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JPH08280386A - 抗体および抗体cDNA - Google Patents

抗体および抗体cDNA

Info

Publication number
JPH08280386A
JPH08280386A JP7112671A JP11267195A JPH08280386A JP H08280386 A JPH08280386 A JP H08280386A JP 7112671 A JP7112671 A JP 7112671A JP 11267195 A JP11267195 A JP 11267195A JP H08280386 A JPH08280386 A JP H08280386A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
cdr
human
cdna
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP7112671A
Other languages
English (en)
Inventor
Hironori Murakami
浩紀 村上
Katsumi Mochizuki
克巳 望月
Masatoshi Kato
正俊 加藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Morinaga and Co Ltd
Original Assignee
Morinaga and Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Morinaga and Co Ltd filed Critical Morinaga and Co Ltd
Priority to JP7112671A priority Critical patent/JPH08280386A/ja
Publication of JPH08280386A publication Critical patent/JPH08280386A/ja
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトの肺癌と特異的に反応し、ヒト正常細胞
株と反応せず、またヒト肺癌組織と反応するヒトモノク
ローナル抗体、及び該ヒトモノクローナル抗体をコード
するcDNA、並びに抗体のCDRをコードするDN
A。 【効果】 該ヒトモノクローナル抗体は、癌の臨床診
断、免疫治療等の医学的分野での応用や癌特異抗原の精
製手段として利用ができる。また該cDNAは、該ヒト
モノクローナル抗体の、遺伝子工学的手法を用いた工業
的規模の大量生産に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトモノクローナル抗
体及び該抗体cDNA並びに抗体のCDRをコードする
DNAに関する。該ヒトモノクローナル抗体は、癌の臨
床診断、免疫治療等の医学的分野での応用や癌特異抗原
の精製手段として利用できる。また該cDNAは、該ヒ
トモノクローナル抗体の、遺伝子工学的手法を用いた工
業的規模の大量生産に用いることができる。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Kohl
er, G およびMilstein, K によるモノクローナル抗体作
成技術(Nature,Vol.256, p495-497, (1975) )が開発
されて以来、肺癌や血液の癌と言われる白血病細胞を始
めとする多くの癌細胞に対するマウスモノクローナル抗
体が作製されている。このような癌特異的といわれてい
るモノクローナル抗体の利用分野の中で最も期待されて
いるのは、これに抗癌剤などを結合して体内に投与し癌
を治療する、いわゆるミサイル療法剤や、あるいは癌マ
線を放出する放射性同位元素で標識したモノクローナル
抗体を体内の癌病巣に集積させて癌の体内診断を行うと
いった医学的分野である。
【0003】用いるモノクローナル抗体がマウスなど人
体にとって異種タンパク質である場合にはこのマウス抗
体に対するヒト抗体(Human anti-mouse antibody : H
AMA)が高頻度に産生されることが知られている。こ
のHAMAは投与したマウスモノクローナル抗体を不活
化するばかりでなく、アレルギー反応を引き起こす危険
性を有する。この問題を回避するため、たとえばマウス
抗体の抗原結合能を保持したままHAMAの生成を引き
起こす抗原性を除こうとする試みがされているが、根本
的な解決には至っていない。一方、ヒトモノクローナル
抗体を用いる場合には、このような抗原性の問題ははじ
めから考えられないため、マウスモノクローナル抗体よ
り優れている。
【0004】マウスモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを得ようとする時には、多くの場合、抗原と
なる物質あるいは細胞などをマウスの体内に免疫するこ
