JPH08507436A

JPH08507436A - 犬の鱗屑由来のアレルゲン性蛋白質及びペプチド並びにそれらの利用

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Publication number: JPH08507436A
Application number: JP6516036A
Authority: JP
Inventors: ピー．モーゲンスターン，ジェイ; コニエツニ，アンドレイ; ビー．ビジンカウスカス，クリスティン; ダブリュー．ブラウア，アンドルー
Original assignee: イミュロジックファーマスーティカルコーポレイション
Priority date: 1992-12-31
Filing date: 1993-12-30
Publication date: 1996-08-13
Also published as: US20070202132A1; US20030049691A1; US20060057641A1; DE69333985T2; CA2152818A1; EP0677105A1; EP1277764A2; ES2260756T3; US6489118B2; ATE318902T1; US20020012963A1; US5891716A; WO1994016068A3; US7166291B2; AU5957694A; DK0677105T3; US7026128B2; US5843672A; EP1277764A3; WO1994016068A2

Abstract

(57)【要約】 Canis familiarisのアレルゲンCanf I又はCanf IIをコードする単離された核酸を開示する。Canf I活性及び予想分子量約１９，２００ダルトンを有するペプチドをコードするｃＤＮＡをも記載する。Canf II活性及び予想分子量約１８，２００ダルトンを有するペプチドをコードするｃＤＮＡをも記載する。これらの核酸をプローブとして用いて、試料中のCanf I若しくはCanf II核酸の存在を検出することが出来、又はCanf I若しくはCanf II活性を有するペプチドの組換え産生のために用いることが出来る。Canf I若しくはCanf II活性を有するペプチドを薬剤投与に適した組成物又は犬鱗屑に対する感受性を診断する方法において用いることが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】犬の鱗屑由来のアレルゲン性蛋白質及びペプチド並びにそれらの利用発明の背景人口の約１０％は、種々の環境起源の抗原にさらされることにより過剰感作（アレルギー性）となる。それらの即時型及び／又は遅延型の過敏症を誘発する抗原はアレルゲンとして知られている（King，T．P.,（1976）Adv.Immunol.,23:77 -105）。これらは、草、木、雑草、動物の鱗屑、昆虫、食物、薬物及び化学物質を含む。枯草熱、喘息及び発疹の症状を含むアトピー及びアナフィラキシー等の即時型アレルギー応答の進展においては、個人の遺伝的素因が役割を演じると考えられる（Young,R.P.等、（1990）Clin.Sci.,79:19a）。アトピー性アレルギーに関係する抗体は、主として免疫グロブリンのＩｇＥクラスに属する。ＩｇＥは、好塩基球、マスト細胞及び樹状細胞に特異的な高アフィニティーレセプターＦｃεＲＩを介して結合する（Kinet,J.P.,（1990）Curr. Opin.Immunol. ,2:499-505）。リガンドとして作用するアレルゲンと同系のレセプターＩｇＥとの結合により、このＩｇＥに結合したＦｃεＲＩは、その細胞表面で架橋されてＩｇＥ−アレルゲン相互作用の生理的明示を生じる。これらの生理的効果は、他の物質のうちで、ヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、エオシン好性白血球に対する走化性因子及び／又はロイコトリエンＣ４、Ｄ４及びＥ４（これらは、気管支平滑筋の長期の収縮を引き起こす）の放出を含む（Hood，L.E.等、Immunology（第２版）、The Benjamin/Cummung Publishing Co.，Inc.（1984））。それ故に、アレルゲンとＩｇＥとの相互作用の最終的な結果は、上記のメディエーターの放出により引き起こされるアレルギー性症状である。かかる症状は、その性質において、抗原が侵入した経路及びＩｇＥのマスト細胞若しくは好塩基球への付着パターンによって、全身性であり又は局所的であり得る。局所的明示は、一般に、アレルゲンが侵入した部位の上皮表面に起きる。全身性効果は、循環（血管内）抗原に対するＩｇＥ−好塩基球応答から生じるアナフィラキシー（アナフィラキシー性ショック）を誘導し得る。ペットの犬（Canis familiaris）は、世界中の家庭で飼われている。通常的に犬が飼われている家及び公立学校においては、犬の鱗屑のアレルゲンが塵試料中に検出され得る（Wood，R.A.等（1988）Am Rev Respir.Dis.,137:358-363及びDy bendal，T.等（1989）Allergy,44:401-411）。皮膚プリック試験で評価した犬に対するアレルギーの罹患率は、約１５％である（Haahtela，T.等、（1981）Alle rgy ，36:251-256及びGroot，H．等、（1991）J.Allergy Clin.Immunol.,87:1056 -1065）。ある研究において、犬アレルゲンに対する感受性は、喘息の子供の４０％において、彼らの家庭で犬をペットとして飼っていないのに検出された（Vanto，T．及びKoivikko ,A.,（1983）Acta Paediatr Scand.，72:571-575）。犬の鱗屑の抽出物の投与による犬アレルギーの患者の治療は、猫の鱗屑の抽出物を用いる猫アレルギー患者の治療程効果があるとは判明していない（Hedlin,G ．等、（1991）J.Allergy Clin Immunol.,87:955-964）。増大する投与量のアレルゲンの注射を含む如何なる脱感作計画を用いても、治療中の潜在的アナフィラキシーの欠点があり、又、臨床症状の有意の低減を生じるのに十分な寛容を確立するには数年間にわたる治療を継続する必要があり得る。犬の毛及び鱗屑の抽出物は、多くのアレルゲン性蛋白質を含む複雑な混合物である（Loewenstein,H等、（1982）Proceedings 11th International Congress o f Allergology and Clinical Immunology，London，545-548;Uchlin，T等、（19 84）Allergy,39:125-133;Yman,L.等（1984）Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.U,44 :358-368;Spitzauer,S.等、（1993）Int.Arch.Allergy Immunol.,100:60-67）。犬の毛／鱗屑中に存在する２種のアレルゲンが、イムノアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製された。犬由来の主要アレルゲンCanf I（ＩＵＩＳの基準による命名（Marsh,D.G.等、（1988）Clin.Allergy,18:201-209;オリジナル命名法によるAg13）が、２つのグループによって部分精製された（Schou,C.等、（1991）Cl in.and Exp.Allergy,21:321-328及びde Groot等、前出）。両グループはCanf I を部分精製し、ＣＲＩＥ分析（Ford A.W．等、（1989）Clin.Exp.Allergy,19:18 3-190）によりアレルゲンとして確立し、次いで、ウサギ又はＢａｌｂ／ｂマウスを免疫してこのアレルゲンに対するポリクローナル若しくはモノクローナル抗体をそれぞれ得た。犬アレルギー患者間の高頻度の陽性皮膚プリック試験を誘出したイムノアフィニティー精製したCanf I（分子量〜２５ｋＤ、〜１８ｋＤの少量成分を伴う）は、ＲＡＳＴ（放射アレルゴソルベント試験）分析において犬鱗屑抽出物に結合するＩｇＥの５０〜７０％を涸渇させることが出来た。de Groot 等はCanf Iの如何なるアミノ酸配列の決定も試みなかったが、Schou等は、彼らのイムノアフィニティー精製したCanf Iのアミノ末端がブロックされていることを見出した。それ故に、現在、Canf Iのアミノ酸配列は、公開されたものはない。犬抽出物中の第２の（少量）アレルゲンの存在は、幾つかのグループにより、犬鱗屑／毛抽出物に対するＩｇＥ抗体の結合により検出さ。れた（de Groot等、 Schou,C.等、前出及びSpitzauer等、（1993）Int.Arch.Allergy Immunol.,100:6 0-67）。少量アレルゲンの分子量は、１８ｋＤ（Schou等、前出）、１９ｋＤ（S pitzauer等、前出）及び２７ｋｄ（de Groot等、前出）と報告された。しかしながら、これらの結果を相関させることは、１グループ（de Groot等、前出）のみがCanf IIと呼ばれる（最初は、Dog2アレルゲンと命名された）アレルゲンをアフィニティー精製したので困難である。Canf IIは、Canf Iと類似の方法にて犬鱗屑抽出物から、抽出物中に存在する第２アレルゲン（de Groot等、前出）に対して生成されたモノクローナル抗体を用いて精製された。このグループにより〜２７ｋＤとして報告されたCanf IIの分子量は、後に〜２４ｋＤに変更された（Aalberse,R.C．私信）。精製Canf IIアレルゲンは、犬アレルギー患者の６６％としか反応しないことが見出された。ＲＡＳＴ分析において、Canf IIアレルゲンは、犬鱗屑抽出物に対するＩｇＥの２３％と競争することが出来た。このCanf IIのアミノ酸配列は、以前には、決定されていない。犬鱗屑アレルゲンに対する感受性を有する多くの患者は、現在、少量の犬鱗屑抽出物を徐々に投与量を増加させる投与によって治療されている。これらの抽出物の利用は、治療中の潜在的アナフィラキシー並びに十分な寛容及び臨床症状の有意の軽減を確立するのにしばしば数年間にわたる治療継続の必要があることを含む多くの欠点を有する。少なくともこれらのCanf I及びCanf II等の主要犬鱗屑アレルゲンの組成物の代用となる能力は、これらの欠点の幾つかを克服するであろう。従って、診断若しくは治療用試薬としての利用のための量で供給し得る純粋なアレルゲン源及び犬鱗屑抽出物と関係する欠点を克服する治療法は、大いに望ましい。発明の要約この発明は、Canis familiaris種の蛋白質アレルゲンCanf I若しくはCanf II の少なくとも１つの生物学的活性を有するペプチドをコードする単離された核酸を提供する。好適核酸は図５（SEQ ID NO:1）（Canf I）及び図１８（SEQ ID NO :67）（Canf II）に示した核酸配列を有するｃＤＮＡである。この発明は又、かかるｃＤＮＡ（SEQ ID NO:1及びSEQ ID NO:67）の全部又は一部によりコードされ且つCanf I若しくはCanf IIの少なくとも１つの生物学的活性を有するペプチドにも関係する。高緊縮条件（例えば、Ｔｍより低い２０〜２７℃及び１ＭＮａＣｌと同等）下で図５（SEQ ID NO:1）又は図１８（SEQ ID NO:67）に示した核酸配列を有し且つ図５（SEQ ID NO:2）（Canf I）又は図１８（SEQ ID NO:68 ）（Canf II）のアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする単離した核酸をも企図している。Canf I若しくはCanf IIの活性を有し且つ図５（SEQ ID N0:2）（Canf I）若しくは図１８（SEQ ID N O:68）（Canf II）に示した配列と少なくとも５０％の相同性を有するペプチドをコードする核酸をも叙述する。この発明の核酸の組換え発現により産生されたCanf I若しくはCanf II活性を有するペプチド及び化学合成により製造したCanf I若しくはCanf II活性を有するペプチドも又この発明で叙述する。好適ペプチドは、Ｔ細胞刺激を含むＴ細胞応答（例えば、Ｔ細胞増殖若しくはサイトカイン分泌により測定）又はＴ細胞不応答（即ち、ペプチド若しくはペプチドの複合体と抗原提示細胞のＭＨＣ分子との接触がＴ細胞に刺激シグナルに対する非応答性若しくは増殖不能を誘導する）を誘導する能力を有する。他の好適ペプチドは、Ｔ細胞応答を誘導する能力と別に若しくはそれに加えて、犬鱗屑アレルギー患者の犬鱗屑特異的ＩｇＥと結合する能力を有する。かかるペプチドは、患者における犬鱗屑に対する感受性を診断するのに有用である。更に他のペプチドは、Ｔ細胞応答を誘導する能力と別に若しくはそれに加えて、減少した若しくは無視し得る犬鱗屑アレルギー性ＩｇＥと結合する能力を有する。かかるペプチドは、特に、治療剤として有用である。他の好適ペプチドは、図５（SEQ ID NO:2）（Canf I）又は図１８（SEQ ID NO :68）（Canf II）に示したアミノ酸配列を含む。一具体例において、Canf I若しくはCanf II活性を有し且つ図５（SEQ ID NO:2）若しくは図１８（SEQ ID NO:68 ）のアミノ酸配列の一部を含むペプチドは、少なくとも約８〜３９アミノ酸、好ましくは約１０〜２０アミノ酸、最も好ましくは約１０〜１６アミノ酸の長さである。この発明の他の面は、Canf I若しくはCanf II活性を有するペプチドと特異的に反応性である抗体を叙述する。Canf I若しくはCanf I Iの活性を有するペプチドは薬剤投与に適した組成物において用いることが出来る。例えば、かかる組成物は、犬鱗屑抽出物に類似の方法で用いて患者における犬鱗屑に対するアレルギー反応を治療し又は予防することが出来る。この発明の核酸及びCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを用いて犬鱗屑に対する患者の感受性を診断することも出来る。図面の簡単な説明図１は、ＰＣＲ増幅のＭＯＰＡＣ技術で用いる成熟Canf I蛋白質の９〜１５及び３０〜３７残基に基づく縮重プライマー対を示す。Canf I蛋白質の１７〜２４残基（Ｄｏｇプローブ１）及び８８〜９４残基（Ｄｏｇプローブ２）に基づく２つの内部縮重オリゴヌクレオチドプローブを示している。図２は、ＲＡＣＥＰＣＲプロトコールでCanf IｃＤＮＡの３’部分を得るために用いるオリゴヌクレオチドを示す。縮重オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄｏｇプローブ４）も又示してある。図３は、アンカードＰＣＲ技術でCanf IｃＤＮＡの５’末端を決定するために用いるプライマーを示す。Canf 蛋白質の９〜１７残基に基づく縮重オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄｏｇプローブ０）が示されている。図４は、増幅したｃＤＮＡの両鎖からの成熟Canf I蛋白質の配列を得るために用いたＰＣＲ配列決定ストラテジーの図式表示である。図５は、Canf IのｃＤＮＡ配列及び演繹したアミノ酸配列である。図６は、Canf I組換え蛋白質を細菌中で発現させるために用いたストラテジーの図式表示である。図７は、Canf II組換え蛋白質を哺乳動物細胞内でｐＪ７Ｌ発現ベクターを用いて発現させるために用いたストラテジーの図式表示である。図８は、Ｈｉｓ６レポーター基を組換えCanf I蛋白質のカルボキシ末端に蛋白質の精製を助成するために挿入するために用いたストラテジーの図式表示である。図９は、３つの部分的３’Canf IｃＤＮＡ配列（Canf I、2Canf I及び3Canf I ）の整列を示す。（＊）は、この整列において完全に保存されている部分を示し、（．）は、よく保存されている部分を示す。（−）は、整列させる目的で必要な場所に挿入した。図１０は、イン・ビトロで組換えCanf I（rCanf I）でプライムし、rCanf I及びCanf Iから誘導した種々のペプチドに対する応答についてポジティビティーインデックス（陽性応答した患者の％に平均刺激インデックスを乗じたもの）により分析した患者由来のＴ細胞系統の応答を描いたグラフ表示である。図１１は、細菌で発現させた組換えCanf Iに対する一人の犬アレルギー患者由来のＩｇＥの直接結合アッセイのグラフ表示である。図１２は、４つの蛋白質調製物の、犬アレルギー患者（９０１番）由来の血漿又は陰性対照患者（２５０番）由来の血漿をプローブとして用いたウエスタンブロット分析（レーン１：犬の毛の抽出物；レーン２：犬の唾液；レーン３：細菌で発現させた組換えCanf I；及びレーン４：哺乳動物細胞培養システムにて発現させた組換えCanf I）を示す。図１３は、成熟Canf IIの部分アミノ酸配列に基づくプライマーのデザイン及びCanf IIについての配列決定ストラテジーを示す。（）は、決定されなかった残基を示す。図１４は、Canf II ｃＤＮＡをクローン化するために用いたストラテジーの図式表示である。図１５は、天然のCanf IIのアミノ酸配列の一部（影を付けてある）をコードする配列に隣接するCanf II ｃＤＮＡの５’（Ａ）及び３’（Ｂ）部分をクローン化するために用いたストラテジーの図式表示である。図１６は、Canf II ｃＤＮＡのクローニングにおいて用いたプライマーのヌクレオチド配列である。図１７は、Canf II ｃＤＮＡクローン１ａ、１ｃ及び１ｊのヌクレオチド配列を決定するために用いたシーケンスストラテジーを示す。この図には、ｃＤＮＡクローン１ａ（７９３ｂｐ）、１ｃ（７９１ｂｐ）及び１ｊ（７７４ｂｐ）の挿入を描いてある。斜線を付けたバーは、コード配列を表している。三角形は、開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）の位置；成熟蛋白質のＮ末端アミノ酸残基を特定するコドン（ＳＴＡＲＴ）；停止コドン（ＳＴＯＰ）の位置；及びポリアデニル化シグナル（Ａｓ）の位置を示している。矢印は、配列決定反応の範囲及び方向を示している。図１８は、Canf IIのｃＤＮＡ配列及び演繹したアミノ酸配列（クローン１ｃより）である。図１９は、クローン１ｃのｃＤＮＡ配列及びＮ末端の蛋白質配列決定により決定した天然Canf IIの一部に基づくCanf IIの演繹したアミノ酸配列の比較である。シグナルペプチドのアミノ酸残基は、−１９〜−１に番号付けしてある。図２０は、種々の犬組織のｍＲＮＡのノーザン分析を示す。犬の舌の上皮組織、耳下唾液腺、皮膚、大顎腺及び顎下腺、肝臓及び脾臓由来の全細胞ＲＮＡ（２５ｍｇ）を、Canf II ｃＤＮＡをプローブとして用いるノーザン分析にかけた。ＲＮＡマーカーの位置をキロベース（ｋｂ）で示してある。図２１は、Canf IIのアミノ酸配列と相同な蛋白質ＭＵＰ６マウス及びラットＡ２Ｕとの比較である。この整列は、Gene Worksプログラムを用いて作成した。シグナル配列２は下線を引いてある。３つの蛋白質すべてで同一のアミノ酸残基はボックスで囲んである。図２２Ａ〜Ｃは、天然のCanf II及び組換えCanf IIに結合するヒトＩｇＥの直接結合アッセイのグラフ表示である。図２３は、Canf IIの部分若しくは全長をコードするｃＤＮＡクローン１ａ、１ｃ及び１ｊの間のヌクレオチドコンセンサス配列である。図２４は、組換えCanf I（rCanf I）を用いてイン・ビトロでプライムし、rCa nf I及びCanf Iから誘導した種々のペプチドに対する応答について刺激インデックスにより分析した１２人の患者に由来するＴ細胞系統の応答を描いたグラフ表示である。バックグラウンドの２倍以上の刺激インデックスを「陽性」と考える。図２５は、組換えCanf I（rCanf I）を用いてイン・ビトロでプライムし、rCa nf I及びCanf Iから誘導した種々のペプチドに対する応答についてこれらのペプチドに対する陽性応答を有する患者群について平均刺激インデックスにより分析した１２人の患者に由来するＴ細胞系統の応答を描いたグラフ表示である。発明の詳細な説明この発明は、Canis familiaris種のアレルゲンCanf I若しくはCanf IIの少なくとも１つの生物学的活性を有するペプチドをコードする単離した核酸に関するものである。好ましくは、この核酸は、図５（SEQ ID NO:1）（Canf I）若しくは図１８（SEQ ID NO:67）（Canf II）に示したヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡである。図５に示したｃＤＮＡ（SEQ ID NO:1）は、塩基１〜７８によりコードされる２６アミノ酸のリーダー配列を含むCanf Iペプチドをコードしている。このリーダー配列は、塩基７９〜５２５によりコードされる成熟Canf I蛋白質中には見出されない。このｃＤＮＡに基づくCanf Iの演繹されたアミノ酸配列も又図５に示してある（SEQ ID NO:2）。このｃＤＮＡは、予想分子量１９．３ｋＤａ、ｐＩ５．５３及び単一の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を有する成熟ペプチドをコードする。Canf IをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした大腸菌の培養物をブダペスト条約の下でAmerican Type Culture Collectionに１９９２年１２月２２日に寄託し、受託番号６９１６７を受けた。図１８に示したｃＤＮＡ（SEQ ID NO:67）は、塩基１９５〜２５１によりコードされる１９アミノ酸のリーダー配列を含むCanf IIペプチドをコードする。このリーダー配列は、塩基２５２〜７３４によりコードされる成熟Canf II蛋白質中には見出されない。このｃＤＮＡに基づいて演繹したCanf IIのアミノ酸配列を図１８に示す（SEQ ID NO:68）。このｃＤＮＡは、予想分子量１８．２２９ｋＤａ、成熟組換えCanf II蛋白質についてはｐＩ４．５４、全長の（シグナル配列を含む）組換えCanf II蛋白質についてはｐＩ４．４４及び単一の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を有するCanf IIペプチドをコードする。Ｎ結合グリコシル化はこのペプチドの分子量を増大させ及び成熟蛋白質のｐＩを変化させ得る。Canf IIをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした大腸菌の培養物をブダペスト条約の下でAmerican Typ e Culture Collectionに１９９３年１２月２９日に寄託し、受託番号ＸＸＸＸを受けた。従って、この発明の１つの面は、Canf I若しくはCanf IIをコードするヌクレオチド配列、Canf I若しくはCanf IIの少なくとも１つの生物学的活性を有するペプチドをコードするその断片、及び／又はかかる核酸の同等物を含む単離した核酸に関係する。この核酸という用語は、ここで用いる場合、かかる断片及び同等物を含むことを意図する。この同等物という用語は、機能的に同等のCanf I若しくはCanf II蛋白質又はCanf I若しくはCanf IIの活性を有する機能的に同等なペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを意図する。ここに規定するように、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドは、Canf I若しくはCan f IIアレルゲンの少なくとも１つの生物学的活性を有する。同等なヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチドの置換、付加又は欠失により異なる配列例えば対立遺伝子変異物を含み、又、遺伝コードの縮重のために図５（SEQ ID NO:1）若しくは図１８（SEQ ID NO:67）に示したCanf I若しくはCanf IIをコードするヌクレオチド配列と異なる配列をも含む。同等物は又、緊縮条件（即ち、融解温度（Ｔｍ）より低い約２０〜２７℃に等しく且つ約１Ｍの塩）の下で、図５（SEQ ID NO:1）に示したCanf I若しくは図１８（SEQ ID NO:67）に示したCanf IIのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列をも含む。