JPH08319238A - リン酸化酵素阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】複数の炎症性サイトカイン遺伝子の転写を抑制
し、ステロイドが惹起するホルモン性の副作用がない、
しかもヒト細胞の増殖に対する影響は少ないがウイルス
の増殖を抑制する医薬品を提供する。 【構成】（１）式で示される化合物またはその塩を有効
成分とするＮＦκＢリン酸化酵素阻害剤。 （式中、Ｘ１，Ｘ２はＨ、または（Ｘ１，Ｘ２）が＝Ｏ
または＝Ｓであり；Ｘ３はＨまたはＺ；Ｘ４はＯまたは
Ｓ；ＹはＨ，ＯＨまたはＯＺ；Ｒ１はＨまたはＣＨ３；
Ｒ２はＨまたはＣＯ２Ｚ；Ｒ３はＨまたは低級アルキル
基；Ｒ４はＨまたは低級アルコキシ基；ＺはＨまたはＣ
１〜Ｃ６の直鎖または分岐低級アルキル基である） 【効果】（１）式の化合物はさらに、臓器移植時の免疫
反応抑制剤、細胞接着を介した炎症に対する抗炎症剤と
して有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、炎症、ウイルス感染等
の治療に関連した転写調節因子ＮＦκＢの活性化能を有
するＮＦκＢリン酸化酵素の阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体が順応できない刺激（起炎性刺激）
に遭遇した時、障害された組織から種々の反応媒介物質
が産生され、炎症が惹起される。中でも種々のサイトカ
インは、自己免疫疾患を始めとする免疫異常に起因する
種々の疾患において、関わっていることが明らかになっ
てきている。例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者の
関節液中のＩＬ−６濃度が局所の炎症所見と相関する
（Di Giovine,F.S. ら Rheumatol. Int., 9: 259,(199
0); Rooney, M. ら Rheumatol. Int., 10: 217,(199
0)）、血清中の濃度が全身的な疾患活動性と相関する
（Eastgate, J.A.ら Lancet, 8613: 706,(1988) ）、Ｉ
Ｌ−８が関節炎、乾癬、喘息、敗血症等の多くの炎症性
疾患で産生異常が認められている（岡本秀一, 臨床免
疫, 27(Suppl.16): 80-85, (1995) ）等のことが明らか
になってきている。

【０００３】これまで多くの抗炎症剤が使用されている
が、種々のサイトカインの産生を抑制するものとして
は、いまだに有効なものは出現していない。ＮＳＡＩＤ
（非ステロイド抗炎症剤）類は、アラキドン酸代謝にお
いてシクロオキシゲナーゼを阻害することにより、プロ
スタグランジンの産生を抑制するのみで直接サイトカイ
ンの産生は阻害しない。ステロイド類は、複数のサイト
カインの産生を抑制はするが、ホルモン性の副作用が大
きい。また、サイトカイン抗体あるいはＩＬ−１受容体
アンタゴニストの類は、特定のサイトカインの活性を抑
制するが複数のサイトカインの機能を直接抑制すること
はできない。

【０００４】最近、ＩＬ−６、ＩＬ−８等の炎症に関わ
るサイトカイン（以下、炎症性サイトカインと呼ぶ）の
遺伝子解析が進み、これらが共通の転写調節因子で制御
されていることが明らかになってきた（Shimizu, H. ら
Mol.Cell.Biol.,10: 561-568,(1990); Zhang, Y. ら M
ol.Cell.Biol.,10: 3818-3823,(1990); Liebermann,T.
ら Mol.Cell.Biol.,10: 2327-2334,(1990); Kunsch, C.
ら Mol.Cell.Biol.,13: 6137-6146,(1993)）。この転写
調節因子が、ヌクレアファクターカッパービー（ＮＦκ
Ｂ）と呼ばれている蛋白質である（Sen, R. ら Cell 4
6: 705-716 (1986); Baeuerle, P.A.ら Genes Dev. 3:
1689-1698 (1989); Lenardo, M.J.ら Cell 58: 227-229
(1989)）。