とによって、抗原に感作されたBリンパ球を容易に得る
ことができるので、これを用いて目的を達することがで
きる。これに対して、倫理的及び保健的な理由から、人
体には積極的な免疫はできず、従って所望の特異性を有
するヒトモノクローナル抗体を容易に得ることはできな
かった。
【0005】本発明者らはこれまでの精力的な研究の結
果、上記のごとく取得するのが困難であるヒトモノクロ
ーナル抗体を取得することに成功している(特公平4−
29357)。このヒトモノクローナル抗体は、肺癌細
胞に対して特異的な反応性を有し、かつ正常細胞には反
応しないもので、さきに述べた医学的分野に応用する目
的には理想的な性質を持っている。
【0006】更に、特公平4−29357に述べられて
いるヒト−ヒトハイブリドーマは、無血清培地中で抗体
を安定に産生し得ることから、安価で高純度のヒトモノ
クローナル抗体を得ることができるが、工業的規模の大
量生産においてはより安定的で高産生性の抗体産生細胞
が有利である。
【0007】また、一方で、遺伝子工学的手法はこれま
でインシュリンを初めとする種々の有用タンパク質を工
業的なスケールで大量に製造する技術を与えている。こ
の遺伝子工学的手法のモノクローナル抗体生産への応用
はモノクローナル抗体の染色体DNA、あるいは相補性
DNA(cDNA)を取得することに始まる。
【0008】以下に、抗体(免疫グロブリン)のうち、
本発明に関連するヒトのIgMの基本構造および遺伝子
について簡単に述べる。
【0009】IgM分子は、分子量約65,000のポ
リペプチド鎖の重鎖および分子量約25,000のポリ
ペプチド鎖の短鎖それぞれ2本ずつから構成される単量
体がJ鎖と呼ばれるポリペプチドを介して5つ結合した
5量体を形成している。重鎖−軽鎖間および重鎖−重鎖
間はS−S結合によって連結されている。重鎖および軽
鎖のアミノ末端から約100個のアミノ酸配列は、抗原
特異的であり、この領域によって抗原と結合する。この
領域を「可変領域」という。これに続く領域は「定常領
域」と呼ばれる一定構造を有し、それぞれ約440個お
よび約150個のアミノ酸配列より成る。IgM分子の
重鎖の定常領域は、Cμ1、Cμ2、Cμ3、Cμ4か
ら成ること、また軽鎖はIgG分子と同様にCκ、Cλ
が知られており、それぞれ重鎖はμ鎖で軽鎖はκ鎖、λ
鎖と呼ばれる。
【0010】ある特定のモノクローナル抗体はその重鎖
および軽鎖の可変領域がそれぞれある特定のアミノ酸配
列である均質な抗体分子の集団であり、モノクローナル
抗体毎に可変領域のアミノ酸配列が大きく異なる。可変
領域はさらに相補性決定領域群(CDR: Complementar
ity determining region)とよばれる超可変領域(Hype
r variable region )と、比較的共通性の高い枠組み残
基群(FR: Framework region)から成る。重鎖、軽鎖
にはそれぞれ3個のCDRがあり、抗原結合部位は、重
鎖と軽鎖の折りたたみによって集まったCDRによって
形成される。このためモノクローナル抗体の抗原結合の
特異性および結合強度は、おもにCDRのアミノ酸配列
が規定している。
【0011】一方、可変領域は、重鎖ではV遺伝子、D
遺伝子、J遺伝子、軽鎖ではV遺伝子、J遺伝子にコー
ドされていることが知られている。ヒト重鎖ではV遺伝
子が100個以下、D遺伝子が6個、J遺伝子が12
個、ヒトκ鎖ではV遺伝子が100個以下、J遺伝子が
5個存在する。B細胞の分化に伴って、重鎖ではV、
D、Jの各遺伝子群の中からそれぞれ任意の1つの遺伝
子が再配列により隣接し、可変領域に相当する遺伝子が
形成される。軽鎖においても同様にV、J遺伝子の再配
列により、可変領域の遺伝子が形成される。
【0012】また定常領域をコードする遺伝子は、可変
領域遺伝子群の下流に位置している。この遺伝子は可変
領域遺伝子の組換えが終了すると可変領域遺伝子と連な
って発現され、重鎖および軽鎖のポリペプチドが生成さ
れる。
【0013】このような知見をもとに、ヒトモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体の可変領域
をコードする相補性DNA(cDNA)を迅速にクロー
ニングする方法が開発された(James W. Larrick et a
l., Biochem. Biophys. Res.Commun., Vol.160, p.1250
-1256(1989); James W. Larrick et al., Bio/Technolo
gy, Vol.7, p.934-938(1989))。
【0014】一方、本発明者らは、癌細胞株を用いたヒ
トリンパ球の生体外免疫法を発明し(特開平4−281
799: Kawahara, K. et al., Human Antibodies and
Hybridomas, Vol.3, p.8-13(1992))、この方法を施し
たヒト末梢血リンパ球を親細胞と細胞融合することによ
って、ヒト癌細胞に反応し、かつヒト正常繊維芽細胞に
反応しないヒトモノクローナル抗体を産生するヒト−ヒ