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するとしてここで言及するペプチドは、図５若しくは図１８に示したCanf I（SEQ ID NO:2）若しくはCanf II（SEQ ID NO: 68）のアミノ酸配列の全部若しくは一部に対応するアミノ酸配列を有するペプチドとしてここに定義する（該ペプチドは、Canf I若しくはCanf IIの少なくとも１つの生物学的活性を有する）。例えば、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドは、Canf I若しくはCanf II制限されたＴ細胞における応答例えば刺激（例えば、Ｔ細胞増殖若しくはサイトカイン分泌）を誘導する能力又はＴ細胞不応答を誘導する能力を有し得る。或は（若しくは更に）Canf I若しくはCanf I Iの活性を有するペプチドは、犬鱗屑アレルギー患者の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体に結合する（認識される）能力を有し得る。ＩｇＥに結合するペプチドは、患者におけるCanf I若しくはCanf IIに対するアレルギー性感受性を検出する方法において有用である。ＩｇＥに結合しないか又は精製した天然のCanf I若しくはCanf II蛋白質がＩｇＥに結合するよりも低い程度でＩｇＥに結合するペプチドは、特に、治療剤として有用である。一具体例において、核酸は、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドをコードするｃＤＮＡである。好ましくは、この核酸は、図５（SEQ ID NO:1）及び図１８（SEQ ID NO:67）に示したCanf I若しくはCanf IIをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むｃＤＮＡ分子である。図５及び図１８のｃＤＮＡ分子の好適部分は、この分子のコード領域を含む。他の具体例において、この発明の核酸は、Canf I若しくはCanf IIの活性を有し且つ図５（SEQ ID NO:2）（Canf I）若しくは図１８（SEQ ID NO:68）（Canf II）に示したアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。好適核酸は、Canf I若しくはCanf II活性を有し且つ図５（SEQ ID NO:1）（Canf I）若しくは図１８（ SEQ ID NO:67）（Canf II）に示した配列と少なくとも約５０％の相同性、一層好適には少なくとも約６０％の相同性、最も好適には少なくとも約７０％の相同性を有するペプチドをコードする。Canf I若しくはCanf II活性を有し且つ図５（SEQ ID NO:2）（Canf I）若しくは図１８（SEQ ID NO:68）（Canf II）に示した配列と少なくとも約９０％、一層好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは約９８〜９９％の相同性を有するペプチドをコードする核酸も又この発明の範囲内にある。相同性とは、Canf I若しくはCanf IIの活性を有する２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性のことをいう。相同性は、比較の目的で整列させた各配列中の位置を比較することによって決定することが出来る。比較した配列中の位置が同じ塩基若しくはアミノ酸で占められている場合には、これらの分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、これらの配列で共有されるマッチング数即ち相同な位置の関数である。この発明の他の面は、図５（SEQ ID NO:2）（Canf I）若しくは図１８（SEQ I D NO:68）（Canf II）に示したアミノ酸配列の全部若しくは一部を有するペプチドをコードする核酸と高若しくは低緊縮条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当な緊縮条件例えば６．０× 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）（約４５℃）とその後の２．０ ×ＳＳＣ（５０℃）での洗浄は、当業者に公知であり、Current Protocols in M olecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.（1989），6.3.1-6.3.6.中に見出すことが出来る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、約２．０×ＳＳＣ（５０ ℃）の低緊縮から約０．２×ＳＳＣ（５０℃）の高緊縮までから選択することが出来る。更に、洗浄工程における温度は、約２２℃の室温の低緊縮条件から約６５℃の高緊縮条件まで増大させることが出来る。ここに記載のようなCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチド及び遺伝コードの縮重のために図５（SEQ ID NO:1）及び図１８（SEQ ID NO:67）に示したヌクレオチド配列と異なる配列を有するペプチドをコードする単離した核酸も又この発明の範囲内にある。かかる核酸は、機能的に同等のペプチド（即ち、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチド）であるが、遺伝コードの縮重のために図５及び図１８の配列とは異なる配列のペプチドをコードしている。例えば、多くのアミノ酸は、１つより多くのトリプレットにより指定される。同じアミノ酸を特定するコドン即ちシノニム（例えば、ＣＡＵとＣＡＣはヒスチジンに対するシノニムである）は、Canf I若しくはCanf II蛋白質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」突然変異を生じ得る。しかしながら、Canf I若しくはCanf IIのアミノ酸配列の変化へ導くＤＮＡ配列多形が犬鱗屑集団内に存在することが予想される。当業者は、Canf I若しくはCanf II の活性を有するペプチドをコードする核酸の１つ以上のヌクレオチドにおけるこれらの変化（ヌクレオチドの約３〜４％まで）が自然の対立遺伝子変化のために個々のペットの犬の間に存在し得ることを認めるであろう。任意の及びすべてのかかるヌクレオチド変化並びにその結果のアミノ酸多形は、この発明の範囲内にある。更に、１つ以上のCanf I若しくはCanf IIのイソ型又は関連する交差反応ファミリーメンバーがある。かかるイソ型又はファミリーメンバーを、Canf I若しくはCanf IIと機能的及びアミノ酸配列において関連するが、異なる遺伝子座の遺伝子によりコードされる蛋白質として規定する。 Canf I若しくはCanf IIをコードする核酸の断片も又この発明の範囲内にある。ここで用いる場合、Canf I若しくはCanf IIをコードする核酸の断片とは、Can f I若しくはCanf II蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列及びここで規定するようなCa nf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチド（即ち、Canf I若しくはCanf IIアレルゲンの少なくとも１つの生物学的活性を有するペプチド）をコードするヌクレオチド配列のことをいう。好適核酸断片は、少なくとも約１０アミノ酸残基長の、好ましくは約１０〜２０アミノ酸残基長の、一層好ましくは約１２〜１６アミノ酸残基長のペプチドをコードする。少なくとも約３０アミノ酸残基長の、少なくとも約４０アミノ酸残基長の、少なくとも約６０アミノ酸残基長の、少なくとも約８０アミノ酸残基長の、少なくとも約１００アミノ酸残基長の及び少なくとも約１４０残基長以上のCanf I活性を有するペプチドをコードする核酸断片も又、この発明の範囲内にある。少なくとも約３０アミノ酸残基長の、少なくとも約４０アミノ酸残基長の、少なくとも約６０アミノ酸残基長の、少なくとも約８０アミノ酸残基長の、少なくとも約１００アミノ酸残基長の、少なくとも約１４０残基長の及び少なくとも約１６０アミノ酸残基長以上のCanf II活性を有するペプチドをコードする核酸断片も又、この発明の範囲内にある。この発明の範囲内の核酸断片は、Canf I若しくはCanf II又はCanf I若しくはC anf IIと交差反応性のアレルゲンを検出するスクリーニングプロトコールで用いるために、高若しくは低緊縮条件下で他の動物種由来の核酸とハイブリダイズすることの出来るものを含む。一般に、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドをコードする核酸を、成熟蛋白質をコードする塩基から選択するが、幾つかの例では、この発明の核酸のリーダー配列部分からのペプチドの全部若しくは一部を選択することが望ましい。この発明の範囲内の核酸は又、Canf I若しくはCanf IIの活性を有する組換えペプチドの分子クローニング、発現若しくは精製に有用な、リンカー配列、修飾制限エンドヌクレアーゼ部位及び他の配列をも含んでよい。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドをコードする核酸は、ペットの犬Canis familiarisの唾液腺その他の器官に存在するｍＲＮＡから得ることが出来る。Canis familiarisのゲノムＤＮＡからCanf I若しくはCanf IIをコードする核酸を得ることも又可能である。例えば、Canf I若しくはCanf IIをコードする遺伝子を、ｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーの何れかから、ここに記載のプロトコールに従ってクローン化することが出来る。Canf I若しくはCanf II をコードするｃＤＮＡは、Canis familiarisから全ｍＲＮＡを単離することにより得ることが出来る。次いで、二本鎖ｃＤＮＡを全ｍＲＮＡから調製することが出来る。続いて、これらのｃＤＮＡを、公知の幾つかの技術の内の任意の１つを用いて、適当なプラスミッド若しくはバクテリオファージベクターに挿入することが出来る。Canf I若しくはCanf IIをコードする遺伝子は又、この発明により提供されるヌクレオチド配列情報によって、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を用いてクローン化することも出来る。この発明の核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。好適核酸は、図５（SEQ ID NO:1）（Canf I）若しくは図１８（SEQ ID NO:67）（Canf II）に描かれた配列を有するCanf Ｉ若しくはCanf IIをコードするｃＤＮＡである。この発明は又、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター（少なくとも１つの制御配列に操作可能に結合したもの）をも提供する。操作可能に結合したとは、ヌクレオチド配列が制御配列にそのヌクレオチド配列の発現を可能とするような仕方で結合することを意味する。制御配列は、技術的に認識され（art-recognized）且つCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドの発現を指示するために選択される。従って、この制御配列という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素を含む。かかる制御配列は、Goeddel;Gene Expression Technology：Methods in Enzymolog y 185，Academic Press，カリフォルニア、San Diego（1990）に記載されている。発現ベクターのデザインが、トランスフォームすべき宿主細胞の選択及び／又は発現させたい蛋白質の型等の因子に依存し得ることは理解されるべきである。一具体例において、発現ベクターは、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを含む。かかる発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクトし、それにより、蛋白質若しくはペプチド（ここに記載のような核酸によりコードされる融合蛋白質若しくはペプチドを含む）を産生することが出来る。この発明は、更に、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞に関係する。この宿主細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞であってよい。例えば、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドは、大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母、又はチャイニーズハムスター巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞において発現させることが出来る。他の適当な宿主細胞は、Goeddel,（1990）（前出）中に見出され又は当業者に公知である。真核細胞例えば哺乳動物、酵母又は昆虫細胞における発現は、組換え蛋白質の部分的若しくは完全なグリコシル化及び／又は関連する鎖間若しくは鎖内ジスルフィド結合の形成へと導き得る。酵母S.cerivisae中での発現のためのベクターの例は、pYepSecl（Baldari等（1987）Embo J. ,6:229-234），pMFa（Kurjan及びHerskowitz,（1982）Cell,30:933-943 ），pJRY88（Schultz等（1987）Gene,54:113-123）及びpYES2（カリフォルニア、San Diego在Invitrogen Corporation）を含む。培養昆虫細胞での蛋白質の発現用の入手し得るバキュロウイルスベクター（ＳＦ９細胞）は、ｐＡｃシリーズ（Smith等、（1983）Mol.Cell Biol.,3:2156-2165）及びｐＶＬシリーズ（Luckl ow,V.A.及びSummers,M.D.,（1989）Virology,170:31-39）を含む。一般に、ＣＯＳ細胞（Gluzman,Y.,（1981）Cell,23:175-182）は、哺乳動物細胞における一過性増幅／発現のためにｐＣＤＭ８（Aruffo,A．及びSeed,B.,（1987）Proc.Natl. Acad.Sci.USA ,84:8573-8577）等のベクターと共に用いるが、他方、ＣＨＯ（dhf r-チャイニーズハムスター卵巣）細胞は、哺乳動物細胞における安定な増幅／発現のためにｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman等、（1987）EMBO J.,6:187-195）等のベクターと共に用いる。ベクターＤＮＡは、従来技術例えばリン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介のトランスフェクション、又は電気穿孔法によって哺乳動物細胞に導入することが出来る。宿主細胞をトランスフォームするための適当な方法は、Sambrook等（Molecular Cloning:A Labo ratory Manual,第二版、Cold Spring Harbor Labonatory press（1989））及びその他の実験室用テキスト中に見出すことが出来る。原核生物中での発現は、最もしばしば大腸菌において誘導可能な融合若しくは非融合発現ベクターの何れかを用いて行なわれる。融合ベクターは、通常、幾つかのＮＨ₂末端アミノ酸を発現される標的遺伝子に加える。これらのＮＨ₂末端アミノ酸は、しばしば、レポーター基として言及される。かかるレポーター基は、通常、１）標的組換え蛋白質の溶解度を増大させ、及び２）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより標的組換え蛋白質の精製を助けるという２つの目的を果たす。しばしば、融合発現ベクターにおいては、融合蛋白質の精製に続いて標的組換え蛋白質をレポーター基から分離することを可能にするために、蛋白質分解の開裂部位がレポーター基と標的組換え蛋白質との接合部に導入される。かかる酵素及びそれらの同系の認識配列は、Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ（オーストラリア、Melbourne在、Amrad Corp）、ｐＭＡＬ（マサチューセッツ、Beverly在、New England Biolabs）及びｐＲＩＴ５（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia）を含み、これらは、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーセ、マルトースＥ結合蛋白質又は蛋白質Ａを標的組換え蛋白質と融合させる。誘導可能な非融合発現ベクターは、ｐＴｒｃ（Amann等（1988）Gene,69:301-3 15）及びｐＥＴ１１ｄ（Studier等、Gene Expression Technology：Methods in Enzymology ,185,Academic Press，カリフォルニア、San Diego在（1990）60-89）。標的遺伝子発現はｐＴｒｃではハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼによる転写に依存しているが、ｐＥＴ１１ｄ中に挿入された標的遺伝子の発現は、同時発現されるウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）により媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ０融合プロモーターからの転写に依存している。このウイルス性ポリメラーゼは、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）若しくはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下でＴ７ｇｎ１を有する常在性λプロファージから供給される。大腸菌における組換えCanf I若しくはCanf II発現を最大にするための１つのストラテジーは、その蛋白質を組換え蛋白質を蛋白質分解により開裂させる能力を減じた宿主細菌中で発現させることである（Gottesman,S.,Gene Expression T echno1ogy ：Methods in Enzymology,185，Academic Press,カリフォルニア、San Diego 在（1990）119-128）。他のストラテジーは、発現ベクターに挿入されるべきCan f I若しくはCanf II蛋白質をコードする核酸を、各アミノ酸に対する個々のコドンが高度に発現される大腸菌蛋白質において優先的に用いられているものとなるように変えることであろう（Wada等、（1992）Nuc．Acids Res.，20:2111-2118 ）。この発明の核酸のかかる改変は、標準的ＤＮＡ合成技術によって行なうことが出来る。この発明の核酸は、標準的技術を用いて化学的に合成することも出来る。ペプチド合成と同様に市販のＤＮＡシンセサイザーにて完全自動化された固相合成を含むポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する種々の方法が知られている（例えば、Itakura等、米国特許第４，５９８，０４９号；Caruthers等、米国特許第４，４５８，０６６号；及びItakura、米国特許第４，４０１，７９６号及び４，３７３，０７１号を参照されたい。これらを参考として本明細書中に援用する）。本発明は、更に、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを生成する方法に関係する。例えば、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現に向けられた核酸ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を適当な条件下で培養してそのペプチドの発現を起こすことが出来る。このペプチドは、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを含む細胞及び培地の混合物から分泌され及び単離することが出来る。或は、このペプチドが細胞質に保持されるならば、細胞を採取して溶解させ、その蛋白質を単離することが出来る。細胞培養物は、宿主細胞、培地及び他の副生物を含んでいる。細胞培養に適した培地は、当業者に周知である。Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞又はその両者から、当業者に公知の蛋白質精製のための技術を用いて単離することが出来る。該技術は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、及びCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドに対して特異的な抗体を用いるイムノアフィニティー精製を含む。この発明の他の面は、Canf I若しくはCanf IIの活性を有する単離されたペプチドに関係する。Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドは、Canf I若しくはCanf IIアレルゲンの少なくとも１つの生物学的活性を有する。例えば、C anf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドは、Canf I若しくはCanf II特異的なＴ細胞における応答例えば刺激（Ｔ細胞増殖又はサイトカイン分泌）を誘導し或はＴ細胞不応答を誘導する能力を有し得る。一具体例において、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドは、例えはＴ細胞増殖又はサイトカイン分泌により証明されるように、Ｔ細胞を剌激する。他の具体例において、Canf I若しくはCanf II活性を有するペプチドは、Ｔ細胞がCanf I若しくはCanf IIペプチドにさらされた後での該ペプチドを用いるチャレンジに非応答性であるＴ細胞不応答を誘導する。更に他の具体例において、Canf I若しくはCanf II活性を有するペプチドは、精製した天然のCanf I若しくはCanf II蛋白質と比較して減じたＩｇＥ結合活性を有する。Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドは、図５（SEQ ID NO:2）（Canf I）若しくは図１８（SEQ ID NO:68）（Canf II）に描いたCanf I若しくはCanf II配列とはアミノ酸配列において異なっていてよいが、かかる差異は、天然のCanf I若しくはCanf II蛋白質と同じ若しくは類似の仕方で機能し或は天然のCanf I若しくはCanf II蛋白質と同じ若しくは類似の性質を有する修飾された蛋白質を生じる。これらの及び他の機能的に同等のペプチドを生成するためのCanf I若しくはCanf II蛋白質の種々の修飾を本明細書に詳述する。ペプチドという用語は、ここで用いる場合、ペプチド、蛋白質及びポリペプチドのことをいう。ペプチドは、図５（SEQ ID NO:2）（Canf I）若しくは図１８（SEQ ID NO:68 ）（Canf II）に示したCanf I若しくはCanf II蛋白質のアミノ酸配列の修飾例えば蛋白質の機能に直接関与しないアミノ酸残基の置換、付加若しくは欠失によって生成することが出来る。この発明のペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸残基長、好ましくは約１０〜２０アミノ酸残基長、一層好ましくは約１０〜１６アミノ酸残基長であってよい。Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチド及び少なくとも約３０アミノ酸残基長、少なくとも約４０アミノ酸残基長、少なくとも約６０アミノ酸残基長、少なくとも約８０アミノ酸残基長、及び少なくとも約１００アミノ酸残基長のペプチドも又、この発明の範囲内に含まれる。