JPH08502891A - 植物脂肪酸シンターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明によれば、β−ケトアシル−ACPシンターゼ（この後、“シンターゼ”として言及される）に関連する組成物及びその使用方法が提供される。生物学的活性植物シンターゼ因子に関連するアミノ酸及び核酸配列の方法及び組成物も興味の対象である。シンターゼタンパク質因子についてのアミノ酸及び核酸、並びに変更された脂肪酸組成物を有する遺伝的に構築された植物の産生のために構成体へのそのような配列の使用方法が提供される。さらに、植物遺伝子構築方法における非植物シンターゼタンパク質の使用がまた、考慮される。

Description

【発明の詳細な説明】 植物脂肪酸シンターゼ 発明の分野 本発明は、脂肪酸合成に関係するシンターゼ酵素、それに関連するアミノ酸及 び核酸配列、及びかかる組成物を植物中で用いる方法に向けられている。 序 背景 植物油は、さまざまな工業的及び食用の用途で使用される。生合成又は天然の 植物を供給源とする新規な植物油組成物及び／又は改良された油組成物獲得方法 が必要とされている。意図されている油の用途に応じて、異なるさまざまな脂肪 酸組成物が望まれる。 例えば、いくつかの例においては、より高い油対種子粗びき粉比をもつ油料種 子を有することが、より低コストで望ましい油を得るのに有用である。このこと は、高価値油製品に典型的なことである。いくつかの例においては、さらに低い 油対種子粗びき粉比をもつ油料種子を有することがカロリー含有量を低下させる のに有用であるだろう。その他の用途では、心血管の健康上の理由で、比較的高 い百分率の未飽和脂肪酸を伴う食用植物油が望まれる。又代替的には、ヤシ及び ココナツといった高飽和熱帯油に対する穏やかな代用品も、さまざまな工業及び 食品利用分野において用途がある。 かかる油及び／又は修正脂肪酸組成物を得るのに必要とされる１つの手段は、 植物の遺伝子工学を通してのものである。しかしながら植物を遺伝子工学処理す るためには、安定した譲り伝えることの できる形で植物に遣伝子材料を移送するための手段がその場になくてはならない 。その上、望まれる表現型上の結果を生み出すことのできる核酸配列、かかる配 列の適正な利用を導くことのできる調節領域などもなくてはならない。さらに、 望ましい表現型を産生するためには、植物の脂肪酸シンターゼ（FAS）経路が、 反応物の比率が加減されるか又は変更されるまで修正されることが必要である、 ということにも留意すべきである。 より高等な植物は、共通の代謝経路を介して脂肪酸を合成すると思われる。ト リグリセリドに付着された脂肪酸がさらなる発芽のためのエネルギー源として貯 蔵される発育中の種子においては、FAS経路は、原色素体の中にある。第１段階 は、酵素アセチル−CoA：ACPトランスアシラーゼ（ATA）を触媒とした、アセチ （ル？）−CoA及びACPからのアセチル−ACP（アシル担体タンパク質）の形成で ある。16及び18炭素脂肪酸へのアセチル−ACPの伸長には、以下の反応シーケン スの周期的作用が関与する：すなわち、マロニル−ACPから２炭素単位を用いて 縮合させてβ−ケトアシル−ACPを形成させる段階（β−ケトアシル−ACPシンタ ーゼ）、アルコールへとケト官能基を還元する段階（β−ケトアシル−ACPレダ クターゼ）、脱水してエノイル−ACPを形成する段階（β−ヒドロキシアシル−A CPデヒドラーゼ）、そして最後にエノイル−ACPを還元して伸長した飽和アシル −ACPを形成する段階（エノイル−ACPレダクターゼ）。β−ケトアシル−ACPシ ンターゼＩは、バルミトイル−ACP（C16：０）までの伸長を触媒作用し、一方β −ケトアシル−ACPシンターゼIIは、ステアロイルACP（C18：０）までの最終的 伸長の触媒として作用する、貯蔵トリグリセリド中に見られるオレイン酸、リノ ール酸及びα−リノレン酸といった一般的な植物未飽和脂肪酸は、可溶性プラス チドΔ−９デサチュラーゼ（往々にして「ステ アロイル−ACPデサチュラーゼ」とも呼ばれる）が触媒として作用する反応にお けるオレオイル−ACP（C18：１）を形成ずるためのステアロイル−ACPの脱飽和 に由来する。還元されたフェレドキシンが電子同時供与体として役立つ脱飽和の ためには、分子酸素が必要とされる。膜結合したΔ−12デサチュラーゼ及びΔ− 15デサチュラーゼの作用により実質的に付加的脱飽和が行なわれる。これらの「 デザチュラーゼ」はかくしてそれぞれモノマは多価不飽和脂肪酸を生み出す。 第３のβ−ケトアシル−ACPシンターゼが、非常に短かいアシル−ACPに向かっ て特異的な活性をもつS．oleraceaの葉の中で報告されてきた。このアセトアシ ル−ACPシンターゼ又は「β−ケトアシル−ACP」シンターゼIIIは、アセチル−A CPよりもアセチル−CoAの方を好む（Jaworski，J．G.，et al.，Plant Phys，（ 1989）90：41-44）。この酵素はATAに代ってFASを開始するための代替的経路で ありうるということが仮定されてきた。 油を生成するため、FAS、脱飽和及び／又はグリセロールバックボーン内への 脂肪酸の取込みにおいて表現型上の結果を生み出すことのできる核酸配列を得る ことには、問題の代謝因子の同定、有用な運動特性をもつタンパク質供給源の選 択及び特徴づけ、望まれるDNA配列を検索するためプローブとして使用できる核 酸配列を得るべくアミノ酸配列データを利用した、そのアミノ酸配列決定を可能 にするようなレベルに至るまでのタンパク質の精製、そして構成体の調製、形質 転換及び結果として得られた植物の分析を含む（ただしこれらに限られるわけで はない）さまざまな障害が付随している。 かくして、酵素標的の同定及び脂肪酸組成物を修正することのできるかかる酵 素標的の核酸配列のための有用な供給源、が必要とさ れる。理想的には、酵素標的は、脂肪酸プールに対する修正の結果としての新し い油組成物及び／又は脂肪酸プール内の不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の比率 、油産成の増減に関連して、単独で又はその他の核酸配列と組合わせた形で単数 又は複数の利用分野へと導くことができるものとなろう。酵素標的がひとたび同 定され認定されたならば、配列決定のためタンパク質の量及び精製プロトコルが 必要となる。究極的には、表現型修正を提供するのに必要な要素をもつ有用な核 酸構成体及びかかる構成体を含む植物が必要とされる。 図面の簡単な説明 図１は、50kDのＲ．コムニス（R．communis）シンターゼＢ因子遺伝子のcDNA 及び翻訳されたアミノ酸の配列を提供している。予備的なcDNA配列及び、50kDの シンターゼタンパク質をコードするcDNAクローン、pCGN2765（２−８）から誘導 された対応する翻訳ペプチド配列が示されている。cDNAは、仮定上のシグナルペ プチド（アミノ酸１〜42）及び成熟タンパク質をコードする配列の両方を含んで いる。 図２は、付加的な３’の未翻訳配列を伴うＲ．コムニスシンターゼＢ因子２− ８配列を提供している。 図３は、Ｒ．コムニス46kDシンターゼＡ因子遣伝子のcDNA及び翻訳されたアミ ノ酸配列を示す。 図４及び５は、ブラシカ（Brassica）シンターゼＢ因子遺伝子のcDNA及び翻訳 されたアミノ酸配列を示す。 図４は、pCGN3248のcDNAインサートの配列を示す。 図５は、クローン4Aの配列を示す。 図６は、ブラシカシンターゼＡ因子遣伝子のcDNA配列を提供して いる。Ｒ．コムニスＡ因子配列と翻訳されたアミノ酸配列を比較すると、ヌクレ オチド1120近くの領域におけるフレームシフト変異の可能性が明らかとなる。 図７は、図６に示されているブラシカシンターゼＡ遺伝子配列のヌクレオチド 79〜1119の翻訳されたアミノ酸配列を提供している。 図８は、図６に示されているブラシカシンターゼＡ遺伝子配列のヌクレオチド 1127〜1606の翻訳されたアミノ酸配列を提供している。 図９は、Bce4の約２kbのゲノミノク配列を提供する。 図10は、Ｃ．チンクトリウス（C．tinctorius）デサチュラーゼから誘導され たcDNA配列及び対応する翻訳ペプチド配列を提供する。cDNAは、プラスミドシグ ナルペプチド配列（アミノ酸１〜33）及び成熟タンパク質をコードする配列の両 方を含んでいる。 発明の要約 本発明により、以下「シンターゼ」と呼ぶβ−ケトアシル−ACPシンターゼに 関ずる組成物及び使用方法が提供される。同様に有利であるのは、生物学的に活 性な植物シンターゼに関連するアミノ酸及び核酸配列の方法及び組成物である。 本書にその全体が参考として内含されているWO92/03564号の中でさまざまな植物 シンターゼＡ因子及びＢ因子タンパク質についての記述が行なわれている。本書 で記述する通り、植物細胞内での発現のためのシンターゼIII構成体を単独で又 はその他の植物シンターゼ又は脂肪酸生合成遺伝子配列と組合わせた形で利用し て、油収量の増強及び／又は植物種子油の組成の変更を得ることも可能である。 宿主細胞中に存在するシンターゼ活性の量を加減するため、核酸構成体内で、 宿主細胞内のシンターゼ活性に必要とされるシンター ゼタンパク質をコードする核酸配列を利用することが可能である。収穫のため又 はシンターゼとその基質の間の接触を実施する手段として、宿主細胞内でシンタ ーゼを産生させることができる。宿主細胞は、原核生物及び／又は真核生物であ る。シンターゼタンパク質をコードする組換え型構成体を含む植物宿主細胞なら びに修正されたレベルのシンターゼタンパク質を含む植物及び細胞も提供される 。シグナルペプチドをコードするものといったような付加的な核酸配列も、特に 特定のシンターゼタンパク質に対する全長閉鎖が利用できない場合又は非植物シ ンターゼ配列が使用される場合に使用可能である。 さらに、植物細胞内でも内因性シンターゼの発現を低減させるように核酸構成 体を設計することができる。一例を挙げると、それは少なくとも通常酵素を産生 するような植物細胞内での発現が可能なプロモータの制御下でのアンチセンスシ ンターゼ配列の使用である。 さらに、１つのシンターゼタンパク質の発現を、脂肪酸合成に関連する酵素を コードするその他の導入された配列又はその他のシンターゼタンパク質の発現と 調和させることが望ましい場合がある。例えば、植物細胞内での最適なシンター ゼII型活性を提供するために、シンターゼＡ因子及びシンターゼＢ因子の調和さ れた発現が望まれる可能性がある。さらに、植物シンターゼタンパク質とシンタ ーゼIII遺伝子の調和された発現も望まれる可能性がある。シンターゼタンパク 質と組合わせて使用できる脂肪酸合成に関連するその他の酵素の例としては、植 物チオエステラーゼ、特に中鎖チオエステラーゼ、デサチュラーゼ、特にΔ−９ デサチュラーゼなどが含まれる。かかる因子をコードする核酸構成体が植物細胞 内への導入のために調製される場合、転写開始領域は互いに異なる可能性がある 。 さらに、植物細胞内の非植物シンターゼタンパク質配列の使用がここでは考慮 されている。かかる配列は、単独で又は植物シンターゼタンパク質と組合わせた 形で使用することができる。例えば、植物細胞中のＥ．コリ（E．coli）シンタ ーゼIIIタンパク質の発現のための構成体が記述されている。