【０００５】一般的に、転写調節因子は遺伝子の上流側
に存在するプロモーターあるいはエンハンサー部分に結
合する蛋白質で、複数の因子によって下流の遺伝子の転
写を調節している。ＮＦκＢは、1986年にＳｅｎらによ
り同定された蛋白質で（Sen, R. ら Cell46: 705-716
(1986)）、ｐ５０とｐ６５の２つのサブユニットからな
り、ＩＬ−２受容体α鎖，Ｔ細胞受容体β等の受容体、
ＩＦＮβ，ＩＬ−２，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＧＭ−ＣＳ
Ｆ，Ｇ−ＣＳＦ，ＴＮＦα，リンホトキシン等のサイト
カインの発現誘導を担っていることが明らかになってき
ている（細胞増殖の制御 南江堂:p161-175 (1993)）。
さらにＮＦκＢは、ＩＣＡＭ−１（Voraberger, G.らIm
munol. 147: 2777-2786 (1991) ）、ＥＬＡＭ−１（Whe
lan, J.ら Nucleic Acids Res. 19: 2645-2653 (199
1)）等、炎症反応に深く関与している細胞接着分子の発
現にも関与している。これらの細胞接着分子に関して
は、中和抗体で機能を抑制することにより炎症症状が改
善すること、さらには臓器移植時の拒絶反応の制御にも
使えることが明らかになってきている（特開平６−２０
９７７８；細胞工学 別冊 接着分子ハンドブック 秀
潤社:p139-144,p229-234, (1994); Isobe, M. ら Scien
ce ,255: 1125-1127 (1992) ）。

【０００６】ところで、ＮＦκＢはエイズウイルス（Ｈ
ＩＶ）、成人Ｔ細胞白血病細胞の原因ウイルス（ＨＴＬ
Ｖ−１）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）等の宿主内
増殖にも関与していることが明らかになってきた（Lena
rdo, M.J. ら Cell 58: 227-229 (1989); 藤沢順一ら,
実験医学,11: 1073-1079,(1993); Sambucetti, LC.らEM
BO J.,8: 4251-4258 (1989); Kowalik, TF.ら Proc Nat
l Acad Sci USA, 90:1107-1111,(1993); Boldogh, I.ら
Biochem Biophys Res Commun 197: 1505-1510 (1993)
）。すなわち、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１は感染後、ヒト
細胞内においてヒトのＮＦκＢを使用して、自らの遺伝
子増殖を行っているのである。

【０００７】現在エイズの発症メカニズムとしては、Ｈ
ＩＶの盛んな増殖がエイズ発症の最大の要因であること
が示唆されており（Pantaleo, G.ら, Nature 362: 355-
358(1993) ; Embretson, J.ら, Nature 362: 359-362
(1993)）、ＨＩＶの増殖を抑制する治療薬の開発が進め
られている。ＡＺＴ等の逆転写酵素阻害剤、プロテアー
ゼ阻害剤等が試みられているが、強い毒性の出現や耐性
株の出現等（Larder,B.A., Science 243, 1731, (198
9); Concorder Coordinating Committee, Lancet 343,
871, (1993)）でまだ有効な治療薬は見出されていない
のが現状である。

【０００８】したがって、この転写調節因子ＮＦκＢの
機能を阻害する化合物は、上記のウイルスの遺伝子発現
を抑制することができ、優れた抗ウイルス剤となり得る
と期待される。ＮＦκＢは、休止期の細胞では細胞質に
局在し、ＮＦκＢの阻害物質であるＩκＢ（inhibitor
ofＮＦκＢ）との複合体を形成して不活性の状態で存在
している（Baeuerle, P.A., ら Science 242: 540-546
(1988); Zabel, U. ら Cell 61: 255-265 (1990)）。細
胞に刺激が加わりＮＦκＢが活性化する場合、ＮＦκＢ
・ＩκＢ複合体に対してプロテインキナーゼＣ（以下、
ＰＫＣと呼ぶ）が作用し、ＩκＢをリン酸化することに
より複合体よりＩκＢを分離し、ＮＦκＢを核内へ移行
させる機構が働くことが、in vitroの実験結果から提唱
されている（Ghosh, S. ら Nature 344: 678-682 (199
0) ）。しかし、ＮＦκＢの活性化はＰＫＣを阻害する
条件でも起こることが示されている（Meichle, A. ら,
J. Biol. Chem. 265:8339-8343 (1990); Schutze, S
ら, Cell 71: 765-776 (1992) ）ことから、ＮＦκＢの
活性化についてはいまだに解明されていない。

【０００９】最近、ＮＦκＢを活性化するとＮＦκＢ自
身がリン酸化されることが明らかになってきた（Mellit
s, K.H.,ら Nucleic Acids Res. 21: 5059-5066 (199
3); Hayashi, T.,ら J. Biol. Chem. 268: 26790-26795
(1993); Naumann, M., ら EMBO J. 13: 4597-4607 (19
94); Diehl, J.A., ら J. Biol. Chem. 270: 2703-2707
(1995) ）。このＮＦκＢをリン酸化する酵素（以下、
ＮＦκＢリン酸化酵素と呼ぶ）によりＮＦκＢがリン酸
化を受けると、ＤＮＡに結合するようになることも確認
されている（Hayashi, T.,ら J. Biol. Chem. 268: 267
90-26795 (1993);Naumann, M., ら EMBO J. 13: 4597-4
607 (1994) ）。

