JPH09107985A - ビタミンｂ６の製造法 - Google Patents
ビタミンｂ６の製造法Info
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- JPH09107985A JPH09107985A JP8253178A JP25317896A JPH09107985A JP H09107985 A JPH09107985 A JP H09107985A JP 8253178 A JP8253178 A JP 8253178A JP 25317896 A JP25317896 A JP 25317896A JP H09107985 A JPH09107985 A JP H09107985A
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- rhizobium
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
- C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 動物、植物および微生物の栄養に必須であ
り、医薬品として、および食料品に使用されているビタ
ミンＢ6 を、高収量で得る方法を提供する。 【解決手段】 好気的条件下、培地中でビタミンＢ6 生
産能を有するリゾビウム属の微生物を培養し、生成した
ビタミンＢ6 を培養液から得る、ビタミンＢ6 の製造
法。該培地は資化可能な炭素源、消化可能な窒素源、無
機塩および微生物の生育に必要な他の栄養素を含むのみ
ならず、好ましくはピルビン酸、 Ｄ−グリセルアルデ
ヒド、グリコールアルデヒド、グリシン、１−デオキシ
−Ｄ−スレオ−ペンチュロース、４−ヒドロキシ−Ｌ−
スレオニンもしくはその混合物を含む。
り、医薬品として、および食料品に使用されているビタ
ミンＢ6 を、高収量で得る方法を提供する。 【解決手段】 好気的条件下、培地中でビタミンＢ6 生
産能を有するリゾビウム属の微生物を培養し、生成した
ビタミンＢ6 を培養液から得る、ビタミンＢ6 の製造
法。該培地は資化可能な炭素源、消化可能な窒素源、無
機塩および微生物の生育に必要な他の栄養素を含むのみ
ならず、好ましくはピルビン酸、 Ｄ−グリセルアルデ
ヒド、グリコールアルデヒド、グリシン、１−デオキシ
−Ｄ−スレオ−ペンチュロース、４−ヒドロキシ−Ｌ−
スレオニンもしくはその混合物を含む。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵によるビタミ
ンＢ6 の製造法に関する。本明細書で用いる“ビタミン
Ｂ6 ”という語はピリドキソール、ピリドキサールおよ
びピリドキサミンを含むものである。
ンＢ6 の製造法に関する。本明細書で用いる“ビタミン
Ｂ6 ”という語はピリドキソール、ピリドキサールおよ
びピリドキサミンを含むものである。
【０００２】ビタミンＢ6 は、動物、植物および微生物
の栄養に必須であり、医薬品として、および食品材料中
に使用されている。本発明の目的は、発酵による効率良
いビタミンＢ6 の生産を提供することにある。
の栄養に必須であり、医薬品として、および食品材料中
に使用されている。本発明の目的は、発酵による効率良
いビタミンＢ6 の生産を提供することにある。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】これ
までにビタミンＢ6 の生産に関する研究は数多くなさ
れ、サッカロミセス属、ピヒア属、クレブシエラ属、ア
クロモバクター属、バチルス属およびフラボバクテリウ
ム属のさまざまな微生物が、ビタミンＢ6 を生産するこ
とで知られている。しかしながら、リゾビウム属（genu
s Rhizobium)の微生物が大量のビタミンＢ6 を蓄積する
ということはこれまで報告されていない。
までにビタミンＢ6 の生産に関する研究は数多くなさ
れ、サッカロミセス属、ピヒア属、クレブシエラ属、ア
クロモバクター属、バチルス属およびフラボバクテリウ
ム属のさまざまな微生物が、ビタミンＢ6 を生産するこ
とで知られている。しかしながら、リゾビウム属（genu
s Rhizobium)の微生物が大量のビタミンＢ6 を蓄積する
ということはこれまで報告されていない。
【０００４】本発明によれば、高収量でビタミンＢ6 を
生産することが可能になる。本発明者らはリゾビウム属
に属する微生物が培養液中に大量のビタミンＢ6 を蓄積
し、そこから所望の純度で蓄積したビタミンＢ6 を回収
できることを見いだした。
生産することが可能になる。本発明者らはリゾビウム属
に属する微生物が培養液中に大量のビタミンＢ6 を蓄積
し、そこから所望の純度で蓄積したビタミンＢ6 を回収
できることを見いだした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、リゾビウム属
に属し、ビタミンＢ6 を産生し得る微生物を、好気的条
件下で、培地中で培養し、その培養液から産生されたビ
タミンＢ6 を得る、ビタミンＢ6 の製造法に関する。
に属し、ビタミンＢ6 を産生し得る微生物を、好気的条
件下で、培地中で培養し、その培養液から産生されたビ
タミンＢ6 を得る、ビタミンＢ6 の製造法に関する。
【０００６】培養液中のビタミンＢ6 の含量はSaccharo
myces carlsbergensis ＡＴＣＣ９０８０（The Analys
is of Nutrients in Foods, Academic Press, London,
224-227, 1978)を用いて定量でき、培養液中のピリドキ
ソール、ピリドキサールおよびピリドキサミンのような
ビタミンＢ6 成分の含量もまた高速液体クロマトグラフ
ィーを用いて分別定量ができる（Vitamin, 63, 349-36
9, 1989）。