かかる構成体は、 植物細胞内での発現のための最適なコドンを提供するよう、ならびに植物脂肪酸 合成反応に対する効果についてプラスチドにシンターゼタンパク質をターゲティ ングするべくシグナルヘプチド配列を提供するように、修正することのできるも のである。 発明の詳細な説明 本発明の植物シンターゼには、Ｃ₂〜Ｃ₁₆の鎮長をもつアシル−ACP又はアシル −CoAと植物宿主細胞内のマロニル−ACPの間の縮合反応を触媒作用する能力を示 すアミノ酸、ポリペプチド、ペプチドフラグメント又はその他のタンパク質調製 物のあらゆる配列が、それが天然又は合成のいずれの供給源から全部又は一部分 誘導されたものであるかに関わらず、含まれている。植物シンターゼは、植物宿 主細胞内すなわちインビボで又は植物細胞様の環境内ですなわちインビトロで、 シンターゼ反応の触媒として作用することができる。標準的には、植物シンター ゼは、全部又は一部が天然の植物供給源から誘導される。 さらに、細菌又は下等植物といったその他の供給源からのシンターゼが、植物 の中でも有用でありかくして本発明において植物シンターゼとみなされる可能性 もある。例えば、fabB遺伝子によりコードされたＥ．コリシンターゼタンパク質 は、ここでは植物シンターゼタンパク質に対する相同性をもつことが示されてい る。Ｅ．コリ内で、シンターゼＩ酵素活性は、fabB遺伝子生成物のホモダイマー により提供される。特に有利であるのは、Ｅ．コリシンターゼIII（fabH）に対 する遣伝子である。植物細胞内での細菌遺伝子の発現のための構成体には、葉緑 体シグナルペプチド配列を取込むための融合構成体が含まれ、かくして、Ｅ．コ リシンターゼIII遺伝子生成物は、脂肪酸合成の部位に向けられるようになって いる。この要領で、全体的な脂質収量を、FAS経路での第１の段階を増強するこ とによって増大させることができる。 シンターゼＩは、より短かい炭素鎖Ｃ₂〜Ｃ₁₄をもつアシル−ACPに向けて優先 的活性を示し、シンターゼIIは、さらに長い炭素鎖Ｃ₁₄〜Ｃ₁₆をもつアシル−AC Pに向けて優先的活性を示す。シンターゼIIIは、非常に短かい炭素鎖Ｃ₂〜Ｃ₆を もつアシル−CoAsに向かって優先的活性を示す。その他の植物シンターゼも、シ ンターゼIII型活性を含め、本発明により応用可能である。 シンターゼは変更、切形、増加などを受けた配列といったような修正されたア ミノ酸配列、ならびに部分的又は全休的に人工的に合成されるような配列を含む 。シンターゼ及びシンターゼをコードする核酸配列は、例えば、植物抽出物の部 分的又は均質な精製、タンパク質モデリング、核酸プローブ、抗体調製物又は配 列比較などによって得ることができる。精製されたシンターゼがひとたび得られ たならば、抗原：抗体免疫複合体の形成及びそれに対し反応する植物シンターゼ の回収へと導く条件の下で、Ｒ．コムニスシンターゼに特異的な抗体と植物シン ターゼを接触させることによってその他の植物シンターゼを得るために、これを 利用することができる。シンターゼをコードする核酸配列がひとたび得られたな らば、さらなるスクリーニングのためプローブ内でこれを利用することもできる し、或いは又宿主細胞特に植物宿主細胞内での転写又は転写と翻訳のため遣伝子 工学構成体の中で使用することもできる。 シンターゼをコードする核酸配列及び有利な非相同核酸配列を含む組換え型構 成体を調製することが可能である。非相同というのは、天然ではシンターゼ配列 に接合された状態で発見されないあらゆる配列のことを意味している。従って定 義上、いずれかの修正されたシンターゼに接合された配列は、野生型配列ではな い。その他の例としては、異なる植物宿主のゲノム内に組込まれている１つの植 物供給源からのシンターゼが含まれる。 構成体を、原核細胞又は真核細胞のいずれかにおいてシンターゼを産生するよ うに設計することができる。植物細胞中のシンターゼの発現の増加又は、植物細 胞内に見られる内因性シンターゼの量の減少は、特に有利なことである。その上 、植物宿主ゲノム内への組込みのための核酸構成体の中では、シンターゼは、転 写方向との関係において「センス」又は「アンチセンス」のいずれの向きにでも 見い出すことができる。従って、核酸は内因性植物シンターゼの産生を阻害する べく生物学的に活性なシンターゼ又はシンターゼをコードする配列に対して相補 的な配列をコードすることができる。植物宿主細胞内でセンス配列を転写及び翻 訳することにより、植物FAS複合体にとって利用可能なシンターゼの量は増大す る。植物宿主細胞内のアンチセンス配列を転写するか又は転写、翻訳することに より植物FASにとって利用可能なシンターゼの量は減少する。理想的には、アン チセンス配列は内因性配列に対しきわめて高い相同性をもつ。FASに利用可能な シンターゼの量を減少させるその他の方法、すなわち例えばリボザイム又は、実 際にはシンターゼの発現を減少させるべく作用するセンス配列を含む構成体で形 質転換された植物細胞のスクリーニング、を本発明の範囲内で利用することも可 能である。当業者ならば、その他の類似の方法も利用することが可能である。 シンターゼは、望まれる結果に応じて脂肪酸合成の伸長用縮合反応の触媒とし て作用するべく、単独又は組合わせて使用することができる。例えば、シンター ゼ活性に影響を及ぼす割合は、シンターゼＩ型、シンターゼII型、シンターゼII I型又はこれらの酵素の組合せにあり得る。さらに、シンターゼ活性は、WO92/03 564に記述されている通りさまざまなシンターゼ因子の組合せによって左右され 得る。 宿主細胞内での問題の核酸配列の転写及び翻訳を提供するための要素を含む構 成体は、「発現カセット」である。宿主に応じて、ウィルス、プラスミド又は染 色体遣伝子などからの構造遣伝子からの領域を含め、調節領域は変動する。原核 又は真核微生物特に単細胞宿主の中での発現のためには、多種多様な構成性の又 は調節可能なプロモーターを利用することができる。記述されてきた転写開始領 域としては、β−ガラクトシダーゼ、T7ポリメラーゼ、trp-lac（tac）、trpEな どといった遣伝子を含め、Ｅ．コリ、Ｂ．サブチリス（B．subtilis）、サッカ ロミセス セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）といった細菌及び酵母宿 主からの領域がある。 植物細胞内でのシンターゼの発現のための発現カセットには、５’→３’の転 写方向で、植物細胞内で機能的な転写及び翻訳開始制御調節領域（「プロモータ 」としても知られている）、シンターゼをコードする核酸配列及び転写終結領域 が含まれることになる。デサチュラーゼ構造遺伝子の多種多様な構成性又は調節 可能な例えば誘発可能な転写を提供する数多くの転写開始領域が利用可能である 。植物のために用いられる転写開始領域としては、カリフラワーモザイクウィル ス（35S，19S）と結びつけられるような領域及びノパリンシンターゼ又はマンノ ピンシンターゼ又はナピン及びACPプロモーターなどのためのもののような構造 遣伝子がある。かかる構造 遣伝子に対応する転写／翻訳開始領域は、それぞれの出発コドンの上流直ぐ５’ のところに見い出される。かくして、意図される用途に応じて、異なるプロモー タが望まれる可能性がある。 本発明において特に有利であるのは、特に種子油形成の早い段階における、種 子組織内でシンターゼを優先的に発現することのできるプロモーターの使用であ る。種子脂肪酸／油組成の選択的修正により、その他の植物組織に対する潜在的 な不利な効果は低減する。このような種子特異的プロモーターの例としては、EP 0255378（88年３月２日公示）の中で記述されているようなナピン又は種子ACP遣 伝子の上流すぐ５’のところにある領域、Thompson et al（Proc．Nat．Acad．S ci．（1991）88：2578〜2582），WO92/03564及び本書図10に記されているような デサチュラーゼ遺伝子、又は同時係属のUSSN494,722及び本書図９に記されてい るようなBce-4遣伝子が含まれる。代替的には、植物シンターゼ構造遺伝子と結 びつけられた５’調節領域、すなわち植物シンターゼ構造遺伝子の上流すぐ５’ のところの領域及び／又は植物シンターゼ構造遺伝子の下流すぐ３’のところに 見られる転写終結領域の使用が往々にして望まれる可能性がある。一般に、プロ モータは、特定の利用分野を仮定すると変化しうるその発現プロフィールに基づ いて選択される。 アンチセンス方向性において見い出される配列は、少なくともシンターゼをコ ードする配列の転写を提供するカセット内に見い出されうる。アンチセンスとい うのは、問題の配列に相補的な配列をコードする５’→３’の転写方向でのDNA 配列のことを意味する。「アンチセンスシンターゼ」は、植物宿主に自生の植物 シンターゼ遣伝子に対し相補的であることが好まれる。種了発育中に全ての貯蔵 組織の中で高レベルの転写の開始をひき起こす植物宿主中で発現することのでき るプロモーターであれば何でも充分である。種子特異 的プロモータが望まれるかもしれない。 本発明のDNA配列には、ゲノミック又はcDNA配列が含まれていてよい。cDNA配 列にはシグナルペプチド配列といった予備処理配列が含まれていてもいなくても よい。シグナルペプチド配列は、一定の与えられた細胞小器官へのタンパク質の 送り込みを容易にし、細胞小器官に進入した時点でアミノ酸半分から分割され、 「成熟」タンパク質（又は酵素）を放出する。シンターゼは、葉緑体、原色素体 などという色素体細胞小器官のFAS経路の一部であることから、基質にタンパク 質（単複）を導くのにシグナルペプチドが必要とされる可能性がある。ACP、特 に種子ACP、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（RuBC）の小さいサブユニ ット、植物デサチュラーゼから、又は天然にそれぞれのシンターゼと結びつけら れている未変性配列からといったように、あらゆる色素体トランスロケーション 源からのシグナルペプチド配列を利用することが可能である。 プローブでゲノミックライブラリをスクリーニングし、以下にさらに詳述する とおりそれにハイブリッド形成するような配列を分離することにより、植物シン ターゼの完全なゲノミック配列を得ることができる。調節配列、シンターゼに対 しすぐ５’にある転写、翻訳開始領域及び３’にある転写、翻訳終結領域が得ら れ、これをシンターゼ構造遺伝子と共に又はこの遺伝子無しで使用することがで きる。 本書において提供されているアミノ酸及びDNA配列から、その他のシンターゼ 及び／又はシンターゼ核酸配列を得ることができる。「得ることができる」とい うのは、生物学的に活性なシンターゼを提供するべく本発明の未変性配列（単複 ）のものに充分類似した配列を有するような植物シンターゼのことを意味する。 当業者であれば、その他の供給源からシンターゼ及び／又はシンターゼ核酸配列 をスクリーニングし回収するために、抗体調製物、核酸プローブ（DNA及びRNA） などを調製し使用することができるということを直ちに認識することだろう。従 って、Ｒ．コムニスシンターゼＩ又はIIのいずれかに相同的に関係づけされた又 はこのいずれかからの誘導である配列は、本発明から得ることができるものを見 なされる。 「相同的に関係づけされた」という語には、未変性配列と比べて同一であるか 又は保存的に置換されているような核酸配列が含まれる。