【００１０】ＮＦκＢリン酸化酵素としてＮＦκＢキナ
ーゼが知られている（Hayashi, T.,ら J. Biol. Chem.
268: 26790-26795 (1993) ）。本酵素は、大量培養した
ヒト末梢血リンパ球の細胞質画分から精製される、ＡＴ
Ｐとの結合反応から推定される分子量が４３ｋＤａの蛋
白リン酸化酵素であり、ＮＦκＢのサブユニットｐ５０
とｐ６５、両方のセリン残基をリン酸化しＮＦκＢを活
性化するものである。ＮＦκＢキナーゼをＡＴＰと共に
３０℃でインキュベートすると、ＮＦκＢがＤＮＡと結
合できるようになることがＥＭＳＡ（Electrophoresis
Mobility ShiftAssay）の実験結果から示されている。

【００１１】本酵素を抑制する阻害剤が得られれば、Ｎ
ＦκＢを介した疾患に対する治療が可能になると考えら
れる。すなわち、複数の炎症性サイトカイン遺伝子の転
写を抑制し、ステロイドが惹起するホルモン性の副作用
がない、しかもヒト細胞の増殖に対する影響は少ないが
ウイルスの増殖を抑制する医薬品、さらには、臓器移植
の際に用いる免疫抑制剤、細胞接着を介した炎症等に対
する抗炎症剤としての臨床応用が考えられる。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本考案は、上記観点か
らなされたものであり、複数の炎症性サイトカイン遺伝
子の転写を抑制し、ホルモン性の副作用のない、しかも
ヒト細胞の増殖に対する影響は少ないがウイルスの増殖
を抑制する医薬品の開発を最終的な目的とし、そのため
のＮＦκＢリン酸化酵素阻害剤を提供することを課題と
する。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記ＮＦ
κＢリン酸化酵素阻害物質に関し、鋭意検索を行ったと
ころ、（１）式で示される化合物にＮＦκＢリン酸化酵
素を強力に阻害する活性が存在することを見出し、本発
明を完成した。すなわち、本発明の目的は、（１）式で
示される化合物またはその塩を有効成分とするＮＦκＢ
リン酸化酵素阻害剤を提供することである。

【００１４】本発明者は、ＮＦκＢリン酸化酵素、とり
わけＮＦκＢキナーゼ（推定分子量４３ｋＤａ）の阻害
剤でＮＦκＢの活性化を抑制し、複数の炎症性サイトカ
イン遺伝子の転写を抑制し、ステロイドが惹起するホル
モン性の副作用のない、しかもヒト細胞の増殖に対する
影響は少ないがウイルスの増殖を抑制する物質を検索し
た。

【００１５】ＮＦκＢリン酸化酵素は、例えば上記文献
に従って、種々の細胞から抽出することができる。特
に、ＮＦκＢキナーゼは、林らの方法（Hayashi T.ら
J. Biol.Chem., 268: 26790 (1993) ）に従ってヒトの
Ｔ細胞からＮＦκＢとの複合体として得ることができ
る。すなわち、ヘパリン添加ヒト末梢血よりＰＢＭＣ画
分を回収し、培地（ＲＰＭＩ−１６４０）で洗浄の後、
必要に応じて培養を行い、その後細胞を回収する。細胞
をダンスホモジナイザー等にて破砕し、１０，０００
ｇ，１０分，４℃の遠心により上清を回収する。この上
清を１００，０００ｇ，３０分の遠心により上清を回収
し、Ｓ１００画分とする。Ｓ１００画分を適当な緩衝液
に対して透析し、陰イオン交換、陽イオン交換、各種ア
フィニティー、ゲルろ過、密度勾配遠心等を用いて分離
を行う。ＮＦκＢキナーゼはＮＦκＢと複合体を形成し
ていることから、ＥＭＳＡ（Electrophoresis Mobility
Shift Assay）により含まれている画分を決定すること
ができる。

