JPH0854340A - ２光子励起顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高速走査が可能で、光の利用効率の良い２光
子励起顕微鏡を実現する。 【構成】 試料に対して単光子励起の場合の励起光の２
倍の波長を持つ光子を同時に２光子照射して試料からの
蛍光を観測する２光子励起顕微鏡において、２光子励起
が可能なレーザと、このレーザの出力光が入射され、複
数のマイクロレンズを有する回転板と、複数のマイクロ
レンズからの出力光を透過若しくは反射させ、試料で生
じる蛍光を分離するダイクロイックミラーと、このダイ
クロイックミラーからの透過光若しくは反射光を前記試
料に集光させる対物レンズと、ダイクロイックミラーか
らの光が入射される撮像装置若しくは接眼装置とを設け
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、２光子励起顕微鏡に関
し、特に光の利用効率が良く、高速走査が可能な２光子
励起顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】２光子励起法とは「レーザ顕微鏡研究会
第１２回講演会論文集」２８頁〜３５頁の「２光子励起
蛍光顕微鏡法による細胞内カルシウム濃度の３次元計
測」に記載されているように、試料に対して単光子励起
の励起光の２倍の波長を持つ光子を同時に２光子照射す
ることにより、前記試料から蛍光分子を励起する方法で
ある。

【０００３】このような２光子励起は単位体積当たり大
量の光子を必要とするため対物レンズの焦点位置でしか
生じない。言い換えれば、共焦点ピンホールを用いるこ
となく共焦点顕微鏡と同様に試料の断面積を得ることが
できる。

【０００４】図２はこのような従来の２光子励起顕微鏡
の一例を示す構成ブロック図である。図２において１は
パルスレーザ等の２光子励起が可能なレーザ、２はダイ
クロイックミラー、３及び４は走査ミラー、５は対物レ
ンズ、６は試料、７は光電子増倍管等の光検出器であ
る。

【０００５】レーザ１の出力光はダイクロイックミラー
２に入射され、ダイクロイックミラー２からの反射光は
走査ミラー３、走査ミラー４及び対物レンズ５を介して
試料６に入射される。

【０００６】試料６で生じた蛍光は対物レンズ５、走査
ミラー４及び走査ミラー３を介してダイクロイックミラ
ー２に入射され、試料６からの蛍光はダイクロイックミ
ラー２を透過して光検出器７に入射される。

【０００７】ここで、図２に示す従来例の動作を説明す
る。走査ミラー３及び４を機械的に動かすことにより、
レーザ１の出力光は試料６上を走査する。この時、前述
の２光子励起により試料６では蛍光が生じる。

【０００８】試料６で生じた蛍光は対物レンズ５、走査
ミラー４及び走査ミラー３を介してダイクロイックミラ
ー２に入射されるが、蛍光の波長はレーザ１の出力光の
波長と異なるためダイクロイックミラー２を透過して光
検出器７で検出される。また、前述のように２光子励起
は対物レンズの焦点位置でしか生じないため、ピンホー
ルを用いることなく共焦点効果を得ることができる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかし、図２に示す従
来例では走査方法として走査ミラー３及び４を用いてい
るため高速走査は困難である。また、構造上、試料６上
を１点の走査光によって走査するため試料６から戻って
くる蛍光の光強度が弱いと言った問題点もある。従って
本発明の目的は、高速走査が可能で、光の利用効率の良
い２光子励起顕微鏡を実現することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るために、本発明では、試料に対して単光子励起の場合
の励起光の２倍の波長を持つ光子を同時に２光子照射し
て前記試料からの蛍光を観測する２光子励起顕微鏡にお
いて、２光子励起が可能なレーザと、このレーザの出力
光が入射され、複数のマイクロレンズを有する回転板
と、前記複数のマイクロレンズからの出力光を透過若し
くは反射させ、前記試料で生じる蛍光を分離するダイク
ロイックミラーと、このダイクロイックミラーからの透
過光若しくは反射光を前記試料に集光させる対物レンズ
と、前記ダイクロイックミラーからの光が入射される撮
像装置若しくは接眼装置とを特徴とするものである。

