JPH08289793A

JPH08289793A - デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有するＡ．Ｔｈａｌｉａｎａの蛋白質をコードするＤＮＡ配列、デルタ７−Ｒｅｄ蛋白質、製造方法、トランスフォームした酵母株、及び利用

Info

Publication number: JPH08289793A
Application number: JP8050798A
Authority: JP
Inventors: Xavier Chenivesse; グザビエ・シュニベス; Catherine Duport; カトリーヌ・デュポール; Eric Lecain; エリク・ルカン; Denis Pompon; ドニ・ポンポン
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1995-02-15
Filing date: 1996-02-15
Publication date: 1996-11-05
Anticipated expiration: 2016-02-15
Also published as: CN1145953A; HRP960078A2; EP0727489B1; HUP9600325A1; DE69638123D1; US5989881A; KR100422293B1; CZ43296A3; FI120877B; SI0727489T1; SK283656B6; TR199600116A2; PL312828A1; IL162476A; US5759801A; AR053931A2; CN1216995C; JP4082469B2; ATE457354T1; HU220587B1

Abstract

(57)【要約】【課題】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダ
クターゼ活性を有するA. Thaliana の蛋白質、デルタ７
−Ｒｅｄ蛋白質をコードするＤＮＡ配列、製造方法、ト
ランスフォームした酵母株、及び利用を提供すること。【解決手段】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７
レダクターゼ活性を有するA. Thaliana の蛋白質、デル
タ７−Ｒｅｄ蛋白質をコードするＤＮＡ配列、製造方
法、トランスフォームした酵母株、及び利用を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レ
ダクターゼ活性を有するA. Thaliana の蛋白質をコード
するＤＮＡ配列、デルタ７−Ｒｅｄ蛋白質、製造方法、
トランスフォームした酵母株、及び利用。

【０００２】

【発明の属する技術分野】本発明は、デルタ−５，７ス
テロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有するA. Tha
liana の蛋白質をコードするＤＮＡ配列、デルタ７−Ｒ
ｅｄ蛋白質、それらの製造方法、トランスフォームした
酵母株、及びそれらの利用に関するものである。

【０００３】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レ
ダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．３．１．２１）は、ラット肝
ホモジェネート中（M. E. Dempsey 等、 Methods Enzymo
l.,15, 501-514, 1969 ）並びにトウモロコシ植物調製
物中（M. Taton等、 Biochem.Biophys.Res.Commun., 18
1, 465-473, 1991 ）の活性により存在が示されている
ミクロソーム酵素である。このレダクターゼはＮＡＤＰ
Ｈに依存して、イン・ビトロで、７−デヒドロコレステ
ロールをコレステロールに還元する。

【０００４】ステロールは、真核生物メンバーの主要な
構成成分であるが、種によって構造的差異を示す。酵母
等の真核生物の細胞においては、主要なステロールは、
Ｃ−５位及びＣ−７位の二重不飽和、Ｃ−２４位の分枝
側鎖及びＣ−２２位の不飽和を含むエルゴステロールで
あるが、他方、哺乳動物においては、コレステロールは
Ｃ−５位の不飽和及び飽和側鎖により特徴付けられる。
シトステロール、スチグマステロール及びカンペステロ
ール（これらは、植物における最も一般的なステロール
を代表するものである）は、分枝しているが飽和の側鎖
を有し、脊椎動物のステロールと同様に、Ｃ−７位には
不飽和を有しない。このステロール核の構造における差
異の原因である酵素は、デルタ−５，７−ステロール，
デルタ−７レダクターゼである。

【０００５】デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７
レダクターゼは、均質に精製されたことはなく、単に部
分精製が記載されただけである（M. E. Dempsey 等; M.
Taton等、既出）。この蛋白質は、その物理化学的性質
により特性決定されていない。この蛋白質の配列の情報
及びそれに対する抗体は記載されていない。更に、ＲＳ
Ｈ／スミス−レムリ−オピッツ（ＳＬＯ）症候群に関連
するヒトにおいて、７−デヒドロコレステロールレダク
ターゼの明白な不足が記載されている（J. M.Opitz 等、
Am. J. Med. Genet., 50, 326-338, 1944 ）。

【０００６】従って、デルタ−５，７−ステロール，デ
ルタ−７レダクターゼをコードするｃＤＮＡのクローニ
ング（それは、対応する蛋白質の配列を同定すること並
びにそのヒト遺伝子又はその先天的欠失の特性表示を可
能にする）は、例えばハイブリダイゼーション及び／又
は免疫学的検出技術を利用する公知の方法を用いては達
成できない。従って、実施すべきクローニングを、特に
蛋白質の情報のない場合に、可能にする創意に富むスク
リーニング方法を得ることが必要とされる。