【００１６】ＥＭＳＡはＳｅｎらの方法（Sen, R. ら C
ell 46: 705-716 (1986)）を参考にして、以下のように
して行うことができる。ただし、これは一例でありこの
方法にこだわらない。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシ
ウム（MgCl2 ）、５ｍＭジチオスレイトール（DTT ）、
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（Tris-HCl）（ｐＨ８．０）
に、７．０５ｐｍｏｌＮＦκＢコンセンサスオリゴヌク
レオチド（以下、ＮＦκＢオリゴと呼ぶ）（Promega 社
製）、１０ｕｎｉｔＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（NE
W ENGLAND 社製）、２２２ＴＢｑ／ｍｍｏｌ濃度の［γ
−32Ｐ］ＡＴＰを１．８５ＭＢｑ添加し最終的に２５μ
ｌとする。３７℃で３０分間インキュベートした後に、
１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）を２５μｌ加え、クイックスピンカラムＧ−２５
（ベーリンガー・マンハイム山之内（株）製）を用い、
１，１００ｇで２分間遠心し放射線標識の入ったＮＦκ
Ｂオリゴを分離する。１００ｍＭ塩化ナトリウム（Ｎａ
Ｃｌ）、２ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＤＴＴ、１０％グリ
セロール、０．２４％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４
０）、０．１６％デオキシコレート（ＤＯＣ）を含む２
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５） １０μｌに、１
μｇ／μｌ濃度のｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）ｐｏｌｙ（ｄ
Ｉ−ｄＣ）（ファルマシア バイオテク（株）製）を２
μｌ加え、試料２μｌを加える。さらに上記で調製した
ＮＦκＢオリゴを１万ｃｐｍになるように添加し最終的
に２０μｌにする。室温で１時間インキューベートした
後に、４％アクリルアミドゲルよりなるネイティブゲル
電気泳動法により分離し、オートラジオグラフィーにて
ＮＦκＢオリゴと結合する画分を決定する。この画分が
ＮＦκＢ・ＮＦκＢキナーゼ複合体が含まれている画分
である。

【００１７】この画分を回収して酵素阻害剤の評価に供
する。この画分に、ＮＦκＢキナーゼが存在しているこ
とは、リン酸化反応により約６５ｋＤａの位置にリン酸
化されたバンドが検出されることより明らかである。今
回検索した化合物の中には、他のセリン・トレオニンキ
ナーゼ、例えばＰＫＣ、プロテインキナーゼＡ（以下、
ＰＫＡと呼ぶ）、プロテインキナーゼＧ（以下、ＰＫＧ
と呼ぶ）、ミオシン軽鎖キナーゼ（以下、ＭＬＣＫと呼
ぶ）、Ｃａ2+／カルモデュリン依存性キナーゼ（以下、
ＣａＭＫＩＩと呼ぶ）に対する阻害活性が調べられてい
るものも存在しており、それぞれの活性は表１に示した
通りである（Kase H.,ら Biochem. Biophys. Res. Comm
un.,142: 436 (1987); Nakanishi S.,ら J. Biol. Che
m.,263: 6215 (1988); Hashimoto Y., ら Biochem. Bio
phys. Res. Commun.,181: 423 (1991);中西聡生体の科
学,40: 364 (1989); Nakanishi S.,ら Mol. Pharmaco
l.,37: 482 (1990) ）。