この発明の他の具体例は、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドの実質的に純粋な調製物を提供する。かかる調製物は、このペプチドが天然において、細胞中で若しくは細胞から分泌された際に伴っている蛋白質及びペプチド（即ち、他のイヌペプチド）を実質的に含まない。単離したという用語は、ここで用いる場合、組換えＤＮＡ技術により生成された場合に細胞性物質若しくは培地を実質的に含まず、或は化学合成された場合には化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない核酸又はペプチドのことをいう。かかる蛋白質若しくはペプチドは、すべての他の犬鱗屑蛋白質を含まないことでも特徴付けられる。従って、Canf I若しくはCanf IIの活性を有する単離したペプチドは、組換えにより又は合成により生成され、細胞性物質及び培養培地を実質的に含まず或は化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まず、そして、すべての他の犬蛋白質を実質的に含まない。単離した核酸は、その核酸を得た生物において、自然にその核酸に隣接する配列（即ち、その核酸の５’ 及び３’末端に位置する配列）をも含まない。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを、例えばかかるペプチドをコードするCanf I若しくはCanf IIの核酸の対応する断片から組換えにより生成したペプチドをスクリーニングすることによって得ることが出来る。更に、断片を、当業者に公知の技術例えば従来のMerrifield固相ｆ−Ｍｏｃ若しくはｔ−Ｂｏｃ化学等を用いて化学合成することが出来る。例えば、Canf I若しくはCanf II蛋白質は、断片の重複を有しないで所望の長さの断片に自由に分割することが出来、或は、好ましくは、所望の長さの重複する断片に分割することが出来る。これらの断片を生成し（組換え若しくは化学合成による）そして試験してCanf I若しくはCanf II活性（即ち、Ｔ細胞応答例えば刺激（増殖、サイトカイン分泌）、不応答を誘導し及び／又は減じたＩｇＥ結合活性を有する能力）を有するペプチドを同定することが出来る。一具体例において、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを、そのペプチドのＴ細胞を刺激する能力又はＴ細胞不応答を誘導する能力によって同定することが出来る。例えばＴ細胞増殖若しくはサイトカイン分泌により測定して、Ｔ細胞を刺激するペプチドを、ここでは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むと規定する。Ｔ細胞エピトープは、アレルギーの臨床症状の原因である蛋白質アレルゲンに対する免疫応答の開始及び持続に関与するものと考えられる。これらのＴ細胞エピトープは、抗原提示細胞表面上の適当なＨＬＡ分子に結合し、それによりこのエピトープに対する関連Ｔ細胞レセプターを有するＴ細胞サブポピュレーションを刺激することによって、ヘルパーＴ細胞のレベルで初期事象の引き金を引くと考えられる。これらの事象は、Ｔ細胞増殖、リンホカイン分泌、局所的炎症反応、抗原／Ｔ細胞相互作用部位への追加の免疫細胞の補充、及び抗体産生へと導くＢ細胞カスケードの活性化へと導く。これらの抗体の１つのイソ型であるＩｇＥは、アレルギー症状の進展に基本的に重要であり、その産生はヘルパーＴ細胞のレベルで事象のカスケードの初期に分泌されたリンホカインの性質により影響を受ける。Ｔ細胞エピトープは基本的要素であり又はＴ細胞レセプターによる認識の最小単位であり、このエピトープは、レセプター認識に必須のアミノ酸を含んでいる。これらのＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を真似たアミノ酸配列及び蛋白質アレルゲンに対するアレルギー応答を調節するアミノ酸配列は、この発明の範囲内にある。ここに記載したようなCanf I若しくはCanf II活性を保持するペプチドをスクリーニングすることは、幾つかの異なるアッセイの１つ以上を用いて達成することが出来る。例えば、Canf I若しくはCanf IIＴ細胞刺激活性は、イン・ビトロで、Canf I若しくはCanf II活性を有することが知られ若しくは疑われるペプチドを、Ｔ細胞培養中の適当なＭＨＣ分子を提供する抗原提示細胞と接触させることによってアッセイされる。Canf I若しくはCanf II活性を有するペプチドを適当なＭＨＣ分子と結合して、必要な同時刺激と共にＴ細胞に提供することは、増大したレベルのサイトカイン特にインターロイキン２及びインターロイキン４の産生を誘導するシグナルをＴ細胞に伝達する効果を有する。この培養上清を得て、インターロイキン２若しくは他の公知のサイトカインについてアッセイすることが出来る。例えば、インターロイキン２についての幾つかの従来のアッセイの任意のもの例えばProc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1333（1989）に記載されたアッセイを用いることが出来、その直接関係のある部分を参考として本明細書中に援用する。インターフェロンの産生についてのアッセイのためのキットも又Genzyme Corporation（マサチューセッツ、Cambridge在）から入手可能である。或は、Ｔ細胞増殖についての一般的アッセイは、トリチウム化チミジンの取り込みの測定を必要とする。Ｔ細胞の増殖は、培養細胞の複製ＤＮＡに取り込まれた³Ｈ標識したチミジンの量を測定することによりイン・ビトロで測定することが出来る。それ故に、ＤＮＡ合成の速度、従って、細胞分裂の速度を定量することが出来る。一具体例において、Canf I若しくはCanf IIＴ細胞刺激活性を有するペプチド（即ち、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプチド）を、蛋白質配列中のＴ細胞エピトープの存在を予想するアルゴリズム例えばHill等、Journal of I mmunology ,147:189-197（1991）により記載されたアルゴリズムを用いて同定することが出来る。Hill等のアルゴリズムは、ＭＨＣに結合しそうでありそれ故Ｔ細胞エピトープを含み得る配列中のあるパターンの存在により蛋白質中のＴ細胞エピトープの位置を予想する。Hill等のアルゴリズムに基づいて、２つの１３アミノ酸ペプチド（実施例１０で検討）が同定され、合成により生成された。かかるペプチドを上記のようにＴ細胞活性について試験した（例えば、トリチウム化チミジンの細胞への取り込みの測定による）。特に実施例１０において、ヒトＴ細胞刺激活性を、Canf Iに感受性の個人（即ち、Canf Iに対するＩｇＥ媒介の免疫応答を有する個人）から得たＴ細胞を、Canf Iから導いたペプチドと共に培養することにより試験し、このペプチドに対する応答におけるＴ細胞の増殖を例えばトリチウム化チミジンの細胞への取り込みを測定することにより測定した。Ｔ細胞によるペプチドに対する応答についての刺激インデックスを、ペプチドに対する応答における最大ＣＰＭを対照ＣＰＭにより除したものとして計算した。バックグラウンドレベルの２倍以上の刺激インデックス（Ｓ．Ｉ．）を「陽性」と考えた。陽性結果は、試験した患者群について各ペプチドに対する平均刺激インデックスを計算するために用いた（図２５を参照されたい）。この発明の好適ペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、２．０以上の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有する。試験した犬鱗屑アレルゲン感受性患者の相当数において２．０以上の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有するペプチドは、治療剤として有用であると考えられる。好適ペプチドは、少なくとも２．５、一層好ましくは少なくとも３．０、一層好ましくは少なくとも３．５、一層好ましくは少なくとも４．０、一層好ましくは少なくとも５．０、最も好ましくは少なくとも約６の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有する。例えば、Canf I活性を有し、少なくとも５の平均Ｔ細胞刺激インデックスを有するペプチドは、図２５に示したデータにより示されるように、 Construct １（SEQ ID NO:105）、Construct ２（SEQ ID NO:106）及びConstruc t ３（SEQ ID NO:107）を含む。Ｔ細胞エピトープは、Canf IIから導かれるペプチドについても上記のように予想し、測定することが出来る。更に、好適ペプチドは、少なくとも約６０の、一層好ましくは約１００の、一層好ましくは少なくとも約２００の、最も好ましくは少なくとも約３００のポジティビティーインデックス（Ｐ．Ｉ．）を有する。ペプチドについてのポジティビティーインデックスを、平均Ｔ細胞刺激インデックスに、犬鱗屑アレルゲンに感受性の個人の集団（例えば、好ましくは少なくとも１２人の個人、一層好ましくは少なくとも３０人の個人又はそれ以上）におけるかかるペプチドに対する少なくとも２．０のＴ細胞刺激インデックスを有する個人のパーセントを乗じることにより測定する。従って、ポジティビティーインデックスは、ペプチドに対するＴ細胞応答の強さ（Ｓ．Ｉ．）と犬鱗屑アレルゲンに感受性の個人の集団におけるペプチドに対するＴ細胞応答の頻度の両方を表す。図１０において、バーは、ポジティビティーインデックス及びCanf Iから導いた種々のペプチドに対する少なくとも２．０のＴ細胞刺激インデックスを有する試験した個人のパーセントを表す。例えば、図２５に示したように、ペプチドＡ００９５は、試験した個人集団において、３．０の平均Ｓ．Ｉ．及び４３％の陽性応答を有し、その結果１２９のポジティビティーインデックスとなる。例えば、微細マッピング技術により正確なＴ細胞エピトープを決定するために、Canf I若しくはCanf IIＴ細胞刺激活性を有しそれ故Ｔ細胞生物学技術により測定して少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプチドを、そのペプチドのアミノ若しくはカルボキシ末端のアミノ酸残基の付加又は欠失により修飾し、その修飾ペプチドに対するＴ細胞反応性の変化を測定する。この技術の後で、ペプチドを選択して、組換えにより又は合成により生成する。ペプチドを、そのペプチドに対するＴ細胞応答の強さ（即ち、刺激インデックス）、犬鱗屑アレルゲンに感受性の個人集団中のそのペプチドに対するＴ細胞応答の頻度、及びそのペプチドと他の犬鱗屑アレルゲンとの潜在的交差反応性を含む種々の因子に基づいて選択する。これらの選択したペプチドの物理的及び化学的特性を試験してこれらのペプチドが治療用組成物における使用に適しているか否か或はごれらのペプチドがここに記載のような修飾を必要とするか否かを決定する。次いで、これらの選択したペプチド又は選択した修飾ペプチドのヒトＴ細胞を刺激する能力（例えば、増殖、リンホカイン分泌を誘導する）をここに記載のようにして測定する。他の具体例において、Canf I若しくはCanf II活性を有するペプチドを、Ｔ細胞不応答を誘導する能力についてスクリーニングする。Ｔ細胞を剌激し（上記のアッセイの１つ以上により測定）、精製した天然のCanf I若しくはCanf II又はその一部の活性を阻害し若しくは完全にブロックすることが知られたペプチド、及び不応答の状態を誘導することが知られたペプチドの能力を、Canf I若しくはCanf II活性を有するペプチドにさらした後に、天然Canf I若しくはCanf II又はCanf I若しくはCanf II活性を有するペプチドを提供する抗原提示細胞によるＴ細胞の刺激におけるその後の試みを用いて測定することが出来る。もしＴ細胞が、その後の活性化の試みに対してインターロイキン２合成及び／又はＴ細胞増殖により測定して非応答性であるならば、不応答性状態が誘導されている。本発明によるアッセイのための基礎として利用することの出来るアッセイ系については、例えば、Gimmi等、（1993）Proc.Natl.Acad.Sci USA,90:6586-6590; 及びSchwartz（1990）Science,248:1349-1356を参照されたい。更に他の具体例において、Canf I若しくはCanf II活性を有するペプチドをＩｇＥ結合活性により同定する。治療目的のためには、この発明のペプチドは、好ましくは、犬鱗屑アレルゲンに特異的なＩｇＥに結合しないか又は対応する精製した天然の犬鱗屑アレルゲンがかかるＩｇＥに結合するよりも実質的に低い程度でかかるＩｇＥに結合する。減じたＩｇＥ結合活性とは、精製した天然のCanf I 若しくはCanf II蛋白質のそれより低いＩｇＥ結合活性のことをいう。もしCanf I若しくはCanf II活性を有するペプチドを診断試薬として用いるならば、そのペプチドは、天然のCanf I若しくはCanf IIアレルゲンと比較して減じたＩｇＥ結合活性を有する必要はない。ペプチドのＩｇＥ結合活性を、例えば、以前に天然のCanf I若しくはCanf IIアレルゲンにさらされた患者（例えば、アレルギー患者）から得た血清を用いて、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定することが出来る。簡単に言えば、Canf I若しくはCanf II活性を有すると疑われるペプチドをミクロ滴定プレートのウェル上にコートする。それらのウェルを洗浄しブロックした後に、Canf I若しくはCanf II活性を有する疑いのあるペプチドにさらされたアレルギー患者の血漿からなる抗体溶液をそれらのウェル中でインキュベートする。血漿は、一般に、インキュベーション前にＩｇＧが枯渇している。標識した第２抗体をこれらのウェルに加えてインキュベートする。次いで、ＩｇＥ結合の量を定量し、精製した天然のCanf I若しくはCa nf II蛋白質により結合されたＩｇＥの量と比較する。或は、ペプチドのＩｇＥ結合活性をウエスタンブロット分析により測定することが出来る。例えば、Canf I若しくはCanf II活性を有すると疑われるペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。次いで、このペプチドをニトロセルロースにトランスファーし、続いてアレルギー患者由来の血清と共にインキュベートする。標識した第２抗体と共にインキュベートした後に、結合したＩｇＥの量を測定して定量する。ペプチドのＩｇＥ結合活性を測定するために利用することの出来る他のアッセイは、競争ＥＬＩＳＡアッセイである。簡単に言えば、ＩｇＥ抗体プールを、直接ＥＬＩＳＡにより天然のCanf I若しくはCanf IIと反応性のＩｇＥを有することが示された犬鱗屑アレルギー患者由来の血漿を合わせることにより生成する。このプールをＥＬＩＳＡ競争アッセイにおいて用いて天然のCanf I若しくはCanf II及びCanf I若しくはCanf II活性を有することが疑わしいペプチドのＩｇＥ結合を比較する。天然のCanf I若しくはCanf II蛋白質及びCanf I若しくはCanf II活性を有すると疑われるペプチドのＩｇＥ結合を測定して定量する。もしCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドがＩｇＥと結合し、治療剤として利用されるならば、かかる結合がマスト細胞若しくは好塩基球からのメディエーター（例えば、ヒスタミン）の放出を生じないのが好ましい。ＩｇＥと結合するペプチドがメディエーターの放出を生じるか否かを決定するために、例えばAmac,Inc．（メリーランド、Westbrook在）から得られる標準試薬及びプロトコールを用いてヒスタミン放出アッセイを行なうことが出来る。簡単に言えば、Canf I若しくはCanf II活性を有すると疑われるペプチドの緩衝溶液を等容量のアレルギー患者由来の全ヘパリン化血液と合わせる。混合及びインキュベーションの後に、これらの細胞をペレット化し、上清をラジオイムノアッセイを用いて処理して分析し、放出されたヒスタミンの量を測定する。治療剤として用いるCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドは、好ましくは、犬鱗屑アトピーの哺乳動物モデル例えばTanimura等、（1986）Microbio l. Immunol. ,30:883-896又は米国特許第４，９３９，２３９号に開示されたマウスモデル或はChiba等、（1990）Int.Arch.Allergy Immunol.,93:83-88に開示された霊長類モデル等にて試験する。Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドに結合するＩｇＥに対する初期スクリーニングは、実験動物又はヒトの志願者におけるスクラッチ試験又は皮内試験により、或は上記のような、イン・ビトロ系例えばＲＡＳＴ、ＲＡＳＴ阻害、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）又はヒスタミン放出アッセイ等により行なうことが出来る。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドの構造を、溶解度を増し、治療若しくは予防効果又は安定性（例えば、生体外貯蔵寿命及び生体内での蛋白質分解に対する抵抗性）を高める目的のために修飾することは可能である。かかる修飾ペプチドは、ここに規定するようなCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドの機能的同等物と考えられる。修飾ペプチドは、アミノ酸の置換、欠失若しくは付加等によって、アミノ酸配列を変えて免疫原性を改変し及び／又はアレルゲン性を減じ、或は同じ目的のために成分を追加して生成することが出来る。例えば、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを修飾して、それがＴ細胞不応答を誘導する能力及び、免疫原性形態で投与したときに強い増殖応答若しくは出来れば如何なる増殖応答を誘導する能力をも伴わずにＭＨＣ蛋白質と結合する能力を維持するようにすることが出来る。この例において、Ｔ細胞レセプター機能にとって決定的な結合性残基を公知の技術（例えば、各残基の置換及びＴ細胞反応性の存在若しくは不存在の測定）を用いて決定することが出来る。Ｔ細胞レセプターとの相互作用に必須であることが示されたそれらの残基を、必須のアミノ酸を他の好ましくは類似のアミノ酸残基で置換（保存的置換）することにより修飾することが出来、その存在は、Ｔ細胞反応性を増大させ、減少させるが排除せず、又は該反応性に影響を与えないことが示される。更に、Ｔ細胞レセプター相互作用に必須でないアミノ酸残基を、他のアミノ酸であってその取り込みがＴ細胞反応性を増大させ、減少させ得るが排除せず、又は該反応性に影響を与えないが関連ＭＨＣへの結合を排除しないアミノ酸で置換することにより修飾することが出来る。更に、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを、ＭＨＣ蛋白質複合体との相互作用に必須であることが示されたアミノ酸を他の好ましくは類似のアミノ酸残基で置換（保存的置換）するによって修飾することが出来、その存在は、Ｔ細胞活性を増大させ、減少させるが排除せず、又は該活性に影響を与えないことが示される。更に、ＭＨＣ蛋白質複合体との相互作用に必須でないが、やはりＭＨＣ蛋白質複合体に結合するアミノ酸残基を、他のアミノ酸であってその取り込みがＴ細胞反応性を増大させ、該反応性に影響せず又は該反応性を減少させ得るが排除しないアミノ酸により置換することにより修飾することが出来る。非必須アミノ酸に対する好適アミノ酸置換は、アラニン、グルタミン酸又はメチルアミノ酸での置換を含むが、これらに限定されない。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドの修飾の他の例は、ジスルフィド結合を介する２量体形成を最少化するためのシステイン残基の好ましくはアラニン、セリン、スレオニン、ロイシン又はグルタミン酸残基での置換である。更に、この発明の蛋白質の断片のアミノ酸側鎖を化学的に修飾することが出来る。他の修飾は、このペプチドの環化である。安定性及び／又は反応性を増大させるために、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを修飾して、任意の天然の対立遺伝子変異から生じる蛋白質アレルゲンのアミノ酸配列における１つ以上の多形を取り込むことが出来る。更に、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸又は非アミノ酸アナログを置換し又は付加してこの発明の範囲内の修飾蛋白質を生成することが出来る。更に、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを、A.Sehonと共同研究者（Wie等、前出）の方法によって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて修飾して、ＰＥＧと結合した蛋白質を生成することが出来る。更に、ＰＥＧを、その蛋白質の化学合成の間に加えることが出来る。Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドの他の修飾は、還元／アルキル化（Tarr，Methods of Protein Microcharac terization ，J.E.Silver編、Humana Press,ニュージャージー、Clifton在155-194（1986 ））；アクリル化（Tarr，前出）；適当なキャリアーとの化学カップリング（Mi shell及びShiigi編、Selected Methods in Cellular Immunology，WH Freeman，カリフォルニア、San Francisco （1980），米国特許第４，９３９，２３９号）；又は温和なホルマリン処理（Marsh,（1971）Int.Arch.of Allergy and Appl.Immunol . ,41:199-215）を含む。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドの精製を容易にし及び潜在的に溶解度を増大させるために、アミノ酸融合部分をペプチド主鎖に加えることが出来る。例えば、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによる精製のためにヘキサ−ヒスチジンを蛋白質に加えることが出来る（Hochuli,E.等、（1988）Bio/Technology,6:1321-1325）。更に無関係の配列を含まないペプチドの単離を容易にするために、特異的なエンドプロテアーゼ開裂部位を融合部分とペプチドの配列の間に導入することが出来る。患者を上首尾にCanf I若しくはCanf II蛋白質又は関連アレルゲンに対して脱感作するために、蛋白質の溶解度を、官能基をその蛋白質に付加し又は疎水性領域を削除することにより増大させることは必要であり得る。 Canf I若しくはCanf II内のＴ細胞エピトープの適当な抗原プロセッシングを潜在的に助成するために、標準的プロテアーゼ感受性部位を、それぞれ少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む領域の間に組換え若しくは合成法によって作成することが出来る。例えば、荷電アミノ酸対例えばＫＫ又はＲＲ等を、組換え体構築中に、蛋白質若しくは断片の内部領域間に導入することが出来る。その結果生成するペプチドは、カテプシン及び／又は他のトリプシン様酵素による開裂に対する感受性を付与され得る（該開裂は、１つ以上のＴ細胞エピトープを含む蛋白質の部分を生成する）。更に、かかる荷電アミノ酸残基は、ペプチドの溶解度の増加を生じ得る。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドをコードする核酸の位置指定突然変異導入法を用いて、当業者に公知の方法により、そのペプチドの構造を修飾することが出来る。かかる方法は、他の方法の内、１つ以上の突然変異を有するオリゴヌクレオチドプライマー（Ho等、（1989）Gene,71:51-59）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は突然変異遺伝子の全合成（Hostomsky,Z.