標準的には、相同的に 関係づけされた核酸配列は、存在しうるあらゆる欠失を除外して、Ｒ．コムニス シンターゼと問題の与えられた植物シンターゼの間に、少なくとも約60％の相同 性、さらに好ましくは少なくとも約70％の相同性を示す。相同性は、配列情報、 核酸又はアミノ酸を比較した時点で又はハイブリダイゼーション反応を通して決 定される。 プローブは完全な配列よりも著しく短かいものであってよいが、長さは少なく とも約10ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約15ヌクレオチド、さらに好まし くは少なくとも約20ヌクレオチドでなくてはならない。問題のポリペプチドをコ ードする遣伝子の全長を最高として、より長いオリゴヌクレオチドも同様に有用 である。DNA及びRNAの両方を使用することが可能である。 問題の植物供給源から調製されたゲノミックライブラリを、Ｒ．コムニスシン ターゼcDNAからの保存された配列でプローブして、相同的に関係づけされた配列 を同定することができる。より短かいプローブ配列が同定されていない場合、全 Ｒ．コムニスシンターゼcDNAを使用することができる。このとき制限酵素消化及 び／又は配列決定により陽性クローンが分析される。この一般的方法においては 、単数又は複数の配列を同定することができ、かかる植物供給源からのシンター ゼ遣伝子の転写調節要素ならびにコーディング領域の 両方が提供される。問題のその他の植物供給源から調製されたcDNAライブラリも 同じくスクリーニングでき、かかる植物供給源からのシンターゼ遣伝子のコーデ ィング領域が提供される。 使用中、プローブは標準的には検出可能な要領で（例えば³²Ｐ標識づけされた 又はビオチニル化されたヌクレオチドを用いて）標識づけされ、遣伝子が探索さ れる植物供給源から一本鎮DNA又はRNAを用いてインキュベートされるが、標識づ けされていないオリゴヌクレオチドも同様に有用である。標準的には、一本鎖及 び二本鎖（ハイブリッド形成された）DNA又はDNA/RNAが分離された後標識を用い てニトロセルロース紙又はナイロン膜を使用することにより、ハイブリダイゼー ションが検出される。オリゴヌクレオチドについて使用するのに適したハイブリ ダイゼーション技術は、当業者にとって周知のものである。従って、適切ないか なる植物からでも、さまざまな技術により植物シンターゼ遺伝子を分離すること ができる。Ｃ．チンクトリウス（C．tinctorius）種子、ナタネ、綿、トウモロ コシ、ダイズ子葉、ホホバ（jojoba）の実、ココナツ、落花生、ギネアアブラヤ シなどといったその他の油料種子植物から得た発育中の種子からのシンターゼ用 の植物遺伝子、ならびにＳ．オレラセア（S．oleracea）の葉緑体、アボカド中 果皮、クフェア（Cuphea）、カリフォルニア、ベイ及びユーグレナ グラシリス （Euglena gracillis）といったような伝統的でない油供給源からのシンターゼ 用植物遺伝子が望まれる。シンターゼ特にクフェアから得られたジンターゼＩは 、中鎖脂肪酸に対する特殊化された活性を示す可能性がある。かかるシンターゼ は、植物中鎖チオエステラーゼと組合わせて使用するのに特に有利である。 望ましい植物シンターゼ配列がひとたび得られたならば、これをさまざまな方 法で操作することができる。フランキング領域は、切 除、突然変異誘発などの対象となりうる。かくして、天然に発生する配列に対し て、トランジション、トランスヴァージョン、欠失及び挿入を行なうことができ る。さらに、修正アミノ酸配列を提供するよう単数又は複数のコドンを修正する ことができるか又は適切な制限部位を提供する又は構築又は発現に関与するその 他の目的のために単数又は複数のコドン突然変異を導入できる場合、配列の全て 又は一部分を合成することができる。さらに、単数又は複数の適切な制限部位な どを導入するため合成アダプター、リンカーを利用することによって、構造遣伝 子をさらに修正することができる。発現のため、植物シンターゼ又はその機能的 フラグメントをコードする読取り枠はその５’末端において、転写開始調節制御 領域に接合されることになる。アンチセンス方向性でシンターゼをコードする核 酸配列を介した植物シンターゼの変調といったいくつかの例においては、転写開 始領域又は転写／翻訳開始領域を使用することができる。シンターゼタンパク質 の発現が植物宿主中で望まれる実施態様においては、転写／翻訳開始調節領域が 必要とされる。さらに、いくつかの利用分野については、修正されたプロモータ すなわち１つの遣伝子供給源から誘導された転写開始領域及び異なる遣伝子供給 源から誘導された翻訳開始領域をもつプロモータ、又は２重35S CaMVプロモータ といった増強プロモータを、利用することができる。 上述のとおり、特に有利なのは、種子の成熟中に調節された遣伝子から得られ る非コーディング領域の上流５’にあるもの、特にACP-及びナピン誘導された転 写開始制御領域といった植物胚芽組織内で優先的に発現されるものである。この ような調節領域は、脂質蓄積中活性であり、従って脂肪酸組成物の修正及び／又 は植物デサチュラーゼの産生を修正するためのより大きい制御及び／又は有効性 に対する潜在性を提供している。特に有利であるのは、種子組織内 で優先的に発現されているすなわちその他の植物部分では検出不可能である転写 開始領域である。この目的のため、Ｂ．カンペストリス（B．campestris）種子 から分離され「Bcg4-4」と呼称されたアシル担体タンパク質の写し開始領域及び 、Ｂ．カンペストリス種子から分離され「Bce-４」と呼称される未知の機能をも つ遣伝子も、実質的な利点を有する。 簡単に言うと、Bce4は、少なくとも開花（花成）後わずか11日目に未成熟胚芽 組織内に見られ、約６〜８日後つまり開花から17〜19日目にピークに達し、開花 から35日目までに検出不能となる。Bce4遺伝子の発現タイミングは、種子組織内 の脂質蓄積のタイミングに密接に追従している。Bce4は、まず最初に種子胚芽組 織内で検出され、それより低い程度で種皮内に見られる。Bce4は、テストされた その他の植物組織、根、茎及び葉の中には検出されなかった。 Bce4写し開始領域は、Bce4構造遺伝子に対しすぐ５’のところに、少なくとも １kb、より好ましくは約５〜約7.5kbの配列を含むことになる。 Bcg4-4 ACPメッセージは、Bce4のものに類似した発現プロフィールを示し、従 って同様に種子組織内の脂質蓄積に対する。Bcg4-4は、種皮の中に発見されず、 本発明の植物Δ−９デサチュラーゼの転写又は転写及び翻訳を調節するのにBcg4 -4 ５’非コーディング配列用いられる場合、Bce4に比べて発現レベルの幾分か の違いを示す可能性がある。 ナピン１−２メッセージは、初期の種子発育において発見され、従って同様に 、脂質蓄積中に本発明の植物デサチュラーゼDNA配列といったような望まれる問 題のDNA配列の優先的転写調節を提供することのできる調節領域を提供する。ナ ピンは、発育中のブラシカ胚芽の中で合成される貯蔵タンパク質の２つの分類の うちの１つで あり（Bhatty，et al.，Can J．Biochem．（1968）46：1191-1197）、ブラシカ ゲノム内に再度導入される時点で組織特異的発現を導くために使用された（Radk e et al.，Theor，Appl．Genet．（1988）75：685-694）。 調節写し終結領域に関して言うと、これらは、異なる遣伝子供給源から誘導さ れた適切な転写終結領域、特に天然に写し開始領域と結びつけられている写し終 結領域又は植物シンターゼをコードするDNA配列により提供されうる。標準的に は、写し終結領域は、終結領域を誘導する構造遣伝子に対し３’のところに、少 なくとも約１kb好ましくは約３kbの配列を含む。 DNA構成体を発達させる上で、通常、細菌宿主例えばＥ．コリ内で複製するこ とのできる適切なクローニングベクターの中に、構成体又はそのフラグメントの さまざまな構成要素が挿入されることになる。文献中に記述されてきた数多くの ベクターが存在する。各々のクローニングの後、プラスミドを分離し、望ましい 配列の構成要素を仕立て上げるべく制限、新フラグメントの挿入、連結、欠失、 挿入、切除などといったさらなる操作にこれを付すことができる。構成体がひと たび完了したならば、次にこれを適当なベクターに移送して、宿主細胞の形質転 換方法に従ってさらに操作することができる。 通常、DNA構成体と共に含まれているのは、宿主内での発現に必要な調節領域 を有し形質転換された細胞の選択を提供する構造遺伝子である。この遺伝子は、 例えば抗生物質、重金属、毒素などの細胞毒性作用物質に対する耐性を提供する ことができ、相補性により、栄養素要求性宿主に対する原栄養作用、ウィルス免 疫などが提供される。発現構成体又はその構成要素が導入される異なる宿主種の 数に応じて、異なる宿主に対し異なる選択条件が使用される場合に は、単数又は複数の標識を利用することができる。 DNA構成体が植物宿主中に導入される要領は本発明にとってきわめて重要なこ とではない。効率の良い形質転換を提供するあらゆる方法を利用することができ る。植物細胞形質転換のためのさまざまな方法には、Ti又はRiプラスミド、マイ クロインジェクション、電気穿孔法、リポソーム融合、DNAボンバードなどの使 用が含まれている。数多くの例において、片側又は両側でT-DNAにより縁どりさ れた構成体、特に左及び右のボーダーを有する構成体、さらに特定的には右ボー ダーを有する構成体を得ることが望まれる。このことは、形質転換の１様式とし て構成体がＡ．ツメファシエンス（A．tumefaciens）又はＡ．リゾゲネス（A．r hizogenes）を使用する場合に特に有用であるが、T-DNAボーダーはその他の形質 転換様式の場合にも使用することができる。 植物細胞の形質転換のためにアグロバクテリウム（Agrobacterium）が使用さ れる場合、アグロバクテリウム宿主の中に存在するTi又はRi−プラスミド又はT- DNAとの相同組換えのためアグロバクテリウムの中に導入することのできるベク ターを使用することができる。組換えのためのT-DNAを含むTi−又はRiプラスミ ドは武装されていても（胆汁形成をひき起こすことができる）又非武装状態であ っても（胆汁形成をひき起こすことはできない）よく、形質転換されたアグロバ クテリウム宿主の中にvir遣伝子が存在するかぎり、いずれも許容可能である。 武装プラスミドは、通常の植物細胞と胆汁の混合物を与えることができる。 植物細胞の形質転換のためのビークルとしてのアグロバクテリウムの使用の好 ましい１つの方法では、広い宿主範囲の複製系、少なくとも１つのT-DNA境界及 び問題の単数又は複数のDNA配列を有するベクターが利用される。一般に使用さ れるベクターには、pRK2又 はその誘導体が含まれる。例えば、本書に参考として内含されるDitta et al.， PNAS USA（1980）77：7347-7351及びEPA0120515を参照のこと。通常、ベクター は、オピンをコードする遺伝子、オンコ遣伝子及びvir遣伝子を含まない。発現 構成体及びT-DNAと共に含まれているのは、形質転換されたアグロバクテリウム 及び形質転換された植物細胞の選択を可能にする単数又は複数の標識である。