トハイブリドーマを取得することに成功した(特開平6
−153984)。また該ヒト−ヒトハイブリドーマよ
り採取した伝令RNA(mRNA)をもとに作製した相
補性DNA(cDNA)の中から、該ヒトモノクローナ
ル抗体を構成する重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする
cDNAをそれぞれクローニングすることに成功した。
さらにこれらのcDNAの塩基配列を解明すると共にア
ミノ酸配列を決定することにも成功した。
【課題を解決するための手段】
【0015】本発明者らは、今回、更に、特定のアミノ
酸配列を有する重鎖又は軽鎖によって特徴付けられる、
ヒトの肺癌と特異的に反応し、ヒト正常細胞株と反応せ
ず、またヒト肺癌組織と反応するヒトモノクローナル抗
体および該抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のcDNAを
見出し、本発明を完成したものである。更に、本発明は
遺伝子工学的手法に供し得るものとして抗体のCDRを
コードするDNAを提供するものである。
【0016】即ち、本発明は、抗体重鎖の可変領域をコ
ードするcDNAが、図1に記載のヌクレオチド配列を
含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗体をコード
するcDNA、抗体軽鎖の可変領域をコードするcDN
Aが、図2に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴
とするヒトモノクローナル抗体をコードするcDNA、
抗体重鎖の可変領域が図3に記載のアミノ酸配列で表さ
れることを特徴とする抗体、抗体軽鎖の可変領域が図4
に記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とする抗
体、図3に記載のアミノ酸配列から成る抗体重鎖の可変
領域をコードすることを特徴とするDNA、図4に記載
のアミノ酸配列から成る抗体軽鎖の可変領域をコードす
ることを特徴とするDNA、抗体重鎖のCDR−1、C
DR−2およびCDR−3がそれぞれ図5、図6および
図7に記載のヌクレオチド配列でコードされることを特
徴とする請求項1記載のcDNA、抗体軽鎖のCDR−
1、CDR−2およびCDR−3がそれぞれ図8、図9
および図10に記載のヌクレオチド配列でコードされる
ことを特徴とする請求項2記載のcDNA、抗体重鎖の
CDR−1、CDR−2およびCDR−3としてそれぞ
れ図11、図12および図13に記載のアミノ酸配列を
有することを特徴とする抗体、抗体軽鎖のCDR−1、
CDR−2およびCDR−3としてそれぞれ図14、図
15および図16に記載のアミノ酸配列を有することを
特徴とする抗体、それぞれ図11、図12および図13
に記載のアミノ酸配列から成る抗体重鎖のCDR−1、
CDR−2およびCDR−3をコードすることを特徴と
するDNA、及びそれぞれ図14、図15および図16
に記載のアミノ酸配列から成る抗体軽鎖のCDR−1、
CDR−2およびCDR−3をコードすることを特徴と
するDNA、に係わる。
【0017】本発明の抗体を産生するヒト−ヒトハイブ
リドーマは、癌細胞株を用いたヒトリンパ球の生体外免
疫法により得られたヒト末梢血リンパ球又は肺癌患者よ
り得られたリンパ球を親細胞株と細胞融合することによ
って作製することができる。かかるハイブリドーマの一
具体例として、昭和63年5月12日付で微工研(工業
技術院微生物工業技術研究所)にブダペスト条約下に国
際寄託したヒト−ヒトハイブリドーマHB4C5(微工
研菌寄第1879号:FERM BP−1879)を挙
げることができる。
【0018】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明する。
【0019】
【実施例】
実施例1細胞融合によるハイブリドーマ作製 肺癌患者から得られたリンパ球(3×106 cells )と
ヒトハイブリドーマ作成用親細胞株NAT−30(特公
平5−51277)(3×107 cells )を混合した
後、400×g、5分間の遠心分離により混合した細胞
を集めた。遠心上清を除いた後、細胞のペレットに1ml
の50%ポリエチレングリコール4000(Boehringer
社製)を1分間かけて添加し、その後37℃、1分間イ
ンキュベートした。さらに1分間に1mlの割合で9mlの
DME培地(大日本製薬)を添加した。400×g、5
分間の遠心分離を行って上清を捨てて、細胞を20mlの
DME培地(15%FCS含有)に懸濁し、これを96
ウェルプレートに播種した。培養は37℃にて行い、融
合細胞のみを選択する目的で、100mMヒポキサンチ
ン、0.4mMアミノプテリン、および16mMチミジンの
いわゆるHATを含有する、15%FCS−DME培地
を添加した。ハイブリドーマによって形成されるコロニ
ーが、細胞融合の日から10日目に現れ始めた。