myces carlsbergensis ＡＴＣＣ９０８０（The Analys
is of Nutrients in Foods, Academic Press, London,
224-227, 1978)を用いて定量でき、培養液中のピリドキ
ソール、ピリドキサールおよびピリドキサミンのような
ビタミンＢ6 成分の含量もまた高速液体クロマトグラフ
ィーを用いて分別定量ができる（Vitamin, 63, 349-36
9, 1989）。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明を実施するにあたり、リゾ
ビウム属に属する微生物は資化可能な炭素源、消化可能
な窒素源、無機塩および微生物の生育に必要な他の栄養
素を含有する培地で培養される。炭素源としては、たと
えばグルコース、フラクトース、ラクトース、ガラクト
ース、スクロース、マルトース、でんぷん、デキストリ
ンまたはグリセリンが使用される。窒素源としては、た
とえばペプトン、大豆粉、コーンスチープリカー、肉エ
キス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムまたは尿素
が、それぞれ単独もしくは混合物として用いられる。さ
らに、無機塩としては、カルシウム、マグネシウム、亜
鉛、マンガン、コバルトおよび鉄の、硫酸塩、塩酸塩ま
たは燐酸塩を用いてよい。そして、また必要に応じて一
般的な栄養因子もしくは、動物油、植物油、鉱油などの
消泡剤を補足的に加えてもよい。
ビウム属に属する微生物は資化可能な炭素源、消化可能
な窒素源、無機塩および微生物の生育に必要な他の栄養
素を含有する培地で培養される。炭素源としては、たと
えばグルコース、フラクトース、ラクトース、ガラクト
ース、スクロース、マルトース、でんぷん、デキストリ
ンまたはグリセリンが使用される。窒素源としては、た
とえばペプトン、大豆粉、コーンスチープリカー、肉エ
キス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムまたは尿素
が、それぞれ単独もしくは混合物として用いられる。さ
らに、無機塩としては、カルシウム、マグネシウム、亜
鉛、マンガン、コバルトおよび鉄の、硫酸塩、塩酸塩ま
たは燐酸塩を用いてよい。そして、また必要に応じて一
般的な栄養因子もしくは、動物油、植物油、鉱油などの
消泡剤を補足的に加えてもよい。
【０００８】培養に用いる培地のｐＨは適切には約５.
０ないし約９. ０で、６. ５ないし７. ５が好ましい。
培養温度は約１０ないし４０℃で、２６ないし３０℃が
好ましい。培養時間は適切には約１ないし１４日で、２
ないし７日が好ましい。通常、培養において通気および
撹拌は好ましい結果をもたらす。ピルビン酸、Ｄ−グリ
セルアルデヒド、グリコールアルデヒド、グリシン、１
−デオキシ−Ｄ−スレオ−ペンチュロース、４−ヒドロ
キシ−Ｌ−スレオニンまたはそれらの適切な混合物を培
地に添加すれば、ビタミンＢ6 生産性に好ましい結果を
もたらす。添加物として１−デオキシ−Ｄ−スレオ−ペ
ンチュロースと４−ヒドロキシ−Ｌ−スレオニンの組み
合わせがビタミンＢ6 生産には特に効果的である。ま
た、ビタミンＢ6 は適当なｐＨ値を有する緩衝液中で培
養液から分離したリゾビウム属に属する微生物の菌体
を、ピルビン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド、グリコール
アルデヒド、グリシン、１−デオキシ−Ｄ−スレオ−ペ
ンチュロースおよび４−ヒドロキシ−Ｌ−スレオニンを
適切に組み合わせた培地で培養しても生産させることが
できる。
０ないし約９. ０で、６. ５ないし７. ５が好ましい。
培養温度は約１０ないし４０℃で、２６ないし３０℃が
好ましい。培養時間は適切には約１ないし１４日で、２
ないし７日が好ましい。通常、培養において通気および
撹拌は好ましい結果をもたらす。ピルビン酸、Ｄ−グリ
セルアルデヒド、グリコールアルデヒド、グリシン、１
−デオキシ−Ｄ−スレオ−ペンチュロース、４−ヒドロ
キシ−Ｌ−スレオニンまたはそれらの適切な混合物を培
地に添加すれば、ビタミンＢ6 生産性に好ましい結果を
もたらす。添加物として１−デオキシ−Ｄ−スレオ−ペ
ンチュロースと４−ヒドロキシ−Ｌ−スレオニンの組み
合わせがビタミンＢ6 生産には特に効果的である。ま
た、ビタミンＢ6 は適当なｐＨ値を有する緩衝液中で培
養液から分離したリゾビウム属に属する微生物の菌体
を、ピルビン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド、グリコール
アルデヒド、グリシン、１−デオキシ−Ｄ−スレオ−ペ
ンチュロースおよび４−ヒドロキシ−Ｌ−スレオニンを
適切に組み合わせた培地で培養しても生産させることが
できる。
【０００９】培養後、培養液中に生産されたビタミンＢ
6 は培養液から分離され、精製される。発酵液から生成
物の分離に通常使用される方法を、ビタミンＢ6 の各種
の性質を利用して行ってもよい。このように、たとえば
菌体を発酵液から除去し、そのろ液中の所望の物質をイ
オン交換樹脂を用いる方法またはそれに類する方法で精
製する。溶出後、所望の生成物をアルコールから再結晶
化させる。
6 は培養液から分離され、精製される。発酵液から生成
物の分離に通常使用される方法を、ビタミンＢ6 の各種
の性質を利用して行ってもよい。このように、たとえば
菌体を発酵液から除去し、そのろ液中の所望の物質をイ
オン交換樹脂を用いる方法またはそれに類する方法で精
製する。溶出後、所望の生成物をアルコールから再結晶
化させる。
【００１０】本発明において使用される微生物は、リゾ
ビウム属に属しビタミンＢ6 生産能を有するすべての菌
株を含み、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）、農林水産省