【００１８】

【表１】

【００１９】これらの化合物は、表１のように各種リン
酸化酵素に対して阻害活性を示すが、それぞれ特異性を
有しており、すべてのリン酸化酵素に対して、阻害活性
を示すわけではない。本発明で使用する（１）式で示さ
れる化合物を得るには、例えば、９，１０，１１，１２
−テトラヒドロ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインド
ロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］−ピ
ロロ−［３，４−ｉ］［１，６］−ベンゾジアゾシン−
１，３（２Ｈ）−ジオン（化合物１と呼ぶ）は特開平３
−５８９９０の方法を用いれば合成できる。さらに、特
開昭６２−１５５２８４、特開昭６３−２９５５８８、
特開昭６３−２９５５８９、特開平３−５８９９０、特
表平６−５０３８３７に記載の方法に従い、また、Ｓｏ
ｍｅｉ，Ｍ．らの方法（Somei, M. ら Heterocycles 3
4: 1285-1288 (1992)）、Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｍ．らの
方法（Augustin, M.ら Tetrohedron 40: 3499 (1984)）
に準じて合成すればよい。特に以下の化合物について
は、試薬として市販品が入手可能である。Ｋ−２５２ａ
（Ｘ1 ＝Ｘ2 ＝Ｈ；Ｘ3 ＝Ｈ；Ｘ4 ＝Ｏ；Ｙ＝ＯＨ；Ｒ
1 ＝ＣＨ3 ；Ｒ2 ＝ＣＯ2 ＣＨ3 ；Ｒ3 ＝Ｈ；Ｒ4 ＝
Ｈ）（2,3,9,10,11,12-Hexahydro-10-hydroxy-9-methyl
-1-oxo-,methyl ester,(9.alpha.,10.beta.,12.alpha.)
-9,12-epoxy-1H-diindolo[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]pyrro
lo[3,4-i][1,6]benzodiazocine-10-carboxylic acid ）
（Calbiochem-Novabiochem社製），Ｋ−２５２ｂ（Ｘ1
＝Ｘ2 ＝Ｈ；Ｘ3 ＝Ｈ；Ｘ4 ＝Ｏ；Ｙ＝ＯＨ；Ｒ1 ＝Ｃ
Ｈ3 ；Ｒ2 ＝ＣＯ2 Ｈ；Ｒ3＝Ｈ；Ｒ4 ＝Ｈ）（2,3,9,1
0,11,12-Hexahydro-10-hydroxy-9-methyl-1-oxo-,(9.al
pha.,10.beta.,12.alpha.)-9,12-epoxy-1H-diindolo[1,
2,3-fg:3',2',1'-kl]pyrrolo[3,4-i][1,6]benzodiazoci
ne-10-carboxylic acid）（Biomol ResearchLaboratori
es社製），ＫＴ５７２０（Ｘ1 ＝Ｘ2 ＝Ｈ；Ｘ3 ＝Ｈ；
Ｘ4 ＝Ｏ；Ｙ＝ＯＨ；Ｒ1 ＝ＣＨ3 ；Ｒ2 ＝ＣＯ2 （Ｃ
Ｈ2 ）5 ＣＨ3 ；Ｒ3 ＝Ｈ；Ｒ4 ＝Ｈ）（2,3,9,10,11,
12-Hexahydro-10-hydroxy-9-methyl-1-oxo-,hexyl este
r,(9.alpha.,10.beta.,12.alpha.)-9,12-epoxy-1H-diin
dolo[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]pyrrolo[3,4-i][1,6]benzo
diazocine-10-carboxylic acid）（Biomol Research La
boratories社製），ＫＴ５８２３（Ｘ1 ＝Ｘ2 ＝Ｈ；Ｘ
3 ＝ＣＨ3 ；Ｘ4 ＝Ｏ；Ｙ＝ＯＣＨ3 ；Ｒ1 ＝ＣＨ3 ；
Ｒ2 ＝ＣＯ2 ＣＨ3 ；Ｒ3 ＝Ｈ；Ｒ4 ＝Ｈ）（2,3,9,1
0,11,12-Hexahydro-10-methoxy-2,9-dimethyl-1-oxo-,m
ethyl ester,[9R-(9.alpha.,10.beta.,12.alpha.)]-9,1
2-epoxy-1H-diindolo[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]pyrrolo
[3,4-i][1,6]benzodiazocine-10-carboxylic acid）（B
iomol Research Laboratories社製），ＫＴ５９２６
（Ｘ1 ＝Ｘ2 ＝Ｈ；Ｘ3 ＝Ｈ；Ｘ4 ＝Ｏ；Ｙ＝ＯＨ；Ｒ
1 ＝ＣＨ3 ；Ｒ2 ＝ＣＯ2 ＣＨ3 ；Ｒ3 ＝Ｈ；Ｒ4 ＝Ｏ
（ＣＨ2 ）2 ＣＨ3 ）（2,3,9,10,11,12-Hexahydro-10-
hydroxy-9-methyl-1-oxo-16-propoxy-,methyl ester,
(9.alpha.,10.beta.,12.alpha.)-(-)-9,12-epoxy-1H-di
indolo[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]pyrrolo[3,4-i][1,6]ben
zodiazocine-10-carboxylic acid）（Biomol Research
Laboratories社製）。

【００２０】このようにして得られた化合物を有効成分
として、ＮＦκＢキナーゼ阻害剤を製造することも可能
ではあるが、更に、シリカゲルカラムや逆相系カラムな
どの公知の精製手段を用いて精製し、得られた化合物を
有効成分としてＮＦκＢキナーゼ阻害剤とすることが好
ましい。かくして得られる（１）式で示される化合物
が、ＮＦκＢキナーゼを阻害することは、ＮＦκＢキナ
ーゼによるｐ５０またはｐ６５のリン酸化度を測定して
検出することができる。以下に、一つの方法の例を示
す。