【０００７】カビの膜の主要なステロールであるエルゴ
ステロールは、Ｃ−５、７位に一対の共役二重結合を含
む（それは、ナイスタチン等のポリエンのファミリーの
化合物に抗真菌活性を与える）（R. Bittman等、 J. Bio
l. Chem., 260, 2884-2889,1985）。ナイスタチンの作
用の、Ｃ−５、７位の不飽和ステロールの膜濃度に対す
る強い依存性は、S.cerevisiaeにおいて蓄積されるステ
ロールについての変異株の選択を可能にした（S. W. Mo
lzahn 等、 J. Gen. Microbiol., 72, 339-348,1972
）。従って、変異体ｅｒｇ２及びｅｒｇ３は、それぞ
れ、ステロールデルタ−８，７イソメラーゼ（W. Ashma
n 等、 Lipids, 26, 628, 1991 ）及びステロールデルタ
−５デヒドロゲナーゼ（B. Arthinton等、 Gene, 102, 3
9, 1991 ）の不足の故に、Ｃ−５，７位に共役二重結合
を有しないステロールを蓄積する。かかる変異体は、エ
ルゴステロール（酵母の主要な天然ステロール）がある
条件下でコレステロールを含む種々の代用ステロールに
よって置き換え可能である故に生存可能である。

【０００８】本願発明者は、S.cerevisiaeにおける代謝
干渉を利用するスクリーニング方法を用いて、デルタ−
５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有
する異種蛋白質をコードするｃＤＮＡをクローン化する
ことにつき、Ｃ−５，７位に二重不飽和を有しないステ
ロールに富む酵母株のナイスタチン耐性を増すことの有
利さに気付いた。しかしながら、ＤＮＡ配列又は蛋白質
を知ること並びに酵素活性にのみ基づく検出に依存しな
い有利さを提供するこのアプローチの成功は、克服され
るべき多くの技術的困難の故に予知できるものではな
い。

【０００９】第１の制限は、ナイスタチンが働く仕方が
完全には解明されていないという事実に由来するもので
ある（L. W. Parks 等、 CRC Critical Reviews in Micr
obiology, 301-304, 1978 ）。例えば、ナイスタチンに
よる選択の低い特異性は、その間接的性質により予知で
き、それは、酵母において、ｅｒｇ変異体等の自然のゲ
ノム変異（S. W. Molzahn 等、既出）又はステロール経
路に依らない耐性を含むゲノム変異の選択へと導く。同
様に、遺伝子ライブラリーによりトランスフォームされ
た細胞は、ステロール経路と無関係のナイスタチン耐性
を与える異種遺伝子を発現することができる。

【００１０】予想される制限の他の例は、例えば、下記
の理由の１つのために、異種蛋白質が細胞内で弱く作用
して、ナイスタチンに対する耐性の欠如又は低い耐性へ
導くという事実に関係する：１）デルタ−５，７−ステ
ロール，デルタ−７レダクターゼをコードする遺伝子が
弱く発現される；２）この蛋白質が、不十分な折りたた
まりのため又は不正確な細胞下配向の結果、活性が弱い
か又は活性がない；３）この植物蛋白質が酵母自身のス
テロールを基質として認識しない；４）基質たり得るス
テロールがエステル型であるか小胞中に貯蔵されていて
この酵素と接触しない。従って、この仕方で蓄積される
ステロールがデルタ−５，７−ステロール，デルタ−７
レダクターゼ（これは、真核生物では、ミクロソームに
局在化されると考えられている）の作用を免れることは
予想され得る。

【００１１】本発明は、デルタ−７Ｒｅｄと呼ばれるデ
ルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活
性を有する蛋白質をコードする A.thaliana のｃＤＮＡ
の、ナイスタチン耐性に基づく代謝干渉により酵母にお
いて行なうクローニング方法によるクローニングに関す
るものである。このデルタ−７Ｒｅｄ蛋白質は、Ｃ−７
位に不飽和を有するステロールを生物学的還元プロセス
によって還元させ、それは、更に、Ｃ−５、７に二重不
飽和を有するステロール又はステロイドのＣ−７位にお
ける選択的還元の問題に有利な解決を与える（化学的経
路を用いる還元方法は、それを与えない）。