等、（1989）Biochem.Biophys.Res.Comm,161:1056-1063）を含んで良い。組換え蛋白質発現を増大させるために、上記の方法を適用して、この発明のｃＤＮＡ配列中に存在するコドンを、組換え蛋白質が発現される宿主細胞により優先的に利用されるものに変えることが出来る（Wada等、前出）。この発明の他の面は、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドと特異的に反応性の抗体に関係する。この発明の抗体を用いて、アレルゲン抽出物を標準化し又は天然の若しくは天然型のCanf I若しくはCanf IIを単離することが出来る。例えば、Canf I若しくはCanf IIのｃＤＮＡ配列に基づいて、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを利用することにより、抗蛋白質／抗ペプチド抗血清又はモノクローナル抗体を、標準的方法を用いて作成することが出来る。哺乳動物例えばマウス、ハムスター又はウサギを、このペプチドの免疫原型（例えば、Canf I若しくはCanf II蛋白質又は抗体応答を誘出し得る抗原性断片）を用いて免疫化することが出来る。蛋白質又はペプチドに免疫原性を与えるための技術は、キャリアーへの結合その他の当業者に周知の技術を含む。Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドをアジュバントの存在下で投与することが出来る。免疫化の進行は、血漿若しくは血清中の抗体力価の検出により監視することが出来る。免疫原を抗原として用いる標準ＥＬＩＳＡ若しくは他のイムノアッセイを利用して抗体レベルを評価することが出来る。免疫化の後に、抗Canf I若しくは抗Canf II抗血清を得ることが出来、所望であれば、ポリクローナル抗Canf I若しくは抗Canf II抗体をその血清から単離することが出来る。モノクローナル抗体を生成するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化した動物から採取して、標準的体細胞融合手順により不滅化細胞例えばミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を生成する。かかる技術、例えばKohler 及びMilstein,（1975）Nature,256:495-497により最初に開発されたハイブリドーマ技術並びに他の技術例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbar等、（19 83）Immunology Today,4:72）及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole等、（1985）Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ,Alan R.Liss,Inc.77-96頁）は、当業者には周知である。ハイブリドーマ細胞を、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドと特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングして、モノクローナル抗体を単離することが出来る。抗体という用語は、ここで用いる場合、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドと特異的に反応する抗体の断片をも含むものとする。抗体は、従来技術を用いて断片化することが出来、それらの断片を全抗体について上述したのと同様の方法において利用のためにスクリーニングすることが出来る。例えば、Ｆ（ab'）₂断片を、抗体をペプシンで処理することにより生成することが出来る。その結果生成したＦ（ab'）₂断片を処理してジスルフィド橋を還元してＦab’断片を生成することが出来る。本発明の抗体は、更に、抗Canf I若しくは抗Canf I I蛋白質を有する複特異性のキメラ分子を含むものとする。この発明の他の面は、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドと特異的に反応するＴ細胞クローン及び可溶性Ｔ細胞レセプターを提供する。モノクローナルＴ細胞集団（即ち、遺伝的に互いに同一であり、同一のＴ細胞レセプターを発現しているＴ細胞）を、Canf I若しくはCanf IIに感受性の個人から導出し、その後、イン・ビトロで、Canf I若しくはCanf II蛋白質又はCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドで、ＭＨＣマッチした抗原提示細胞の存在下で反復刺激することが出来る。その後、単一のCanf I若しくはCanf II ＭＨＣ応答性細胞を限界希釈によりクローン化し、永久細胞系統を周期的イン・ビトロ再刺激により発達させて維持することが出来る。或は、Canf I若しくはCanf II特異的Ｔ−Ｔハイブリドーマを、Ｂ細胞ハイブリドーマ産生に類似した技術によって生成することが出来る。例えば、マウス等の動物を、Ca nf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドで免疫化し、次いで、Ｔ細胞を精製して自律増殖性のＴ細胞腫瘍細胞系統と融合する。その結果生成したハイブリドーマから、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドに応答する細胞を選択してクローン化する。増殖中のモノクローナルＴ細胞集団からの手順は、Ce llular and Molecular Immunology （Abul K.Abbas等編）、W.B.Saunders Compan y，ペンシルベニア、Philadelphia在（1991）139頁に記載されている。Canf I若しくはC anf IIの活性を有するペプチドと特異的に反応する可溶性Ｔ細胞レセプターを、Immumology : A Synthesis （第二版）,Edward S.Golub等編、Sinauer Associates，Inc.,マサチューセッツ、Sunderland在（1991）366-269に記載されたようなＴ細胞レセプターに対する抗体を用いる免疫沈降により得ることが出来る。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドと特異的に反応するＴ細胞クローンを用いて、関連Ｔ細胞レセプターをコードする遺伝子を単離して分子的にクローン化することが出来る。更に、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドと特異的に反応する可溶性Ｔ細胞レセプターを用いて、例えばCanf I若しくはCanf IIに感受性の個人に投与することにより、関連Ｔ細胞サブポピュレーションの抗原依存性活性化を邪魔し又は阻止することが出来る。かかるＴ細胞レセプターと特異的に反応性の抗体を、ここに記載の技術によって生成することが出来る。かかる抗体を用いて、Ｔ細胞とＭＨＣにより提供されるペプチドとの相互作用をブロックし又は邪魔することが出来る。アレルギー患者をCanf I若しくはCanf IIの活性を有し且つＴ細胞刺激活性を有するペプチドにさらすことは、適当なＴ細胞サブポピュレーションを応答性蛋白質アレルゲンに対して不応答性（例えば、このようにさらすことに対して免疫応答を刺激しない等）にする。更に、かかる投与は、天然の蛋白質アレルゲン若しくはその部分にさらすことに比較してリンホカイン分泌プロフィルを改変し得る（例えば、ＩＬ−４の減少及び／又はＩＬ−２の増加）。更に、Ｔ細胞刺激活性を有するCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドにさらすことは、通常はアレルゲンに対する応答に関与するＴ細胞サブポピュレーションに影響を与えて、これらのＴ細胞がアレルゲンにさらされた通常の部位から離れてこの蛋白質若しくはそれから導かれた断片の治療投与部位に向かうようにすることが出来る。このＴ細胞サブポピュレーションの再配分は、通常のアレルゲンにさらされた部位において通常の免疫応答を刺激する個人の免疫系の能力を改善し又は低減させてアレルギー症状を軽減させることが出来る。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドは、犬鱗屑アレルゲンに感受性の患者に投与した場合に、そのアレルゲンに対するその患者のＢ細胞応答、Ｔ細胞応答、又はＢ細胞及びＴ細胞応答の両者を改変することが出来る。ここで用いる場合、患者の犬鱗屑アレルゲンに対するアレルギー応答の改変とは、標準的臨床手順（Varney等、（1990）British Medical Journal，302:265-269を参照されたい）により測定して、アレルゲンに対する不応答又は症状の軽減（犬鱗屑で誘導された喘息症状の軽減を含む）として定義する。ここで言及する場合、症状の軽減とは、この発明のペプチドを用いる治療養生法の後における、アレルゲンに対する患者の如何なるアレルギー症状の軽減をも含む。この症状の軽減は、主観的に（例えば、患者がそのアレルゲンにさらされた際に一層快適に感じる等）又は臨床的に（例えば、標準皮膚試験により）測定することが出来る。本発明のペプチド又は抗体を、Canf I若しくはCanf IIに対する感受性を検出し及び診断するために利用することも出来る。例えば、これは、感受性を評価すべき患者から得た血液若しくは血液製剤をCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドと、その血液中の成分（例えば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）がこの（これらの）ペプチドと結合するのに適した条件下で合わせて、かかる結合が起きる程度を測定することによってなし得る。これらの本発明のペプチド又は抗体を利用することの出来るアレルギー疾患に対する他の診断方法は、ラジオアレルゴソルベント試験（ＲＡＳＴ）、ペーパーラジオイムノソルベント試験（ＰＲＩＳＴ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノ−ラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、ルミネッセンスイムノアッセイ（ＬＩＡ）、ヒスタミン放出アッセイ及びＩｇＥイムノブロットを含む。本発明は、更に、Canf I若しくはCanf IIに対する患者の感受性を検出し及び治療する方法を提供する。患者におけるCanf I若しくはCanf IIに特異的なＩｇＥの存在及びCanf I若しくはCanf IIのＴ細胞エピトープに対する患者のＴ細胞の応答能力を、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチド又はCanf I若しくはCanf IIの活性を有する修飾型ペプチド（それぞれ、このアレルゲンに特異的なＩｇＥに結合する）を用いて、患者に即時型過敏症試験及び／又は遅延型過敏症試験（ Immunology（1985）Roitt,I.M.,Brostoff,J.,Male,D.K.（編）C.V.Mosby Co.,Go wer Medical Publishing，ニューヨーク、London在、19.2-19.18；22.1-22.10頁を参照されたい）を施すことによって測定することが出来る。同じ患者に、遅延型過敏症試験を施してから、施すと同時に、又は施した後で、即時型過敏症試験を施す。勿論、即時型過敏症試験を施してから遅延型過敏症試験を施すならば、遅延型過敏症試験は、特異的な即時型過敏症反応を示した患者に行なうべきである。遅延型過敏症試験は、ヒトＴ細胞刺激活性を有するが、アレルゲンに感受性の患者集団の相当なパーセンテージ（例えば、少なくとも約７５％）においてそのアレルゲンに特異的なＩｇＥに結合しないCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを利用する。特異的即時型過敏症反応及び特異的遅延型過敏症反応の両者を有することが見出された患者には、薬剤投与に適した量の組成物を投与する。この組成物は、遅延型過敏症試験で用いるようなCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチド及び製薬上許容し得るキャリアー若しくは希釈剤を含む。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを、犬鱗屑アレルゲン又は交差反応性蛋白質アレルゲンに対するアレルギー反応を診断し、治療し及び予防する方法において用いることが出来る。従って、本発明は、Canf I若しくはCanf IIの活性を有する少なくとも１種のペプチドのある量と製薬上許容し得るキャリアーとを含む薬剤投与に適した組成物を提供する。脱感作すべき患者への本発明の組成物の投与は、患者の犬鱗屑アレルゲンに対する感受性を減少させる（即ち、アレルギー応答を減らす）のに有効な投与量及び期間にて、公知の手順を用いて行なうことが出来る。患者という用語は、免疫応答を誘出させ得る生きた生物例えば哺乳動物を含むものとする。患者の例は、ヒト、犬、猫、マウス、ラット及びこれらのトランスジェニック種を含む。治療効果を達成するのに必要なCanf I若しくはCanf IIの活性を有する少なくとも１種のペプチドの量は、患者の犬鱗屑に対する感受性の程度、年齢、性別及び体重並びにCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドが患者において抗原性応答を誘出する能力等の因子によって変化し得る。投薬養生法は、最適治療応答を与えるように調整することが出来る。例えば、幾つかに分けた投与量を毎日投与するか、又は治療状況の緊急性によって投与量をそれに合わせて減じることが出来る。活性化合物（即ち、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチド）を、従来の方法例えば注射（皮下、静脈注射等）、経口投与、吸入、経皮適用又は直腸投与により投与することが出来る。投与の経路によって、活性化合物は、その化合物を不活性化し得る酵素、酸その他の天然条件の作用から保護するための物質でその化合物を被覆することが出来る。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを非経口投与以外の投与によって投与するためには、ペプチドをその不活性化を防ぐための物質で被覆するか又は該物質と同時投与することが必要であろう。例えば、Canf I若しくはCanf I Iの活性を有するペプチドを、適当なキャリアー、希釈剤又はアジュバントにて個人に投与するか、又は酵素インヒビターと同時投与するか若しくはリポソーム等の適当なキャリアーにて投与することが出来る。製薬上許容し得る希釈剤は、塩溶液及び緩衝水溶液を含む。アジュバントは、その最も広い意味で用い、インターフェロン等の任意の免疫刺激性化合物を含む。ここで企図するアジュバントは、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤例えばポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルを含む。酵素インヒビターは、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＰ）及びトラシノールを含む。リポソームは、水中油中水ＣＧＦエマルジョン並びに従来のリポソーム（Strejan等、（1984）J.Neuroimmunol.,7:27）を含む．Ｔ細胞不応答を誘導する目的のために、この組成物を、好ましくは、非免疫原形態例えばアジュバントを含まない形態にて投与する。活性化合物は、非経口投与又は腹腔内投与によって投与することも出来る。分散を、グリコール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混合物並びに油にて調製することが出来る。通常の貯蔵及び使用の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を予防するための防腐剤を含んで良い。注射用途に適した製薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散及び無菌注射溶液若しくは分散を即座に調製するための滅菌粉末を含む。すべての場合に、この組成物は、無菌的でなければならず且つ容易に注射可能である程に流動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及びカビ等の微生物の混入に対して保護されていなければならない。キャリアーは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの適当な混合物並びに植物油を含む溶媒又は分散媒質であって良い。適当な流動性は、例えば、所望の粒子サイズを維持することにより（分散の場合）及び界面活性剤の使用によって維持することが出来る。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤及び抗カビ剤例えばパラベンス、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することが出来る。多くの場合に、等張剤例えば糖類、ポリアルコール例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことは好ましい。組成物中に吸収を遅らせる薬剤例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンを含ませることによって、これらの注射可能な組成物の長期間の吸収を達成することが出来る。活性化合物（即ち、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチド）を所望の量で、上記の成分の１つ又は幾つかの組合せと共に、適当な溶媒中に取り込み、必要ならばその後に濾過滅菌することによって、無菌の注射可能な溶液を調製することが出来る。一般に、分散は、基本的分散媒質及び上記の成分の内の必要なものを含む無菌のビヒクル中に活性化合物を取り込むことによって調製することが出来る。無菌の注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好適な調製方法は、活性成分（即ち、Canf I若しくはCanf IIの活性を有する少なくとも１種のペプチド）に任意の追加の所望成分を加えた粉末を予め無菌濾過した溶液から生成する真空乾燥及び凍結乾燥である。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを上記のように適当に保護した場合には、そのペプチドを、例えば不活性な希釈剤若しくは同化可能な食べられるキャリアーと共に、経口投与することが出来る。ペプチド及び他の成分を、固い若しくは柔らかい殻のゼラチンカプセルに封入し、錠剤に圧縮し又は個人の食事に直接取り入れることも出来る。経口治療投与のために、活性化合物を賦形剤と共に取り込み、摂取可能な錠剤、口内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で用いることが出来る。これらの組成物及び調製物のパーセンテージは、勿論、変わり得るが、単位の約５〜８０重量％が便利である。かかる治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、適当な投与量が得られるようなものである。「製薬上許容し得るキャリアー」とは、ここで用いる場合、任意のすべての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗細菌剤及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。製薬上活性な物質に対するかかる媒質及び薬剤の使用は、当業者には周知である。任意の従来の媒質及び薬剤は、それらが活性化合物と相容れない場合を除いて、これらの治療用組成物におけるそれらの利用は企図される。補足的活性化合物も又これらの組成物中に取り込まれる。各投与についての投与単位形態で及び均一な投与量で非経口組成物を配合することは特に有利である。投与単位形態とは、ここで用いる場合、治療すべき哺乳動物患者に対する単位投与量として適当な物理的に分離した単位のことをいう（各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された予め決めた量の活性化合物を必要な製薬用キャリアーと共に含む）。この発明の投与単位形態について仕様は、（a）活性化合物の独自の特性及び達成すべき特定の治療効果、及び（b）患者の感受性の治療のためのかかる活性成分を混合することの技術上の本質的限界により指図され且つそれらに直接依存する。本発明は又、Canf I若しくはCanf IIの活性を有する少なくとも２種のペプチド（例えば、少なくとも２種のペプチドの物理的混合物）（各々Ｔ細胞刺激活性を有する）を含む組成物をも提供する。例えば、Canf I の活性をそれぞれ有する少なくとも２種のペプチドを合わせることが出来、又はCanf IIの活性をそれぞれ有する少なくとも２種のペプチドを合わせることが出来、又はCanf Iの活性を有する少なくとも１種のペプチドとCanf IIの活性を有する少なくとも１種のペプチドとを合わせて投与することが出来る。或は、それぞれＴ細胞刺激活性を有する少なくとも２つの領域（即ち、各領域は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む）を有するペプチドをアレルギー患者に投与することが出来る。かかるペプチドは、同じアレルゲンCanf I若しくはCanf II又はCanf IとCanf IIの組合せから導いた少なくとも２つの領域を有し得る。少なくとも２つの領域を有する２つのペプチド又は１つのペプチドの組成物を、前述の製薬上許容し得るキャリアーを伴う組成物の形態で、患者に投与することが出来る。１種以上のかかる組成物のある量を、同時に又は順次に、犬鱗屑アレルゲンに感受性の患者に投与してかかる感受性を治療することが出来る。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドをコードするｃＤＮＡ（又は逆転写においてテンプレートとして働いたｍＲＮＡ）を用いて、任意の変種若しくは型の動物において、類似の核酸配列を同定し、そうして、Canf I若しくはCa nf IIの活性を有するペプチドをコードするｃＤＮＡにハイブリダイズするだけ十分な配列相同性を有する遺伝子をクローン化することが出来る。従って、本発明は、Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドを含むだけではなく、本発明のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアレルゲンであり得る他の蛋白質をも含む。抗体交差反応性又はＴ細胞交差反応性等によりCanf I若しくはCanf IIに免疫学的に関連する単離されたペプチド（既に同定されたものを除く）は、この発明の範囲内にある。かかるペプチドは、この発明の蛋白質及びペプチドに特異的な抗体と結合し、又はこの発明の蛋白質及びペプチドに特異的なＴ細胞を刺激する。 Canf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチド（即ち、組換え又は化学台成により生成したCanf I若しくはCanf II）は、他のすべての犬鱗屑蛋白質を含まず、従って、犬鱗屑過敏症の診断及び治療に対して鍵となる試薬であるアレルゲン抽出物の標準化に有用である。更に、かかるペプチドは、一貫して、治療目的（例えば、犬鱗屑に感受性の患者のアレルギー応答を改変する等）のために投与することの出来る調製物における利用のための十分規定された組成及び生物学的活性のものである。かかるペプチドは又、Canis familiarisアレルギーの免疫療法の機構を研究するために及び免疫療法において有用な修飾された誘導体若しくはアナログをデザインするために利用することも出来る。他の研究者の仕事は、一般に、アレルゲン抽出物の高投与量が免疫療法において最良の結果（即ち、最大の症状の軽快）を生じるということを示した。