【００２１】被験化合物をジメチルスルホキサイド（以
下、ＤＭＳＯと呼ぶ）に１０ｍＭになるように溶解し、
これを原液溶液として、蒸留水で希釈して１００μＭ，
１０μＭ，１μＭ，１００ｎＭの溶液を調製する。比較
のためＤＭＳＯを蒸留水で同濃度になるように希釈した
ものを用意する。１０ｍＭＭｇＣｌ2 、３ｍＭ塩化マン
ガン（ＭｎＣｌ2 ）、５ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰ
及び精製したＮＦκＢ・ＮＦκＢキナーゼ複合体を一定
量含む２０ｍＭのＮ−２−ハイドロキシエチルピペラジ
ノ−Ｎ−２−エタンスルホン酸緩衝液（以下、ＨＥＰＥ
Ｓと呼ぶ）（ｐＨ７．８）に、３，０００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ濃度の［γ-32 Ｐ］ＡＴＰを１０μＣｉ添加し最終的
に１０μｌとする。３０℃で３０分間インキュベートし
た後、ＳＤＳサンプルバッファー１０μｌを加えて反応
を停止させる。この液を１００℃で５分間沸騰させた
後、７. ５％アクリルアミドよりなるＳＤＳゲル電気泳
動法により分画する。次にオートラジオグラフィーで、
６５ｋＤａのＮＦκＢｐ６５サブユニットの位置を確認
し、その部分をＢＡＳ−２０００バイオ・イメージング
アナライザー（富士写真フイルム（株）製）を用いて放
射能を測定する。阻害化合物を添加しないＤＭＳＯ溶液
の反応による放射能の量を対照に、その低下率により阻
害活性を求めることができる。

【００２２】（１）式で示される化合物は、常法により
製剤化することができる。すなわち、（１）式で示され
る化合物と医薬用に用いられる種々の担体、および必要
により本発明阻害剤に悪影響を与えない安定剤、防腐
剤、乳化剤等を組合せることにより製剤化することがで
きる。また、本発明のＮＦκＢリン酸化酵素阻害剤は、
注射、経口など従来公知の方法により投与することが可
能であるが、循環器系の疾病やエイズ・癌の予防・治療
という観点からは、経口投与によることが好ましく、こ
れに適した製剤形態としては、粉末剤、顆粒剤、錠剤等
が挙げられる。

【００２３】なお、製剤中における（１）式で示される
化合物の含量は、製剤全体に対して０．１〜９５％、好
ましくは１〜６０％程度であり、また、投与量として
は、投与の目的、疾患の程度によっても異なるが、一般
には大人１日当り０．０１〜１０００ｍｇ程度とするこ
とが好ましい。

【００２４】

【実施例】次に実施例により本発明をさらに詳細に述べ
るが、これに限定されるものではない。

【００２５】

【実施例１】まずＮＦκＢ・ＮＦκＢキナーゼ複合体を
調製する方法の具体例を述べる。 （１）ＮＦκＢ・ＮＦκＢキナーゼ複合体の調製 ＮＦκＢ・ＮＦκＢキナーゼ複合体の調製は、林らの方
法（Hayashi T.ら J.Biol.Chem., 268: 26790 (1993)
）に準じて行った。すなわち、ヘパリン添加ヒト末梢
血よりＰＢＭＣ画分を回収し、ＲＰＭＩ−１６４０で洗
浄の後、無血清培地ＡＩＭ−Ｖ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ
製）に浮遊させた。ＯＫＴ３固層化フラスコ（ヤンセン
協和（株）製）中で３日間培養し、その後、ＡＩＭ−Ｖ
／０．２ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ インスリン／１％ヒト血
清／７００Ｊｕｒｋａｔ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ＩＬ−２
に浮遊させ、ガス透過性カルチャーバッグ（デュポン社
製）中にて１週間培養を行った。培養終了時に遠心によ
り細胞（約５×１０9 ｃｅｌｌｓ）を回収し、ＮＦκＢ
・ＮＦκＢキナーゼ複合体調製のための材料とした。

【００２６】細胞を３倍量の低張緩衝液（１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ，５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
（ｐＨ７．５），４℃）に浮遊させた後、１０分間静置
した。ダンスホモジナイザーに移して、１０回のストロ
ークで細胞を破砕し、１０，０００ｇ，１０分，４℃の
遠心により上清を回収した。この上清を１００，０００
ｇ，３０分の遠心により上清を回収し、Ｓ１００画分と
した。