【００１２】この発明は又、Ｃ−７位及び適宜Ｃ−２２
位が飽和された生成物を驚くべき仕方で蓄積するデルタ
−７Ｒｅｄを発現するトランスフォームされた酵母細胞
にも関係し、該生成物は、エルゴステロールと対照的
に、コレステロールの側鎖の制限酵素（即ち、チトクロ
ームＰ₄₅₀ ＳＣＣ）の基質である。

【００１３】これらの予期しない性質は、工業的及び／
又は薬理学的用途を有するステロール若しくはステロイ
ドの製造方法、特に、Ｃ−７位が還元された酵母の内因
性ステロールのチトクロームＰ₄₅₀ ＳＣＣ（Ｐ₄₅₀ ＳＣ
Ｃ）による、アドレノドキシンレダクターゼ（ＡＤＲ）
及びアドレノドキシン（ＡＤＸ）の存在下での生物学的
酸化によるプレグネノロンの製造において、この発明の
トランスフォームされた酵母の利用を可能にする。この
発明のトランスフォームされた酵母は、哺乳動物及び他
の脊椎動物におけるコレステロールのヒドロコーチゾン
への代謝経路の中間体ステロイドの製造方法においても
利用することができる。この利用は、ヒドロコーチゾン
又はその中間体の生物学的酸化プロセスにおける製造を
可能にする利点を有し、該プロセスは、コレステロール
等の外因性ステロールの初期基質としての利用を必要と
せず、従って、ステロールの酵母中への透過の問題を回
避する（好気性条件下での酵母の外因性ステロールに対
する不透過性は、R. T. Lorentz 等、 J. Bacteriology,
981-985, 1986に記載されている）。

【００１４】この発明は又、この発明のクローニング方
法を用いて得られた核酸配列の利用にも関係する。デル
タ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼをコ
ードするＲＮＡ又はＤＮＡ配列を、このデルタ−５，７
−ステロール，デルタ−７レダクターゼの遺伝子の生成
物が関係する疾患の診断又は治療に用いることが出来
る。例えば、７−デヒドロコレステロールをコレステロ
ールに変換するデルタ−５，７−ステロール，デルタ−
７レダクターゼの不足は、ＲＳＨ／ＳＬＯ症候群に関係
すると推定されている。従って、ヒトＤＮＡ配列を、デ
ルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの
不足を診断するためのプローブとして利用することがで
き、かかる不足を矯正するための遺伝子治療において利
用することもできる。

【００１５】従って、本発明の主題は、デルタ−５，７
−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋
白質をコードする配列を含む核酸配列であり、該核酸
は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、特にｃＤＮＡである。

【００１６】デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７
レダクターゼ活性は、例えば、イン・ビトロで酵素的試
験を用いて示すことができる（実験部分にて更に説明す
る）。

【００１７】本発明の更に特別の主題は、コード配列
が、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクタ
ーゼ活性を有し且つ下記のSEQ ID NO:１のヌクレオチド
配列を有する A.thaliana の蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａ配列：

【化４】並びに、この配列の対立遺伝子変異体である。

【００１８】図３に示した配列（SEQ ID NO:２）に対応
する４３０アミノ酸を有する蛋白質をコードする上記の
ｃＤＮＡ配列は、例えば、酵母におけるクローニング
（A.thaliana発現ライブラリーから開始し、後述の詳細
な説明の操作条件に従って、酵母のナイスタチン耐性の
出現に基づくスクリーニング方法を用いることによる）
によって得ることのできるｃＤＮＡ配列である。

【００１９】上記のヌクレオチド配列SEQ ID NO:１の知
識は、当業者に公知の方法によって（例えば、化学合
成、又はハイブリダイゼーション技術若しくはＰＣＲ増
幅により合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて遺伝
子ライブラリー若しくはｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングすることにより）、本発明を再現することを可
能にする。

【００２０】この発明の主題は又、デルタ−５，７−ス
テロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質
をコードし且つ、平均的若しくは高緊縮条件下でヌクレ
オチド配列SEQ ID NO:１とハイブリダイズし又はこの配
列と約６０％以上の配列同一を有するＤＮＡ配列でもあ
る。

【００２１】この配列SEQ ID NO:１と検出可能な様式で
ハイブリダイズする配列は、平均的緊縮の標準的条件下
でハイブリダイズする。例えば、４２℃で、ホルムアミ
ドの５０％溶液、ＳＳＣ×６中で１２時間のハイブリダ
イゼーションの後に洗浄するか又は一層緊縮でない条件
下でのハイブリダイゼーション、例えば、ホルムアミド
の２０％溶液、ＳＳＣ×６中での４２℃、２４時間のハ
イブリダイゼーションの後に公知の標準的条件下で洗浄
する（T. Maniatis 等、 Molecular cloning, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, 1989）。