しかしながら、多くの患者は、かかる抽出物の多量投与には、これらの調製物中のアレルゲン及び他の成分により誘出される全身性反応のために絶えることが出来ない。この発明のCanf I若しくはCanf IIの活性を有するペプチドは、他のすべての犬鱗屑蛋白質を含まないという利点を有する。従って、かかるペプチドは、治療目的のために投与することが出来る。今や、感受性患者においてアレルギー反応を誘導する犬鱗屑アレルゲンの能力をブロックし又は阻止することの出来る薬剤をデザインすることも可能である。かかる薬剤は、例えば、それらが関連抗Canf I若しくは抗Canf II ＩｇＥ分子に結合し、そうして、ＩｇＥ−アレルゲン結合及びその後のマスト細胞／好塩基球の脱顆粒を妨げるような仕方でデザインすることが出来るであろう。或は、かかる薬剤は、免疫系の細胞成分に結合して、犬鱗屑アレルゲンに対するアレルギー応答の抑制若しくは脱感作を生じ得るであろう。この非応答性の例は、Canf I 若しくはCanf IIのＢ若しくはＴ細胞エピトープを含むペプチド又はそれらの修飾物の利用である（犬鱗屑アレルゲンに対するアレルギー応答を抑制するCanf I 若しくはCanf IIのｃＤＮＡ蛋白質構造に基く）。これは、犬鱗屑に感受性の患者に由来する血液成分を用いるイン・ビトロでの研究においてＢ及びＴ細胞機能に影響を与えるＢ及びＴ細胞エピトープをコードする断片の構造を規定することによって実施することが出来よう。この発明を、更に、下記の実施例によって説明するが、この主題発明を制限するものと解釈してはいけない。この出願において引用されているすべての参考文献及び公開された特許出願の内容を、参考としてここに援用する。実施例１：精製したCanf Iの蛋白質配列分析アフィニティー精製したCanf I蛋白質をAalberse博士から得た（de Groot,H．等、前出）。Applied Biosystems Model 477A気相シーケンサーをオン−ラインフィニルチオヒダントイン（ＨＴＨ）アミノ酸分析（Model 120A）と共に用いて、精製したCanf I蛋白質を配列決定した。抽出プログラム、多重ブチルクロリド抽出の変法を用いてアミノ酸回収を改善した。プロリンがアミノ末端に位置する場合には、第１アミンのブロックにＯ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）を用いた。 Brauer,A.W.等（1984）Anal.Biochemistry,137:134,142。イン・シトゥーアルキル化を、非求核性還元剤トリブチルホスフィンを４−ビニルピリジンによる同時アルキル化と共にエチルモルホリン緩衝液中で用いることによって行なった。An drews,P.C.及びDixon,J.E.,（1987）Anal.Biochemistry,161:524-528。この方法論を用いて、Ｎ末端がブロックされているという以前の報告（Schou, C.等、前出）に反して、Canf I蛋白質のＮ末端の配列を決定した。夾雑シグナルのＯＰＡブロッキングと共に複数のＮ末端配列分析により同定された６５アミノ酸残基のＮ末端配列は、新規な蛋白質配列を表している（図５）。このCanf I蛋白質配列は、ＣＮＢｒ開裂ペプチドの配列分析により確認され拡張された。シーケンスガラスフィルターディスク上でのCanf Iのイン・シトゥーＣＮＢｒ消化は、更なる蛋白質配列情報を提供した。Simpson,R.J.及びNice,E.C.（1984）Bioch em.International ,8:787-791。イン・シトゥーＣＮＢｒ開裂の前に、４４サイクルのアミノ酸配列決定を行ない、次いで、蛋白質試料をＯＰＡで処理してすべてのアミノ基をブロックした。イン・シトゥーＣＮＢｒ消化の５時間後に、Ｍｅｔ４６、Ｍｅｔ３０及び未知のＭｅｔの後ろの配列（後に、Ｍｅｔ１０３であることが示された）に相当する３つの主要な配列を同定した。１８サイクルの後の更なるＯＰＡブロック（Ｐｒｏ６５の前）は、Ａｓｐ８６までの配列に達した。ＨＰＬＣ（Applied Biosystem,Inc.,Model 130,C8カラム）で分離したＣＮＢｒペプチド断片の配列分析は、更に、Ｎ末端配列を９４アミノ酸残基まで拡張した。ＯＰＡブロッキングを伴うイン・シトウーＣＮＢｒ間裂は又、３９アミノ酸残基のペプチド（残基１０４〜１４２）をも同定した。潜在的Ｎグリコシル化部位が、ｃＤＮＡから演繹されたアミノ酸配列中に見出された（Ａｓｎ５４−Ｉｌｅ５５−Ｔｈｒ５６）。蛋白質配列分析は、Canf IのＩｌｅ５５及びＴｈｒ５６を同定したが、５４位では何も同定し得なかった。これは、翻訳後修飾が、Canf IのＡｓｎ５４で起きること及びその修飾が蛋白質配列決定中のトリフルオロ酢酸処理に対して安定であることを示唆する。実施例２：イヌ耳下腺からのｍＲＮＡの抽出及び Canf Iのクローニング異系交配により得られた１匹の犬からの一対の新鮮な耳下腺をTufts Universi ty School of Veterinary Medicine（マサチューセッツ、Worcester在）から得て、リン酸緩衝塩溶液にて洗浄し、ドライアイス上で直ちに凍結した。ＲＮＡを、本質的に文献（Chirgwin,J.M．等、（1979）Biochemistry,18:5294-5299）に記載されたようにして抽出した。一方の腺を液体Ｎ₂で冷凍した乳鉢と乳棒で粉砕して粉末にし２５ｍｌのＧＴＣ緩衝液（５０％ｗ／ｖグアニジンチオシネート、０．５％ｗ／ｖＮａラウリルサルコシン、０．７％ｖ／ｖ β−メルカプトエタノール、０．１％ｖ／ｖ Sigma Antifoam A、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）に懸濁して溶解するまでボルテックスミキサーにかけた。この溶液中に存在するゲノムＤＮＡを、溶液の粘性がもはや低下しなくなるまで溶液を１６ゲージの注射針を通すことにより剪断した。この剪断した溶液を３Ｋｒｐｍで５分間、室温で遠心分離した。次いで、上清を、もはや粘性が低下しなくなるまで２３ゲージの注射針を通して剪断し、５Ｋｒｐｍで５分間、室温で遠心分離して澄ませた。この溶液をＣｓＣｌクッション（５．７ＭＣｓＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡｐＨ７．５）上に重層して、Beckman SW41 Tiローターにて３５Ｋｒｐｍで１６時間２０℃で超遠心分離した。上清を捨て、ＲＮＡペレットを７０％ＥｔＯＨで洗い、次いで、０．３ＭＮａＯＡｃ、１０ｍＭＥＤＴＡ）０．１％ＳＤＳ中に再懸濁した。２容の無水ＥｔＯＨを加えて、ドライアイス上で沈澱を行なった。ＲＮＡを遠心分離によりペレット化し、７０％ＥｔＨＯで洗い、そしてＴＥＳ（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）中に再懸濁した。最終的収量は、〜１．８ｍｇであった。一本鎖の全犬耳下腺ｃＤＮＡを、上記のＲＮＡ調製物をテンプレートとして用いて逆転写にて合成した。４μｇの全ＲＮＡをＥｔＯＨ沈殿し（Boerhinger Man heim製グリコーゲン（分子生物学用）をキャリアーとして使用）、７０％ＥｔＯＨで洗い、そして１０μｌのｄＨ₂Ｏに再懸濁した。オリゴｄＴ（１２〜１８）を５０μｇ／ｍｌに加えてＲＮＡを７０℃で５分間変性した。反応液を氷上で急速冷却し、１μｌ（４０単位）のＲＮＡｓｉｎ（Promega）を夾雑ＲＮアーゼに対する予防剤として加えた。ＢＲＬスーパースクリプト（商標）逆転写酵素キットからの成分を次のように加えた：４μｌの５×緩衝液、２μｌの０．１ＭＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ混合物。反応液を３７℃に加温した後に、１ μｌ（２００単位）のスーパースクリプト（商標）逆転写酵素を加え、反応を３７℃で１時間進行させた。逆転写を７０℃で１５分間インキュベートすることにより停止させ、−２０℃に保存した。最初に、ＰＣＲ増幅（Lee,C.C.等、（1988）Science,239:1288-1291）のＭＯＰＡＣ（混合オリゴヌクレオチドでプライムしたｃＤＮＡの増幅）技術を用いて、成熟蛋白質のアミノ酸１４〜２９をコードするCanf Iの部分的ｃＤＮＡを得た。犬耳下腺ｃＤＮＡをテンプレートとして、成熟Canf Iの残基９〜１５（SEQ ID NO:3）［図１、Ｓ１Ａ（SEQ ID NO:4）又はＳ１Ｂ（SEQ ID NO:5）］及び３０〜３７（SEQ ID NO:10）［図１、ＡＳ２Ａ（SEQ ID NO:11）又はＡＳ２Ｂ（SEQ ID NO:12）］に基く縮重したプライマー対（Applied Biosystems 392にて合成）と共に用いて、予想されるサイズ（〜３×２８アミノ酸即ち８４ｂｐ）のＤＮＡ断片を、ＰＣＲキット（GeneAmp kit，コネチカット、Norwalk在、Perkin Elmer Cetus ）を、次のプログラムと共に、MJ Researchミニサイクラーにて用いて増幅することが出来る：４０×（９２℃ ３０秒／５５℃ １分間／７５℃ １分間）。プライマー対５’Ｓ１Ｂ／３’ＡＳ２Ｂは、予想される断片を最大効率にて増幅したが、これから、両コード領域においてロイシン残基がＴＴ（Ａ又はＧ）ではなくＣＴＸによりコードされていることが推論される。確実性の試験として、増幅した断片を、サザーンブロット上にて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−³²ＰＡＴＰで標識した内部縮重オリゴヌクレオチドプローブＤｏｇプローブ１（SEQ ID NO:7）［Canf Iの残基１７〜２４（SEQ ID NO:6）に基く］とハイブリダイズさせた。増幅した断片をブルースクリプトＫＳプラスミッドベクター（カリフォルニア、San Diego在、Stratagene）中にサブクローン化した後に、Sangerのジデオキシターミネーターキット（オハイオ、Cleveland在、USB）を用いて配列決定し、成熟Canf Iの残基１６〜２９を正確にコードしていることを示した。同様に、精製したCanf Iのアミノ酸配列分析が成熟蛋白質の残基９４まで達する配列情報を生成したときには、延長された部分的Canf IｃＤＮＡ（残基１４〜８７）のＭＯＰＡＣＰＣＲ増幅において、新たなプライマー対を用いた。５’ 又はセンスプライマーＳＡ（残基１４〜２０）及びＳＢ（残基２１〜２７）は、公知のCanf Iの部分的ｃＤＮＡ配列に基づくネストした対であり、他方、３’又はアンチセンスプライマーＡＳ３Ａ（SEQ ID NO:13）（図１）及びＡＳ３Ｂ（SE Q ID NO:14）（図１）は、残基８８〜９４に基づく縮重オリゴヌクレオチドであった。ネストした５’センスオリゴを単一の３’アンチセンス縮重プライマーと共に用いる１対の連続反応において上記の条件を用いるＰＣＲのシーケンシャルラウンドにおいて（最初の反応の１／１００を、第２の反応のためのテンプレートとして用いた）、予想されるサイズ（３×８０アミノ酸即ち２４０ｂｐ）のＤＮＡ断片を増幅することが出来る。縮重３’アンチセンスオリゴＡＳ３Ｂは、オリゴＡＳ３Ａよりも、部分的内部Canf IｃＤＮＡを増幅するための５’センスオリゴの連続した対と協力させた場合に、一層効率的であったが、これはやはり、ロイシン残基がＴＴ（Ａ若しくはＧ）ではなくＣＴＸによってコードされていることを示唆する。この２４０ｂｐＤＮＡ断片を、ブルースクリプトＫＳプラスミッドベクター中にサブクローン化して、上記のように配列決定した。やはり、確実なCanf IｃＤＮＡであることが判明した。残基５４におけるCanf Iのアミノ酸配列中の失われた残基がアスパラギンであることを、次の根拠に基づいて決定した：１）蛋白質配列分析中に残基５４には、アミノ酸シグナルが見出されなかったこと；及び２）アスパラギン残基が、Ｎ結合グリコシル化のコンセンサス配列（Ｎ５４Ｉ５５Ｔ５６）内にあること。これらのデータは、Ｎ５４残基がＮ結合グリコシル化によって修飾されていることを強く示唆している。 Canf IｃＤＮＡの３’部分を得るために、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）ＰＣＲプロトコールを用いた（Frohman,M.A.等、（1988）Proc.Natl.Acad.Sci . ,85:8998-9002）。全犬耳下腺ＲＮＡからの第１鎖ｃＤＮＡ合成を上記のようにして行なった、但し、ＪＭ３オリゴヌクレオチドを反応のプライマーとしてオリゴｄＴの代わりに用いた。ＪＭ３プライマー（SEQ ID NO:22）は、オリゴｄＴ域の５’側にコードされた〜４０ヌクレオチドの自由域を有する（図２）。それ故、ｃＤＮＡを作成するためのポリＡ＋ＲＮＡのプライミングに際して、この既知のヌクレオチド標識を、発生中のｃＤＮＡ転写物の５’末端に共有結合する。ＭＯＰＡＣＰＣＲ分析からの既知のCanf IｃＤＮＡ配列に基づくネストした５’プライマーＳＤ（残基７３〜７９（SEQ ID N0:15））及びＳＥ（残基８０〜８６（SEQ ID NO:17））並びに既知のＪＭ３プライマー配列（ＪＭ３−１（SE Q ID NO:23）及びＪＭ３−３Ｂａｍ（SEQ ID NO:24））に基づくネストしたプライマーを上記のＰＣＲ反応で用いて（但し、ＰＣＲプログラムは、４０×［９２ ℃ ３０秒／６０℃１分間／７５℃ １分間］）、〜５００ｂｐの長さのＤＮＡ断片を増幅した。キナーゼ標識した縮重オリゴヌクレオチドＤｏｇプローブ２（ SEQ ID NO:9）［成熟Canf Iの残基８８〜９４（SEQ ID NO:8）］に対するプローブ試験をしたとき、このバンドは、ハイブリダイゼーションについて陽性であることが判明した。プラスミッドベクター中にサブクローン化してＤＮＡ配列分析したところ、３つの異なる部分的３’Canf IｃＤＮＡが同定された：Canf I（SE Q ID NO:61）、２Canf I（SEQ ID NO:62）及び3Canf I（SEQ ID NO:63）（それぞれ、図９に示してある）。2Canf Iは、.メチオニン残基とその後ろに続くアスパラギン−プロリン対をコードする配列を有した。これらの蛋白質配列分折についての境界標識残基は、次のことを予言した：１）ＮＨ₂末端配列ＭＡＫＬＬＧＲＤＰＥＱ・・・（SEQ ID NO:64）を有するＣＮＢΓ断片；２）ＤＰ対における酸感受性開裂部位；及び３）ＯＰＡ処理に無反応性であると判明し、他のすべてのＮＨ₂末端はその処理によりブロックされるアミノ酸配列データを生成するプロリン残基。実際、精製Canf Iの更なる蛋白質配列分析は、内部プロリン残基におけるＯＰＡ封鎖と共に配列（Ｍ）ＡＫＬＬＧＲＤＰＥＱＳＱＥＡＬＥＤＦ（）ＥＦＳ（）ＡＫＧＬＮＱＥＩＬＥＬＡＱＳ（Ｅ）Ｔ（SEQ ID NO:65）を有するＣＮＢｒ断片を同定した。精製蛋白質の酸開裂は、配列（Ｄ）ＰＥＱＳ（Ｅ）ＥＡ（SEQ ID NO:66）を有するペプチドを産生した。これらの蛋白質配列分析及びCanf Iの部分的ｃＤＮＡクローニングからの補足データは、Canf IｃＤＮＡの信頼すべき３’末端が単離されていないことを示した。精製Canf Iの配列決定からのアミノ酸配列データと部分的ｃＤＮＡ 2Canf I及び3Canf Iによりコードされたものとの比較は、３’ｃＤＮＡの多数の種が発生期のCanf I転写物の別のスプライシングであったことを暗示した（部分的ｃＤＮＡ 3Canf Iにおいて、どのようにＣＮＢｒ断片のＮＨ₂末端からの残基が、中間残基なしで、断片のＣＯＯＨ末端残基に結合して見出されているかに注意されたい）。この別のスプライシングのレベルに起源を有する複数のｃＤＮＡの仮説と対照的に、Canf IｃＤＮＡの３’末端の上記のＰＣＲ増幅は、単一の顕著な〜５００ｂｐ長のＤＮＡ断片を生成した。しかしながら、３つの部分的３’ｃＤＮＡは、５００ｂｐより有意に長いか又は短いものであった。これは、恐らく信頼すべきCanf IｃＤＮＡが、ＰＣＲ増幅により発生するＤＮＡ断片のサブクローニングで用いるプライマーの末端にてコードされる制限部位を有するので、稀な部分的ｃＤＮＡがサブクローン化されたことを示唆した。それ故に、信頼すべきCanf IｃＤＮＡを表すＰＣＲ生成物を制限エンドヌクレアーセ（この場合には、５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＢａｍＨＩ）で消化したときに、１）信頼すべきCanf IｃＤＮＡは少なくとも２つの断片に切断され、２）欠失したＥｃｏＲＩ及び／又はＢａｍＨＩ部位を含むエキソンを有する発生期のCanf IＲＮＡ転写物の別のスプライシングから発生した稀なｃＤＮＡがサブクローン化される傾向がある。この状況を扱うために、５’ 末端に種々の制限酵素部位を有する新たなプライマーを合成してCanf IｃＤＮＡの３’末端のＲＡＣＥＰＣＲにおいて使用した。ＪＭ３−３オリゴを、ＢｇｌＩＩを５’末端に結合して再合成した［ＪＭ３−３ＸＢ（SEQ ID NO:21）］（図２）が、他方、５’プライマーＳＤ及びＳＥを、５’末端にＸｈｏＩ部位を用いて再合成した［ＸＳＤ（SEQ ID NO:16）及びＸＳＥ（SEQ ID NO:18）］（図２）。これらの新たなプライマー及び以前の増幅条件を用いて、ＪＭ３のネストしたＰＣＲが全犬耳下腺ｃＤＮＡをプライムした後に、キナーゼ標識したＤｏｇプローブ４［（SEQ ID NO:20）、成熟Canf I（SEQ ID NO:19）の残基１１５〜１２１］にハイブリダイズするCanf IｃＤＮＡの完全な３’末端をサブクローン化して配列決定した。部分的ｃＤＮＡの翻訳されたアミノ酸配列は、蛋白質配列データと直に一致し、停止コドンに出会う前に更なる６アミノ酸を延長した。クローニングアーティファクトが予想されたので、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位の両者は、完全な３’Canf IｃＤＮＡのコード領域内に見出された。 Canf IｃＤＮＡの５’末端を、アンカードＰＣＲ技術（Roux，K．H．及びDhan arajan，P.,（1990）Biotechniques,8:48-57;Rafnar,T．等、（1991）J.Biol.Ch em .226:1229-1236）を用いてクローン化した。二本鎖の犬耳下腺ｃＤＮＡを、キット（BRLスーパースクリプトｃＤＮＡ合成システム）を利用して、ｃＤＮＡの第２鎖合成のＲＮアーゼＨプライミングの方法（Gubler,U.,及びHoffman,B.J., （1983）Gene,25:263-269）を用いて合成した。鈍端二本鎖ｃＤＮＡをアンカーアダプターにライゲーションし、それにより、既知の配列をｃＤＮＡの５’に位置させた（SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；及びSEQ ID NO:27）（図３参照）。アンカー配列に基づくプライマーを、５’センスプライマー（ＡＰ）として３’アンチセンスプライマーＡＳＡ（SEQ ID NO:31）［残基１８〜２４（SEQ ID NO:30 ）］及びＡＳＢ（SEQ ID NO:33）［残基２５〜３０（SEQ ID NO:32）］のネストした対（ＰＣＲのシーケンシャルラウンド（４０×［９２℃ ３０秒／６０℃ １分間／７５℃ １分間］）におけるＭＯＰＡＣＰＣＲからの既知のCanf IｃＤＮＡ配列に基づく）と共に用いて、Canf IｃＤＮＡの５’末端を増幅した（１°反応ｄｓアンカードｃＤＮＡテンプレートで５’ＡＰ／３’ＡＳＢプライマー使用：２°反応１／１００の１°反応のテンプレートで５’ＡＰ／３’ＡＳＡプライマー使用）。２° 反応のアガロースゲル電気泳動分析は、〜３００ｂｐ長のブロードなバンドを示したが、それは、サザーンブロット分析において、成熟Canf Iの残基９〜１７（ SEQ ID NO:28）に基づく³²Ｐキナーゼ処理した縮重オリゴヌクレオチドプローブＤｏｇプローブ０（SEQ ID NO:29）（図３）とハイブリダイズした。増幅した断片を、ブルースクリプトＫＳプラスミッド中にサブクローン化し、ＤＮＡ配列分析にかけた。そのCanf IｃＤＮＡの５’末端としての確実性を、その部分的ｃＤＮＡの３’における成熟Canf I蛋白質の最初の１３残基の存在により確認した。最長の部分的５’ｃＤＮＡの配列は、更に、１２６ｂｐ延長し、成熟Canf I中には見られない２６アミノ酸のリーダー配列をコードした。インフレームの停止コドンは、仮のイニシエーターメチオニンコドン（Ｍ−２６）の５’側に見出されなかったが、それは、次の理由により、真のイニシエーターコドンであり、内部メチオニンコドンではない：１）それは哺乳動物細胞における翻訳開始のためのコンセンサス配列（Kozak,M.,（1986）Cell,44:283-292）内に埋め込まれており；２）予想されるリーダー配列が、Canf Iと高度に関係する蛋白質のリーダー配列と高度に相同性である（下記参照）。次いで、隣接するCanf IｃＤＮＡを増幅し、両鎖をＰＣＲ生成物として直接配列決定して分子のコード配列を確認した。ＰＣＲ反応中に増幅されたｃＤＮＡ中に誤りが導入される可能性を最小にするために、ＰｆｕＩＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア、San Diego在、Stratagene）を用いてコードｃＤＮＡを増幅した。ＰｆｕＩＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ中にＴａｑＤＮＡポリメラーゼよりも大幅に少ないオーダーの誤りしか導入しないことが文献に示されている（Lundberg,K.S .,（1991）Gene,108:1-4）。ＰＣＲ反応からのクローン化されないＤＮＡ断片の直接配列決定についても、ＰＣＲ中にＤＮＡポリメラーゼにより為される任意の誤りを未然に防ぐべきである。何故なら、かかる誤りは、ＰＣＲ生成物の集団中にランダムに分散されるからである（Gyllensten,U.B.,及びEhrlich,H.A.,（198 8）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:7652-7656）。増幅／配列決定に用いられたプライマーは、５’センスｌｅａｄｅｒｅｘオリゴ（SEQ ID NO:35）［Canf Iの残基−２６〜−２０（SEQ ID NO:34）］及び３’アンチセンスｓｔｏｐＢｇｌＩＩオリゴ（SEQ ID NO:36）［Canf Iの停止コドンの３’側４０ｂｐの２４量体］（図４）を含んだ。プログラム４０×（９５℃ ３０秒／６０℃ ４５秒／７５℃４５秒）を上記のプライマー及びＰｆｕＩＤＮＡポリメラーゼと共に用いて、〜６００ｂｐ長のＤＮＡ断片を増幅し、続いてそれを０．６％低融点アガロースゲル上でバンドとして単離した。このゲルスライスを７０℃で溶融し、³² Ｐ標識したオリゴヌクレオチドをプライマーと市販のキット（AmpliTaqサイクルシーケンシングキット、コネチカット、Norwalk在、Perkin Elmer Cetus）を用いるＰＣＲ配列決定のためのテンプレートとして利用した。プログラム３０×（９５ ℃ ３０秒／６０若しくは６８℃ ３０秒）をサイクルシーケンシングに用いた。増幅したｃＤＮＡの両鎖からの成熟Canf I蛋白質の明確な配列を得るためのＰＣＲ配列決定ストラテジーを、下記のセンスプライマー：ｓｔａｒｔｅｘ（SE Q ID NO:37）；ＳＢ（SEQ ID NO:38）；ＳＫ（SEQ ID NO:39）；ＳＥ（SEQ ID N O:40）；及びＳＨ（SEQ ID NO:41）並びにアンチセンスプライマー：Ｄｏｇ９（ SEQ ID NO:42）；ＡＳＫ（SEQ ID NO:43）；ＡＳＢ（SEQ ID NO:44）；及びＡＳＪ（SEQ ID NO:45）を用いて図４に示した。成熟Canf I蛋白質をコードする増幅したｃＤＮＡのＰＣＲサイクルシーケンシング分析は、Canf Iのクローン化部分的ｃＤＮＡから以前に得られたＤＮＡ配列を確認するための役に立った（図４）。 Canf Iの可能な生物学的機能を推論するために、そのアミノ酸配列をGenBank ，GenBankUpdate，EMBL,及びEMBL Update配列データベースの配列（９２年６月２５日）と、NCBI BLASTネットワークサービスを利用して比較した（Altschul,S.F., 等、（1990）J.Mol.Biol.,215:403-410）。Canf I前駆体蛋白質（成熟Canf I蛋白質中に見出されないシグナル配列を含む）は、次の３つの蛋白質と強い相同性を示した：１）ヒトのvon Ebner腺蛋白質；２）ラット（ＶＥＧ）のvon Ebner腺蛋白質前駆体（Hartwig,S.等、（1990）Nature,343:366-369）；及び３）ラットの臭気物質結合蛋白質（Pevsner,J.等、（1988）Science,241:336-339）。