ク ロラムフェニコール、アミノグリコシドG418、ハイグロマイシンなどに対する耐 性といった数多くの標識が、植物細胞で使用するために開発されてきた。利用さ れる特定の標識は、本発明にとっで必要不可欠ではなく、特定の宿主及び標識要 領に応じていずれかの標識が好まれる。 T-DNAを植物細胞内に移送するために機能するvir遺伝子を有するアグロバクテ リウムへの形質転換により植物細胞内に問題のDNAを導入するために、ベクター を使用する。次に、複製及び正常な発現が起こるような条件下で植物宿主細胞内 に望ましいDNAを移送するのに適した条件の下で植物細胞を感染させるべく、広 い宿主範囲のベクター構成体を含むアグロバクテリウムを使用する。これには又 通常標識の移送も含まれ、かくして望ましいDNAを含む細胞を容易に選択できる ようになっている。 発現構成体は、多種多様な植物特に植物油の産生に関与する植物について利用 できる。これらの植物としては、ナタネ、落花生、ヒマワリ、Ｃ．チンクトリウ ス（C．tinctorius）、綿、Cuphea、ダイズ及びトウモロコシ又はヤシがあるが 、これらに制限されるわけではない。 アグロバクテリウムを用いた植物細胞の形質転換のためには、形質転換にとっ て充分な時間形質転換されたアグロバクテリウムと外植体を組合わせインキュベ ートし、細菌を殺し、植物細胞を適当な 選択培地の中で培養することができる。ひとたびカルスが形成したならば、既知 の方法に従って適当な植物ホルモンを利用することにより苗条形成を促進するこ とができ、苗条は植物の再生のため発根培地へと移送される。このとき、植物を 種子を生じるまで成長させることができ、種子は反復的世代を樹立するためそし て植物油の分離のために用いられる。 本発明はここで一般的に記述されてきたが、本発明を例示することのみを目的 としそれを制限する意味を全くもたない以下の例を参照することによって、本発 明をより良く理解することが可能となろう。 実施例 例１．シンターゼタンパク質の分析 WO92/03564において論述されているとおりのシンターゼタンパク質の精製にお いて、シンターゼII活性は、Ｒ．コムニス（R．communis）タンパク質の調製物 内に46及び50kDの両方のペブチドが存在した場合にのみ観察され、一方シンター ゼＩ活性は、50kDのペプチドのみを含む調製物の中で検出された。さらに、Ｅ． コリの発現データは、46kD及び50kDの両方のシンターゼ因子（それぞれ因子Ａ及 びＢ）がシンターゼII型活性のために必要であったこと及びシンターゼＡ因子が シンターゼII活性に対する長鎮脂肪酸基質の特異性に負献することを実証してい た。 シンターゼII活性が２つの離散的タンパク質を必要とするか又は単一のヘテロ ダイマーを必要とするかを見極めるため、精製したタンパク質調製物の中に共有 分子内結合を導入し、この反応の産物をSDS-PAGE及びウェスタン分析により同定 した。シンターゼＩ活性が単一ペプチドにより提供されるか又は観察された50kD のペプチドのホモタイマーにより提供されるかを見極めるため、類似の分析を行 なう。 「20緩衝液」中の精製されたシンターゼIII調製物20μｇ（46kD及び50kDのペ ブチド400pmol）を10％のMe₂SO中で40nmolのEGS（エチレングリコールビス（ス クシニミジルスクシネート））と組合わせ最終的に0.4mlの量になるようにする 。0.045mlの２Ｍトリス−HCl，pH7.0を付加することにより反応を停止させ、β −メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE試料を付加することによって、ゲル電気 泳動のため直ちにタンパク質を調製する。85μｌの体積内で8.3nmolのEGSと600n g（12pmolの50kDペブチド）を組合わせるという点を除いて、シンターゼＩの精 製された調製物を同じ要領で処理する。この反応を、２Ｍのトリス−HCl，pH7.0 を９μｌ付加することによって停止する。SDS-PAGE、ウェスタントランスファ及 び抗体ブロッティングにより、架橋結合したタンパク質を分析する。 EGS分子上の２つの活性部位の各々は、研究されているタンパク質のいずれか の利用可能なアミノ基と共有結合を形成することができ、結果としてEGS架橋を 横断しての２つのアミノ基のリンケージがもたらされる。シンターゼIIでは、0. 1mM〜10mMのEGS中で10分又は30分の室温インキュベーションにて、わずか２つの 主要及び２つの微量種の架橋結合したタンパク質しか形成されない。これらのタ ンパク質は、約124及び107kDでSDS-PAGE上を移動することが観察され、このこと はこれらのタンパク質が二量体であることを示唆している。ウェスタン分析によ ると、架橋結合した全ての産物は、46kD及び50kDの両方のペプチドに対処して生 み出された抗体と陽性反応し、両ペプチドが全ての架橋結合産物の中に存在する ことを表わしている。複数の二量体の外観は、分子内結合形成の数及び場所に応 じて二量体の異なるコンホメーションを反映することができる。長時間のインキ ュベーションの後にのみ又は、より高い濃度のEG Sを用いた場合にのみ、多量体タンパク質種が形成される。これらの結果は、シ ンターゼIIタンパク質が46kD及び50kDのサブユニットのヘテロダイマーであるこ との付加的な証拠を提供するものである。 シンターゼＩタンパク質が同じ反応に付される場合、各々約116kDの移動度を もつ１つの主要産物及び２つの微量産物が形成される。これらの産物のうちの３ つは全て、50kDのペプチドに対して生み出された抗体と反応するが、46kDのペプ チドに対して生み出された抗体とは反応しない。これらの結果は、シンターゼＩ 活性をもつタンパク質が50kDペプチドのホモダイマーであることを示唆している 。 例２．シンターゼ遺伝子配列 Alexander et al．（Methods in Enzymology（酵素学方法）（1987）154：41 〜64）中に記されている通りの方法を用いたcDNAライブラリの調製及びシンター ゼcDNAクローンのためのcDNAライブラリのスクリーニングについては、WO92/035 64中で記述されている。シンターゼII活性のために必要であることが立証された 植物シンターゼ因子タンパク質Ａ及びＢの配列は、本書で図１〜８に示されてい る。シンターゼＢ因子タンパク質も又植物シンターゼＩ型活性にとって必要であ るということに留意されたい（WO92/03564）。 Ｅ．コリシンターゼIII遣伝子の配列はTsay et al（J．Biol．Chem．（1992） 267：6807-6814）の中に見られる。 例３．発現カセット この例においては、シンターゼ遣伝子の挿入に適した発現カセットについて記 述する。 種子の発育中に優先的に発現された遣伝子の５’−上流配列及び３’下流配列 を利用した発現カセットは、適当な発現パターンをも つ遣伝子の分離されたDNA配列から構築できる。ブラシカ内での種子発育中に発 現される遣伝子の例は、両者共欧州特許公報EP0255378号に記述されているナピ ン遺伝子、１−２、及びACP遺伝子Bcg4-4、及び以下で記述するBce4遣伝子であ る。ナピン遣伝子は、活発に貯蔵タンパク質を産生している未成熟胚芽の中で優 先的に発現される種子貯蔵タンパク質をコードする。ACP遺伝子は、発育中の胚 芽内の脂肪酸の合成における内在性因子であるタンパク質をコードし、脂肪酸合 成中に優先的に発現される。Bce4は、開花後約15〜19日目に胚芽発育の早期に優 先的に発現され開花後わすか11日目に検出可能でもある未知の機能をもつタンパ ク質を産生する遺伝子である。Bce4の配列は、図９に示されている。 これらの遣伝子の発現を制御するDNA配列を分離し、これらの配列の間に挿入 されたシンターゼ遣伝子が種子発育の早期に優先的に発現されるように５’及び ３’の調節領域の充分な部分を組み合わせることができる。この発現パターンに より、シンターゼ遣伝子は、同じく種子発育早期に起こる脂肪酸合成に影響を与 えることができることになる。例えば、利用可能なさまざまなDNA操作技術を用 いて、ACP発現カセット内で、Bcg4-4 ACP遣伝子の３’配列を含む1.5kbのSstl/B glIIフラグメント及び５’配列を含む1.45kbのXholフラグメントを組合わせるこ とができる。同様にして、EcoRＶ部位からATG開始コドン直前までの約1.725kbの ５’配列及び１〜２ナピン遣伝子のTAG停止コドンを通過して約18塩基のところ のXhol部位から３’HindIII部位までの約1.25kbの３’配列を含むナピン発現カ セットを調製ずることも可能である。Bce4発現カセットは、上流PstＩ部位からA TG開始コドン直前までの約7.4kbの５’DNA配列を、TAA停止コドン直後から３’ PstＩ部位までの約1.9kbの３’配列と組合せることによって作ることができる。 種子発育中の適当な時点での挿入されたシンターゼ遣伝子の発現を可能にする 発現カセットを結果としてもたらすかぎりにおいて、５’及び３’配列の量を増 減すること、１つの遣伝子の５’配列を異なる遣伝子の３’配列と組合わせるこ と（例えば１つの発現カセット中にACP Bcg4-4の1.5kbの３’配列と共にナピン １−２の1.3kbの５’配列を用いる）又は、利用可能なその他の３’調節配列を 使用することといった変更を、これらの発現カセット内で行なうことが可能であ る。 Ａ．ナピン種子特異的発現カセット １．ナピン１−２ pCGN1808発現カセットＢ．カムペストリス（B．campestris） ナピン遣伝子から得ることのできる５’上流配列及び３’下流配列を利用する発 現カセットを以下の通りに構築することができる。 ５’上流配列を含むナピン１−２の2.7kbのXhoＩフラグメント（1988年２月３ 日に公示されたEP0255378号の図２を参照のこと）をpCGN789（制限消化部位EcoR Ｉ，SalＩ，BalII，PstＩ，XhoＩ，BamHＩ，HindIIIをコードする合成リンカー により置換された通常のポリリンカーを伴うpUCベースのベクター）へとサブク ローニングし、その結果pCGN90が得られる。pCGN940のナピンコーディング領域 の大部分をSalＩでの消化及び再連結により欠失させ、pCGN1800を形成した。ナ ピン遺伝子のATG開始コドン及びプロモータ領域の接合部にEcoRＶ及びNcoＩ制限 部位を挿入した合成オリゴヌクレオチドを用いたインビトロ突然変異誘発反応（ Adelman et al.，DNA（1983）2：183-193）の中でpCGN1800からの一本鎖DNAを使 用した。突然変異誘発及び配列分析のために使用されたオリゴヌクレオチドに対 するハイブリダイゼーションにより、適当な突然変異体を同定しこれをpCGN1801 と命名した。 EcoRＶでの部分的消化及び、EcoRＩで切断され、DNAポリメラーゼＩクレノウ フラグメントを充てんすることにより平滑化されたpCGN786（正常なポリリンカ ーの代わりに上述の合成リンカーを伴うpCGN566（WO92/03564に記されているpCG N565と反対の方向性のポリリンカー）のクロラムフェニコールベースのベクター ）への連結により、pCGN1801から1.7kbのプロモーターセグメントをサブクロー ニングし、pCGN1802を作り上げた。 ３’下流配列を含むナピン１−２の2.1kb SalＩフラグメントをpCGN789（上述 ）にサブクローニングし、結果としてpCGN941を得る。pCGN941をXhoＩ及びHindI IIで消化し、結果として得られた約1.6kbのナピン３’配列をXhoＩ−HindIIIで 消化されたpCGN1802内に挿入してpCGN1803を結果として得る。pCGN1803内に２つ のHindIII部位があるということの結果として、天然の方向性とは反対に挿入さ れた326ヌクレオチドHindIIIフラグメントを除去するために、HindIIIでpCGN180 3を消化し再連結させる。再連結の後、もとの1.6ナビン３’配列を1.25kbしか含 まなくなったクローンが選択される。このクローンpCGN1808は、ナピン１−２発 現カセットであり、1.725kbのナピンプロモータ配列及び1.265kbのナピン３’配 列そしてその間の唯一のクローニング部位SalＩ，PstＩ及びXhoＩを含んでいる 。 ２．ナビン１−2pCGN3223発現カセット 代替的には、pCGN1808を修正して、発現配列のみの動きを可能にしpCGN1557（ McBride及びSummerfelt、前出）といったバィナリーベクターに対する抗生物質 耐性標識の動きを許さないようフランキング制限部位を含むようにすることがで きる。KpnＩ，NotＩ及びHindIII制限部位を含む合成オリゴヌクレオチドをアニ ールし、pCGN1808の唯一のHindIII部位に連結させ、かくして１つのHindIII部位 の みが回収されるようにする。結果として得られたプラスミドpCGN3200は、配列分 析により確認されるように、ナピン３’−調節配列の３’末端に唯一のHindIII ，NotＩ及びKpnＩ制限部位を含んでいる。 ナピン発現カセットの大部分は、HindIII及びSacＩでの消化及びHindIII及びS acＩで消化されたpIC19R（Marsh et al．（1984）Gene（遣伝子）32：481-485） への連結によってpCGN3200からサブクローニングされ、pCGN3212を作る。ナピン プロモータ領域の極端の５’配列は、鋳型としてpCGN3200をそしてpCGN1808構成 体からのpCGN3200のpUCバックボーン及びナビン５’プロモータの接合部及びSac Ｉ部位をフランキングする２つのプライマーを用いて、PCRにより再構築される 。順方向プライマーは、ClaＩ，HindIII，NotＩ及びKpnＩ制限部位ならびにナピ ン５’−配列（EcoRＶ部位からの）のヌクレオチド408-423を含み、逆方向プラ イマーは、５’−プロモーター内に唯一のSacＩ部位を含むナピン配列718-739に 対する補体を含んでいる。PCRは、製造業者の仕様に従ってPerhin Elmer/Cetus のサーモサイクラーを用いて行なった。PCRフラグメントを、平滑端をもつフラ グメントとしてpUC8（Vieira及びMessing（1982）Gene 19：259-268）の中にサ ブクローニングさせ、HincIIで消化させてpCGN3217を得る。ナピンインサートを 横切ったpCGN3217の配列は、PCRによって不適当なヌクレオチドが全く導入され なかったということを確認している。pCGN3217内のナピン５−配列は、ClaＩ及 びSacＩでの消化及びClaＩ及びSacＩで消化されたpCGN3112に対する連結により 、ナピン発現カセットの残りに連結される。結果として得られた発現カセットpC GN3221をHindIIIで消化させ、ナピン発現配列をゲル精製し、HindIIIで消化され たpIC20H（Marsh、前出）に連結させる。最終的発現カセットは、アンピシリン 耐性バ ックグラウンドの中に、pCGN1808内に見られるような基本的に同一の１：725ナ ピン５’及び1.265の３’調節配列を含むpCGN3223である。調節領域は、HindIII ，NotＩ及びKpnＩ制限部位でフランキングされ、唯一のSalＩ，BglII，PstＩ及 びXhoＩクローニング部位が５’と３’の非コーディング領域の間にある。 Ｂ．Bce4発現カセット 種子特異的発現のための発現カセットを、同様に、図９に表わされているもの のようなBce4遣伝子配列からも構築することができる。Bce4配列をブローブとし て用いてブラシカ カムペストリス（Braccica campestris）のゲノミックライ ブラリーから、Bce4遣伝子の調節配列をもつゲノミッククローンを分離すること ができる。例えば、約20kbのBamHＩフラグメントを分離し、クローンPlClと呼称 する。BamHＩ消化によりクローンPlClの約20kbのインサートを放出させ、バイナ リーベクターpCGN1547のBamHＩ部位の中に挿入し（以下参照）、pCGN1853を産生 させる。Bce4遺伝子を含むpCGN1853のPstＩフラグメントをpUC18（Norrander et al．（1983）Gene 26：101-106）のPstＩ部位内に挿入し、pCGN1857を産生させ る。プラスミドpCGN1857は、1990年３月９日に受入れ番号68251にてATCC，Rockv iele，MD．に寄託された。Bce4遺伝子を含むpCGN1857のClaＩフラグメントを、C laＩ消化されたBluescript KS+（Stratagene：La Jolla，CA）の中に連結させ、 pCGN1864を産生させる。１本鎖DNAをpCGN1864から作り、翻訳された開始及び停 止コドンのBce4配列５’及び３’に対する相同性を有ししかも制限消化部位をコ ードするオリゴヌクレオチドを用いて、Adelman et al．（DNA（1983）2：183-1 93）に記されている通りのインビトロ突然変異誘発により変更する。結果として 得られたプラスミドpCGN1866は、Bce4開始コドンに対しすぐ５’のところにXho Ｉ及びBamHＩ部位を（BCE45Pから）又 Bce4停止コドンに対し直ぐ３’のところにBamHＩ及びSmaＩ部位（BCE43Pから） を含む。突然変異誘発された配列を含むpCGN1866のClaＩフラグメントをpCGN201 6（以下に記されている）のClaＩ部位内に挿入しpCGN1866Cを産生させる。pCGN1 866CのClaＩフラグメントを用いてpCGN1867（以下に記述）の対応する野生型Cla Ｉフラグメントを置換させpCGN1868を産生させる。BamHＩでのpCGN1868の消化及 びプラスミドの再環状化によりBce4コーディング配列を除去してpCGN1870を産生 する。Bce4発現カセットpCGN1870は、クローニング部位XhoＩ，BamHＩ及びSmaＩ により分離されたBce4ゲノミッククローンから誘導された7.4kbの５’調節配列 及び1.9kbの３’調節配列を含む。 pCGN1867 端部の補修無しで、BamHＩ−SmaＩ消化及びプラスミドの再環状化によりpUC18 のBamHＩ及びSmaＩ部位（Norrander et al.，（1983）前出）を除去し、pCGN186 2を産生させる。Bce4遣伝子を含むpCGN1857のpstＩフラグメントをpCGN1862のPs tＩ部位内に挿入してpCGN1867を産生させる。 pCGN2016 pUC12-Cm（Buckley，K.，Ph．D（物理学博士号）論文、UCSD，CA（1985）の多 重クローニング部位をpUC18のもので置換してpCGN565を産生させる。クロラムフ ェニコール耐性遺伝子を含むpCGN565のHhaＩフラグメントを切除し、緑豆ヌクレ アーゼを使用して平滑化し、Bluescript KS-（Stratagene，La Jolla，CA）のEc oRＶ部位の中に挿入して、pCGN2008を作り上げる。pCGN2008のクロラムフェニコ ール耐性遺伝子をEcoRＩ−HindIII消化により除去する。末端を平滑化するため クレノウ酵素で処理した後、Bluescript KS-のアンピシリン耐性遣伝子に置換す るクロラムフェニコール耐性遣伝子を 支持するフラグメントをBluescript KS-のDral部位の中に挿入して、pCGN2016を 産生する。 Ｃ．ACP発現カセット Ｂ．カムペストリスACP遣伝子から得ることのできる５’上流配列と３’下流 配列を利用する発現カセットは、以下の要領で構築することができる。５’上流 配列を含むBcg4-4の1.45kb XhoＩフラグメントをクローニング１配列決定ベクタ −Bluescript＋（Stratagene Cloning Systems，San Diego，CA）内へサブクロ ーニングさせる。結果として得られた構成体pCGN1941をXhoＩで消化させ、XhoＩ で消化されたクロラムフェニコール耐性Bluescript M13＋ベクター，pCGN2015に 連結させる。pCGN2015については、WO92/05364内に記述されている。こうしてプ ラスミドの抗生物質耐性は、ペニシリン耐性からクロラムフェニコール耐性へと 変わる。クロラムフェニコール耐性プラスミドはpCGN1953である。 M13 Bluescript＋ベクターのSstＩ／BamHＩ部位内でクローニングされたSstＩ ／BglIIフラグメント上に、Bcg4-4の３’配列が含まれている。このプラスミド はpCGN1940と命名される。SstＩ部位からのACP遺伝子の18のヌクレオチドに対す る読取り枠の停止コドンの直ぐ後にSmaＩ及びPstＩ制限部位を挿入するため合成 オリゴヌクレオチド（配列番号51）５’−CTTAAGAAGTAACCCGGGCTGCAGTTTTAGTATT AAGAG−３’を用いて、インビトロ部位特異的突然変異誘発（Adelman et al.，D NA（1983）2：183-193）によりpCGN1940を修正する。この修正されたプラスミド pCGN1950からの３’−非コーディング配列を、PstＩ及びSmaＩで切断されたpCGN 1953の中へ、PstＩ−SmaＩフラグメントとして移動させる。結果として得られた プラスミドpCGN1977は、これらのACP遣伝子領域の調節の下で遺伝子クローニン グが発現されるよう1.45kbの５’非コーディング配列と 1.5kbの３’非コーディング配列の間で利用可能な唯一の制限部位EcoRＶ，EcoR Ｉ及びPstＩを伴うACP発現カセットを含んでいる。 例４．シンターゼ構成体 Ａ．植物形質転換ベクター調製 シンターゼcDNA配列を、さまざまな操作技術を用いて、植物調節領域を含む発 現カセット内に挿入することが可能である。この要領で、センス又はアンチセン スのいずれかの方向性のシンターゼ構成体が調製される。適当な制限部位がシン ターゼクローン内に存在する場合、制限エンドヌクレアーゼで消化させかつ利用 可能なクローニング部位のうちの１つ又は複数の部位において消化されたカセッ トの中に連結させることによって、これらの制限部位を発現カセット内に挿入す ることができる。クローン内で適切な制限部位が利用可能でない場合、カセット 又はシンターゼ遣伝子（単複）のいずれかのDNAをさまざまなやり方で修正して カセット内へのシンターゼ遣伝子のクローニングを容易にすることができる。DN Aを修正するための方法の例としては、PCR、合成リンカー又はアダプター連結、 インビトロ部位特異的突然変異誘発（Adelman et al.，前出）、張出し５’又は ３’末端のフィルイン又は切り戻しなどによるものがある。