【００２２】ヌクレオチド配列同一のパーセンテージ
は、例えば、NCBIサーバーにて、BLAST プログラム「基
礎的局所的整列（alignment ）サーチ用ツール」（S.
F. Altschul等、 J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990
）を用いることにより決定することができる。

【００２３】この発明は又、デルタ−５，７−ステロー
ル，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコー
ドし、下記のアミノ酸配列SEQ ID NO:３を有するコンセ
ンサス配列をコードするオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いるＰＣＲ技術により増幅可能であるＤＮＡ
配列にも関係する：

【化５】（式中、７位のＸａａは、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、１
２位のＸａａは、Ｈｉｓ又はＬｙｓである）。

【００２４】上記の配列SEQ ID NO:３は、新規なコンセ
ンサス配列に対応し、該配列は、新規な配列SEQ ID NO:
２（ヌクレオチド配列SEQ ID NO:１から演繹される）と
公知の配列（Ｃ−７位以外の位置での作用特異性を有す
る他のステロールレダクターゼ又はラミンＢレセプター
の配列）との間のアミノ酸配列の同一の整列により規定
された（実験部分にて更に詳細に説明する）。アミノ酸
配列SEQ ID NO:３により与えられる情報から、最大で４
５ヌクレオチドから構成されるプライマーを規定して合
成することができ、該プライマーは、再結合配列として
の第２プライマーオリゴｄＴ（１７ヌクレオチド）と組
み合わせて、市販のＰＣＲアッセイキット（例えば、St
ratagene）を用いて、デルタ−５，７−ステロール，デ
ルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする
ＤＮＡの増幅を可能にする。

【００２５】この発明は又、デルタ−５，７−ステロー
ル，デルタ−７レダクターゼ活性を有し且つ下記のアミ
ノ酸配列SEQ ID NO:２を有する A.thaliana の蛋白質：

【化６】並びに、この配列の対立遺伝子変異体及びアナログにも
関係する。

【００２６】対立遺伝子及びアナログには、１つ以上の
アミノ酸の置換、欠失又は付加により修飾された配列
が、これらの生成物が同じ機能を維持する限りにおい
て、含まれる。これらの修飾配列は、例えば、当業者に
公知の位置指定突然変異導入技術を用いることにより作
ることができる。

【００２７】この発明の特別の主題は、デルタ−５，７
−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有し且つ
上記のアミノ酸配列SEQ ID NO:２を有してデルタ−７Ｒ
ｅｄと呼ばれる A.thaliana の蛋白質である。

【００２８】この発明は又、デルタ−５，７−ステロー
ル，デルタ−７レダクターゼ活性を有し、配列SEQ ID N
O:２と約６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
を有する蛋白質にも関係する。

【００２９】同一性のパーセンテージは、例えば、上記
のBLAST プログラムを用いて決定することができる。

【００３０】この発明は又、デルタ−５，７−ステロー
ル，デルタ−７レダクターゼ活性を有し且つ上で規定し
た A.thaliana デルタ−７Ｒｅｄ蛋白質と交差免疫反応
性を有する蛋白質にも関係する。

【００３１】この蛋白質は、例えば、公知の方法により
調製したデルタ−７Ｒｅｄ蛋白質に対する抗血清を用い
る免疫沈降によって検出することができる。

【００３２】この発明の一つの面は、デルタ−５，７−
ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白
質、例えば、前に規定したＤＮＡ配列を含む宿主細胞に
おける発現により得られるもの等に関係し、特に A.tha
liana の蛋白質例えば上記のアミノ酸配列SEQ ID NO:２
をコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞における発現に
より得られるものに関係する。

【００３３】この発明の蛋白質を宿主細胞における発現
により得る場合は、これを、当業者に公知の遺伝子工学
及び細胞培養法によって行なう。

【００３４】発現は、この発明のデルタ−７Ｒｅｄをコ
ードする配列（適当なプロモーターを先行させる）を含
む原核生物宿主細胞例えば大腸菌、又は真核生物宿主細
胞例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞若しくは酵母にて行な
うことができる。

【００３５】得られる組換え蛋白質は、グリコシル化さ
れていてもされていなくてもよい。

【００３６】特に、この発明は、この発明による蛋白
質、例えば、酵母中での発現により得られたもの等に関
係する。

【００３７】この発明は又、前に規定したデルタ−５，
７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する
蛋白質に対する抗体にも関係する。この抗体は、当業者
に公知の方法により調製されたポリクローナル抗体であ
ってもモノクローナル抗体であってもよい。