農業生物資源研究所（ＭＡＦＦ）、東京大学応用微生物
研究所（ＩＡＭ）など請求によりだれでも入手できる公
的な菌株寄託機関で保管されているリゾビウム属に属す
るすべての菌株であってもよい；そのような寄託株の例
としては、たとえばRhizobium meliloti ＩＦＯ １４
７８２、Rhizobium meliloti ＭＡＦＦ ３０３０４
０、Rhizobium meliloti ＭＡＦＦ ３０３０４７、Rh
izobium melilotiＭＡＦＦ ３０３０９７、Rhizobium
tropici ＩＦＯ １５２４７、Rhizobium huakuii ＩＦ
Ｏ １５２４３、Rhizobium leguminosarum ＩＦＯ １
４７７８、Rhizobium galegae ＩＦＯ １４９６５、Rh
izobium fredii ＩＦＯ １４７８０、Rhizobium loti
ＩＦＯ １４９９８、Rhizobium sp. ＩＡＭ １３６
２３およびRhizobium sp. ＩＡＭ １３６３１が挙げら
れる。
ビウム属に属しビタミンＢ6 生産能を有するすべての菌
株を含み、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）、農林水産省
農業生物資源研究所（ＭＡＦＦ）、東京大学応用微生物
研究所（ＩＡＭ）など請求によりだれでも入手できる公
的な菌株寄託機関で保管されているリゾビウム属に属す
るすべての菌株であってもよい；そのような寄託株の例
としては、たとえばRhizobium meliloti ＩＦＯ １４
７８２、Rhizobium meliloti ＭＡＦＦ ３０３０４
０、Rhizobium meliloti ＭＡＦＦ ３０３０４７、Rh
izobium melilotiＭＡＦＦ ３０３０９７、Rhizobium
tropici ＩＦＯ １５２４７、Rhizobium huakuii ＩＦ
Ｏ １５２４３、Rhizobium leguminosarum ＩＦＯ １
４７７８、Rhizobium galegae ＩＦＯ １４９６５、Rh
izobium fredii ＩＦＯ １４７８０、Rhizobium loti
ＩＦＯ １４９９８、Rhizobium sp. ＩＡＭ １３６
２３およびRhizobium sp. ＩＡＭ １３６３１が挙げら
れる。
【００１１】リゾビウム属のこれらの株のなかで、特に
好ましい株はRhizobium melilotiＩＦＯ １４７８２お
よびRhizobium tropici ＩＦＯ １５２４７である。こ
れらの株、Rhizobium meliloti ＩＦＯ １４７８２お
よびRhizobium tropici ＩＦＯ １５２４７は、１９９
５年９月４日にドイツ、ゲッチンゲンにあるＤＳＭ（De
utsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur
en GmbH)に、ＤＳＭNo.１０２２６およびＤＳＭ No.１
０２２７としてそれぞれ寄託されている。
好ましい株はRhizobium melilotiＩＦＯ １４７８２お
よびRhizobium tropici ＩＦＯ １５２４７である。こ
れらの株、Rhizobium meliloti ＩＦＯ １４７８２お
よびRhizobium tropici ＩＦＯ １５２４７は、１９９
５年９月４日にドイツ、ゲッチンゲンにあるＤＳＭ（De
utsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur
en GmbH)に、ＤＳＭNo.１０２２６およびＤＳＭ No.１
０２２７としてそれぞれ寄託されている。
【００１２】
【実施例】以下、本発明についてさらに実施例を示して
詳細な説明を行うが、本発明は以下の実施例になんら限
定されない。
詳細な説明を行うが、本発明は以下の実施例になんら限
定されない。
【００１３】実施例１ ０. １％酵母エキス（Difco 社製）、０. ５％マンニト
ール、０. ０７％Ｋ2ＨＰＯ4 、０. ０１％ＫＨ2 ＰＯ4
、０. １％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏおよび１.５％寒天か
らなる寒天培地（pH７. ０）に生育したRhizobium meli
loti ＩＦＯ１４７８２（ＤＳＭ No.１０２２６）の一
白金耳の細胞を、１. ０％グルコース、０. ５％ポリペ
プトン（日本製薬社製）、０. ２％酵母エキス（Difco
社製）、０. １％ＫＨ2 ＰＯ4 、０. ０５％ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2 Ｏ、０. ００１％ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏおよび
０. ００１％ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏからなる５mlの種菌
培地を含有する試験管に植菌し、往復振とう機（２８５
rpm)にて２８℃で１７時間振とう培養を行った。その４
mlの種培養物を、４％グルコース、４％ポリペプトンＳ
（日本製薬社製）、０. ８％酵母エキス（Difco 社
製）、０. ０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０. ０５％Ｍ
ｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０. ００１％ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏおよび一滴の消泡剤ＣＡ−１１５（日本油脂社製）か
らなる培地２００mlを含有する２個の邪魔板付きの５０
０ml容フラスコに植菌し、２８℃で回転振とう培養（１
８０rpm)を行った。１６８時間培養後、培養液上清中の