von E bner腺は、舌下腺であり、疎水性分子を含む味覚の強化に関与すると思われる多量の蛋白質を唾液中に分泌する。von Ebner腺蛋白質は、脂質親和性分子キャリアーのスーパーファミリーに属する（Godovac-Zimmermann,J,（1988）Trends Bi ochem.Sci. ,13:64-66）。Canf Iとヒト及びラットのvon Ebner腺蛋白質との間の相同性は、Canf Iがイヌのvon Ebner腺蛋白質の類似物であり得ることを示している。更なるデータは、Canf IｍＲＮＡが、von Ebner腺が局在する舌上皮組織において優勢に発現されており、耳下腺では極めて低レベルでしか発現していない（ノーザンブロット分析で検出不能）ことを示している。実施例３：精製したCanf IIの蛋白質配列分析アフィニティー精製したCanf I蛋白質をAalberse博士から得た（de Groot,H．等、前出）。Applied Biosystems Model 477A気相シーケンサーをオン−ラインフィニルチオヒダントイン（ＨＴＨ）アミノ酸分析（Model 120A）と共に用いて、精製したCanf I蛋白質を配列決定した。抽出プログラム、多重ブチルクロリド抽出の変法を用いてアミノ酸回収を改善した。プロリンがアミノ末端に位置する場合には、第１アミンのブロックにＯ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）を用いた。Brauer,A.W.等（1984）Anal.Biochemistry,137:134,142。イン・シトゥーアルキル化を、非求核性還元剤トリブチルホスフィンを４−ビニルピリジンによる同時アルキル化と共にエチルモルホリン緩衝液中で用いることによって行なった。 Andrews,P.C.及びDixon,J.E.,（1987）Anal.Biochemistry,161:524-528。この方法論を用いて、Canf II蛋白質のＮ末端の配列を決定した。夾雑シグナルのＯＰＡブロッキングと共に複数のＮ末端配列分析により同定された３８アミノ酸残基のＮ末端配列は、新規な蛋白質配列（SEQ ID NO:88）を表している（図１９）。実施例４：イヌ耳下腺からのｍＲＮＡの抽出及び Canf IIのクローニング Canf IIをクローニングするためのストラテジーを図１４に示す。ｃＤＮＡを、上記の調製物を逆転写におけるテンプレートとして使用して合成した。次の工程において、ｄｓＤＮＡをＰＣＲ用のテンプレートとして、Canf IIのアミノ酸配列に基づいてデザインし且つ方向付けた縮重プライマーと共に用いてCanf IIｃＤＮＡの断片を増幅した。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、次いで、直接配列決定にかけた。ヌクレオチド配列は、ＰＣＲ生成物がCanf IIｃＤＮＡの断片を表すことを確実にした。更なるポリメラーゼ連鎖反応を、一層長い断片を得るためにCanf II特異的プライマーを用いて行ない、続いて、それをプローブとして用いて犬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンを同定し、プラーク精製し、配列決定して完全長のCanf IIｃＤＮＡを得た。異系交配により得られた１匹の犬からの新鮮な耳下腺をTufts University Sch ool of Veterinary Medicine（マサチューセッツ、Worcester在）から得て、リン酸緩衝塩溶液にて洗浄し、ドライアイス上で直ちに凍結した。ＲＮＡを、本質的に文献（Chirgwin,J.M．等、（1979）Biochemistry,18:5294-5299）に記載されたようにして抽出した。２つの腺（約５０ｇ）を液体Ｎ₂で冷凍した乳鉢と乳棒で粉砕して粉末にし２５ｍｌのＧＴＣ緩衝液（５０％ｗ／ｖグアニジンチオシネート、０．５％ｗ／ｖＮａラウリルサルコシン、０．７％ｖ／ｖ β−メルカプトエタノール、０．１％ｖ／ｖ Sigma Antifoam A（ミズーリ、St.Louis在、Sigma）、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）に懸濁して溶解するまでボルテックスミキサーにかけた。この溶液中に存在するゲノムＤＮＡを、溶液の粘性がもはや低下しなくなるまで溶液を１６ゲージの注射針を通すことにより剪断した。この剪断した溶液を３Ｋｒｐｍで５分間、室温で遠心分離した。次いで、上清を、もはや粘性が低下しなくなるまで２３ゲージの注射針を通して剪断し、５Ｋｒｐｍで５分間、室温で遠心分離して澄ませた。この溶液をＣｓＣｌクッション（５．７ＭＣｓＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡｐＨ７．５）上に重層して、Beckman SW41 Tiローターにて３５Ｋｒｐｍで１６時間１７℃で遠心分離した。上清を捨て、ＲＮＡペレットを７０％ＥｔＯＨで洗い、次いで、０．３ＭＮａＯＡｃ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ中に再懸濁した。２容の無水ＥｔＯＨを加えて、ドライアイス上で沈澱を行なった。ＲＮＡを遠心分離によりペレット化し、７０％ＥｔＨＯで洗い、そしてＴＥＳ（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）中に再懸濁した。最終的収量は、全ＲＮＡの〜５．３ｍｇであった。ｍＲＮＡを全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム上のクロマトグラフィーにより、Aviv,H．及びLeder,P.により記載された方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,（1972）69:1408）を用いて単離した。２０μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを１．７ｍｇの全ＲＮＡから得た。腺ポリ（Ａ）ｍＲＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換は、標準的手順（Ausubel等、（1993）Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons）を用いて行なった。第１に、ポリ（Ａ）ＲＮＡをｃＤＮＡにコピーするのは、AmershamｃＤＮＡ合成システムプラスを用いて製造者の手順に従って行なった。４μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡをテンプレートとして用い且つオリゴｄＴ（１２〜１８）を用いて第１鎖合成をプライムした。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡをＲＮアーゼＨにより除去し、第２鎖をＤＮＡポリメラーゼＩにより合成した。二本鎖ｃＤＮＡを完成し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＤＮＡリガー-ゼにより鈍端化した（Gubler,U.及びHoffman,B.J.,（1983）Gene,25:263 ）。最初に、ＰＣＲ増幅（Mullis,K.B．及びFaloona,F.,（1987）Methods Enzymol ,155:355-360）を用いて、成熟蛋白質のアミノ酸１６〜２９（SEQ ID NO:97）をコードするCanf IIの部分的ｃＤＮＡを得た。犬耳下腺ｃＤＮＡをテンプレートとして、成熟Canf IIの残基３〜６（Ｓ１Ａ）（図１３）（SEQ ID NO:91）及び（Ｓ１Ｂ）（図１３）（SEQ ID NO:92）並びに残基３３〜３８（ＡＳＰ２Ａ）（図１３）（SEQ ID NO:93）及び（ＡＳＰ２Ｂ）（図１３）（SEQ ID NO:94）に基づく縮重したプライマー対（Applied Biosystems 392にて合成）と共に用いて、予想されるサイズ（〜１２０ｂｐ）のＤＮＡ断片を、ＰＣＲキット（GeneAmp ki t，コネチカット、Norwalk在、Perkin ElmerCetus）を用いて増幅した。反応のための条件は：９４℃で１分間の変性、４２℃で１分間のアニーリング及び７２℃で１分間の重合であった。このサイクルを３０回繰り返した。確実性の試験として、増幅した断片を、市販のキット（AmpliTaqサイクルシーケンシングキット、コネチカット、Norwalk在、Perkin Elmer Cetus）与えられた指示に従ってを用いる直接配列決定にかけた。増幅／配列決定において使用するプライマー（Ｓ１Ａ、Ｓ１Ｂ、ＡＳＰ２Ａ及びＡＳＰ２Ｂを含む）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて γ−³²ＰＡＴＰで末端標識した。次の１９サイクルのプログラム（９５℃で１分間の変性、５０℃で１分間のアニーリング及び７２℃で１５秒間の伸長）を、ＭＪリサーチミニサイクラーにてサイクルシーケンシング用に用いた。約４０ヌクレオチドの断片のヌクレオチド配列が成熟Canf II（SEQ ID NO:97）の残基１６〜２９を正確にコードしていることが示された。天然蛋白質のアミノ酸配列中の２６位の欠失した残基は、アスパラギンであることが見出された。ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いるのに十分な長さ（＞１００ｂｐ）のCanf II特異的なプローブを生成するために、Canf II ｃＤＮＡの５’及び３’末端を、アンカードＰＣＲ技術（Roux，K．H．及びDhanarajan， P.,（1990）Biotechniques,8:48-57;Rafnar,T．等、（1991）J.Biol.Chem.226:1 229-1236）を用いてクローン化した（図１５）。二本鎖の犬ｃＤＮＡを上記のようにして合成した。鈍端二本鎖ｃＤＮＡをアンカーアダプターＡＴ／ＡＬ（図１６；SEQ ID NO:96及び102）にライゲーションし、それにより、既知の配列をｃＤＮＡの５’及び３’末端に位置させた（図１５Ａ）。Canf II ｃＤＮＡの５ ’末端を得るために、アンカー配列ＡＰ２（図１６）（SEQ ID NO:95）に基づくプライマーを５’プライマーとして、３’アンチセンスプライマーＤ２−１（残基２２〜３０）（図１３及び１６）（SEQ ID NO:74）、Ｄ２−２（残基１７〜２５）（図１３及び１６）（SEQ ID NO:75）及びＤ２−３（残基１６〜２１）（図１３及び１６）（SEQ ID NO:76）（初期ＰＣＲから得た既知のCanf II ｃＤＮＡ配列に基づく）と共に用いた。ＰＣＲのシーケンシャルラウンド（４０×［９２ ℃ ３０秒／６０℃ １分間／７５℃ １分間］）を実施してCanf II ｃＤＮＡの５’末端を増幅した。１°反応において、二本鎖アンカードｃＤＮＡをテンプレートとして、５’ＡＰ２／３’Ｄ２−１プライマーと共に用いた；２°反応においては、１°反応混合物の１／２０を５’ＡＰ２／３’Ｄ２−２プライマーと共に用いた；３°反応においては、２°反応混合物の１／２０をＡＰ２／Ｄ２− ３プライマーと共に用いた。反応生成物の１％アガロースゲル電気泳動は、〜３００ｂｐ長の単一バンドの存在を示した。プライマーの位置から予想されるように（図１５参照）、２°及び３°反応生成物は、１°反応生成物より早く移動した。３°反応からの増幅断片をゲル精製し、ＰＮＡ配列分析にかけた。そのCanf II ｃＤＮＡの５’末端としての確実性を、成熟Canf II蛋白質のＮ末端残基の存在（図１５Ａ、影を付けた残基）により確認した。ｃＤＮＡの５’部分（図１５Ａ）（SEQ ID NO:98）は、成熟Canf II中には見出されないアミノ酸シグナル配列の部分をコードしていた。Canf II（図１５Ｂ）（SEQ ID NO:99）の３’部分を、５’末端と同様の方法で合成した。但し、一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして用い、ＡＰＡ（図１６）（SEQ ID NO:100）を３’プライマーとして用い、そして、Ｄ２−４（SEQ ID NO:77）、Ｄ２−５（SEQ ID NO:78）及びＤ２−６（SEQ ID NO: 79）（図１４及び１６）をＰＣＲにおける内部プライマーとして用いた。３°反応からのＰＣＲ生成物の直接配列決定は、既知のCanf II配列の８アミノ酸及びその下流の既知の配列の８アミノ酸の存在を示した。完全長Canf IIｃＤＮＡをクローン化するために、ｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な公開された手順（Gubler及びHoffman，Ausubel等、前出）を用いてスクリーニングした。ラムダｃＤＮＡライブラリーを、Clontech Laboratorie s,Inc.に依頼して次のように作成した：第１鎖ｃＤＮＡをポリ（Ａ）ＲＮＡからオリゴｄ（Ｔ）１５によりプライムした。鈍端二本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩリンカーCCGGAATTCCGGSEQ（ID NO:101）にライゲーションし、ＥｃｏＲＩで消化し、５００ｂｐより大きい断片を得るためにサイズで選択し、そして、ＥｃｏＲＩ切断して脱リン酸化したベクターλｇｔ１０にライゲーションした。このＤＮＡを、次いで、ラムダ粒子内にパッケージングして、C690-hfl及びC-600大腸菌株上にプレートし、そして、ライブラリーの力価を測定した。この非増幅ライブラリーは、０．６ｋｂから３〜４ｋｂのサイズに及ぶ挿入物を含む１．５３×１０⁶の独立のクローン（C-600hfl宿主上の透明プラーク）からなった。挿入物の平均サイズは、Clonte chλｇｔ１０プライマーを用いてＰＣＲにより測定して１．２ｋｂであった。１００，０００クローンをC-600hfl宿主上にプレートし、Canf II特異的プローブを用いてスクリーニングした。Canf II ｃＤＮＡのクローニング及び配列決定をするための操作は、Protocols in Molecular Biology（Ausubel等、前出）に従って行なった。Canf IIプローブを、Ｄ２−９（SEQ ID NO:80）及びＤ２−１３（SEQ ID NO:83）プライマー（図１６）を用いる犬ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た。次いで、ＰＣＲ生成物をランダムプライミングにより³²Ｐ標識した。２０の陽性クローンをプラーク精製し、ファージＤＮＡを個々のクローンから抽出し、ＥｃｏＲＩで消化してｐＵＣ１８中にサブクローン化した。挿入物の存在を、プラスミッドＤＮＡのＥｃｏＲＩでの消化により確認し、３つの個々のクローンのヌクレオチド配列を、シーケナーゼ（United States Biochemicals）及びAm pliTaqサイクルシーケンシングキット（コネチカット、Norwalk在、Perkiｎ Elmer Cet us）を製造者の指示に従って用いて決定した。ＰＣＲサイクルシーケンシング分析は、恐らくＧＣリッチなCanf IIテンプレート上の２次構造の形成の結果であろう幾つかのＤＮＡ配列の曖昧さを解決するための役に立った。配列決定のストラテジーを、図１７に描いてある。配列決定／増幅に用いたプライマーは、New England BioLabs から市販されている１６量体のReverse Sequencing Primer（-21）及び１７量体のSequencing Primer（-20）並びに図１６に列挙したCanf II特異的プライマーを含んだ。これらの３つのクローンのヌクレオチド配列は、蛋白質配列決定及び部分的ｃＤＮＡのＰＣＲ配列決定（前記参照）により初期に同定された成熟Canf IIの３８Ｎ末端アミノ酸残基（図１３におけるアミノ酸１〜３８）（SEQ ID NO:88）を含むオープンリーディングフレームの存在を示した。配列決定ストラテジー及び３つのｃＤＮＡクローン１ａ、１ｃ及び１ｊの特徴を図１７に示す。７９１ｂｐ（SEQ ID NO:67）のクローン１ｃは、Canf II前駆体蛋白質（シグナル配列を含む）の全長をコードし及び５’（塩基１〜１９４）及び３’（塩基７３８〜７９１）非翻訳領域を含む。７９３ｂｐ（SEQ ID NO:69）のクローン１ａ及び７７４ｂｐ（SEQ ID NO:71）のクローン１ｊは、シグナル配列の部分が失われ、１ｃにおけるよりも長い３’非翻訳領域を含む前駆体Canf II蛋白質をコードしている。この配列の整列は、３つのクローン間の多形を示した（図１８）。１ａのヌクレオチド配列は、１ｃと比較して、１ヌクレオチド置換（６０７位にてＣからＴ）及び１欠失（７５２位）を含む（図１８）。１ｊのヌクレオチド配列は、１ａ及び１ｃと比較して、２つのヌクレオチド置換を３４７位（ＴからＣ）及び４０１位（ＧからＴ）に含む。更に、クローン１ａ及び１ｃの配列は、それらの５’及び３’末端において有意に異なっている。４０１位におけるＧからＴへの置換は、Canf IIの予想アミノ酸配列を、残基６８において、グリシン（ＧＧＣ）からバリン（ＧＴＣ）に変える。他のすべてのヌクレオチド変化は、それらがサイレント突然変異であるか又は成熟Canf IIのコード配列の外側にあるのでCanf IIのアミノ酸配列を変化させない。ｃＤＮＡクローン間の多形は、異なる対立遺伝子からのCanf II伝子の発現を反映しているのであろう。それは、誤りへと導き得る逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成の故のクローングアーティファクトを表していることもあり得る（Holland等、（1982）Science ,215:1577-1585）。例えば、精製ＨＩＶ−１逆転写酵素は、１／２０００〜１／４０００の割合で取り込み誤りを導くことが見出された（Preston等、（1988）S cience ,242:1168-1171）。ＧＣリッチなCanf II ｍＲＮＡ上の２次構造形成が、逆転写の停止又は合成の異常終了を引き起こすこともあり得る。図１８に示したCanf II蛋白質の予想配列（SEQ ID NO:68）は、図１８に示したｃＤＮＡ（SEQ ID NO:67）の塩基１９５〜２５１によりコードされる１９アミノ酸のシグナル配列を含んでいる。このシグナル配列は、塩基２５２〜７３４によりコードされる成熟Canf II蛋白質中には見出されない。−１９位のメチオニンコドンは、次の理由により、真の開始メチオニンコドンであり、内部メチオニン残基ではない：１）シグナルペプチド（残基−１９〜−１）の予想アミノ酸配列がCanf IIに関連する蛋白質のシグナル配列に高度に類似しており且つ長さが等しいこと（下記参照）；及び２）他のインフレームのメチオニンコドンが仮の開始メチオニン（−５３位）の５’側に見出されるにもかかわらず、それが真の開始コドンであることはなさそうであること（何故なら、残基−５３から開始するペプチドの演繹されたアミノ酸配列は、任意の既知のシグナル配列よりずっと長く且つ如何なる既知のシグナル配列とも何ら類似性を示さないから）。Canf I IｃＤＮＡは、予想分子量１８．２ｋＤａ及び単一の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を有する蛋白質をコードする。１）蛋白質配列分析中に残基２５にアミノ酸シグナルが見出されなかったこと、及び２）アスパラギン残基が、Ｎ結合グリコシル化のためのコンセンサス配列（Ｎ２６Ｋ２７Ｓ２８）内にあることの故に、これらのデータは、Ｎ２６残基がＮ結合グリコシル化により修飾されることを強く示唆する。Ｎグリコシル化は、成熟蛋白質の分子量を増加させ得る。この核酸配列によりコードされた成熟蛋白質の演繹されたアミノ酸配列は、実施例３に記載のようにして行なった精製Canf II蛋白質のアミノ酸配列分析により決定された既知のＮ₂末端及び内部アミノ酸配列と同じである。種々の組織におけるCanf II蛋白質の発現を、ノーザンブロット技術を用いて研究した。種々の組織からのポリ（Ａ）ＲＮＡ又は全ＲＮＡを、２．２Ｍホルムアミドを含む１．５％アガロースゲル中で電気泳動により分離した。（Ausubel 等、前出）。電気泳動後に、分離したＲＮＡをGeneScreenメンブレン（NEN）上にトランスファーした。トランスファー、³²Ｐ標識したCanf IIプローブとのハイブリダイゼーション［該プローブは、Ｄ２−９（SEQ ID NO:14）及びＤ２−１３（SEQ ID NO:83）（図１６）プライマーを用いる、ＰＣＲによる増幅によって得た］及びフィルターの洗浄を、製造者の指示に従って行なった。Canf IIプローブは、高緊縮にて特異的に、犬耳下腺からのＲＮＡ及び舌上皮組織からのＲＮＡとハイブリダイズすることが分かった（図２０）。それは、肝臓又は下顎腺からのＲＮＡとはハイブリダイズしなかった。ハイブリダイゼーションでは、約８００ｂｐと９００ｂｐの２つのバンドが認められ、これは、Canf IIが２種のｍＲＮＡ種によってコードされていることを示唆している。サザーンブロット実験は、犬ゲノム中に単一コピーのCanf II遺伝子しか存在しないことを示唆したので、２種のＲＮＡが２つの異なる遺伝子から転写されるということはありそうもない。これらの２種のCanf IIをコードするｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの別のスプライシング又は分解のためであろう。前者の可能性が非常にありそうである。何故なら、３’非コード領域における異なるスプライシング構成が、Canf IIに類似の蛋白質について記載されているからである（Clark等、（1984）EMBO J.,3:1045-1052、下記も参照されたい）。 Canf IIの可能な生物学的機能を推論するために、そのアミノ酸配列をGenBank ，GenBankUpdate，EMBL,及び EMBL Update配列データベースの配列と、NCBI BL ASTネットワークサービスを利用して比較した（Altschul,S.F.，等、（1990）J. Mol.Biol. ,215:403-410）。Canf II前駆体蛋白質は、次の２群の関連蛋白質と高度の類似性を示した：１）マウス尿蛋白質（ＭＵＰ）（図２１）（SEQ ID NO:90 ）及び２）ラットの尿ａ−２−グロブリン（Ａ２Ｕ）（図２１）（SEQ ID NO:89 ）。ＭＵＰ及びＡ２Ｕの配列は、それらの両者がリポカリン蛋白質ファミリー（ Cavaggioni等、（1987）FEBS Lett.,212:225-228）のメンバーであることを示している。これらは、疎水性分子に高度の親和性と特異性をもって結合し得る小型蛋白質である。このファミリーは、現在、配列相同性により基本的には一致する２０の異なる蛋白質を含んでいる（Flower等、（1991）Biochem.Biophys.Res.Co mmun. ,180:69-74）。ＭＵＰ及びＡ２Ｕの機能は不明であるが、ゲッ歯類の尿蛋白質がフェロモン束縛及び引き続くそれらの乾燥尿からの放出の原因であることが提案されている（Bocskei等、（1992）Nature,360:186-188）。それらは、肝臓において種々のレベルで合成され且つ顎下腺、涙腺、耳下腺及び乳腺において合成される（Shahan等、（1987）Mol.Cell.Biol.,7:1947-1954）。例えば、ＭＵＰＩＶは、涙腺及び耳下腺において優勢に発現されるが、肝臓では発現されない（Sh ahan等、前出）。Canf II、ＭＵＰ及びＡ２Ｕのアミノ酸類似性並びにそれらの発現パターンは、Canf IIが犬のリポカリン類似物であることを示し得る。興味深いことには、ＭＵＰ及びＭＵＰ関連蛋白質の免疫学的及び生化学的研究は、これらの蛋白質が重要なヒトアレルゲンであることを示している（Lorusso等、（1 986）J.Allergy Clin.Immunol.,78:928；Platts-Mills等、（1987）J.Allergy C lin.Immunol. ,79:505；Gurka等、（1989）J.Allergy Clin．Immunol.,83:945-95 4）。実施例５：Canf Iの細菌での発現 Canf Iの細菌での発現を下記のようにして行なった。ベクターｐＥＴ１１ｄΔ ＨＲＨｉｓ６（ウィスコンシン、Madison在、Novagen;ImmuLogic Pharmaceutical Corpo rationにてJ.P.Morgensternにより改変）を、このベクターに挿入すべきCanf I ｃＤＮＡからの内部ＥｃｏＲＩ制限部位（残基Ｅ１４３Ｆ１４４）の除去によって、大腸菌におけるCanf Iの発現用に改変した。