【００３８】この発明は又、前に規定したＤＮＡ配列を
含む発現ベクター並びにこのベクターによりトランスフ
ォームされた宿主細胞にも関係する。

【００３９】これらの発現ベクターは、適当なプロモー
ターの制御下で蛋白質の発現を与える公知のベクターで
ある。原核生物細胞用には、このプロモーターは、例え
ば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃ
プロモーター、β−ラクタマーゼプロモーター又はＰＬ
プロモーターであってよい。哺乳動物細胞用には、この
プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター又はアデノウイ
ルスのプロモーターであってよい。バキュロウイルス型
のベクターも又、昆虫細胞における発現用に用いること
ができる。酵母細胞用には、このプロモーターは、例え
ば、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＣＹＣ
１プロモーター又はＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーター
であってよい。

【００４０】宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞
であってもよい。原核細胞は、例えば、大腸菌、バチル
ス、ストレプトミセスである。真核宿主細胞は、酵母及
び糸状菌並びに更に高等な生物の細胞例えば哺乳動物細
胞又は昆虫細胞を含む。哺乳動物細胞は、ハムスターの
ＣＨＯ細胞又はサルのＣｏｓ細胞であってよい。昆虫細
胞は、例えば、ＳＦ９細胞である。酵母細胞は、例え
ば、Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces
pombe 又はKluyveromyces lactisであってよい。

【００４１】この発明の主題は又、デルタ−５，７−ス
テロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質
をコードする核酸の、微生物における、下記より選択す
るスクリーニング方法を含むクローニング方法でもあ
る： − 微生物のナイスタチン又は類似化合物（その毒性が
Ｃ−７位に不飽和を有するステロールの存在に依るも
の）に対する耐性、 − 核酸の、上記の配列SEQ ID NO:１のヌクレオチド配
列とのハイブリダイゼーション、 − ランダムに単離されたＤＮＡ配列からの、データ処
理技術を用いることによる核酸の同定、 − 蛋白質の直接発現とそれに続く上記のアミノ酸配列
SEQ ID NO:２を有する蛋白質に対する抗体を用いる免疫
学的検出。

【００４２】微生物とは、例えば、S.cerevisiae、S.po
mbe 又は K.lactis を意味する。

【００４３】ナイスタチンに類似する化合物は、例え
ば、アンフォテリシンＢ又はフィリピンを含む。

【００４４】ハイブリダイゼーションとは、公知の標準
的条件による平均的又は高緊縮条件下でのハイブリダイ
ゼーションを意味する（T. Maniatis 等、既出）。

【００４５】データ処理技術を利用する同定は、例え
ば、上記のBLAST プログラムによって行なうことができ
る。

【００４６】スクリーニング方法が酵母のナイスタチン
耐性を利用する上記のクローニング方法の一例を、実験
部分において更に説明する。

【００４７】この発明の主題は又、上記のクローニング
方法によって得られたＤＮＡ又はＲＮＡ核酸配列でもあ
る。その核酸配列は、クローニングを行なう材料によっ
て、原核生物起源でも、真核生物起源でもよい（例え
ば、ヒト起源でもよい）。

【００４８】この発明の主題は又、上記のクローニング
方法により得られたＤＮＡ配列を含むベクターによりト
ランスフォームされた宿主細胞でもある。この宿主細胞
は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。宿主
細胞及びベクターの例は、前に示されている。

【００４９】この発明の特別の主題は、前に規定した発
明によるＤＮＡ配列又は上記のクローニング方法により
得られたＤＮＡ配列等を含むベクターによりトランスフ
ォームされた酵母又は糸状菌から選択する宿主細胞であ
る。

【００５０】この発明の主題の一つは又、デルタ−５，
７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する
蛋白質の製造方法にも関係し（該製造方法においては、
本発明によりトランスフォームされた宿主細胞を培養し
て発現された蛋白質を単離する）、特に、宿主細胞がト
ランスフォームされた酵母（該酵母において、コードＤ
ＮＡ配列は、酵母プロモーターの制御下に置かれる）で
ある方法に関係する。

【００５１】この発明の主題の一つは又、Ｃ−７位が不
飽和のステロールのイン・ビトロでの還元方法にも関係
する（該方法においては、還元すべきステロールを、上
記の方法により得られた蛋白質と共にインキュベート
し、得られる還元されたステロールを適宜単離する）。

【００５２】この発明の主題の一つは又、Ｃ−７位が不
飽和の外因性ステロールのイン・ビボでの還元方法にも
関係する（該方法においては、ステロールを、この発明
によりトランスフォームした宿主細胞と共にインキュベ
ートし、得られる還元されたステロールを適宜単離す
る）。宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であっ
てもよい（特に、酵母又は糸状菌であってよい）。