ビタミンＢ6 の含有量を、以下に述べるSaccharomyces
carlsbergensis ＡＴＣＣ ９０８０を用いる濁度法に
より測定した。培養上清およびピリドキソールの標準溶
液（０−１００mg/l）を順次蒸留水で１. ７３１×１０
-4まで希釈した。２００μl の希釈液、１. ５mlの蒸留
水および４０μl の１. １５５N 硫酸の順に、試験管に
加えた。１２０℃、２０分間高圧滅菌後、Saccharomyce
s carlsbergensisＡＴＣＣ ９０８０を含有する１. ５
mlのビタミンＢ6 定量用培地（日水株式会社製）を試験
管に加え、３０°に傾斜させ２８℃で培養した。１７時
間培養後、菌体の増殖を５mlの０. ２N 塩酸を加えて停
止し、その後６６０nmで試料の吸光度を測定した。試料
中のビタミンＢ6 量は、試料の濁度をSaccharomyces ca
rlsbergensis ＡＴＣＣ ９０８０の標準生育曲線と比
較して算出した。その結果、１６８時間の培養液の上清
には８４mg/lのビタミンＢ6 が含まれていた。さらに、
内部標準物質として１００μl の４′−デオキシ−ピリ
ドキソール（１００mg/l）を１６８時間の培養液の上清
４００μl に加え、その混合液をWaters６００Ｅ型シス
テムコントローラー、Waters６００Ｆ型ポンプ、Waters
９９１Ｊ型フォトダイオードアレイディテクター、Wate
rs７００型サテライトＷＩＳＰサンプルインジェクター
およびWaters５２００型プリンターから構成されたＨＰ
ＬＣシステムを用いて０. １M の過塩素酸ナトリウム、
０. １M のリン酸カリウムおよび２％アセトニトリル
（pH３. ５）の混合溶媒を流速１. ０ml／分、波長＝２
９２nmで、Capcell pak Ｃ18ＳＧ１２０カラム（４. ６
×２５０mm、資生堂株式会社製）で分析した。その結
果、その上清には、７８. ６mg/lのピリドキソールが含
まれていた。
ール、０. ０７％Ｋ2ＨＰＯ4 、０. ０１％ＫＨ2 ＰＯ4
、０. １％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏおよび１.５％寒天か
らなる寒天培地（pH７. ０）に生育したRhizobium meli
loti ＩＦＯ１４７８２（ＤＳＭ No.１０２２６）の一
白金耳の細胞を、１. ０％グルコース、０. ５％ポリペ
プトン（日本製薬社製）、０. ２％酵母エキス（Difco
社製）、０. １％ＫＨ2 ＰＯ4 、０. ０５％ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2 Ｏ、０. ００１％ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏおよび
０. ００１％ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏからなる５mlの種菌
培地を含有する試験管に植菌し、往復振とう機（２８５
rpm)にて２８℃で１７時間振とう培養を行った。その４
mlの種培養物を、４％グルコース、４％ポリペプトンＳ
（日本製薬社製）、０. ８％酵母エキス（Difco 社
製）、０. ０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０. ０５％Ｍ
ｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０. ００１％ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏおよび一滴の消泡剤ＣＡ−１１５（日本油脂社製）か
らなる培地２００mlを含有する２個の邪魔板付きの５０
０ml容フラスコに植菌し、２８℃で回転振とう培養（１
８０rpm)を行った。１６８時間培養後、培養液上清中の
ビタミンＢ6 の含有量を、以下に述べるSaccharomyces
carlsbergensis ＡＴＣＣ ９０８０を用いる濁度法に
より測定した。培養上清およびピリドキソールの標準溶
液（０−１００mg/l）を順次蒸留水で１. ７３１×１０
-4まで希釈した。２００μl の希釈液、１. ５mlの蒸留
水および４０μl の１. １５５N 硫酸の順に、試験管に
加えた。１２０℃、２０分間高圧滅菌後、Saccharomyce
s carlsbergensisＡＴＣＣ ９０８０を含有する１. ５
mlのビタミンＢ6 定量用培地（日水株式会社製）を試験
管に加え、３０°に傾斜させ２８℃で培養した。１７時
間培養後、菌体の増殖を５mlの０. ２N 塩酸を加えて停
止し、その後６６０nmで試料の吸光度を測定した。試料
中のビタミンＢ6 量は、試料の濁度をSaccharomyces ca
rlsbergensis ＡＴＣＣ ９０８０の標準生育曲線と比
較して算出した。その結果、１６８時間の培養液の上清
には８４mg/lのビタミンＢ6 が含まれていた。さらに、
内部標準物質として１００μl の４′−デオキシ−ピリ
ドキソール（１００mg/l）を１６８時間の培養液の上清
４００μl に加え、その混合液をWaters６００Ｅ型シス
テムコントローラー、Waters６００Ｆ型ポンプ、Waters
９９１Ｊ型フォトダイオードアレイディテクター、Wate
rs７００型サテライトＷＩＳＰサンプルインジェクター
およびWaters５２００型プリンターから構成されたＨＰ
ＬＣシステムを用いて０. １M の過塩素酸ナトリウム、
０. １M のリン酸カリウムおよび２％アセトニトリル
（pH３. ５）の混合溶媒を流速１. ０ml／分、波長＝２
９２nmで、Capcell pak Ｃ18ＳＧ１２０カラム（４. ６
×２５０mm、資生堂株式会社製）で分析した。その結
果、その上清には、７８. ６mg/lのピリドキソールが含
まれていた。
【００１４】実施例２ 実施例１で述べたと同様の方法で、Rhizobium meliloti