この改変は、このベクター中のすべてのＤＮＡ断片は、Ｈｉｓ６のＮＨ₂末端リーダー配列と双方の５’ＥｃｏＲＩ部位にてインフレームでクローン化されるので必要であった。それ故に、挿入物内部のＥｃｏＲＩ部位は、回避しなければならない。ｐＥＴ１１ｄΔＨＲＨｉｓ６ベクターは又、挿入物が３’ＢａｍＨＩ部位を有することをも必要とする。しかしながら、Ｂｇ１ＩＩ及びＢｃ１Ｉ等の制限部位は、ＢａｍＨＩオーバーハングと互換性があるので、それらは、Canf IｃＤＮＡの３’末端に位置することが出来、内部ＢａｍＨＩ部位を突然変異させる必要性を回避する。成熟Canf I 蛋白質をコードするｃＤＮＡは、その除去された内部ＥｃｏＲＩ部位、５’末端に位置する、ユニークなＥｃｏＲＩ部位及び３’末端に位置するＢｇ１ＩＩ部位を、増幅中の誤りを最小にするためにＰｆｕＩＤＮＡポリメラーゼを用いる２ステップＰＣＲ反応（Ho等、前出）において有した（図６）。Canf IｃＤＮＡの半分２つを第一次ＰＣＲ反応（テンプレート：サイクルシーケンシングからのＰＣＲ断片、プログラム：４０ ×［９５℃ ３０秒／６０℃ ４５秒／７５℃ ４５秒］）にて増幅し、この分子の５’部分をＳｔａｒｔｅｘ（SEQ ID NO:46及びSEQ ID NO:47）／ＥＦアンチセンス（SEQ ID NO:50及びSEQ ID NO:48）プライマー対を用いて増幅し、３’ 部分をセンスＥＦ（SEQ ID NO:49及びSEQ ID NO:48）／ＴＡＧＢｇ１ＩＩ（SEQ ID NO:51及びSEQ ID NO:52）プライマー対を用いて増幅した。両ＥＦプライマーを、Canf Iの残基Ｅ１４３Ｆ１４４のＥｃｏＲＩ部位に点突然変異（GAATTCから GAGTTC）を導入するようにデザインした（これは、グルタミン酸がGAA又はGAGコドンによってコードされるので、Ｅ１４３残基を維持する）。予想されるサイズの増幅されたＤＮＡ断片をゲルスライスにて０．６％低融点アガロースゲルから単離し、７０℃にて融解させ、混合して第二次（２°）ＰＣＲ反応にてテンプレートとして、Ｓｔａｒｔｅｘ及びＴＡＧＢｇ１ＩＩプライマーと共に用いた。Ｅ１４３Ｆ１４４対を有する突然変異させた領域は、反応の初期ステージで、ハイブリダイズしてCanf IｃＤＮＡの５’及び３’にリンクするが、他方、末端５’及び３’プライマーは完全な突然変異させたｃＤＮＡを増幅するのに役立つであろう。全反応を、フェノール／クロロホルム抽出し、ＥｔＯＨ沈殿させ、７０％ＥｔＯＨで洗い、そしてＥｃｏＲＩ及びＢｇ１ＩＩで消化した。予想されるサイズ（〜４５０ｂｐ）のバンドをゲルスライスとして０．６％低融点アガロースゲルから単離し、７０℃で融解させ、室温でＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＥＴ１１ｄΔＨＲＨｉｓ６プラスミッドにライゲーションして、そのライゲーションしたものをＸＬ−１細菌（Stratagene）中にトランスフォームした。トランスフォームしたコロニーの１つの３ｍｌの培養物の、ＥｃｏＲＶ消化によるミニプレプ分析（Qiagen［カリフォルニア、Foster City在］プラスミッドミニキットを使用）は、発現ベクター中の適当なサイズの挿入物の存在を示した。このコロニーを接種した３００ｍｌの培養物を成長させ、プラスミッドＤＮＡを抽出し（Qiag enプラスミッドmidiキット）そしてＤＮＡ配列分析にかけた。全４５３ｂｐ挿入物が、成熟Canf IｃＤＮＡの正確な配列（GAAからGAGの突然変異したＥ１４３コドンを含む）を有し、５’末端にコードされたインフレームで付加されたＨｉｓ６レポーター基（SEQ ID NO:53）を伴うことが示された。このＨｉｓ６レポーター基は、組換え蛋白質の金属イオンアフィニティー精製にてＮＴＡＮｉ⁺⁺キレート樹脂（Qiagen;Hochuli等、前出）を用いて使用すべきものであった。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ１１ｄΔＨＲＨｉｓ６Canf IｄＲＩ細菌の単一コロニーを２ｍｌの脳心臓浸出液（ＢＨＩ）培養（＋２００μｇ／ｍｌアンピシリン）に接種して、飽和ではないが濃濁するまで３７℃でインキュベートした。この時点で、６μｌを取り出して６００μｌのＢＨＩに加えて混合した。１００μｌを６つのＢＨＩ間テンプレート（＋２００μｇアンピシリン）の各々に広げて一晩３７℃でインキュベートした。翌朝、細菌の芝生をプレートから掻き取ってプールして２０ｍｌのＢＨＩ培地中に再懸濁し、次いで、１ｍｌのアリコートを取って、１８個の２リットルEhrlenmeyerフラスコ中の各５００ｍｌのＢＨＩ培養物（＋２００μｇ／ｍｌアンピシリン）に加えた。培養物を３７℃でインキュベートし、Ａ₆₀₀が１．０に達するまで３００ｒｐｍで振盪した。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、終濃度１ｍＭまで加えてＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導した（これは、更に、ハイブリッドＴ７ｇｎ１０／ｌａｃ０プロモーターからのＨｉｓ６Canf I蛋白質の発現を誘導する）。発現を２時間進行させ、その後細菌をペレット化して６Ｍグアニジンヒドロクロリド（ＧｕＨＣｌ）、１００ｍＭＮａＰＯ₄ 、１０ｍＭトリス、１００ｍＭ２−メルカプトエタノール（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。抽出を１時間激しく振盪しながら行ない、不溶性物質を１０Ｋｒｐｍで−ＪＡ−１０ローター（Beckman）にて１時間でペレット化することにより停止した。上清を取り出し、そのｐＨを８．０に調節してから、６ＭＧｕＨＣｌ、１００ｍＭＮａＰＯ₄、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）にて平衡化した５０ｍｌのＮＴＡアガロースカラム上に載せた。カラムを、次のように、ステップ勾配により洗った：１）６ＭＧｕＨＣｌ、１００ｍＭＮａＰＯ₄、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、２）８Ｍ尿素、１００ｍＭＮａＰＯ₄、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、３）８Ｍ尿素、１００ｍＭＮａＯＡｃ、１０ｍＭトリス（ｐＨ６．３）（各洗浄処理を、カラムからの流出液のＡ₂₈₀がバックグラウンドに達するまで行なった）。組換えＨｉｓ６Canf I蛋白質は、８Ｍ尿素、１００ｍＭＮａＯＡｃ、１０ｍＭトリス（ｐＨ４．５）にてカラムから溶出された。プールしたピーク画分の収量は、〜１００ｍｇであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した物質試料の密度測定により測定して〜８０％の純度であった。 Canf Iをコードする核酸を含むベクターｐＥＴ１１ｄでトランスフォームした大腸菌を、ＡＴＣＣに、受託番号６９１６７にて寄託した。実施例６：Canf I蛋白質の哺乳動物での発現哺乳動物細胞内で発現される可能なグリコシル化した形態の組換えCanf I蛋白質を生成するために、Canf Iの発現を下記のように行なった。完全長のCanf I蛋白質（成熟蛋白質中には見出されないリーダー配列を含む）は、哺乳動物細胞内で発現させた場合、適当に折りたたまれ、グリコシル化されて分泌される。組換えCanf Iの高レベルの一過性発現のための２つの系を用いた。第１に、ＣＯＯＨ末端に融合したＨｉｓ６レポーター基を有する組換えCanf Iの一過性発現を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ｐＪ７Ω発現ベクター（Morgenstern,J. P.及びLand,H.,（1990）Nuc.Acids Res.,18:1068）を用いて行なった。ｐＪ７Ω は、ポリリンカー中に挿入された遺伝子の発現を、一過性トランスフェクト中に、ＳＣＭＶＩＥ９４プロモーター（Morgenstern及びLand，前出）から、高レベルに駆動する。全Canf Iコード配列を含むｃＤＮＡを、５’Kozakリーダー（SEQ ID NO:54）／３’ＴＡＧＢｇ１ＩＩ（SEQ ID NO:51及びSEQ ID NO:52）プライマー対（図７参照）を伴う全犬耳下腺ｃＤＮＡの、ＰｆｕＩによるＰＣＲを用いて増幅した。全ＰＣＲ反応をフェノール−クロロホルム抽出し、ＥｔＯＨ沈殿させ、７０％ＥｔＯＨで洗い、そして、ＸｈｏＩ及びＢｇ１ＩＩで消化してｐＪ７Ωへの挿入のための正確なオーバーハングを生成した。全Canf IｃＤＮＡをコードするために予想されるサイズ（〜６００ｂｐ）のバンドを、ゲルスライスとして、０．６％低融点アガロースゲル上で単離し、７０℃で融解して、Ｓａ１Ｉ／Ｂｇ１ＩＩ消化したｐＪ７Ωに室温でライゲーションした（図７参照）。このライゲーションしたものをコンピテントなXL-1 Blue大腸菌中にトランスフォームして、陽性コロニーをアンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）皿上で選択した。挿入物の５’及び３’末端のＤＮＡ配列分析を、２つのコロニーの３ｍｌの培養物から得たプラスミッド上で行った（Qiagenプラスミッドminiキットを使用）。両プラスミッドは、完全長のCanf Iの５’及び３’末端の正確な配列を有する挿入物を有した。次に、哺乳動物細胞中で生成された組換えCanf I蛋白質の精製を助成するために（Jankecht,R．等、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8972-8976）、Ｈｉｓ６レポーター基は、ＣＯＯＨ末端に融合されるべきものであった。これを、Ca nf IのＣＯＯＨ末端をコードするＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ−Ｂｇ１ＩＩ断片として切り出し、それを更なる６ヒスチジンで改変した蛋白質のＣＯＯＨ末端をコードするＥｃｏＲＩ−Ｂｇ１ＩＩ断片と交換することにより達成した（図８）。このＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ６ＤＮＡ断片を、次のような重複する合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲにより生成した：成熟Canf I蛋白質の残基Ｅ１２３〜Ｑ１４８（SE Q ID NO:55）をコードするセンスオリゴヌクレオチド（SEQ ID N0:56）；センス３’Ｈｉｓ６リンク（SEQ ID NO:57）；残基Ｅ１４１〜Ｑ１４８／Ｈｉｓ６域／停止コドン（SEQ ID NO:50及びSEQID NO:59）をコードするアンチセンスオリゴヌクレオチド；及び３’Ｈｉｓ６ＴＡＧＢｇ１ＩＩ（SEQ ID NO:60）を合成してＯＰＣカラムクロマトグラフィー（カリフォルニア、Foster City在、Applied Biosyste ms）により精製した。更に、上記のオリゴヌクレオチドの最初の２４ヌクレオチドからなる一層小さいプライマーである５’Ｈｉｓ６リンク及び３’Ｈｉｓリンクをも合成した。ＰＣＲによって、これらの２つの長いオリゴヌクレオチドを結合し且つ増幅して、Canf IＣＯＯＨ末端 −Ｈｉｓ６融合物をコードするＥｃｏＲＩ−Ｂｇ１ＩＩＤＮＡ断片を生成した。それぞれの大型オリゴヌクレオチド１０ｐモルを、プログラム４０×（９５℃ ３０秒／６０℃ ４５秒／７５℃ ３０秒）を使用し１μＭプライマーを用いるＰｆｕＩによるＰＣＲにおいて基質として用いた。全ＰＣＲ反応をフェノール抽出し、ＥｔＯＨ沈殿させ、７０％ＥｔＯＨ洗浄し、ＥｃｏＲＩ及びＢｇ１ＩＩで消化してｐＪ７Ωへの挿入のための正確なオーバーハングを生成した。Canf IＣＯＯＨ末端／Ｈｉｓ６融合物をコードするための予想されるサイズ（〜１１０ｂｐ）のバンドを２．０％NuSieveアガロースゲル上のゲルスライスとして単離し、７０℃で融解させてＥｃｏＲＩ／Ｂｇ１ＩＩ消化したｐＪ７ΩCanf Iに室温でライゲーションした。このライゲーションしたものをコンピテントなXL-1 Blue 大腸菌にトランスフォームして陽性クローンをアンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）皿にて選択した。プラスミッドを、異なるコロニーを接種した４つの培養から単離して挿入物の３’末端におけるＤＮＡ配列分析にかけた。クローン＃３は、Canf IのＣＯＯＨ末端にインフレームで結合した予想されたＨｉｓ６残基を含んでおり、それ故、この培養物の大規模生育に取りかかってトランスフェクション用に多量のｐＪ７ΩCanf IＨｉｓ６プラスミッドを得た。Ａ₆₀₀が０．６に到達したら、１リットルの培養物を１５μＭクロラムフェニコール中で増幅させた。８００ μｇのプラスミッドを、アルカリ溶解及び２回の連続したＣｓＣｌバンド化（Sa mbrook等、前出）の後に単離した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の１０プレートを、１．７×１０⁶細胞／１５ｃｍ組織培養皿でまき、次の朝、２０μｇ／皿のｐＪ７ΩCanf IＨｉｓ６プラスミッド（Park er，B.A.，及びStark,G.R.,（1979）J.Virol.,31:360-369）でのリン酸カルシウムトランスフェクトに供した。トランスフェクションの４８時間後に、これらの皿から上清をプールし、０．４５μユニット（Costaｒ）を通して濾過し、そして、１μＭイミダゾール濃度とした（プロテアーゼインヒビター１ｍＭＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、１μｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター及び１μｇ／ｍｌロイペプチンを添加）。その上清を、１×ＰＢＳ、１ｍＭイミダゾール、１ｍＭＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、１μｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター及び１μｇ／ｍｌロイペプチンにて平衡化した２ｍｌＮＴＡアガロース（Qiagen）カラムに加えることにより、Canf IＨｉｓ６蛋白質の金属イオンアフィニティー精製を達成した。非特異的に結合した蛋白質を、１０カラム容積のＩＸＰＢＳ、２０ｍＭイミダゾール、１ｍＭＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、１μｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター及び１μｇ／ｍｌロイペプチンでカラムから洗い出した。Canf IＨｉｓ６蛋白質は、１×ＰＢＳ、８０ｍＭイミダゾール、１ｍＭＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、１μｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター及び１μｇ／ｍｌロイペプチン（Hoffmann,A．及びRoeder,R.G., （1991）Nuc.Acids,Res.,19:6337-6338及びJanknecht等、前出）にて、特異的にカラムから溶出された。溶出した画分のアリコートを１２％ＳＤＳＰＡＧＥによって分析した。ゲルのクーマシーブルー染色は、分子量〜７０ｋＤａ、４５ｋＤａ及び２５ｋＤａの３つの主要バンドを示した。天然のイムノアフィニティー精製したCanf Iの分子量は２５ｋＤａである（Schou等、及びGroot等、前出）ので、このＳＤＳゲル上の最小のバンドが組換えCanf IＨｉｓ６であることが推測される。実施例７：ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットによる組換えCanf Iに対するヒトＩｇＥの直接結合ＥＬＩＳＡプレート（IMMULON II、バージニア、Chantilly在、Dynatech）を、細菌で発現させた組換えCanf I（rCanf Ｉ）で０．５μｇ／ウェル（ＰＢＳ−Tween 中）にて被覆し、４℃で一晩インキュベートした。被覆抗原を取り出し、ウェルをＰＢＳ中の０．５％ゼラチン（２００μｌ／ウェル）で２時間室温でブロックした。皮膚試験陽性の犬アレルギー患者＃９０１からの血漿を、ＰＢＳ−Tween で連続的に希釈して、ウェル当り１００μｌを加えて一晩４℃でインキュベートした（これらの血漿の希釈物は二連で試験した）。第２抗体（ビオチン化ヤギ抗−ヒトＩｇＥ１：１０００、Ki rkegaard & Perry Laboratories）を、１００μｌ／ウェルで１時間室温で加えた。この溶液を取り出し、ストレプトアビジン−ＨＲＰＯを１：１０，０００（アラバマ、Birmingham在、Southern Biotecnology Associates）で１時間室温で加えた。ＴＭＢメンブレンペルオキシダーゼサブストレートシステム（Kirkegaard & Perry Laboratories）を新たに混合して１００μｌにて加えた。２〜５分間発色させた。この反応を、１００μｌ／ウェルでの１Ｍリン酸の添加により停止させた。このプレートを、Mircoplate EL 310オートリーダー（バーモント、winooski在、Biotek Instruments）で４５０ｎｍフィルターを用いて読んだ。二連のウェルの吸光度レベルを平均した。そのグラフ化した結果を、図１１に示す。このデータは、患者＃９０１が、１／１６２希釈（用いた最大血漿希釈物）にて、組換えCanf Iに対する結合レベルがやはりバックグラウンドの２倍である程に高レベルの抗Canf特異的ＩｇＥを有することを示している。公知の陰性患者（＃２５０）は、このアッセイによって陰性であることも試験して示された。 Canf Iの潜在的源として４つの異なる蛋白質調製物のウエスタンブロットを行なった。ウエスタンブロッティングに用いた４つの異なる調製物は：犬の毛の抽出物、犬の唾液、細菌で発現させたrCanfＩ（ＥＬＩＳＡに使用）及び哺乳動物細胞培養システムにて発現させたrCanfＩであった。これらの調製物を１５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥに５μｇ／レーンで載せた（それぞれ、１〜４レーン）。蛋白質濃度は、ビシンコニニン酸（Bicinchoninic acid）（ＢＣＡ）アッセイ（イリノイ、Rockford在、Pierce）に基づいた。電気泳動後に、これらの蛋白質をニトロセルロースにトランスファーして、墨汁で染色した。ニトロセルロース切片を、１％ミルク／１％ＢＳＡを含むTween溶液中で３０分間室温でインキュベートすることによりブロックし、次いで、患者＃９０１血漿又は陰性対照患者＃２５０をプローブとして、Tween緩溶液中で１：２０希釈にて調べた。この第一次抗体インキュベーションを一晩室温で行なった。ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＥ（ＫＰＬ）を第２次抗体として用いて１：５０００希釈にて２時間インキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（１：２０，０００希釈）及びＥＣＬウエスタンブロット検出システム（イリノイ、Arlington Heights在、Amersham）を、化学発光による検出のために用いた。２０秒露出を行なって、フィルムを現像した。このアッセイの結果は、患者＃２５０のＩｇＥによっては蛋白質調製物の認識がされないことを示している。犬アレルギー患者＃９０１からのＩｇＥは、唾液中のCanf I蛋白質及び細菌で発現させた組換えCanf Iへの明瞭な結合（図１２、レーン２及び３）を示している。これらの蛋白質型のサイズは、これらの２つの調製物間で異なっているが、これは、犬の唾液中に見出される天然Canf I蛋白質がグリコシル化されて見かけ分子量２８，０００で泳動されるのに対して、細菌からの組換え型は炭水化物修飾を有していないという事実のためである。患者＃９０１の血清からのＩｇＥの哺乳動物で発現されたrCanfＩへの結合は極めてかすかであり、目下のところ、陽性発現を示唆するのみである。完全長の細菌にて産生した型（レーン３）は、見かけ分子量１８，０００ダルトンを有し、レーン２及び３の両方の一層大きいＩｇＥ結合蛋白質は、恐らくもっと小さい分子量の蛋白質の２量体構造であろう。実施例８：Canf IIの細菌での発現多量の純粋な組換えCanf II蛋白質を容易に製造する試みにおいて、成熟Canf II蛋白質をコードする完全長ｃＤＮＡを、Ｄ２−３ｐｅｔ（SEQ ID NO:103）及びＤ２−５ｐｅｔ（SEQ ID NO:104）プライマー対（図１３）を用いるＰＣＲにおいて、全耳下腺ｃＤＮＡからの分子の増幅により得た。プライマーを、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれｃＤＮＡ分子の５’及び３’に導入するようにデザインした。ｐＥＴ１１ｄΔＨＲＨｉｓ６ベクターは、挿入物が５’ＥｃｏＲＩ部位及び３’ＢａｍＨＩ部位を有することを必要とする。予想サイズの増幅したＤＮＡ断片を、低融点アガロース中で電気泳動により精製して、室温でＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＥＴ１１ｄΔＨＲＨｉｓ６プラスミッドにライゲーションし、そのライゲーション混合物を用いてXL-1 Blue細菌（Stratagene）をトランスフォームした。幾つかのトランスフォームしたコロニーのミニプレップ分析（Qjagen［カリフォルニア、Foster City在］miniキットを使用）は、発現ベクター中の適当なサイズの挿入物の存在を示した。１コロニーを接種した３００ｍｌの培養物を生育させ、プラスミッドＤＮＡを抽出して配列分析にかけた。完全な４８６ｂｐの挿入物は、５’末端にコードされたレポーター基を付加された成熟Canf IIｃＤＮＡに対する正確な配列を有することが示された。このＨｉｓ６レポーター基は、組換え蛋白質のＮＴＡＮｉ⁺⁺キレート樹脂（Qiagen）を使用する金属イオンアフィニティー精製において用いるべきものであった。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ１１ｄΔＨＲＨｉｓ６Canf II細菌の単一コロニーを、２ｍｌの脳心臓浸出液（ＢＨＩ）培養（＋２００μｇ／ｍｌアンピシリン）中に接種して、飽和ではないが濃濁となるまで３７℃でインキュベートした。この時点で、６μｌを取り出して、６００μｌのＢＨＩに加えて混合した。６個の各ＢＨＩ寒天プレート（＋２００μｇアンピシリン）上に１００μｌを広げて一晩３７℃でインキュベートした。次の朝、細菌の芝生をプレートから掻き取ってプールし、２０ｍｌのＢＨＩ培地に再懸濁し、次いで、１ｍｌのアリコートを取って、１８個の２リットルEhrlenmeyerフラスコ中の各５００ｍｌのＢＨＩ培養物（＋２００μｇ／ｍｌアンピシリン）に加えた。培養物を３７℃ でインキュベートし、Ａ₆₀₀が１．０に達するまで３００ｒｐｍで震盪した。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、１ｍＭまで加えてＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導した（これは、更に、ハイブリッドＴ７ｇｎ１０／ｌａｃ０プロモーターからのＨｉｓ６Canf II蛋白質の発現を誘導する）。発現を２時間進行させ、その後細菌をペレット化して６Ｍグアニジンヒドロクロリド（ＧｕＨＣｌ）、１００ｍＭＮａＰＯ₄ １０ｍＭトリス、１００ｍＭ２−メルカプトエタノール（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。抽出を１時間激しく振盪しながら行ない、不溶性物質を１０ＫｒｐｍでＪＡ−１０ローター（Beck man）にて１時間でペレット化することにより停止した。上清を取り出し、そのｐＨを８．０に調節してから、６ＭＧｕＨＣｌ、１００ｍＭＮａＰＯ₄、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）にて平衡化した５０ｍｌのＮＴＡアガロースカラム上に載せた。カラムを、次のように、ステップ勾配により洗った：１）６ＭＧｕＨＣｌ、１００ｍＭＮａＰＯ₄、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、２）８Ｍ尿素、１００ｍＭＮａＰＯ₄、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、３）８Ｍ尿素、１００ｍＭＮａＯＡｃ、１０ｍＭトリス（ｐＨ６．