【0020】実施例2癌細胞に反応するヒトモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマのスクリーニングおよびクローニング ハイブリドーマの産生する抗体の反応性を、以下に述べ
る間接蛍光抗体法を用いて調べた。96ウェルプレート
又は組織培養用チェンバー(ヌンク社)に肺腺癌細胞株
PC−8を1〜5日間37℃の5%炭酸ガスインキュベ
ーター中で培養し付着させた。培養後、0.05%グル
タルアルデヒド又は4%ホルムアルデヒドで固定した。
固定後、リン酸緩衝化生理食塩水(以下、PBSとい
う)で3回洗浄し、3%牛血清アルブミンを含むPBS
を加え室温で30分間放置した。放置後、PBSで5回
洗浄し、ハイブリドーマの増殖しているウェルの培地を
100μl ずつ加え、37℃、5%炭酸ガスインキュベ
ーター中で30分間放置した。この後、PBSで5回洗
浄し、蛍光標識(FITC)したヤギのヒト抗体に対す
る抗体(タゴ社)を50倍にPBSで希釈し加え、37
℃、5%炭酸ガスインキュベーター中で30分間放置し
た。放置後、PBSで5回洗浄し、直ちに蛍光顕微鏡で
観察した。4000余りのハイブリドーマを調べた結
果、PC−8細胞のウェルにおいて、特異的な蛍光がウ
ェル中の50%以上の細胞に認められる抗体を産生する
ハイブリドーマが1つ得られた。このハイブリドーマを
限界希釈法によってクローニングし、IgMクラスのモ
ノクローナル抗体を安定に生産するクローンを得た。こ
のモノクローナル抗体を産生するヒト−ヒトハイブリド
ーマをHB4C5と命名した。尚、このモノクローナル
抗体の短鎖のサブクラスをELISAによって調べたと
ころκであった。
【0021】実施例3モノクローナル抗体の肺癌組織に対する反応性 上記で得られたハイブリドーマを3×105 cells/mlの
細胞密度で、5μg/mlウシインシュリン、35μg/mlヒ
トトランスフェリン、20μMエタノールアミン、2.
5nMセレナイト及び2mg/ml ヒト血清アルブミンを含
むERDF培地に播種し、37℃、7日間培養すること
によって、モノクローナル抗体を含む培養上清を得た。
ヒトIgMを測定するためのELISAによって培養上
清中のモノクローナル抗体濃度を測定したところ、2μ
g/mlであった。この培養上清を癌組織上にたらし、室温
で2時間インキュベートした。インキュベート後、癌組
織をPBSで5分間、3回洗浄した。1,000倍希釈
したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgM抗体(Tago
社製)を癌組織上にたらし、室温、1時間インキュベー
トした。上記と同様に癌組織を洗浄し、ペルオキシダー
ゼの基質となる0.5mg/ml DAB(同仁化学製、Cat.
No. 347-00904)および0.01% H2 2 を含む5
0mM Tris-HCL (pH 7.4)を用いて抗体の癌組織に対する
反応性を調べた。
【0022】
【表1】 HB4C5の産生するヒトモノクローナル抗体の 肺癌組織に対する反応性 ──────────────────────────────── ヒトモノクロ 扁平上皮癌 腺 癌 大細胞癌 小細胞癌 ーナル抗体 ──────────────────────────────── HB4C5 5/6 5/5 2/3 2/2 ──────────────────────────────── 表中の数字: 陽性検体数/試験検体数
【0023】表1の結果から明らかなようにHB4C5
の産生するヒトモノクローナル抗体は、種々の肺癌に高
い確率(88%)で反応した。対照として用いたヒト血
清IgMは、調べた全ての肺癌組織に反応しなかった。
【0024】実施例4mRNAの調製 実施例3で得られたHB4C5細胞を10%FCS−E
RDF培地に5×105 cells/mlまでまきこんだ。2日
間培養の後、5×108 の細胞を得た。
【0025】細胞を4℃においてPBS(予め氷冷して
おく)で3回洗浄した(2000×g 5min.)。ま
ず、終濃度1%となるように 2-MercaptoethanolをGuan
idiumThiocyanate Bufferに添加した。これを5倍体積
の 2-Mercaptoethanol-Guanidium Thiocyanate Buffer
に懸濁し、シリンジに23Gのニードルをつけたもので
吸引及び吐出を行って、粘性がなくなるまで破砕した。
Sodium Lauryl Sarcosinate を終濃度0.5%で添加
し、よく攪拌した。室温で5,000×g,10min の
遠心によって、不溶性の画分を取り除いた。上清を23
Gニードルをつけたシリンジで吸い取り、透明な超遠心
チューブの中の5.7M CsCl、0.01M ED
TA(pH 7.5) のクッションの上に静かに重層した。チ
ューブの外にクッション上部の位置をマークした。重量
の補正は、Guanidium Thiocyanate で行った。SW5
0.1 Swing rotor を用い、20℃、40,000rpm
,24Hourの条件で超遠心した。遠心後、下から0.