ＭＡＦＦ ３０３０４０、Rhizobium meliloti ＭＡ
ＦＦ ３０３０４７、Rhizobium meliloti ＭＡＦＦ
３０３０９７、Rhizobium huakuii ＩＦＯ １５２４
３、Rhizobium leguminosarum ＩＦＯ １４７７８、Rh
izobium tropici ＩＦＯ １５２４７（ＤＳＭ No.１０
２２７）、Rhizobium galegae ＩＦＯ １４９６５、Rh
izobium fredii ＩＦＯ １４７８０、Rhizobium loti
ＩＦＯ １４９９８、Rhizobiumsp. ＩＡＭ １３６
２３およびRhizobium sp. ＩＡＭ １３６３１を培養し
た。それぞれ１６８時間培養した後、培養液の上清中の
ビタミンＢ6 の含有量をSaccharomyces carlsbergensis
ＡＴＣＣ ９０８０を用いた濁度法によって測定し
た。結果を表１に示す。
ＭＡＦＦ ３０３０４０、Rhizobium meliloti ＭＡ
ＦＦ ３０３０４７、Rhizobium meliloti ＭＡＦＦ
３０３０９７、Rhizobium huakuii ＩＦＯ １５２４
３、Rhizobium leguminosarum ＩＦＯ １４７７８、Rh
izobium tropici ＩＦＯ １５２４７（ＤＳＭ No.１０
２２７）、Rhizobium galegae ＩＦＯ １４９６５、Rh
izobium fredii ＩＦＯ １４７８０、Rhizobium loti
ＩＦＯ １４９９８、Rhizobiumsp. ＩＡＭ １３６
２３およびRhizobium sp. ＩＡＭ １３６３１を培養し
た。それぞれ１６８時間培養した後、培養液の上清中の
ビタミンＢ6 の含有量をSaccharomyces carlsbergensis
ＡＴＣＣ ９０８０を用いた濁度法によって測定し
た。結果を表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】実施例３ 実施例１で述べたと同様の培養条件で調製されたRhizob
ium meliloti ＩＦＯ１４７８２（ＤＳＭ No.１０２２
６）の培養液からビタミンＢ6 を得た。それぞれの精製
段階におけるビタミンＢ6 の濃度をSaccharomyces carl
sbergensisＡＴＣＣ ９０８０を用いた濁度法により追
跡した。１リットルの１６８時間目の培養液を８, ００
０rpm で１０分間遠心分離を行った。その結果得られる
上清のｐＨを１N 塩酸で３. １に調整し、その上清を３
５０mlのアンバーライトＣＧ１２０（Ｈ+ 型、１００−
２００メッシュ、オルガノ社製）を充填したカラム
（３. ６×４０cm）に通した。そのカラムを３００mlの
脱イオン水で洗浄し、その後５％の水酸化アンモニウム
で溶出した。ビタミンＢ6 画分を減圧下で濃縮した。そ
の結果得られた残渣を、１０mlの０. ０１M ギ酸アンモ
ニウム（pH３. ２）に溶解し、その溶液を１８０mlのDo
wex ５０Ｗｘ８（アンモニウム型、２００−４００メッ
シュ、米国ダウケミカル社製）を充填したカラム（２.
４×４０cm）に通し、２００mlの０. ０１M ギ酸アンモ
ニウム（pH３. ２）で洗浄した。その後カラムを２００
mlの０. ０５M ギ酸アンモニウム（pH４. ２５）を初発
の緩衝液として展開し、つづいてそれぞれ０. ０５M ギ
酸アンモニウムと０. ５M ギ酸アンモニウム緩衝液（pH
７. ０）の２００mlでの直線的濃度勾配により溶出を行
った。そのクロマトグラムはSaccharomyces carlsberge
nsis ＡＴＣＣ ９０８０に対し生育活性を示す１つの
大きなピークと２つの小さいピークを有していた。大き
なピークの画分を減圧下、少量まで濃縮し、溶液のｐＨ
を１N 塩酸で３.１に調整し、７５mlのアンバーライト
ＣＧ１２０（Ｈ+ 型、１００−２００メッシュ）で充填
したカラム（１. ８×４０cm）に通した。そのカラムを
１５０mlの脱イオン水で洗浄し、５％水酸化アンモニウ
ムで溶出した。Saccharomyces carlsbergensis ＡＴＣ
Ｃ ９０８０に対して生育活性を有する画分を減圧下で
濃縮した。固形物を少量の熱エタノールに溶解した後、
４℃で一晩放置した。生じた沈殿物をろ過により得、真
空で乾燥し、５１mgの粗結晶を得た。さらにその粗結晶
をエタノールから再結晶化を行い、１６０℃の融点を有
する、白色結晶４４mgを得た。この物質の赤外吸収、紫
外吸収およびＮＭＲスペクトルはピリドキソール標品の
スペクトルと一致した。一方、Saccharomyces carlsber
gensis ＡＴＣＣ ９０８０に対して生育活性を有する
２つの小さなピークは実施例１で述べた分析条件下でＨ
ＰＬＣ分析を行い、それぞれピリドキサミンおよびピリ
ドキサールと同定した。
ium meliloti ＩＦＯ１４７８２（ＤＳＭ No.１０２２
６）の培養液からビタミンＢ6 を得た。それぞれの精製
段階におけるビタミンＢ6 の濃度をSaccharomyces carl
sbergensisＡＴＣＣ ９０８０を用いた濁度法により追
跡した。１リットルの１６８時間目の培養液を８, ００
０rpm で１０分間遠心分離を行った。その結果得られる
上清のｐＨを１N 塩酸で３. １に調整し、その上清を３
５０mlのアンバーライトＣＧ１２０（Ｈ+ 型、１００−
２００メッシュ、オルガノ社製）を充填したカラム
（３. ６×４０cm）に通した。そのカラムを３００mlの
脱イオン水で洗浄し、その後５％の水酸化アンモニウム
で溶出した。ビタミンＢ6 画分を減圧下で濃縮した。そ
の結果得られた残渣を、１０mlの０. ０１M ギ酸アンモ
ニウム（pH３. ２）に溶解し、その溶液を１８０mlのDo
wex ５０Ｗｘ８（アンモニウム型、２００−４００メッ
シュ、米国ダウケミカル社製）を充填したカラム（２.