【００５３】この発明の主題の一つは又、Ｃ−７位が不
飽和の内因性ステロールのイン・ビボでの還元方法にも
関係する（該方法においては、酵母又は糸状菌から選択
し、この発明によってトランスフォームした宿主を培養
して、蓄積された還元されたステロールを適宜単離す
る）。

【００５４】特に、この発明は、上に規定したイン・ビ
トロ又はイン・ビボでの還元方法に関係し（該方法にお
いては、得られる還元されたステロールは、コレステロ
ールの側鎖の制限酵素（Ｐ₄₅₀ ＳＣＣ）の基質であ
る）、特に、イン・ビボでの還元方法に関係する（該方
法においては、還元すべき外因性ステロールは、エルゴ
スタ５，７ジエン３−オール、エルゴスタ５，７，２４
（２８）トリエン３−オール又はエルゴスタ５，７，２
２トリエン３−オール又はこれらの混合物である）。

【００５５】この発明の主題は又、プレグネノロンの製
造方法でもある（該方法においては、酵母又は糸状菌か
ら選択してこの発明によりトランスフォームした宿主細
胞を培養し、蓄積された内因性のステロール又はＣ−７
位が還元されたステロールを適宜単離し、これらの還元
されたステロールをＰ₄₅₀ ＳＣＣの存在下で（適宜、ア
ドレノドキシンレダクターゼ（ＡＤＲ）及びアドレノド
キシン（ＡＤＸ）の存在下で）インキュベートして得ら
れるプレグネノロンを適宜単離する）。

【００５６】この発明の特別の主題は、上に規定したプ
レグネノロンの生成方法（宿主細胞は酵母）である。

【００５７】この発明は又、デルタ−５，７−ステロー
ル，デルタ−７レダクターゼ及びＰ₄₅₀ ＳＣＣの活性を
有する蛋白質並びに適宜ＡＤＲ及びＡＤＸの活性を有す
る蛋白質の同時発現を可能にする１つ以上のベクターで
トランスフォームした酵母を培養し、遊離の若しくはエ
ステル化したプレグネノロンを適宜単離するプレグネノ
ロンの生成方法にも関係する。

【００５８】この発明は、特に、デルタ−５，７−ステ
ロール，デルタ−７レダクターゼ、Ｐ₄₅₀ ＳＣＣ、ＡＤ
Ｒ及びＡＤＸの活性を有する蛋白質を同時発現するトラ
ンスフォームされた酵母を培養する上記の方法に関係
し、特に、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レ
ダクターゼ活性を有する蛋白質が A.thaliana の蛋白質
デルタ−７Ｒｅｄである上記の方法に関係し、特に、酵
母株がＥＣ０１／ｐＣＤ６３株である上記の方法に関係
する。

【００５９】この発明によるプレグネノロンの生成の例
を、更に、実験部分で与える。

【００６０】上記のプレグネノロンの生成方法を実施す
るために用いられるトランスフォームされた酵母は、例
えば、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダク
ターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含
むこの発明の発現ベクター並びにチトクロームＰ₄₅₀ Ｓ
ＣＣの及び適宜ＡＤＸ及びＡＤＲの発現ベクターにより
同時トランスフォームされた酵母であってよい。これら
のチトクロームＰ₄₅₀ＳＣＣ及び／又はＡＤＸの発現ベ
クターは公知であり、調製は、例えば、欧州特許出願Ｅ
Ｐ０３４０８７８並びに実験部分に記載されている。

【００６１】用いるトランスフォームされた酵母は又、
デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ
活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列がゲノムの
特定の遺伝子座（例えば、ＡＤＥ２遺伝子座）にインテ
グレートされ及びエルゴステロールがもはやデルタ−７
レダクターゼの発現条件下において主要ステロールでな
い酵母であってもよい。得られた「インテグレートされ
た」酵母を、次いで、チトクロームＰ₄₅₀ ＳＣＣ並びに
適宜ＡＤＸ及びＡＤＲをコードするＤＮＡ配列を含むイ
ンテグレート発現カセット又は発現ベクターによりトラ
ンスフォームすることが出来る。