5cmの位置にラインを引いた。パスツールピペットでク
ッションのレベルの上まで液を注意深く取り除いた。新
しいピペットで下の線のところまで液を除き、残った液
のちょうど上のレベルでチューブをカミソリで切断し
た。チューブの底をキムワイプのパッドの上に置き、注
意深く自動ピペッタで残った液を抜いた。チューブを逆
さまにし、残った液を完全に取り除いた。チューブを上
向きにしてRNAのペレットがチューブの外に落ちてな
いことを確認した。CsClを取り除くために、RNA
ペレットをEthanol で洗浄した。70% Ethanol(室
温)をチューブの底に満たし、チューブを逆さまにして
Ethanol を捨てた。再びRNAの存在を確認した。RN
Aを室温で乾燥した。0.1%SDSを含むTE(pH
7.6) で、ティスポのチップを付けた自動ピペッタでピ
ペッティングすることによって、RNAを溶解した。R
NA溶液をエッペンドルフチュープにとった。遠心管の
底は、25μlのTEで洗い、その洗浄液もエッペンド
ルフチューブにとった。150μlのTE、30μlの
3M Sodium Acetate (pH 5.2)、0.9mlの氷冷Ethano
l を添加した。混合した後、少なくとも30min ,0℃
保存した。ペレットをEthanol で洗浄し、再度わずかに
遠心した。そして、空気中で乾燥させた。RNAを1ml
のTEに溶解し、3倍体積のEthanol を添加し、小分け
して必要なときまで−70℃で保存した。以上の結果、
4mgのRNAを抽出することができた。
【0026】oligo(dT)−cellulose を充填したSpu
n column をよく振って、樹脂をよく懸濁した。カラム
の下のキャップを外し、それから上のキャップを外し
た。カラムを15mlの遠心管にセットし、保存用緩衝液
をドレーンした。High-salt bufferを1ml添加し、重力
でドレーンした(2回)。遠心管の底に溜まった液を捨
て、またカラムを遠心管にセットした。
【0027】RNAサンプルを1.0mlのTE(pH 7.
4)に溶解し、65℃、5min 処理した。この時、RN
Aが完全に溶解していることを確認した。また、 Eluti
on buffer を65℃に保温しておいた。サンプルを氷冷
し、sample buffer を0.2ml加え、穏やかに攪拌し
た。サンプルを調製済みのカラムの上にのせ、重力で溶
出させた。1400rpm (r=165)2min 遠心し
た。 High-salt buffer を0.25mlカラムに添加し、
遠心した(2回)。 Low-salt buffer 0. 25mlでカラ
ムを洗浄した(3回)。遠心管の底に溜まった buffer
を捨て、減菌したエッペンドルフチューブを遠心管にセ
ットし、さらにカラムの溶出口がエッペンドルフチュー
ブの中に入るようにしてカラムを遠心管にセットした。
poly(A)+ RNAを溶出するために、65℃に保
温しておいた Elution buffer 0.25mlで4回カラム
を洗浄した。遠心管からカラムを取り除き、それから乾
熱したピンセットでエッペンドルフチューブを取り出し
すぐに氷冷した。1/10 vol.の3M Sodium Acetate
を添加し、その2.5〜3 vol. の ethanolを添加
し、−80℃に保存した。
【0028】その結果、200μgのmRNAを得るこ
とができた。このmRNAを、電気泳動したところ、r
RNAは分解されておらず、5kb以上のmRNAも確認
できた。また、in vitro translationの結果、重鎖遺伝
子が含まれることが確認できた。このmRNAを用いて
cDNA合成を行うことにした。
【0029】実施例5ファーストストランドcDNAの合成 Water Bath(42℃及び12℃)の準備をし、Kit
(cDNA合成システムプラス (Amersham) )の酵素以
外の試薬及びmRNAを溶解し、氷冷した。酵素は使用
の直前まで−20℃に保存しておいた。以下の試薬を順
番に加えた。
【0030】
【表2】 5×ファーストストランド合成反応用 buffer 10.0μl ピロリン酸ナトリウム溶液 2.5μl ヒト胎盤リボヌクレースインヒビター 2.5μl デオキシヌクレオタイド三リン酸混液 5.0μl オリゴ(dT)プライマー 2.5μl mRNA(in water) 17.5μl Total 40.0μl 逆転写酵素 10.0μl Total 50.0μl
【0031】静かに混和し、混液を遠心によって遠心管