これらの及びその他 のDNA操作方法は、当業者にとっては周知のものである。 発現カセット、５’配列／シンターゼ／３’配列の中にシンターゼ遣伝子を含 むフラグメントを次に、アグロバクテリウム形質転換についてMcBride及びSumme rfelt（Pl．Mol．Biol．（1990）14：269-276）により記述されているように、 バイナリーベクターの中にクローニングする。その他のバイナリーベクターが当 該技術分野において知られており、同様にシンターゼカセット用に使用すること ができる。発現カセット及びシンターゼ遺伝子を含むバイナリーベ クターはHalsters et al.，（Mol．Gen．Genet．（1978）163：181-187）の方法 にあるように菌株EHA101（Hood，et．al.，J．Bacteriol．（1986）168：1291-1 301）といったAgrobacterium tumefaciens（アグロバクテリウム、ツメファシエ ンス）へと形質転換され、例５に記されている通り形質転換された植物を生成す るべく使用される。 Ｂ．シンターゼＡ因子構成体 １．センス方向性 植物細胞内での発現のため植物調節領域の制限下でセンスシンターゼ配列を含 む構成体は、以下の要領で調製することができる。cDNAインサートの５’末端に BamHＩ制限部位を、又翻訳停止コドンからすぐ３’のところにXhoＩ及びSmaＩ部 位を挿入するべくインビトロ突然変異誘発により、Ｒ．コムニスシンターゼＡ因 子のcDNA，１〜1Aを変更する。結果として得られた構成体pCGN2781を、BamHＩ及 びXhoＩで消化させ、上述のナピン発現カセットであるBalII及びXhoＩで消化さ れたpCGN3223内に連結させ、結果としてpCGN2785を得る。Asp718での消化により pCGN2785のナピン／Ａ因子／ナピン領域を得、Asp718で消化されたpCGN1557（Mc Bride et al.；前出）の中に連結させ、結果としてpCGN2787を得る。 ２．アンチセンス方向性 アンチセンスシンターゼＡのためには、平滑末端を作り出すべくＢ．カンペス トリスシンターゼＡ因子cDNAクローン、pCGN4300（ヌクレオチド218〜1535）のB amHＩ／EcoRＶフラグメントを処理し、ACP発現カセットpCGN1977のEcoRＶ部位内 にサブクローニングさせてpCGN4304を作り上げる。ACP ５’／アンチセンスブラ シカＡ因子／ACP ３’フラグメントを含むKpnＩ／XbaＩフラグメントを、KpnＩ ／XbaＩ消化されたバイナリーベクターpCGN1557（McBride及 びSummerfelt、前出）の中に挿入し、結果として植物形質転換構成体pCGN4306を 得る。 ナピンカセソト内にブラシカシンターゼＡ因子cDNAクローンを挿入するため、 pCGN4300（ヌクレオチド218〜1535）のBamHＩ／EcoRＶフラグメントを平滑化し 、平滑末端をもつDNA分子を提供ずるべく同様に処理されてきたBglII−消化され たナピンカセットpCGN3223内に連結させる。結果として得られたブラスミドは、 pCGN4305である。ナピン５’／アンチセンスブラシカＡ／ナピン３’フラグメン トを含むAsp718フラグメントをバイナリーベクターpCGN1557の中にサブクローニ ングして植物形質転換のための構成体pCGN4324を産生する。 ３．トランジット融合構成体 Ｒ．コムニスＡ因子のcDNAクローンがシグナルペプチド全体をコードしないと いう可能性のため、Ｒ．コムニスＡ因子クローンからの成熟ペプチドコーディン グ領域に対してブラシカＡ因子cDNAクローンからのシグナルペプチドコーディン グ領域（Ｖ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｍ−Ｓ保存領域を含む）を融合するようにDNA構成体 を調製する。これらの構成体は、成熟Ｒ．コムニスタンパク質の最初の24個のア ミノ酸及びシグナルペプチドのためのコーディング領域（図３に示されている配 列のヌクレオチド365〜367におけるリジン残基）がブラシカクローンからの対応 する領域と置換されるように設計されている。 ブラシカＡ因子のcDNAの２つの異なる５’領域をPCRによって得る。「短かい 」バージョンは、図６に示されている配列のヌクレオチド79〜423を含んでいる 。この領域は、ブラシカＡ因子のcDNAの最初のメチオニン残基から位置115にお けるヒスチジン残基までコードする。「長い」バージョンは図６に示された配列 のヌクレオチ ド７〜423を含み、従ってＡ因子の５’未翻訳領域の一部分を含んでいる。これ らのブラシカシンターゼＡ因子フラグメントの各々は、それぞれ、PCRで用いら れるオリゴヌクレオチドプライマー内に設けられたSalＩ及びEcoRＶ制限部位も その５’及び３’末端に含んでいる。３’EcoRＶ部位の挿入は116 Aspのための コドンを「GAC」から「GAT」に変更する。 図３に示されている配列のアミノ酸145〜540についてのコーディング領域及び 停止コドンを含むＲ．コムニスシンターゼＡ因子DNAフラグメントも同様にPCRに より得られる。このフラグメントの５’末端にEcoRＶ部位を提供するためには、 位置145〜146のAsp’及びIleアミノ酸のためにコーディング配列「GATATC」を選 択する。PCRプライマは、「TGA」停止コドンのすぐ後でこのフラグメントの３’ 末端にXhoＩ部位を挿入するような形で設計される。 ブラシカ及びＲ．コムニスシンターゼＡ因子フラグメントは、そのそれぞれの ３’及び５’EcoRＶ部位の連結により融合される。融合フラグメントをSalＩ及 びXhoＩでの消化によって獲得し、ナピン発現カセットpCGN3223の中に連結させ る。「短かい」ブラシカＡ因子を含む構成体をpCGN4313と呼称し、「長い」Bras sicaＡ因子を含む構成体をpCGN4314と呼称する。ナピン５’／シンターゼＡ融合 ／ナピン３’フラグメントを含むKpnＩフラグメントをバイナリーベクターpCGN1 557の中にサブクローニングして、植物形質転換のためのベクターを産生させる 。「短かい」ブラシカＡ因子構成体をpCGN4319と呼称し、「長い」ブラシカＡ因 子構成体をpCGN4320と呼称する。 図10に示されているＣ．チンクトリウスデサチュラーゼのシグナルペプチドコ ーディング配列を取込む成熟Ｒ．コムニスシンターゼＡ因子を伴う第３の融合構 成体を調製する。RCRによって、図３の アミノ酸121〜540をコードするDNAフラグメント（成熟Ｒ．コムニスシンターゼ Ａ因子及び成熟ペプチドに対しすぐＮ末端のアスパラギン残基）を得る。さらに 、順方向オリゴヌクレオチドプライマ内に配列CCATGGCCを含み入れこのフラグメ ントの５’末端に付加し、かくしてシンターゼ配列の前にNcoＩ制限部位がくる ようにし、シンターゼペプチドコーディング領域に対してアラニン残基を付加す る。３’末端で停止コドンの直ぐ後にXhoＩ制限部位を提供する。 図10に示されているＣ．チンクトリウスデサチュラーゼcDNAクローン、pCGN27 54は、コーディング領域をフランキングするべくPstＩ，SmaＩ及びXhoＩ部位を 挿入するように、PCRによって修正される。PCR産物を、PstＩで消化させ、PstＩ で消化されたpUC8（Vieira and Messing（1982）Gene 19：2359-268）に対して 連結させて、pCGN3220を産生する。NcoＩ部位に対し５’のところ及びSacＩ部位 に対し３’のところにpUC8ベクター及びＣ．チンクトリウスデサチュラーゼcDNA 配列を含むpCGN3220の大きいNcoＩ／SacＩフラグメントをゲル精製し、pCGN2754 のゲル精製されたNcoＩ／SacＩ内部フラグメントに連結させ、その結果pCGN3222 を得る。pCGN3222からのＣ．チンクトリウスデサチュラーゼのコーディング領域 を、XhoＩでの消化及びXhoＩ及びSalＩで消化されたpCGN3223に対する連結によ りpCGN3223ナピンカセットへとクローニングし、その結果pCGN3229を得る。 pCGN3229をNcoＩ及びXhoＩで消化して成熟デサチュラーゼコーディング領域を 除去する。上述のＲ．コムニスシンターゼＡ因子フラグメントをNcoＩ及びXhoＩ で消化しNcoＩ／XhoＩ消化されたpCGN3229に連結させる。この結果、ナピン５’ ／デサチュラーゼ：シンターゼＡ／ナピン３’融合構成体であるpCGN4308が得ら れる。 pCGN4308をAsp718で消化し、バイナリベクターpCGN1557へとサブクローニングし て、植物形質転換構成体pCGN4318を産生させる。 Ｃ．シンターゼIII構成体 細菌シンターゼIIIコーディング配列し、さまざまな植物シグナルペブチドコ ーディング配列の融合構成体を調製することができる。これらの構成体は、植物 脂肪酸合成酵素との相互作用のため葉緑体の中に細胞シンターゼが取り込まれる 、トランスジェニック植物の生成のために用いられる。 Ｂ．ラパ（B．rapa）（前カンペストリス）種子のACP cDNA（Roseet al．（19 87）Nuc．Acids Res．15：7197）からのブラシカACPシグナルペプチドコーディ ング配列及びＥ．コリＫ−12（Tsay etal．（1992）J．Biol．Chem．267：6807- 6814）からのβ−ケトアシル−アシル担体タンパク質シンターゼIII遺伝子（fab H）の融合を、以下のとおりに調製する。PCRによりB．rapa ACPジグナルペプチ ドコーディング領域に５’未翻訳配列が加わったものを得るが、ここでオリゴヌ クレオチドブライマーは、B．rapa cDNAクローンの５’末端でXhoＩ部位に対し すぐ５’のところにBamHＩ部位が付加され、NheＩ部位がシグナルペプチドコー ディング領域の３’末端でシステインコドンに対しすぐ３’のところに挿入され るような形で設計されている。fabHコーディング領域は、NheＩ部位がＮ末端メ チオニンコドンに対しすぐ５’のところに挿入されXhoＩ及びSmaＩ部位がTAG停 止コドンに対しすぐ３’のところに挿入されるような形で設計されたオリゴヌク レオチドプライマを用いて、Ｅ．コリDNAからPCRによって得られる。NheＩ部位 はfabH Ｎ末端メチオニンに対しすぐ５’のところにアラニン及びセリンコーデ ィング領域を付加する。 ACP及びジンターゼIIIフラグメントを、挿入されたNheＩ制限部 位での連結により得る。ACP/シンターゼIII融合フラグメントを、植物調節領域 を含む適切なカセット内に挿入する。例えば、ナピン調節領域下での調節のため には、ACP/シンターゼIIIフラグメントは、BglII及びXhoＩでの消化により得ら れ、pCGN3223に連結される。同様にして、融合ACP/シンターゼIIIフラグメント がその他のさまざまな植物調節領域下での制御のために位置づけられている構成 体を得ることができる。問題のその他の調節領域としては、さまざまな植物組織 内で構成性発現を提供するべく、種子発現のためのBce4及びACP領域ならびに35S ，２重35S又はT-DNAプロモータ領域（例えばmas及びnos）が含まれる。例えば植 物原形質体への電気穿孔法及びウェスタン分析により、かかる構成体によって産 生されたシンターゼタンパク質の葉緑体内への摂取についてテストするために、 構成性発現が望ましいものでありうる。