【００２７】以下、ＮＦκＢ・ＮＦκＢキナーゼ複合体
の調製操作は４℃で実施した。Ｓ１００画分を緩衝液Ｄ
（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９），２０％ ｇｌ
ｙｃｅｒｏｌ，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ Ｐ
ＭＳＦ，０．５ｍＭ ＤＴＴ）＋０．２８ＭＫＣｌに対
して透析した。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファル
マシア バイオテク（株）製）をつめたカラム（1.6 ×
10cm）を用意し、緩衝液Ｄ＋０．２８ＭＫＣｌで平衡化
した。このカラムに透析したＳ１００画分をアプライし
て、その非吸着画分を回収した。

【００２８】その非吸着画分を緩衝液Ｄ＋０．１ＭＫＣ
ｌに対して透析し、次のカラムにアプライした。次のカ
ラムとしては、緩衝液Ｄ＋０．１ＭＫＣｌであらかじめ
平衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
（1.6 ×10cm）を用いた。上記の非吸着画分をこのカラ
ムにアプライして５カラム体積の緩衝液Ｄ＋０．１ＭＫ
Ｃｌで洗浄後、１０カラム体積で０．１〜０．５ＭＫＣ
ｌのグラジエント溶出を行った。ＮＦκＢ・ＮＦκＢキ
ナーゼ複合体が含まれている画分はＥＭＳＡ（Electrop
horesis Mobility Shift Assay）により決定した。

【００２９】ＥＭＳＡはＳｅｎらの方法（Sen, R. ら C
ell 46: 705-716 (1986)）を参考にして、以下のように
して行った。すなわち、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、５ｍＭＤ
ＴＴ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に、
７．０５ｐｍｏｌＮＦκＢオリゴ（Promega 社製）、１
０ｕｎｉｔＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（NEW ENGLAN
D 社製）、２２２ＴＢｑ／ｍｍｏｌ濃度の［γ−32P ］
ＡＴＰを１．８５ＭＢｑ添加し最終的に２５μｌとし
た。３７℃で３０分間インキュベートした後に、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を
２５μｌ加え、クイックスピンカラムＧ−２５（ベーリ
ンガー・マンハイム山之内（株）製）を用い、１，１０
０ｇで２分間遠心し放射線標識の入ったＮＦκＢオリゴ
を分離した。

【００３０】１００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、２
０ｍＭＤＴＴ、１０％グリセロール、０．２４％ＮＰ−
４０、０．１６％ＤＯＣを含む２ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）１０μｌに、１μｇ／μｌ濃度のｐｏｌ
ｙ（ｄＩ−ｄＣ）ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）（ファルマシ
ア バイオテク（株）製）を２μｌ加え、ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅカラム分離画分２μｌを加えた。さら
に上記で調製したＮＦκＢオリゴを１万ｃｐｍになるよ
うに添加し最終的に２０μｌにした。室温で１時間イン
キューベートした後に、４％アクリルアミドゲルよりな
るネイティブゲル電気泳動法により分離し、オートラジ
オグラフィーにて、ＮＦκＢオリゴと結合する画分を決
定した。この画分がＮＦκ・ＮＦκＢキナーゼ複合体が
含まれている画分である。

【００３１】ＮＦκＢ・ＮＦκＢキナーゼ複合体画分を
回収し、緩衝液Ｄ＋０．１ＭＫＣｌに対して透析した。
次にＰｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｐ１１（ワッ
トマン ペーパー（株）製）（約６ｍｌ）をつめたカラ
ムを用意し、緩衝液Ｄ＋０．１ＭＫＣｌで平衡化してお
いた。上記の透析したＮＦκＢ・ＮＦκＢキナーゼ複合
体画分をカラムにアプライし、非吸着画分を回収した。
この画分を、あらかじめ緩衝液Ｄ＋０．１ＭＫＣｌで平
衡化しておいたＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ １ｍｌ
（ファルマシア バイオテク（株）製）にアプライし、
非吸着画分を回収した。

【００３２】ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ 非吸着画
分をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（グーレースジャパン
（株）製）で濃縮し、あらかじめ緩衝液Ｄ＋０．１Ｍ
ＫＣｌで平衡化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００Ｈ
Ｒ １０／３０（ファルマシア バイオテク（株）製）
にアプライし、ＮＦκＢ・ＮＦκＢキナーゼ複合体画分
をＥＭＳＡにより決定した。その画分を回収して酵素阻
害剤の評価に供した。

