することを含むＨＩＶ感染の治療方法。２４．請求項２０に記載の医薬品を患者に投与することを含むＨＩＶ感染の治療方法。２５．各ペプチドは０から４個のアミノ酸残基が先行しており、２から４個のアミノ酸残基が後に続いているアミノ酸配列ＧＰＧＲを含んでいるが、本質的にアミノ酸配列ＩＧＰＧＲ又はＩＸＸＧＰＧＲ（式中、Ｘはアミノ酸残基である）を有していない、２から64個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物の製造方法において、樹脂上でペプチド鎖を固相で段階的に延長し、続いて該樹脂から多分岐ペプチド構築物を開裂させることを特徴とする方法。２６．樹脂が４−オキシメチル−フェニルアセトアミドメチルコポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）である請求項２５に記載の方法。２７．ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステル（Ｂoc−アミノ酸−ＯＢt ）との系統的二重カップリングを含むＢoc／ベンジル法を使用する請求項２５又は請求項２６に記載の方法。２８．樹脂からの開裂が無水フッ化水素を用いて０℃で実施される請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。２９．製造されるペプチド構築物が、コアマトリックスに結合した４から32個までのペプチドが存在している構築物である請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。３０．製造されるペプチド構築物が、各ペプチドが同一である構築物である請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。３１．製造されるペプチド構築物か、各ペプチドがＧＰＧＲＡＦである構築物である請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。３２．製造されるペプチド構築物が、８個又は16個のペプチドＧＰＧＲＡＦが存在している構築物である請求項３１に記載の方法。３３．製造されるペプチド構築物が、コアマトリックスがリジン残基を含んでいる構築物である請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の方法。３４．製造されるペプチド構築物が、コアマトリックスとペプチドの間にスペーサーが存在している構築物である請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の方法。３５．製造されるペプチド構築物が、ペプチドがペプチド類似体である構築物である請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。３６．製造されるペプチド構築物が、すべてのペプチド又はいくつかのペプチドに１個又は複数個の右旋性アミノ酸残基を含んでいる構築物である請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヤヒ，ヌアラフランス国マルセイユ 13009，ブルヴァールドルドン，83番，ラルヴィエール，バティマンデー２ (72)発明者ファニュイエ，エマニュエルフランス国ラヴァレットドゥヴァール 83160，アヴェニュートルテル, 707番 (72)発明者マブルーク，カメルフランス国マルセイユ 13300，ブルヴァールジ．デスプラセ，７番 (72)発明者グルックマン，ジャン・クロードフランス国パリ 75014，ブルヴァールドゥポン・ロワイヤル，70番 (72)発明者ヴァンリエショータン，ジュルファースフランス国エクスアンプロヴァンス 13100，ヴァルドラトルスダルタニャン ▲ＩＩ▼（番地なし) (72)発明者ロシャ，エルヴフランス国ミメ 13105，シュマンデサンジェオン（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．２から64個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物であって、その際上記各ペプチドは０から４個までのアミノ酸残基が先行しており、２から４個までのアミノ酸残基が後に続いているアミノ酸配列ＧＰＧＲを含んでいるが、本質的にアミノ酸配列ＩＧＰＧＲ又はＩＸＸＧＰＧＲ（式中、Ｘはアミノ酸残基である）を有していない多分岐ペプチド構築物。２．コアマトリックスに結合した４から32個までのペプチドが存在している請求項１に記載のペプチド構築物。３．各ペプチドが同一である請求項１又は２に記載のペプチド構築物。４．各ペプチドがＧＰＧＲＡＦである請求項１又は請求項２に記載のペプチド構築物。５．８又は16個のペプチドＧＰＧＲＡＦが存在している請求項４に記載のペプチド構築物。６．コアマトリックスがリジン残基を含むものである請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド構築物。７．コアマトリックスとペプチドの間にスペーサーが存在している請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド構築物。８．ペプチドがペプチド類似体である請求項１に記載のペプチド構築物。９．すべてのペプチド又はいくつかのペプチドが１個又は複数個の右旋性アミノ酸残基を含んでいる請求項１に記載のペプチド構築物。１０．ＨＩＶウイルスの表面エンベロープ糖タンパク質gp120のＶ３ループから誘導される２から64個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物であって、該多分岐ペプチド構築物は10^-4モル未満の血清濃度で非免疫原性であり、結合したＣＤ4⁺／ＧalＣer^- 及びＣＤ4^-／ＧalＣer⁺細胞の両方でＨＩＶウイルスの感染性を阻止できる多分岐ペプチド構築物。１１．請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多分岐ペプチド構築物を製薬的に許容可能な希釈剤又は担体と混合して含んでいる医薬品。１２．各ペプチドは０から４個のアミノ酸残基が先行しており、２から４個のアミノ酸残基が後に続いているアミノ酸配列ＧＰＧＲを含んでいる、２から64個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物のＨＩＶ感染治療用の医薬品を製造するための用途。１３．各ペプチドは０から４個のアミノ酸残基が先行しており、２から４個のアミノ酸残基が後に続いているアミノ酸配列ＧＰＧＲを含んでいる、２から64個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物を患者に投与することを含むＨＩＶ感染の治療方法。１４．請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多分岐ペプチド構築物を患者に投与することを含むＨＩＶ感染の治療方法。１５．請求項１１に記載の医薬品を患者に投与することを含むＨＩＶ感染の治療方法。１６．各ペプチドは０から４個のアミノ酸残基が先行しており、２から４個のアミノ酸残基が後に続いているアミノ酸配列ＧＰＧＲを含んでいるが、本質的にアミノ酸配列ＩＧＰＧＲ又はＩＸＸＧＰＧＲ（式中、Ｘはアミノ酸残基である）を有していない、２から64個までのペプチドが結合しているコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物の製造方法において、樹脂上でペプチド鎖を固相で段階的に延長し、続いて該樹脂から多分岐ペプチド構築物を開裂させることを特徴とする方法。１７．樹脂が４−オキシメチル−フェニルアセトアミドメチルコポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）である請求項１６に記載の方法。１８．ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステル（Ｂoc−アミノ酸−ＯＢt ）との系統的二重カップリングを含むＢoc／ベンジル法を使用する請求項１６又は請求項１７に記載の方法。１９．樹脂からの開裂が無水フッ化水素を用いて０℃で実施される請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。２０．製造されるペプチド構築物が、コアマトリックスに結合した４から32個までのペプチドが存在している構築物である請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。２１．製造されるペプチド構築物が、各ペプチドが同一である構築物である請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。２２．製造されるペプチド構築物が、各ペプチドがＧＰＧＲＡＦである構築物である請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。２３．製造されるペプチド構築物が、８個又は16個のペプチドＧＰＧＲＡＦが存在している構築物である請求項２２に記載の方法。２４．製造されるペプチド構築物が、コアマトリックスがリジン残基を含んでいる構築物である請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。２５．製造されるペプチド構築物が、コアマトリックスとペプチドの間にスペーサーが存在している構築物である請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。２６．製造されるペプチド構築物が、ペプチドがペプチド類似体である構築物である請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。２７．製造されるペプチド構築物が、すべてのペプチド又はいくつかのペプチドに１個又は複数個の右旋性アミノ酸残基を含んでいる構築物である請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。