４×４０cm）に通し、２００mlの０. ０１M ギ酸アンモ
ニウム（pH３. ２）で洗浄した。その後カラムを２００
mlの０. ０５M ギ酸アンモニウム（pH４. ２５）を初発
の緩衝液として展開し、つづいてそれぞれ０. ０５M ギ
酸アンモニウムと０. ５M ギ酸アンモニウム緩衝液（pH
７. ０）の２００mlでの直線的濃度勾配により溶出を行
った。そのクロマトグラムはSaccharomyces carlsberge
nsis ＡＴＣＣ ９０８０に対し生育活性を示す１つの
大きなピークと２つの小さいピークを有していた。大き
なピークの画分を減圧下、少量まで濃縮し、溶液のｐＨ
を１N 塩酸で３.１に調整し、７５mlのアンバーライト
ＣＧ１２０（Ｈ+ 型、１００−２００メッシュ）で充填
したカラム（１. ８×４０cm）に通した。そのカラムを
１５０mlの脱イオン水で洗浄し、５％水酸化アンモニウ
ムで溶出した。Saccharomyces carlsbergensis ＡＴＣ
Ｃ ９０８０に対して生育活性を有する画分を減圧下で
濃縮した。固形物を少量の熱エタノールに溶解した後、
４℃で一晩放置した。生じた沈殿物をろ過により得、真
空で乾燥し、５１mgの粗結晶を得た。さらにその粗結晶
をエタノールから再結晶化を行い、１６０℃の融点を有
する、白色結晶４４mgを得た。この物質の赤外吸収、紫
外吸収およびＮＭＲスペクトルはピリドキソール標品の
スペクトルと一致した。一方、Saccharomyces carlsber
gensis ＡＴＣＣ ９０８０に対して生育活性を有する
２つの小さなピークは実施例１で述べた分析条件下でＨ
ＰＬＣ分析を行い、それぞれピリドキサミンおよびピリ
ドキサールと同定した。
【００１７】実施例４ 実施例１で述べたと同様の培養条件で、Rhizobium trop
ici ＩＦＯ １５２４７（ＤＳＭ No.１０２２７）の種
培養物を調製した。その種培養物４mlを、２％グルコー
ス、１％ポリペプトン、０. ２％酵母エキス、０. ０５
％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０. ０５％ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ
2 Ｏ、０. ００１％ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ、および一滴
の消泡剤ＣＡ−１１５からなる２００mlの培地を含有す
る２本の５００ml容フラスコに植菌した。さらに、１％
１−デオキシ−Ｄ−スレオ−ペンチュロース( 以下、Ｄ
ＴＰと略記する）と１％４−ヒドロキシ−Ｌ−スレオニ
ン( 以下、ＨＴと略記する）を含有する４mlの滅菌溶液
を一本のフラスコに加え、他方には滅菌水４mlを加え
た。２本のフラスコを２８℃で回転式振とう機（１８０
rpm)を用いて振とうした。９６時間２８℃で培養後、培
養液上清中のビタミンＢ6 の含有量を、実施例１で述べ
たようにSaccharomyces carlsbergensis ＡＴＣＣ ９
０８０を用いる濁度法によって定量した。表２にまとめ
たように、ＤＴＰおよびＨＴを加えていない培地を含有
するフラスコ中では３. １６mg/lのビタミンＢ6 が生産
されたのに対し、ＤＴＰおよびＨＴを加えた培地を含有
するフラスコ中では４５mg/lのビタミンＢ6 が生産され
た。さらに、それぞれ０. ０２％のＤＴＰおよびＨＴを
加えた培地で９６時間培養した１リットルの培養液か
ら、実施例３で述べたと同様の方法で生成物を単離し、
融点１５９. ５℃を有する１９．３mgの白色結晶を得
た。その物質の赤外吸収、紫外吸収およびＮＭＲスペク
トルはピリドキソール標品のスペクトルと一致した。
ici ＩＦＯ １５２４７（ＤＳＭ No.１０２２７）の種
培養物を調製した。その種培養物４mlを、２％グルコー
ス、１％ポリペプトン、０. ２％酵母エキス、０. ０５
％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０. ０５％ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ
2 Ｏ、０. ００１％ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ、および一滴
の消泡剤ＣＡ−１１５からなる２００mlの培地を含有す
る２本の５００ml容フラスコに植菌した。さらに、１％
１−デオキシ−Ｄ−スレオ−ペンチュロース( 以下、Ｄ
ＴＰと略記する）と１％４−ヒドロキシ−Ｌ−スレオニ
ン( 以下、ＨＴと略記する）を含有する４mlの滅菌溶液
を一本のフラスコに加え、他方には滅菌水４mlを加え
た。２本のフラスコを２８℃で回転式振とう機（１８０
rpm)を用いて振とうした。９６時間２８℃で培養後、培
養液上清中のビタミンＢ6 の含有量を、実施例１で述べ
たようにSaccharomyces carlsbergensis ＡＴＣＣ ９
０８０を用いる濁度法によって定量した。表２にまとめ
たように、ＤＴＰおよびＨＴを加えていない培地を含有
するフラスコ中では３. １６mg/lのビタミンＢ6 が生産
されたのに対し、ＤＴＰおよびＨＴを加えた培地を含有
するフラスコ中では４５mg/lのビタミンＢ6 が生産され
た。さらに、それぞれ０. ０２％のＤＴＰおよびＨＴを
加えた培地で９６時間培養した１リットルの培養液か
ら、実施例３で述べたと同様の方法で生成物を単離し、
融点１５９. ５℃を有する１９．３mgの白色結晶を得
た。その物質の赤外吸収、紫外吸収およびＮＭＲスペク
トルはピリドキソール標品のスペクトルと一致した。
【００１８】
【表２】
【００１９】実施例５ Rhizobium meliloti ＩＦＯ １４７８２（ＤＳＭ No.