の底に集めた。mRNA 1μg当たり20units の逆
転写酵素を添加、混和し、42℃、40min インキュベ
ートした。尚、温度は厳密に42℃にし、時間に関して
は40min よりもあまり長くしてはならない。インキュ
ベート後、直ちに氷冷した。その後、−20℃に保存し
た。長期保存するときには、−80℃に保存した。
【0032】実施例6PCR法による抗体可変領域cDNAの増幅 前出の文献(James W. Larrick et al., Biochem. Biop
hys. Res. Commun., Vol. 160, p.1250-1256(1989); Ja
mes W. Larrick et al., Bio/Technology, Vol. 7, p.9
34-938(1989))に従い、ヒト抗体重鎖のリーダー配列に
対応するプライマー(HS−1,2,3)及びヒトIg
M抗体重鎖の定常領域に対応するプライマーを作製し、
これらの3つの組み合わせによるPCRによって、HB
4C5細胞の生産するヒトモノクローナル抗体の重鎖可
変領域の増幅を試みた。軽鎖可変領域については、同様
に、ヒトλ鎖のリーダー配列及び定常領域に対応する2
本のプライマーを作製し、これらを用いたPCRによっ
て増幅を試みた。PCRの反応は、以下の試薬を順番に
加えて行った。
【0033】
【表3】 Water 10.6μl 10×PCR反応用 buffer 2.0μl デオキシヌクレオタイド三リン酸混液 3.3μl プライマー(+) 1.0μl プライマー(−) 1.0μl ファーストストランドcDNA 2.0μl Taq ポリメレース 0.1μl Total 20.0μl
【0034】PCRは94℃ 1min 、55℃ 2min
、72℃ 3min の反応温度で30サイクル行った。
その結果、HS−3を用いたPCRよりIgM抗体重鎖
の可変領域のcDNAに予想されたサイズ(約490b
p)の増幅断片が認められた。このことから抗体重鎖可
変領域のcDNAが特異的に増幅されたものと考えた。
この増幅断片に関して、塩基配列決定することにした。
【0035】実施例7増幅断片のサブクローニング 増幅断片に挿入してある制限酵素部位を用いて、pUC
119シークエンスベクターのEcoRI−Hind I
IIにサブクローニングした。増幅断片は1.5%アガロ
ースゲル電気泳動によって、分離され、グラスビーズを
用いて抽出され、EcoRI−Hind III処理した。
一方、ベクターである、pUC119もEcoRI−
ind III処理し、制限酵素処理した増幅断片ととも
に、除タンパクを行った後、ライゲーションした。宿主
をMV1184として形質転換を行った。
【0036】その結果、挿入断片を含むものが約50%
得られた。これらについてアルカリラピッド法を用いて
サイズ確認したところ、32クローン中30クローンに
目的サイズと思われるプラスミドがみられた。このうち
の、12クローンに関して、アルカリSDS法によっ
て、挿入断片のサイズ確認を行った。その結果12クロ
ーンすべてが目的サイズの断片を含んでいた。このうち
の、4クローンに関して、一本鎖DNAを調製して、塩
基配列決定を行った。
【0037】実施例8塩基配列決定のための一本鎖DNA配列 挿入断片のサイズを確認した後、ヘルパーファージM1
3KO7を用いて一本鎖を調製した。
【0038】MV1184(pUC119-Insert)を、2×Y
T(150μg/ml Ampicillin を含む)で前培養した。
前培養液30μl に、ヘルパーファージM13K07液
(>1010pfu/ml)30μl を加え、37℃で30mi
n 静置した。37℃に温めておいた2×YT brot
h(150μg/ml Ampicillin, 70μg/ml Kanamyci
n, 0.01% thiamine を含む。)を3ml加えた。3
7℃で14〜18時間培養した。(この時、ヘルパーフ
ァージ液の調製と同様に、なるべく通気性のよい条件で
培養した。)培養液をミクロ遠心管に移し、遠心分離に
て菌体を取り除き、上清を別のミクロ遠心管にとった。
培養上清1mlに対して200μl のPEG−NaCl溶
液を加え、よく混合し、15min 室温においた。遠心分
離上清を除いた。濾紙等で完全にPEG−NaCl溶液
を取り除いた。沈澱を100μl のTE−bufferで完全
に溶解させた。TE飽和Phenolを50μl 添加し、約1
0sec 振盪し、約10min 放置した。クロロホルム:イ