【００６２】プレグネノロン又はその酢酸エステルをイ
ン・ビボで産生する酵母株の構築の例を、更に、実験部
分に与える。

【００６３】従って、この発明の主題は又、デルタ−
５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ、Ｐ₄₅₀
ＳＣＣ、ＡＤＲ及びＡＤＸの活性を有する蛋白質を同時
発現し且つ遊離若しくはエステル化したプレグネノロン
を蓄積するトランスフォームされた酵母株でもあり、特
に、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクタ
ーゼの活性を有する蛋白質が A.thalianaの蛋白質デル
タ−７Ｒｅｄである上記の酵母株、特にＥＣ０１／ｐＣ
Ｄ６３と呼ばれる酵母株（その正確な構築を更に実験部
分で与える）でもある。

【００６４】この発明は又、上に規定したクローニング
方法により得られ、デルタ−５，７−ステロール，デル
タ−７レダクターゼの先天的欠乏を診断するためのプロ
ーブとして利用されるヒトＤＮＡ配列にも及ぶ。デルタ
−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの欠乏
は、例えば、異常に低いレベルの血漿コレステロールの
原因である７−デヒドロコレステロールレダクターゼの
欠乏を含む。

【００６５】この発明は又、ヒトゲノムＤＮＡを含む試
料を上に規定したプローブと共に標準的ハイブリダイゼ
ーション条件下でインキュベーションし、そのプローブ
のゲノムＤＮＡへの固定又は固定の不在を示すこと（固
定の不在又は後者の減少は、デルタ−５，７−ステロー
ル，デルタ−７レダクターゼの先天的欠乏を示す）を含
むデルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクター
ゼの欠乏の検出方法にも関係する。

【００６６】この発明の方法は、例えば、出生前デルタ
−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの先天
的欠乏又は新生児並びに種々の病気特にＲＳＨ／ＳＬＯ
症候群の臨床的明示を有する患者における先天的欠乏の
検出を可能にすることができる。

【００６７】下記の実施例は、この発明を制限すること
なく説明する。

【００６８】

【実施例】実施例１：A.thalianaの５，７−ステロール，デルタ−
７レダクターゼ（デルタ−７Ｒｅｄ）をコードするｃＤ
ＮＡのクローニングＡ − 酵母中のA.thalianaの発現ライブラリーのスク
リーニング出発ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、M.Minet 等（Plant
J., 2, 417-422,1992）により記載されたライブラリー
であり、該ライブラリーは、二葉の発芽段階のA.thalia
naのｍＲＮＡから調製され、そのＮｏｔＩ部位と接する
ｃＤＮＡがシャトルベクターE.coli/S.cerevisiae ｐＦ
Ｌ６１の発現カセットのＢｓｔＸＩ部位に挿入された。
このカセットは、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子
（ＰＧＫ）のプロモーター及びターミネーター配列を含
む。２ｕ配列から誘導された酵母の複製オリジン及び選
択の指標ＵＲＡ３は、このベクターの酵母中での増殖を
確実にする。このベクターの大腸菌中での増殖は、プラ
スミッドｐＵＣ１９に由来する。

【００６９】酵母ＦＹ１６７９株（Mata）（これは、Th
ierry 等（Yeastk, 6, 521-534, 1990）により記載され
たＳ２８８Ｃの同系株である）を、D.Gietz 等（Nuclei
c Acids Res., 20, 1425, 1992）により記載された酢酸
リチウム法を用いて、ｃＤＮＡライブラリーによりトラ
ンスフォームした。

【００７０】これらの細胞を、７ｇ／ｌの「yeast nitr
ogen base 」（Difco ）、１ｇ／ｌのバクトカザミノ酸
（Difco ）、２０ｇ／ｌのグルコース、２０ｍｇ／ｌの
トリプトファンを含み、ウラシルを含まない合成培地Ｓ
ＧＩ上にプレートした。１０⁵ のウラシルについての原
栄養体トランスフォーマントが得られ、次いで、分類し
て同じウラシルを含まず２若しくは５μｇ／ｍｌのナイ
スタチンを含む合成培地上に５×１０⁴ 細胞／皿の割合
で再プレートした。各ナイスタチン濃度について１０⁶
細胞を、この方法でスクリーニングした。３日間２８℃
でインキュベーションした後に、２μｇ／ｍｌのナイス
タチン濃度で成育させた約１００クローンを、５つのク
ローンの群を構成することにより集めた（ステロール組
成を逆相構成の液体クロマトグラフィー（以後、ＲＰ−
ＨＰＬＣと呼ぶ）により分析した）が、単一の耐性クロ
ーン（Ｆ２２と呼ぶ）が、５μｇ／ｍｌのナイスタチン
濃度で得られた。

【００７１】Ｂ − クローンＦ２２に蓄積されたステ
ロールの分析酵母の全ステロールを、L. Parks等（Methods in Enzym
ol., 111, 333-346, 1985 ）により記載されたアルカリ
鹸化法によって調製し、次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣ及び／
又はガスクロマトグラフィー（ＧＣと呼ぶ）により分析
した。