１０２２６）を実施例１で述べたと同様の培養条件で培
養した。２８℃で７２時間培養後、８, ０００rpm で１
０分間遠心分離により菌体を得て、１００mlの滅菌０.
８５％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄し、８８mlの滅菌
蒸留水に懸濁した。０. ０２％ＤＴＰ、０. ２４％グリ
コールアルデヒド、０. ２４％グリシンおよび菌体の懸
濁液（６００nmでの最終吸光度＝２０／ml）からなる１
０mlの０. １M トリス−塩酸緩衝液（pH８. ０）を含有
する試験管中で、２８℃で往復振とう機（２８５rpm)を
用いてビタミンＢ6 の生産を行った。２８℃で２４時間
振とう後、反応液の上清中のビタミンＢ6 を、実施例１
で述べたと同様の分析条件でＨＰＬＣにより定量した。
表３にまとめたように、９. ６６mg/lのピリドキソール
が、ＤＴＰ、グリコールアルデヒドおよびグリシンから
なる基質から生産された。
１０２２６）を実施例１で述べたと同様の培養条件で培
養した。２８℃で７２時間培養後、８, ０００rpm で１
０分間遠心分離により菌体を得て、１００mlの滅菌０.
８５％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄し、８８mlの滅菌
蒸留水に懸濁した。０. ０２％ＤＴＰ、０. ２４％グリ
コールアルデヒド、０. ２４％グリシンおよび菌体の懸
濁液（６００nmでの最終吸光度＝２０／ml）からなる１
０mlの０. １M トリス−塩酸緩衝液（pH８. ０）を含有
する試験管中で、２８℃で往復振とう機（２８５rpm)を
用いてビタミンＢ6 の生産を行った。２８℃で２４時間
振とう後、反応液の上清中のビタミンＢ6 を、実施例１
で述べたと同様の分析条件でＨＰＬＣにより定量した。
表３にまとめたように、９. ６６mg/lのピリドキソール
が、ＤＴＰ、グリコールアルデヒドおよびグリシンから
なる基質から生産された。
【００２０】
【表３】
【００２１】実施例６ Rhizobium meliloti ＩＦＯ １４７８２（ＤＳＭ No.
１０２２６）の洗浄菌体の懸濁液を実施例５で述べたと
同様の方法で調製した。０. ２４％ピルビン酸、０. ２
４％Ｄ−グリセルアルデヒド、０. ０２％ＨＴおよび洗
浄菌体の懸濁液（６００nmでの最終吸光度＝２０／ml）
からなる１０mlの０. １M トリス−塩酸緩衝液（pH７．
６）を含有する試験管中で、２８℃で往復振とう機（２
８５rpm)を用いてビタミンＢ6 の生産を行った。２８℃
で２４時間振とう後、反応液の上清中のビタミンＢ6
を、実施例１で述べたと同様の分析条件でＨＰＬＣによ
り定量した。表４にまとめたように、１０. １mg/lのピ
リドキソールが、ピルビン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド
およびＨＴからなる基質から生産された。
１０２２６）の洗浄菌体の懸濁液を実施例５で述べたと
同様の方法で調製した。０. ２４％ピルビン酸、０. ２
４％Ｄ−グリセルアルデヒド、０. ０２％ＨＴおよび洗
浄菌体の懸濁液（６００nmでの最終吸光度＝２０／ml）
からなる１０mlの０. １M トリス−塩酸緩衝液（pH７．
６）を含有する試験管中で、２８℃で往復振とう機（２
８５rpm)を用いてビタミンＢ6 の生産を行った。２８℃
で２４時間振とう後、反応液の上清中のビタミンＢ6
を、実施例１で述べたと同様の分析条件でＨＰＬＣによ
り定量した。表４にまとめたように、１０. １mg/lのピ
リドキソールが、ピルビン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド
およびＨＴからなる基質から生産された。
【００２２】
【表４】
【００２３】実施例７ Rhizobium meliloti ＩＦＯ １４７８２（ＤＳＭ No.