ソアミルアルコールを50μl 添加し、約10sec 振盪
した。5min 遠心後水層(上層)を別のミクロ遠心管に
移した。10μl の3M Sodium Acetate を添加し、2
50μl の cold Ethanol を加え混和後、−70℃で5
min 放置した。長期保存する場合はこの状態で置いてお
いた。5min 遠心し、沈澱を70% Ethanolで洗浄し
た。再遠心し、上清を除き減圧乾燥した。TE−buffer
50μl に沈澱を溶かし、−20℃に保存した。
【0039】実施例9塩基配列決定 塩基配列決定は、Sequenase を用いて行った。以下に、
その塩基配列決定方法を示した。
【0040】シークエンス反応 0.5mlチューブの中でアニーリング及びラベリングを
行った。 1.アニーリング Primer 1μl 5× Sequenase Buffer 2μl DNA(約1μg) 7μl チューブのキャップをして、65℃で2min インキュべ
ートした後、30min以上かけて室温に戻した。 2.ラベリング DTT 0.1M 1.0μl Diluted Labeling Mix 2.0μl 〔α−32P〕dCTP 0.5μl Diluted Sequenase 2.0μl 3.ターミネーション 4本のチューブにG.A.T.Cと記入し、それぞれの
チューブに Termination Mix 2. 5μl をいれた。
【0041】1.のアニーリングが終わったら、溶液を
2.の反応液に加え、穏やかに攪拌の後、3.5μl ず
つ3.のチューブに、液が混ざらないように注意しなが
ら、チューブの縁につけた。室温で5min インキュベー
トし、遠心によって液を混ぜた。もう一度液を混和し、
37℃で5min インキュベートした。各 Termination反
応液に、Stop Solution 4μl を加えて、十分混和し、
Sequencing Gelにロードする用意ができるまで氷冷し
た。用意が整ったら、試料を75〜80℃で2min 加熱
し、その後、4μl ずつGel にロードした。50V/cmで
電気泳動を行った。泳動後、ゲルドライヤーを用いて、
ゲルをよく乾燥させ、オートラジオグラフィーを行っ
た。その結果、図1に示されるような、本発明抗体重鎖
をコードするcDNAのヌクレオチド配列が得られた。
このヌクレオチド配列を翻訳することによって、該抗体
重鎖の可変領域のアミノ酸配列を解明し、図3に示し
た。
【0042】図3に示したアミノ酸配列を、既知のヒト
型抗体のアミノ酸配列データのリスト(Elvin A. Kabat
et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL IN
TEREST, FIFTH EDITION, U.S. DEPARTMENT OF HEALTH A
ND HUMAN SERVICES, PublicHealth Service, National
Institute of Health (1991))と比較し、さらに図1及
び図3の核酸配列及びアミノ酸配列をDNA及びタンパ
ク質のデータベース(EMBL−GDB(Release 41)
,LASL−GDB(Release 86) ,NBRF−PD
B(Release 43) 及びSWISS−PROT(Release
30))に対してホモロジー検索を行うことにより、該抗体
重鎖が、サブグループI〜VIの分類のうちのサブグルー
プIVに属すると判定した。さらに、3つのCDRを挟む
位置に存在する4つのFRのアミノ酸は配列が、サブグ
ループ毎に大略において保存されていることから、図1
1、図12および図13に示したアミノ酸配列が、それ
ぞれ該抗体重鎖のCDR−1、CDR−2及びCDR−
3であると決定した。これにより該抗体重鎖のCDR−
1、CDR−2及びCDR−3をコードするヌクレオチ
ド配列は、それぞれ図5、図6及び図7で表されること
が明白となった。
【0043】以上の操作を本発明抗体の軽鎖についても
実施し、夫々の配列を決定した。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明抗体の重鎖の可変領域をコードするヌク
レオチド配列。
【図2】本発明抗体の軽鎖の可変領域をコードするヌク
レオチド配列。
【図3】本発明抗体の重鎖の可変領域を構成するアミノ
酸配列。
【図4】本発明抗体の軽鎖の可変領域を構成するアミノ
酸配列。
【図5】本発明抗体の重鎖のCDR−1をコードするヌ