【００３３】この画分に、ＮＦκＢキナーゼが存在して
いることは、リン酸化反応により約６５ｋＤａの位置に
リン酸化されたバンドが検出できたことより明らかであ
る。 （２）阻害剤の調製 （１）式の中で、以下の化合物は市販品を用いた。Ｋ−
２５２ａ（Calbiochem-Novabiochem社製），Ｋ−２５２
ｂ（Biomol Research Laboratories社製），ＫＴ５７２
０（Biomol Research Laboratories社製），ＫＴ５８２
３（Biomol Research Laboratories社製），ＫＴ５９２
６（Biomol Research Laboratories社製）。また、化合
物１（9,10,11,12-Tetrahydro-9,12-epoxy-1H-diindolo
[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]-pyrrolo-[3,4-i][1,6]-benzod
iazocine-1,3(2H)-dione）は特開平３−５８９９０の方
法を参考に合成した。

【００３４】これらの化合物をＤＭＳＯ（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ製）に１０ｍＭになるように溶解した。これを原
液溶液として、蒸留水で希釈して１００μＭ，１０μ
Ｍ，１μＭ，１００ｎＭの溶液を調製した。比較のため
ＤＭＳＯを蒸留水で同濃度になるように希釈した。 （３）阻害活性の測定方法 １０ｍＭＭｇＣｌ2 、３ｍＭＭｎＣｌ2 、５ｍＭＤＴ
Ｔ、０．５ｍＭＡＴＰ及び上記のＮＦκＢ・ＮＦκＢキ
ナーゼ複合体を含む画分をタンパク質として０．３５μ
ｇ含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）に、被検化
合物溶液２．５μｌ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ濃度の
［γ−32Ｐ］ＡＴＰを１０μＣｉ添加し最終的に１０μ
ｌとした。３０℃で３０分間インキュベートした後、Ｓ
ＤＳサンプルバッファー１０μｌを加えて反応を停止さ
せた。

【００３５】次にこの液を１００℃で５分間沸騰させた
後、７. ５％アクリルアミドよりなるＳＤＳゲル電気泳
動法により分画した。次にオートラジオグラフィーで、
６５ｋＤａのＮＦκＢの位置を確認し、その部分を、Ｂ
ＡＳ−２０００バイオ・イメージングアナライザー（富
士写真フイルム（株）製）を用いて放射能を測定した。
阻害化合物を添加しないＤＭＳＯ溶液の反応による放射
能の量を対照に、その低下率により阻害活性を求めた。
低下率を表２に示した。

【００３６】

【表２】

【００３７】

【実施例２】（１）式で示される化合物のいずれか２０
ｍｇをそれぞれが含んで成る錠剤を下記の組成により慣
用の方法で調製した。活性成分をコムギデンプンの一
部、ラクトース及びコロイド状シリカと混合して、その
混合物を篩にかけた。残りのコムギデンプンの一部を湯
浴上で５倍量の水でペースト状にし、その粉末混合物を
そのペーストとややプラスチック状の塊ができるまでこ
ねた。このプラクチック塊を約３ｍｍのメッシュサイズ
を有する篩に通し、得られる乾燥顆粒を再び篩に通し
た。残りのコムギ粉、タルク及びステアリン酸マグネシ
ウムを混ぜ合わせて、その混合物をそれぞれ１４５ｍｇ
の重量及び破断ノッチを有する錠剤となるように圧搾し
た。

【００３８】

【発明の効果】本発明のリン酸化酵素阻害剤は、ＮＦκ
Ｂリン酸化酵素を阻害し、ＮＦκＢを介した疾患に対す
る治療を行うのに有用である。すなわち、複数の炎症性
サイトカイン遺伝子の転写を抑制し、ステロイドが惹起
するホルモン性の副作用がない、しかもヒト細胞の増殖
に対する影響は少ないがウイルスの増殖を抑制する医薬
品、さらには、臓器移植の際に用いる免疫抑制剤、細胞
接着を介した炎症等に対する抗炎症剤として有用であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 //(Ｃ０７Ｄ 498/22 209:44 209:04 273:06 307:18）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（１）式で示される化合物またはそ
   の塩を有効成分とするＮＦκＢリン酸化酵素阻害剤。 【化１】 （式中、Ｘ1 ，Ｘ2 はＨ、または（Ｘ1 ，Ｘ2 ）が＝Ｏ
   または＝Ｓであり；Ｘ3はＨまたはＺ；Ｘ4 はＯまたは
   Ｓ；ＹはＨ，ＯＨまたはＯＺ；Ｒ1 はＨまたはＣＨ3 ；
   Ｒ2 はＨまたはＣＯ2 Ｚ；Ｒ3 はＨまたは低級アルキル
   基；Ｒ4 はＨまたは低級アルコキシ基；ＺはＨまたはＣ
   1 〜Ｃ6 の直鎖または分岐低級アルキル基である）