構成性発現は又、葉、根及び茎といった 植物のさまざまな組織内でのシンターゼの発現の効果の分析のためにも有用であ る。 ACPシグナルペプチドコーディング領域に加えてACP成熟タンパク質のさまざま な部分を含む付加的なACP/シンターゼIII融合構成体を調製することが可能であ る。例えば、成熟ACPタンパク質の付加的な12のアミノ酸についてのコーディン グ配列を加えたＢ．ラパACPシグナルコーディング配列を含む融合を調製する。D deＩ部位「CTAAG」がＮ末端メチオニンコドンに対しすぐ５’のところに挿入さ れ、XhoＩ及びSmaＩ部位がTAG停止コドンに対しすぐ３’のところに挿入される ように設計されたオリゴヌクレオチドプライマを用いて、E．coli DNAからのPCR により、fabHコーディング領域を得る。Ｂ．ラパACPクローンは、成熟タンパク 質領域のアミノ酸11-12（Ser-Lys）のためのコドン内に、DdeＩ部位を含む、か くして、Ｂ．ラパACPシグナル＋12フラグメントは、ATG開始コドンに対 し５’のところの適切な部位とDdeＩでの消化によって得られる。このフラグメ ントをDdeＩ部位でシンターゼIIIフラグメントに連結させてACPシグナル＋12／ シンターゼIII融合を形成させる。この融合を、XhoＩでの消化及びXhoＩ消化さ れたpCGN3223に対する連結により、ナピン発現カセット内に挿入する。上述のと おり、その他のさまざまな植物調節要素の下でのシンターゼIII融合の転写制御 のための付加的な構成体を、同様の要領で調製することができる。 上述のACPトランジットペブチドに加えて、当該技術分野ではさまざまなその 他の植物シグナルペプチドが知られており、類似の要領で用いることができる。 例えば、Ｒ．コムニスシンターゼ融合構成体において上で用いられたブラシカシ ンターゼＡシグナルペプチドは同様に細菌シンターゼIIIと組合わせて使用する こともできる。同様にして、SSU、ステアロールACPデサチュラーゼ及びその他の 核コードされた葉緑体タンパク質のためのものといったその他の既知のシグナル ペプチドを、ACPシグリールペプチドと置換することができる。 Ｄ．複数のシンターゼ遣伝子を含む構成体 植物内で最適な効果を得るために複数のシンターゼ遣伝子が必要とされる場合 、遣伝子を同じプロモータの調節下で又は代替的には上述のナピン、ACP及びBce 4配列といったような発育中の種子の中で優先的に発現される２つの異なるプロ モータの調節下で発現させることができる。このとき、構成休を同じバイナリベ クター内で植物の中に導入するか又は異なるバナイリーベクター内で同時に導入 することが可能である。 例えば、植物細胞内でのシンターゼＡ因子及びＢ因子の両方の発現のためには 、Ｒ．コムニスシンターゼＡ因子及びＲ．コムニスシンターゼＢ因子の遣伝子が 各々同じバイナリーベクター内でナピン 調節領域の制御下にある構成体が調製される。 pCGN2785のナピン／Ａ因子／ナピン領域を、Asp718での消化によって得、Asp7 18で消化されたpCGN1557（McBride et al；前出）内へ連結させ、その結果pCGN2 787が得られる。pCGN2787を唯一のPstＩ部位で消化させ、T4ポリメラーゼで処理 して３’の張り出しを充てんし、仔牛腸内アルカリ性ホスファターゼで消化させ て、pCGN2787の自己連結を防ぐべく５’末端を脱リンさせる。DNAポリメラーゼ のクレノウフラグメント及びHindIIIでの消化により、pCGN2786のナピン／Ｂ因 子／ナピン領域を得て、平滑末端をもつDNAフラグメントを提供し、このフラグ メントを次にT4ポリメラーゼ平滑末端pCGN2787 DNAに連結させる。結果として得 られた構成体pCGN2797は、各々ナピンプロモータ領域から発現のために位置づけ されたＲ．コムニスシンターゼＡ因子及びＢ因子を含む。 例５．植物の形質転換 この例では、アグロバクテリウムを媒介とした植物形質転換について記述され ておりブラシカナパス（Brnssica napus）が例示されている。同様に、DNA-ボン バード植物形質転換について記述され、落花生形質転換が例示されている。 Ａ．アグロバクテリウムを媒介とする形質転換 ブラシカ種の形質転換については、Radke et al．（Theor，Appl．Genet．（1 988）75：685-694：Plant Cell Reports（植物細胞報告書）（1992／11：499-50 5）が記述している。ブラシカナパスcv．Deltaの種子を２分間95％のエタノール 中に浸漬し、45分間一滴のTween 20を含む次亜塩素酸ナトリウムの1.0％溶液中 で表面殺菌し、無菌精製水の中で３回洗浄した。次に、ピロドキシン（50μｇ／ ｌ）、ニコチン酸（50μｇ／ｌ）、グリシン（200μｇ／ｌ）及び0.6％Phytagar （Gibco）pH5.8で補足したMurashigeの最少有機 培地（Gibco）の１／10濃縮を用いて、マジェンダボックス内に種子を平板固定 する。種子を、１秒１平方メートルあたり約65μアインシュタイン（μEm^-2s^-1 ）の強度の低温蛍光赤色光を用いて16時間の光周期で22℃で培養室内で発芽させ る。 胚軸を７日目の実生から切除し、長さ約４mmの小片に切断し、フィータープレ ート（Horsch et al．1985）上で平板固定する。加圧滅菌する前にpHを5.8に調 整した約30mlのMS塩塩基（Carolina Biological）、100mg／ｌのイノシトール、 1.3mg／ｌのチアミン−HCl，200mgのKH₂PO₄と３％のショ糖、２，４−Ｄ（1.0mg ／ｌ）、0.6％のPhytagarを含むペトリ皿（100×25mm）上にタバコ懸濁液1.0ml を平板固定することにより、使用する一日前にフィーダープレートを調製する。 使用に先立ってフィーダー層の上に一枚の無菌ろ紙ディスク（Whatman ３mm） を置く。２，４−Ｄ（0.2mg／ｌ）、カイネチン（0.1mg／ｌ）を伴うフィーダー プレートについて記述した通り100mlの新鮮なMS培地の中に10mlの培養を移送す ることにより、毎週、タバコ懸濁培養を継代培養させる。30μEm^-2s^-1〜65μEM^- 2s^-1の強度の連続光内で22℃で24時間フィーダープレート上で全ての胚軸外植体 を予備インキュベートする。 バイナリプラスミドを含むＡ．ツメファシエンス（A．tumefaciens）菌株EHA1 01の単一コロニーを5mlのMG／Ｌブイヨンに移送し、30℃で一晩成長させる。１ リットルあたり、MG／Ｌブイヨンは５ｇのマンニトール、１ｇのＬ−グルタミン 酸又は1.15ｇのグルタミン酸ナトリウム、0.25のKH₂PO₄，0.10ｇのNaCl，0.10ｇ のMGSO₄・７H₂O，１mgのビオチン、５ｇのトリプトン及び2.5ｇの酵母抽出物を 含んでおり、ブイヨンはpH7.0に調整される。１×10⁸細菌／mlに希釈された細菌 を伴う７〜12mlのMG／Ｌブイヨンの中に胚軸外植体を浸漬し、10〜20分後にフィ ーダープレート上に平板固定する 。アグロバクテリウムでの48時間の同時インキュベーションの後、フィルター殺 菌したカルベニシリン（500mg／ｌ、加圧滅菌後に付加）及び25mg／ｌの濃度の 硫酸カナマイシン（Boehringer Mannheim）を含むB5 0/1/0カルス誘発培地に胚 軸外植体を移送する。 65μEm^-2s^-1〜75μEm^-2s^-1の連続光で３〜７日間培養した後、カルス組織が切 断表面上に見られ、胚軸外植体は、苗条誘発培地、B5 BZ（pHを5.8に調整した、 ３mg／ｌのベンジルアミノプリン、１mg／ｌのゼアチン、１％のショ糖、0.6％ のPhytagarで補足されたビタミン）へと移送される。この培地は同様に、カルベ ニシリン（500mg／ｌ）及び硫酸カナマイシン（25mg／ｌ）をも含んでいる。胚 軸外植体を２週間毎に新鮮な苗条誘発培地に継代培養させる。 １〜３ヵ月後、胚軸カルスから苗条が再生する。少なくとも１cmの高さの緑の 苗条をカルスから切除し、B5塩とビタミン、１％のショ糖、カルベニシリン（30 0mg／ｌ）、硫酸カナマイシン（50mg／ｌ）及び0.6％のPhytagar）を含む培地上 に置き、種子の発芽について記述した通りの条件で培養室の中に入れる。２〜４ 週間後、緑色のままである苗条を基部でカットし、根誘発培地（B5塩及びビタミ ン、１％のショ糖、２ml／ｌのインドールブチル酸、50mg／ｌの硫酸カナマイシ ン及び0.6％のPhytagar）を含むマジェンタボックスに移送する。NPTII活性につ いて緑色発根苗条を試験する。類似の技術を用いてアグロバクテリウムを媒介と する形質転換により、トランスジェニック アラビドプシス タリアナ（Arabid opsis thaliana）植物を得ることもできる。例えば、Valverkens et al.，（Pro c．Nat．Acad．Sci．（1988）85:5536-5540）により有用な方法が記述されてい る。 Ｂ．粒子ボンバードによる形質転換 問題のDNA配列は、少なくとも１つのプロモータ領域、問題の遺 伝子及び終結領域を含む発現カセットとして、欧州特許出願第332855号及び1988 年７月27日に提出された同時係属出願USSN07/225,332の中に記述されているとお り、粒子ボンバードを介して植物ゲノム内に導入することができる。 簡単に言うと、0.5μＭ〜３μＭのサイズのタングステン又は金の粒子を発現 カセットのDNAでコーディングする。このDNAは水性混合物又は乾燥DNA/粒子沈降 物の形をしていてよい。 ボンバード用標的として用いられる組織は子葉外植体、苗条分裂組織、未成熟 小葉又は葯である。 DNAでコーディングされた粒子を用いた組織のボンバードは、Biolistics^(TM) 粒子ガン（Dupont；Wilmington，D E）を用いて行なわれる。粒子は、銃身口か ら１〜14cmの可変的距離のところで銃身内に入れられる。ボンバードを受けるべ き組織は、停止用プレートの下に置かれる；試験は最高20cmの距離で組織に対し て行なわれる。放出時点で、組織は、10μＭ〜300μＭのメッシュをもつナイロ ンネット又は複数のナイロンネットの組合せによって保護される。 ボンバードの後、Atreya et al.，（Plant Science Lelters（1984）34：379- 383）の方法に従って植物を再生することができる。簡単に言うと、胚芽軸組織 又は子葉の断片をMS培地（Murashige及びSkoog，Physio，Plant，（1962）15：4 73）（子葉断片についてはMs及び2.0mg・ｌの６−べンジルアデニン（BA））上 に置き、25±２℃で１時間暗所にてインキュベートさせ、ひきつづき連続した低 温白色螢光（6.8ｗ／ｍ²）に対し移送する。培養10日目で、小植物を、無菌土壌 を含む植木鉢に移し、３〜５日間日よけの下に保ち、最終的に温室に移動させる 。 推定上のトランスジェニック苗条を発根させる。植物ゲノム内への外因性DNA の組込みは、当業者にとって既知のさまざまな方法に より確認できる。 例６．形質転換された植物の分析 pCGN2797（ナピン５’／Ｒ．コムニスシンターゼＡ因子／ナピン３’及びナピ ン５’／Ｒ．コムニスシンターゼＢ因子／ナピン３’）で形質転換した15のアラ ビドプシス（Arabidopsis）からの種子を、Ｒ．