クレオチド配列。
【図6】本発明抗体の重鎖のCDR−2をコードするヌ
クレオチド配列。
【図7】本発明抗体の重鎖のCDR−3をコードするヌ
クレオチド配列。
【図8】本発明抗体の軽鎖のCDR−1をコードするヌ
クレオチド配列。
【図9】本発明抗体の軽鎖のCDR−2をコードするヌ
クレオチド配列。
【図10】本発明抗体の軽鎖のCDR−3をコードする
ヌクレオチド配列。
【図11】本発明抗体の重鎖のCDR−1を構成するア
ミノ酸配列。
【図12】本発明抗体の重鎖のCDR−2を構成するア
ミノ酸配列。
【図13】本発明抗体の重鎖のCDR−3を構成するア
ミノ酸配列。
【図14】本発明抗体の軽鎖のCDR−1を構成するア
ミノ酸配列。
【図15】本発明抗体の軽鎖のCDR−2を構成するア
ミノ酸配列。
【図16】本発明抗体の軽鎖のCDR−3を構成するア
ミノ酸配列。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07K 16/30 9162−4B C12N 15/00 C C12N 5/10 9281−4B 5/00 B (C12P 21/08 C12R 1:91)

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 抗体重鎖の可変領域をコードするcDN
    Aが、図1に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴
    とするヒトモノクローナル抗体をコードするcDNA。
  2. 【請求項2】 抗体軽鎖の可変領域をコードするcDN
    Aが、図2に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴
    とするヒトモノクローナル抗体をコードするcDNA。
  3. 【請求項3】 抗体重鎖の可変領域が図3に記載のアミ
    ノ酸配列で表されることを特徴とする抗体。
  4. 【請求項4】 抗体軽鎖の可変領域が図4に記載のアミ
    ノ酸配列で表されることを特徴とする抗体。
  5. 【請求項5】 図3に記載のアミノ酸配列から成る抗体
    重鎖の可変領域をコードすることを特徴とするDNA。
  6. 【請求項6】 図4に記載のアミノ酸配列から成る抗体
    軽鎖の可変領域をコードすることを特徴とするDNA。
  7. 【請求項7】 抗体重鎖のCDR−1、CDR−2およ
    びCDR−3がそれぞれ図5、図6および図7に記載の
    ヌクレオチド配列でコードされることを特徴とする請求
    項1記載のcDNA。
  8. 【請求項8】 抗体軽鎖のCDR−1、CDR−2およ
    びCDR−3がそれぞれ図8、図9および図10に記載
    のヌクレオチド配列でコードされることを特徴とする請
    求項2記載のcDNA。
  9. 【請求項9】 抗体重鎖のCDR−1、CDR−2およ
    びCDR−3としてそれぞれ図11、図12および図1
    3に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする抗
    体。
  10. 【請求項10】 抗体軽鎖のCDR−1、CDR−2お
    よびCDR−3としてそれぞれ図14、図15および図
    16に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする抗
    体。
  11. 【請求項11】 それぞれ図11、図12および図13
    に記載のアミノ酸配列から成る抗体重鎖のCDR−1、
    CDR−2およびCDR−3をコードすることを特徴と
    するDNA。
  12. 【請求項12】 それぞれ図14、図15および図16
    に記載のアミノ酸配列から成る抗体軽鎖のCDR−1、
    CDR−2およびCDR−3をコードすることを特徴と
    するDNA。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2322551A2 (en) * 2004-12-22 2011-05-18 Amgen, Inc Compositions comprising Anti-IGF-1R Antibodies and Methods for their Production

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