３）（各洗浄処理を、カラムからの流出液のＡ₂₈₀がバックグラウンドに達するまで行なった）。組換えＨｉｓ６Canf I蛋白質は、８Ｍ尿素、１００ｍＭＮａＯＡｃ、１０ｍＭトリス（ｐＨ４．５）にてカラムから溶出された。プールしたピーク画分の収量は、〜１００ｍｇであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した物質試料の密度測定により測定して〜８０％の純度であった。 Canf IIをコードする核酸を含むベクターｐＥＴ１１ｄでトランスフォームした大腸菌を、ＡＴＣＣに、受託番号ＸＸＸにて寄託した。実施例９：ヒトＩｇＥの天然及び組換えCanf IIへの直接結合１４人の犬アレルギー患者（皮膚試験４＋）からの血漿試料を、天然Canf II 及びrCanf IIに結合するＩｇＥについてアッセイした。ＥＬＩＳＡプレート（Im mulon II、バージニア、Chantilly在、Dynatech）を、天然の及び細菌で発現させた組換えCanf IIで０．５μｇ／ウェル（ＰＢＳ−Tween中）にて被覆し、４℃で一晩インキュベートした。被覆抗原を取り出し、ウェルをＰＢＳ中の０．５％ゼラチン（２００μｌ／ウェル）で２時間室温でブロックした。ヒトＩｇＥの被覆抗原への結合を、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＥ、ペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジン及びＴＭＢ基質を用いて検出した。反応物を、プレートリーダーで、４５０ｎｍ（Ａ₄₅₀）にて読んだ。天然Can f IIに対するＩｇＥについて試験した１４の血漿試料の内、５つが検出可能な抗体結合を含んだ（最高レベルを含む患者＃９０１及び＃２２７からの血漿を使用）（図２２Ａ）。同様に、細菌で発現させた組換えCanf IIに対するＩｇＥについて試験した２３の血漿試料の内、幾つかは、検出可能な抗体結合を含んだ（図２２Ｂ及びＣ）。実施例１０：Canf IヒトＴ細胞増殖分析 Canf IＴ細胞刺激活性を有するペプチドを同定するために、Canf Iから誘導した幾つかのペプチドを生成して、組換えCanf I蛋白質でプライムしたヒトＴ細胞系統と共に培養し、標準的Ｔ細胞増殖アッセイによって応答を測定した。増殖アッセイにおいて、Canf I（Construct１（SEQ ID NO:105）、Construct２（SEQ I D NO:106 ）及びConstruct３（SEQ ID NO:107））から導いたペプチドのセット（それぞれは、Canf I蛋白質の一部に相当する）を用いた。更に、これらのアッセイは、Hill等、Journal of Immunology147:184-197に記載されたアルゴリズムを用いて潜在的Ｔ細胞エピトープを含んでいるので選択した２つのペプチド（アミノ酸７〜１９のＡ００９５（SEQ ID NO:108）及びアミノ酸４２〜５４の（SEQ ID NO:109））を含んだ。 Construct１、２及び３を、Canf I蛋白質を標準技術を用いて大腸菌中で発現させ、そして精製することによって生成した。Construct１（Canf Iのアミノ酸１〜６５）及びConstruct２（アミノ酸５６〜１０８）をコードするＤＮＡ断片を、完全長のCanf IｃＤＮＡを含むプラスミッドｐＥＴ１１ｄΔＨＲＨｉｓ６Ca nf IΔから増幅することによって獲得し、Ｈｉｓ６レポーター配列を含むｐＥＴ１１ｄベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位中にサブクローン化した。Constr uct３（アミノ酸９０〜１４８）をコードするＤＮＡ断片を同じプラスミッドから増幅してｐＥＴ１１ｄベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。組換え蛋白質を、ＮＴＡＮｉ⁺⁺キレート樹脂（Qiagen）にて、公開されたプロトコールに従ってアフィニティー精製した。 Canf I及び上記の５つのCanf Iペプチドに対するヒトＴ細胞増殖応答のイン・ビトロアッセイを行なうために、皮膚プリック試験においてCanf Iに対してアレルギー性の患者から得た全血液を、リンパ球分離用培地（ＬＳＭ）を通して血小板、赤血球及び顆粒球を除去した。その結果の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、５％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭＬ−グルタミン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、５０μＭ２−メルカプトエタノール並びに１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地中で、実施例２に記載したようにして生成した５０μｇ／ｍｌの組換えCanf Iで６日間刺激した。第２のＬＳＭ分離を行なって高密度の細胞残骸及び死細胞を除去した。その結果のＰＢＭＣ細胞を１２〜１８日間増殖させた。この期間中、培地に組換えＩＬ２（５単位／ｍｌ）及びＩＬ４（５単位／ｍｌ）を補った。リンパ球が休止点に到達したときに（³Ｈチミジンによる２０，０００細胞の一晩のパルス標識が２０００〜４０００ＣＰＭの範囲になったことで判定）、これらの細胞を第２増殖アッセイにおける分析のために再刺激した。第２Ｔ細胞増殖アッセイは、２×１０⁴Ｔ細胞／ウェル、抗原提示細胞としての５×１０⁴ＰＢＭＣ／ウェル（３５００ラドで照射）を含んだ。抗原を二重若しくは三重ウェルにて下記の濃度でアッセイした： rCanf Ｉ：４、４０及び１００μｇ／ｍｌペプチド：３、１５及び７５μｇ／ｍｌ犬抽出物：３、１５及び７５μｇ蛋白質／ｍｌこの調製物犬抽出物中のCanf Iの濃度は未知である Construct：初期に２０μｇ／ｍｌの単一濃度で、その後３、１５及び７５μｇ／ｍｌ Constructは、７５μｇ／ｍｌで不溶性であった。ＰＨＡを１ｐｇ／ｍｌで加えて非特異的活性化能力を誘導した。無関係の抗原である破傷風毒素を１：２０００、１：４０００及び１：８０００の希釈で加えてＴ細胞特異性を示した。第２アッセイの条件下での培養の３日後に、１μＣｉの³Ｈチミジンを各培養ウェルに加えて一晩インキュベートした。培養物をガラスフィルター上に採取して³Ｈチミジンの取り込みをβシンチレーション計数により測定した。ペプチドに対するＴ細胞応答の強さの尺度である刺激インデックスを、処理した培養物の³ Ｈチミジン取り込みを未処理の培地対照の³Ｈチミジン取り込みで割ることによって計算した。第２Ｔ細胞増殖アッセイの結果を、図２４〜２５に示す。図２４は、rCanf Ｉ，ペプチドＡ００９５〜Ａ００９６及びConstruct１〜３に対する個々の患者の刺激インデックスをグラフにより比較している。この比較は、Construct１〜３（これらは、集まると完全なCanf I蛋白質配列を含む）の相当な刺激インデックスによって示されるように、Canf I蛋白質におけるＴ細胞反応性の重要な領域がこの蛋白質の３つのすべての部分に見出されることを示している。図１０に示したペプチドについてのポジティビティーインデックスを、平均Ｔ細胞刺激インデックス（図２５）に試験した個人の内で陽性応答即ち少なくとも２のＴ細胞刺激インデックスを有した者のパーセントを乗ずることによって計算した。各試験したペプチドについての陽性応答者のパーセンテージは次の通りであった：rCanf Ｉ：８９％、Ａ００９５：４３％、Ａ００９６：４３％、Constr uct１：６４％、Construct２：７３％、Construct３：８２％。犬鱗屑アレルゲンに感受性の個人の集団において、ペプチドに対するＴ細胞応答の強さ（Ｓ．Ｉ．）及びペプチドに対するＴ細胞応答の頻度の両者を計るポジティビティーインデックスの比較（図１０）は、Canf I蛋白質のＮ末端（アミノ酸１〜６５）とＣ末端（アミノ酸９０〜１０８）の両末端が多くのＴ細胞エピトープを含むことを示す。同等物この発明は、好適具体例に関して記載されているが、他の具体例も同じ結果に到達し得る。当業者は、常例的実験を用いて、ここに記載した特定の具体例の多くの同等物を認識し又は確かめることが出来る。かかる同等物もこの発明の範囲内にあると考えられ、後述の請求の範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9452−4Ｂ 21/08 9358−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｑ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ，ＵＳ (72)発明者コニエツニ，アンドレイアメリカ合衆国 02178 マサチューセッツ，ベルモント，ウォルナットストリート 92 (72)発明者ビジンカウスカス，クリスティンビー. アメリカ合衆国 02122 マサチューセッツ，ドーチェスタ，キングストリート 119 (72)発明者ブラウア，アンドルーダブリュー. アメリカ合衆国 01970 マサチューセッツ，セイレム，ゲドニーコート 21

Claims

【特許請求の範囲】１．犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆＩの活性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。２．ｃＤＮＡ配列である請求項１の単離された核酸。３．ｃＤＮＡが図５に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を含む請求項２の単離された核酸。４．ｃＤＮＡが図５に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のコード領域を含を含む請求項２の単離された核酸。５．ペプチドが図５に示すアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む請求項１の単離された核酸。６．ペプチドが図５に示す配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のアミノ酸残基１〜１４８を含む請求項５の単離された核酸。７．ペプチドが図５に示すアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む配列と少なくとも５０％相同である請求項１の単離された核酸。８．ペプチドが、図５に示すアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含むペプチドをコードする核酸に高い或は低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる請求項１の単離された核酸。９．ペプチドが、少なくとも１０アミノ酸の長さである請求項１の単離された核酸。１０．ペプチドが、少なくとも２０アミノ酸の長さである請求項１の単離された核酸。１１．ペプチドが、少なくとも２５アミノ酸の長さである請求項１の単離された核酸。１２．ペプチドが、少なくとも３０アミノ酸の長さである請求項１の単離された核酸。１３．少なくとも２０アミノ酸残基又はそれ以上の長さを有しかつ図５に示す配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含むアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ。１４．犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆIIの活性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。１５．ｃＤＮＡ配列である請求項１４の単離された核酸。１６．ｃＤＮＡが図１８に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）を含む請求項１５の単離された核酸。１７．ｃＤＮＡが図１８に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）のコード領域を含む請求項１５の単離された核酸。１８．ペプチドが図１８に示すアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）を含む請求項１４の単離された核酸。１９．ペプチドが図１８に示す配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）のアミノ酸残基１〜１６１を含む請求項１８の単離された核酸。２０．ペプチドが図１８に示すアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）を含む配列と少なくとも５０％相同である請求項１４の単離された核酸。２１．ペプチドが、図１８に示すアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）を含むペプチドをコードする核酸に高い或は低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる請求項１４の単離された核酸。２２．ペプチドが、少なくとも約１０〜２０アミノ酸の長さである請求項１４の単離された核酸。２３．ペプチドが、少なくとも約１０〜１６アミノ酸の長さである請求項１４の単離された核酸。２４．少なくとも約１０〜１６アミノ酸残基又はそれ以上の長さを有しかつ図１８に示す配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）を含むアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ。２５．請求項１の核酸を含む組換え発現ベクター。２６．核酸がｃＤＮＡである請求項２５の組換え発現ベクター。２７．ｃＤＮＡが図５に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を含む請求項２６の組換え発現ベクター。２８．請求項１４の核酸を含む組換え発現ベクター。２９．核酸がｃＤＮＡである請求項２８の組換え発現ベクター。３０．ｃＤＮＡが図１８に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）を含む請求項２９の組換え発現ベクター。３１．ＣａｎｆＩの活性を有するペプチドの発現を指令することができる請求項２９の組換え発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞。３２．真核細胞である請求項３１の宿主細胞。３３．ＣａｎｆＩの活性を有するペプチドの発現を指令することができる請求項２７の組換え発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞。３４．真核細胞である請求項３３の宿主細胞。３５．ＣａｎｆIIの活性を有するペプチドの発現を指令することができる請求項２８の組換え発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞。３６．真核細胞である請求項３５の宿主細胞。３７．ＣａｎｆIIの活性を有するペプチドの発現を指令することができる請求項３０の組換え発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞。３８．真核細胞である請求項３７の宿主細胞。３９．請求項３１の宿主細胞を培地で培養してペプチドを発現させ、ペプチドを培養物から単離することを含むＣａｎｆＩの活性を有するペプチドを生成する方法。４０．請求項３５の宿主細胞を培地で培養してペプチドを発現させ、ペプチドを培養物から単離することを含むＣａｎｆIIの活性を有するペプチドを生成する方法。４１．請求項１の核酸の組換え発現によって産生された、犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆＩの活性を有する単離されたペプチド。４２．請求項３の核酸の組換え発現によって産生された、犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆＩの活性を有する単離されたペプチド。４３．請求項４の核酸の組換え発現によって産生された、犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆＩの活性を有する単離されたペプチド。４４．請求項１３のＤＮＡの組換え発現によって産生された、犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆＩの活性を有する単離されたペプチド。４５．化学合成によって生成された、犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆＩの活性を有する単離されたペプチド。４６．少なくとも約１０〜２０アミノ酸の長さである請求項４５の単離されたペプチド。４７．少なくとも約１０〜１６アミノ酸の長さである請求項４６の単離されたペプチド。４８．請求項１４の核酸の組換え発現によって産生された、犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆ IIの活性を有する単離されたペプチド。４９．請求項１６の核酸の組換え発現によって産生された、犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆ IIの活性を有する単離されたペプチド。５０．請求項１７の核酸の組換え発現によって産生された、犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆ IIの活性を有する単離されたペプチド。５１．請求項２４のＤＮＡの組換え発現によって産生された、犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆ IIの活性を有する単離されたペプチド。５２．化学合成によって生成された、犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆIIの活性を有する単離されたペプチド。５３．少なくとも約１０〜２０アミノ酸の長さである請求項５２の単離されたペプチド。５４．少なくとも約１０〜１６アミノ酸の長さである請求項５２の単離されたペプチド。５５．ＣａｎｆＩの活性を有する修飾されたペプチド。５６．図５に示すＣａｎｆＩアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）中に存在する少なくとも１個のシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換された請求項５５の修飾されたペプチド。５７．図５に示すＣａｎｆＩアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）中に存在する少なくとも１個のシステイン残基がセリン残基で置換された請求項５６の修飾されたペプチド。５８．少なくとも１個のリシン残基がペプチドのアミノ若しくはカルボキシ末端に或はアミノ及びカルボキシ両末端に加えられた請求項５５の修飾されたペプチド。５９．ＣａｎｆIIの活性を有する修飾されたペプチド。６０．図１８に示すＣａｎｆIIアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）中に存在する少なくとも１個のシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換された請求項５９の修飾されたペプチド。６１．図１８に示すＣａｎｆIIアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）中に存在する少なくとも１個のシステイン残基がセリン残基で置換された請求項６０の修飾されたペプチド。６２．少なくとも１個のリシン残基がペプチドのアミノ若しくはカルボキシ末端に或はアミノ及びカルボキシ両末端に加えられた請求項５９の修飾されたペプチド。６３．犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆＩの活性を有するペプチドの実質的に純粋な製剤。６４．犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆIIの活性を有するペプチドの実質的に純粋な製剤。６５．ＣａｎｆＩの活性を有する少なくとも一種のペプチド及び製薬上許容し得るキャリヤーを含む薬剤投与するのに適した組成物。６６．ペプチドが図５のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む請求項６５の組成物。６７．ペプチドが図５のアミノ酸残基１〜１４８（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む請求項６６の組成物。６８．ＣａｎｆIIの活性を有する少なくとも一種のペプチド及び製薬上許容し得るキャリヤーを含む薬剤投与するのに適した組成物。６９．ペプチドが図１８のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）を含む請求項６８の組成物。７０．ペプチドが図１８のアミノ酸残基１〜１６１（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）を含む請求項６９の組成物。７１．請求項６５の組成物を患者に投与することを含む、犬鱗屑アレルゲンに感受性の患者におけるアレルゲンへの感受性を治療する方法。７２．請求項６６の組成物を患者に投与することを含む、犬鱗屑アレルゲンに感受性の患者におけるアレルゲンへの感受性を治療する方法。７３．患者から得られる血液試料に請求項４１のペプチドを、血液成分とペプチドとを結合させるのに適した条件下で一緒にしかつそのような結合が起きる程度を求めることを含む、患者における犬鱗屑アレルゲンへの感受性を検出する方法。７４．結合が起きる程度を、Ｔ細胞機能、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞機能、血液中に存在する抗体への蛋白質の結合或はこれらの組合せを評価することによって求める請求項７３の方法。７５．請求項６８の組成物を患者に投与することを含む、犬鱗屑アレルゲンに感受性の患者におけるアレルゲンへの感受性を治療する方法。７６．請求項６９の組成物を患者に投与することを含む、犬鱗屑アレルゲンに感受性の患者におけるアレルゲンへの感受性を治療する方法。７７．患者から得られる血液試料に請求項４８のペプチドを、血液成分とペプチドとを結合させるのに適した条件下で一緒にしかつそのような結合が起きる程度を求めることを含む、患者における犬鱗屑アレルゲンへの感受性を検出する方法。７８．結合が起きる程度を、Ｔ細胞機能、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞機能、血液中に存在する抗体への蛋白質の結合或はこれらの組合せを評価することによって求める請求項７７の方法。７９．請求項４１のペプチドと特異的に反応する抗体。８０．モノクローナル抗体である請求項７９の抗体。８１．請求項４４のペプチドと特異的に反応する抗体。８２．モノクローナル抗体である請求項８１の抗体。８３．請求項４８のペプチドと特異的に反応する抗体。８４．モノクローナル抗体である請求項８３の抗体。８５．請求項５１のペプチドと特異的に反応する抗体。８６．モノクローナル抗体である請求項８５の抗体。８７．請求項４１のペプチドと特異的に反応するＴ細胞クローン。８８．請求項４１のペプチドと特異的に反応する可溶性Ｔ細胞レセプター。８９．請求項８８のＴ細胞レセプターと特異的に反応する抗体。９０．モノクローナル抗体である請求項８９の抗体。９１．請求項４８のペプチドと特異的に反応するＴ細胞クローン。９２．請求項４８のペプチドと特異的に反応する可溶性Ｔ細胞レセプター。９３．請求項９２のＴ細胞レセプターと特異的に反応する抗体。９４．モノクローナル抗体である請求項９３の抗体。９５．ＳＥＱＩＤＮＯ：１０５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１０９からなる群より選ぶアミノ酸配列な含む、犬鱗屑アレルゲンＣａｎｆＩの活性を有する単離されたペプチド。