コムニスシンターゼタンパク質 の存在について分析した。これらの植物のうち５つが、ウェスタン分析により、 50kDのＲ．コムニスシンターゼＢ因子タンパク質の発現について陽性というテス ト結果を示す。対応するブラシカシンターゼタンバク質とのＲ．コムニスシンタ ーゼＡ因子ポリクローナル抗体の交差感受性が、ウェスタン分析によるこのシン ターゼタンバク質の検出の妨げとなっている。 50kDのＲ．コムニスシンターゼタンパク質の発現について陽性という結果を示 した植物のうちの２つ、つまり形質転換体＃５及び＃６を分析して、それらの種 子油の脂肪酸組成を決定した。いくつかの非発現形質転換体及び形質転換されて いない対照を同様の要領で分析した。種子脂肪酸組成を、基本的にBrowse et al ．（Anal．Biochem．（1986）152：141-145）により記述されているとおりに酸 メタノリシス方法により決定する。簡単に言うと、各々の試料の種子100個をMeO H中の５％H₂SO₄ １mlで処理し、２時間90℃の水浴中で加熱して脂肪酸を脂肪酸 メチルエステル（FAME_s）に変換する。内部標準（C17.0）を、加熱段階に先立ち 各試料（トルエン中の１mg／ml溶液を250ml）に対し付加する。試料を冷却させ 、その後H₂O中の0.9％NaCl １mlを加えて相内分離を助ける。FAMEを抽出するた めにヘキサン（各バイアルに対し250mlずつ）を加え、その後渦巻運動に付し遠 心分離して位相を分離させる、ヘキサン層を除去し、GC上での注入のためGCオー トサンプラーに移す。これらの分析の ための有用なGC温度プログラムは以下の通りである：すなわち、最初のゼロ分に ついて200℃とし、その後１分につき５度の温度勾配で最終的に250℃まで上昇さ せ、この温度を６分間保つ、以下の表Ｉに合計脂肪酸の％としてデータが報告さ れている。 形質転換体＃５からの種子は3.95％のC16：０を含み、＃６からの種子は4.59 ％のC16：０を含む。非発現性形質転換体及び形質転換されていない対照からの 種子は、5.85〜6.63％のC16：０百分率を有していた。＃５からの種子中の合計 飽和脂肪酸は、形質転換されていない対照からの種子については12.47％の合計 飽和脂肪酸そして非発現形質転換体からの種子について11.57％〜13.33％の範囲 の合計飽和脂肪酸であるのに比べて、9.74％であった。形質転換体＃６からの合 計飽和脂肪酸レベルは10.64％である。 上述の結果は、種子油の組成が修正されたトランスジェニック植物の産生のた めの植物遺伝子工学方法においてシンターゼDNA配列を使用する能力を立証して いる。 本明細書において言及した全ての出版物及び特許出願明細書は、本発明の関連 技術の当業者の技能レベルを表わすものである。全ての出版物及び特許出願明細 書は、個々の出版物又は特許出願明細書が参考として内含されるべきものとして 特定的かつ個別的に表示されている場合と同じ範囲で、本書中に参考として内含 されている。 前述の発明は、理解を明確にするための例として幾分か詳細に記述されてきた が、添付のクレームの範囲内でいくつかの変更及び修正を実施することができる 、ということも明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 9/00 9359−4Ｂ 9/04 Ｚ 9359−4Ｂ 9/16 Ｚ 8827−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 7/64 7432−4Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．５’→３’の転写方向に、植物細胞内で機能的なプロモータ、β−ケトア シル−ACPシンターゼタンパク質コーディング配列及びこのシンターゼタンパク 質コーディング配列に対し３’のところにある転写終了調節領域を含む組換え型 DNA構成体において、前記β−ケトアシル−ACPシンターゼタンパク質が植物以外 の供給源に由来する、組換え型DNA構成体。 ２．前記シンターゼタンパク質コーディング配列がセンス配列の転写のために 方向づけされている、請求の範囲第１項に記載の構成体。 ３．前記シンターゼタンパク質コーディング配列に対し直ぐ５’のところに、 シグナルペプチドをコードする植物配列を含んで成る、請求の範囲第２項に記載 の構成体。 ４．前記シンターゼタンパク質コーディング配列が、E．coli fabH遣伝子配列 である、請求の範囲第３項に記載の構成体。 ５．前記シグナルペプチドコーディング配列がアシル担体タンパク質遣伝子か らのものである、請求の範囲第３項に記載の構成体。 ６．前記プロモータが、好ましくは植物種子組織内で発現される遣伝子からの ものである、請求の範囲第１項に記載の構成体。 ７．請求の範囲第１項に記載の構成体を含む植物細胞。 ８．脂質合成に結びつけられるタンパク質をコードする配列の実質的部分の前 記植物細胞内での転写を提供する第２の組換え型DNA構成体をさらに含んで成る 、請求の範囲第７項に記載の植物細胞。 ９．前記タンパク質がデサチュラーゼ又はチオエステラーゼである、請求の範 囲第８項に記載の細胞。 10．前記植物細胞がブラシカ植物細胞である、請求の範囲第７項 又は第８項に記載の細胞。 11．５’→３’の転写方向に、植物細胞内で機能的なプロモータ、植物シグナ ルペプチドコーディング配列、成熟Ｒ．コムニスβ−ケトアシル−ACPシンター ゼＡ因子コーディング配列、及びこのシンターゼＡ因子コーディング配列に対し ３’のところにある転写終結調節領域を含んで成る組換え型DNA構成体において 、前記シグナルペプチドコーディング配列が天然に前記Ｒ．コムニスβ−ケトア シル−ACPジンターゼＡ因子コーディング配列と結びついていない、組換え型DNA 構成体。 12．前記植物シグナルペプチドコーディング配列が、ブラシカβ−ケトアシル −ACPシンターゼタンパク質をコードする遺伝子からのものである、請求の範囲 第11項に記載の構成体。 13．前記ブラシカシンターゼタンパク質がシンターゼＡ因子である、請求の範 囲第12項に記載の構成体。 14．前記植物シグナルペプチドコーディング配列が、ステアロイル−ACPデサ チュラーゼタンパク質をコードする遺伝子からのものである、請求の範囲第11項 に記載の構成体。 15．請求の範囲第11項に記載の構成体を含んで成る植物細胞。 16．前記植物細胞がブラシカ植物細胞である、請求の範囲第15項に記載の細胞 。 17．組換え型DNA配列から発現された非植物β−ケトアシル−ACPシンターゼタ ンパク質を含んで成るトランスジェニック植物細胞。 18．前記非植物シンターゼタンパク質が、Ｅ．コリfabHによりコードされるβ −ケトアシル−ACPシンターゼタンパク質である、請求の範囲第17項に記載の細 胞。 19．β−ケトアシル−ACPシンターゼタンパク質の産生を可能に する条件下で、請求の範囲第１項に記載の構成体を含んで成る植物細胞又はその 後代を成長させる段階を含む、植物細胞又はその後代の中で非植物β−ケトアシ ル−ACPシンターゼタンパク質を産生する方法。 20．請求の範囲第19項に従って産生された非植物β−ケトアシル−ACPシンタ ーゼタンパク質を含む植物細胞。 21．前記構成体が前記植物細胞のゲノム内に組込まれている、請求の範囲第20 項に記載の植物細胞。 22．５’→３’の転写方向に、その植物細胞内で機能的なプロモータ、非植物 β−ケトアシル−ACPシンターゼタンパク質コーディング配列及びこの植物細胞 内で機能的な転写終結領域を含むDNA構成体を自らのゲノムの中に組込んだ植物 細胞を、前記シンターゼタンパク質コーディング配列の発現を可能にする条件下 で成長させる段階を含む、植物細胞内で脂肪酸組成物を修正する方法。 23．前記シンターゼタンパク質コーディング配列がセンス配列である、請求の 範囲第22項に記載の方法。 24．前記シンターゼタンパク質が、Ｅ．コリfabHによりコードされるβ−ケト アシル−ACPシンターゼタンパク質である、請求の範囲第23項に記載の方法。 25．シンターゼタンパク質コーディング配列の転写を可能にする条件下で、請 求の範囲第11項に記載のDNA構成体を自らのゲノム内に組込んだ植物細胞を成長 させる段階を含む、植物細胞中の脂肪酸組成物を修正する方法。 26．前記植物細胞が油料種子植物の種子細胞である、請求の範囲第22項又は第 25項に記載の方法。 27．請求の範囲第26項に記載の方法に従って産生した修正済みの遊離脂肪酸組 成物を有する植物細胞。 28．−調節要素の活性を促進する条件下で、脂質蓄積中に種子中で機能的な調 節要素の転写制御下にある非植物β−ケトアシル−ACPシンターゼタンパク質コ ーディング配列を含む組換え型DNA配列を自らのゲノム内に組込んだ植物を成長 させて種子を生じさせる段階及び −この種子を収穫する段階、 を含んで成る方法に従って産生された、未変性脂肪酸組成物を有する前記植物の 種子と比べて変性された脂肪酸組成物を有する植物種子。 29．前記シンターゼタンパク質が、Ｅ．コリfabHによりコードされたβ−ケト アシル−ACPシンターゼタンパク質である、請求の範囲第28項に記載の種子。 30．−調節要素の活性を促進する条件下で、請求の範囲第11項に記載の組換え 型DNA構成体を自らのゲノム内に組込んだ植物を成長させて種子を生じさせる段 階、及び −この種子を収穫する段階、 を含んで成る方法に従って産生された、未変性脂肪酸組成物を有する前記植物の 種子と比べて修正された脂肪酸組成物を有する植物種子。 31．前記植物が油料種子植物である、請求の範囲第28項又は第30項に記載の種 子。 32．前記植物がブラシカである、請求の範囲第31項に記載の種子。 33．油料種子作物から産生されたトリグリセリドの脂肪酸組成物を修正する方 法において、 −５’→３’の転写方向に、植物細胞内で機能的なプロモータ及び非植物β−ケ トアシル−ACPシンターゼタンパク質コーディング配 列を含んで成るDNA構成体を自らのゲノム内に組込んだ植物細胞を、このシンタ ーゼタンパク質コーディング配列の転写を可能にする条件下で成長させる段階、 を含む、油料種子作物から産生されたトリグリセリドの脂肪酸組成物を修正する 方法。 34．前記シンターゼタンパク質コーディング配列がセンス配列である、請求の 範囲第33項に記載の方法。 35．前記シンターゼタンパク質が、Ｅ．コリfabHによりコードされるβ−ケト アシル−ACPシンターゼタンパク質である、請求の範囲第34項に記載の方法。 36．シンターゼタンパク質コーディング配列の転写を可能にする条件下で、請 求の範囲第11項に記載のDNA構成体を自らのゲノム内に組込んだ植物細胞を成長 させる段階を含む、油料種子作物から産生されたトリグリセリドの脂肪酸組成物 を修正する方法。 37．前記植物細胞が種子細胞である、請求の範囲第33項又は36項に記載の方法 。 38．請求の範囲第37項に従って産生されたトリグリセリドの修正された脂肪酸 組成物を有する植物細胞。 39．ナタネ、ヒマワリ、サフラワー、綿、クフェア（cuphea）、ダイズ、ラッ カセイ、ココナツ、ギネアアブラヤジ及びトウモロコシから成るグループの中か ら前記油料種子作物が選択される、請求の範囲第37項に記載の方法。 40．請求の範囲第31項に従って産生された種子から分離された植物種子油。 41．前記植物がブラシカである、請求の範囲第１項に記載の油。