１０２２６）の洗浄菌体の懸濁液を実施例５で述べたと
同様の方法で調製した。０. ２４％ピルビン酸、０. ２
４％Ｄ−グリセルアルデヒド、０. ２４％グリコールア
ルデヒド、０.２４％グリシンおよび洗浄菌体の懸濁液
（６００nmでの最終吸光度＝２０／ml）からなる１０ml
の０. １M トリス−塩酸緩衝液（pH８. ０）を含有する
試験管中で、２８℃で往復振とう機（２８５rpm)を用い
てビタミンＢ6 の生産を行った。２８℃で２４時間振と
う後、反応液の上清中のビタミンＢ6 を、実施例１で述
べたと同様の分析条件でＨＰＬＣにより定量した。表５
にまとめたように、９. ６６mg/lのピリドキソールが、
ピルビン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド、グリコールアル
デヒドおよびグリシンからなる基質から生産された。
１０２２６）の洗浄菌体の懸濁液を実施例５で述べたと
同様の方法で調製した。０. ２４％ピルビン酸、０. ２
４％Ｄ−グリセルアルデヒド、０. ２４％グリコールア
ルデヒド、０.２４％グリシンおよび洗浄菌体の懸濁液
（６００nmでの最終吸光度＝２０／ml）からなる１０ml
の０. １M トリス−塩酸緩衝液（pH８. ０）を含有する
試験管中で、２８℃で往復振とう機（２８５rpm)を用い
てビタミンＢ6 の生産を行った。２８℃で２４時間振と
う後、反応液の上清中のビタミンＢ6 を、実施例１で述
べたと同様の分析条件でＨＰＬＣにより定量した。表５
にまとめたように、９. ６６mg/lのピリドキソールが、
ピルビン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド、グリコールアル
デヒドおよびグリシンからなる基質から生産された。
【００２４】
【表５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田副 正明 神奈川県横浜市磯子区洋光台５−14−22
Claims (1)
- 【請求項１】 リゾビウム属に属しビタミンＢ6 生産能
を有する微生物を、好気的条件下、培地中で培養し、生
成したビタミンＢ6 を培養液から得るビタミンＢ6 の製
造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH95115488.9 | 1995-09-30 | ||
| EP95115488 | 1995-09-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09107985A true JPH09107985A (ja) | 1997-04-28 |
Family
ID=8219678
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8253178A Pending JPH09107985A (ja) | 1995-09-30 | 1996-09-25 | ビタミンｂ６の製造法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5766894A (ja) |
| EP (1) | EP0765938B1 (ja) |
| JP (1) | JPH09107985A (ja) |
| CN (1) | CN1111605C (ja) |
| AT (1) | ATE220107T1 (ja) |
| DE (1) | DE69622114T2 (ja) |
| DK (1) | DK0765938T3 (ja) |
| ES (1) | ES2179141T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018207931A1 (ja) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | 三井化学株式会社 | 組換え微生物、組換え微生物を用いたピリドキサミン又はその塩の製造方法、及び組換え微生物を用いたピリドキサール又はその塩の製造方法 |
| WO2018207930A1 (ja) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | 三井化学株式会社 | 組換え微生物及び該組換え微生物を用いたピリドキサミン又はその塩の製造方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ID22473A (id) * | 1998-04-15 | 1999-10-21 | Hoffmann La Roche | Produksi enzimatik vitamin b6 |
| EP0950715A3 (en) * | 1998-04-15 | 2001-07-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Enzymatic production of vitamin B6 |
| US6320187B1 (en) * | 1999-12-07 | 2001-11-20 | Nikon Corporation | Magnification and rotation calibration patterns for particle beam projection system |
| CA2449378A1 (en) * | 2001-06-20 | 2003-01-03 | Roche Vitamins Ag | Vitamin b6-phosphate phosphatase |
| WO2004029250A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Dsm Ip Assets B.V. | Dna encoding flavin-adenine-dinucleotide-dependent-d-erythronate-4-phosphate-dehydrogenase, pdxr, and microbial production of vitamin b6 |
| AU2003267370A1 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-19 | Dsm Ip Assets B.V. | Microorganism and process for preparing vitamin b6 |
| ATE335088T1 (de) * | 2002-09-27 | 2006-08-15 | Dsm Ip Assets Bv | Verfahren zur herstellung von vitamin-b6 |
| DE10247036A1 (de) * | 2002-10-09 | 2004-04-22 | Basf Ag | Vitamin B6 und/oder deren Salze enthaltende Futtermitteladditive und Verfahren zu deren Herstellung |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU629204A1 (ru) * | 1977-02-21 | 1978-10-25 | Украинский научно-исследовательский институт земледелия | Штамм клубеньковых бактерий люцерны 441-активный симбиотический азотфиксатор |
| EP0647717A1 (en) * | 1993-10-06 | 1995-04-12 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method of producing vitamin B12 |
-
1996
- 1996-09-06 US US08/709,068 patent/US5766894A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-24 CN CN96112974A patent/CN1111605C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-25 EP EP96115336A patent/EP0765938B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-25 JP JP8253178A patent/JPH09107985A/ja active Pending
- 1996-09-25 AT AT96115336T patent/ATE220107T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-09-25 DE DE69622114T patent/DE69622114T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-25 ES ES96115336T patent/ES2179141T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-25 DK DK96115336T patent/DK0765938T3/da active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018207931A1 (ja) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | 三井化学株式会社 | 組換え微生物、組換え微生物を用いたピリドキサミン又はその塩の製造方法、及び組換え微生物を用いたピリドキサール又はその塩の製造方法 |
| WO2018207930A1 (ja) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | 三井化学株式会社 | 組換え微生物及び該組換え微生物を用いたピリドキサミン又はその塩の製造方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2179141T3 (es) | 2003-01-16 |
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| EP0765938A2 (en) | 1997-04-02 |
| DK0765938T3 (da) | 2002-10-28 |
| US5766894A (en) | 1998-06-16 |
| EP0765938A3 (en) | 1998-04-29 |
| CN1153823A (zh) | 1997-07-09 |
| CN1111605C (zh) | 2003-06-18 |
| DE69622114D1 (de) | 2002-08-08 |
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| ATE220107T1 (de) | 2002-07-15 |
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