【００１１】

【作用】複数のマイクロレンズを設けた回転板を回転さ
せて試料上を走査することにより、高速走査が可能にな
り、光の利用効率も良くなる。

【００１２】

【実施例】以下本発明を図面を用いて詳細に説明する。
図１は本発明に係る２光子励起顕微鏡の一実施例を示す
構成ブロック図である。図１において１ａは２光子励起
が可能なレーザ、２ａはダイクロイックミラー、５ａは
対物レンズ、６ａは試料、８は複数のマイクロレンズを
有する回転板、９はレンズ、１０はＣＣＤカメラ等の撮
像装置である。

【００１３】回転板８に設けられているマイクロレンズ
は、例えば、本願出願人の出願に係る特願平３−２８６
１１２号に記載したように配列されているものである。

【００１４】レーザ１ａの出力光は回転板８に入射さ
れ、回転板８上に設けられたマイクロレンズ（以下、単
にマイクロレンズと呼ぶ。）を透過した光はダイクロイ
ックミラー２ａ及び対物レンズ５ａを介して試料６ａに
入射される。

【００１５】試料６ａで生じた蛍光は対物レンズ５ａを
介してダイクロイックミラー２ａに入射され、ダイクロ
イックミラー２ａで反射された試料６ａからの蛍光はレ
ンズ９を介して撮像装置１０に入射される。

【００１６】ここで、図１に示す実施例の動作を説明す
る。また、前記マイクロレンズは回転板８上に複数個設
けられているが、説明を簡単にするため図１中”イ”に
示すマイクロレンズについてのみ説明する。

【００１７】図１中”イ”に示すマイクロレンズは対物
レンズ５ａの後側焦点である図１中”ロ”の点にレーザ
１ａの出力光を集光させるような位置関係で設けられて
いる。即ち、図１中”ロ”の点にマイクロレンズの焦点
を一致させるようにマイクロレンズを設ける。

【００１８】また、対物レンズ５ａの他方の焦点は試料
６ａ上にあり、回転板８を回転させることにより試料６
ａ上を高速で走査することができる。

【００１９】前述のように２光子励起は対物レンズ５ａ
の焦点位置でのみ生じ、発生した蛍光はダイクロイック
ミラー２ａにおいて分離され撮像装置１０に入射されて
観測される。

【００２０】この結果、マイクロレンズを設けた回転板
８を回転させて試料６ａ上を走査することにより、走査
ミラー３及び４で走査する場合と比較して高速走査をす
ることが可能となる。

【００２１】また、回転板８には複数のマイクロレンズ
が設けられており、それぞれのマイクロレンズにより走
査された蛍光が同時に撮像装置１０に入射されることに
なるので、試料６ａから戻ってくる蛍光の光強度が従来
例と比較して強くなり光の利用効率が向上する。

【００２２】なお、光の利用効率が向上することによ
り、撮像装置１０の代わりに接眼装置を用いて直接肉眼
で観測することも可能である。

【００２３】

【発明の効果】以上説明したことから明らかなように、
本発明によれば次のような効果がある。複数のマイクロ
レンズを設けた回転板を回転させて試料上を走査するこ
とにより、高速走査が可能で、光の利用効率の良い２光
子励起顕微鏡を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る２光子励起顕微鏡の一実施例を示
す構成ブロック図である。

【図２】従来の２光子励起顕微鏡の一例を示す構成ブロ
ック図である。

【符号の説明】

１，１ａ レーザ ２，２ａ ダイクロイックミラー ３，４ 走査ミラー ５，５ａ 対物レンズ ６，６ａ 試料 ７ 光検出器 ８ 回転板 ９ レンズ １０ 撮像装置

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料に対して単光子励起の場合の励起光の
   ２倍の波長を持つ光子を同時に２光子照射して前記試料
   からの蛍光を観測する２光子励起顕微鏡において、 ２光子励起が可能なレーザと、 このレーザの出力光が入射され、複数のマイクロレンズ
   を有する回転板と、 前記複数のマイクロレンズからの出力光を透過若しくは
   反射させ、前記試料で生じる蛍光を分離するダイクロイ
   ックミラーと、 このダイクロイックミラーからの透過光若しくは反射光
   を前記試料に集光させる対物レンズと、 前記ダイクロイックミラーからの光が入射される撮像装
   置若しくは接眼装置とを備えたことを特徴とする２光子
   励起顕微鏡。