【００７２】得られたステロールの残渣をエタノール−
テトラヒドロフラン−水の混合物（６５：１０：２５ｖ
／ｖ）に溶解させ、次いで、Applied Biosystems C18結
合シリカカラム（１００×２．１ｍｍ）上での、水中の
メタノールの直線的勾配（１８分間にわたって、５０〜
１００％）及び２０５ｎｍ及び２８５ｎｍでの測光検出
（エルゴステロール、カンペステロール及びコレステロ
ール標準と比較）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより分析す
る（１ｍｌ／分の流量及び５５℃で行なう）。

【００７３】ステロールの組成は又、ヘリウムをキャリ
アーガスとして使用するAlltech SE-30 キャピラリーカ
ラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ）上でのＧＣ（インジェク
ター及び検出器での温度は、それぞれ、２８０℃及び３
１０℃）によっても分析する（初期に４５℃／分の速度
で温度を１１０℃から２４５℃まで増大させ、次いで、
３℃／分にて２８０℃に達する）。

【００７４】ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析（図１Ａ）及び
ＧＣによる分析（図１Ｂ）は、上で得られたクローンＦ
２２に蓄積したステロールのプロフィルを示し、それ
は、トランスフォームしてないＦＹ１６７９株の主要ス
テロールであるエルゴステロールの事実上完全な消失、
及び２つの主要ステロール（類似の量）での置き換えに
より特徴付けられ、該ステロールは、２８５ｎｍにて吸
収せず、従って、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析により、も
はや共役二重不飽和を有しない。

【００７５】図１Ａにおいて、カンペステロール（Sigm
a ）（２４−Ｒ−エルゴスタ５−エン３−オール）は、
約３５％のジヒドロブラシカステロール（２４−Ｓ−エ
ルゴスタ５−エン３−オール）を含む。

【００７６】Ｃ − デルタ−７ＲｅｄｃＤＮＡのクロ
ーニングクローンＦ２２起源のプラスミッドを J. N. Strathern
等（Methods in Enzymol., 194, 319-329, 1991 ）によ
り記載された方法によって大腸菌中で増幅し、次いで、
ＮｏｔＩにより消化した。約６００塩基対（ｂｐ）の断
片及び１．６ｋｂｐの断片を得た。ＦＹ１６７９株を上
記の各断片でそれぞれトランスフォームした。トランス
フォームした酵母の各クローンのステロールの組成を上
記のように分析し、ステロールの変化したプロフィルの
原因である遺伝子を有するプラスミッドを弁別した。こ
の方法で同定したプラスミッドをｐＦ２２と命名した。

【００７７】Ｄ − デルタ−７ＲｅｄのｃＤＮＡ配列
の決定ｐＦ２２のｃＤＮＡインサートを、ｐＵＣ９（Pharmaci
a ）から誘導したベクターｐＵＣ９ＮのＮｏｔＩ部位に
サブクローン化した（該ベクターにおいては、多数クロ
ーニング部位のＥｃｏＲＩ部位をＮｏｔＩ制限部位の挿
入により置き換えてあるが、他方、ＬａｃＺ遺伝子のリ
ーディングフレームは保持している）。次いで、制限地
図を決定した（図２）。

【００７８】外部ＮｏｔＩ部位及び内部ＥｃｏＲＩ、Ｐ
ｖｕＩＩ又はＨｉｎｄＩＩＩ部位をそれぞれ有する制限
断片を、pBluescript プラスミッド（Stratagene）中に
サブクローン化した。そのヌクレオチド配列を、これら
の二鎖について、ＤＮＡポリメラーゼ Sequenase（Stra
tageneキット）を用いて、pBluescript ｐＵＣ９、Ｔ３
及びＴ７の直接及び逆行プライマー又はｃＤＮＡヌクレ
オチド配列の推定の特異的プライマーを利用することに
より、サンガー法によって決定した。

【００７９】得られた配列をすべて編集すると、図３に
示した A.thaliana のデルタ−７ＲｅｄｃＤＮＡヌクレ
オチド配列（SEQ ID NO:１）を与える。それは、ポリア
デニル化配列で終了する１４９６ヌクレオチドを含む。
それは、ヌクレオチド７６のメチオニンイニシエーター
で開始し、ヌクレオチド１３６６の終止コドンで終了す
るオープンリーディングフレームを有する。これは、４
３０アミノ酸の蛋白質をコードする１２９０ヌクレオチ
ドのオープンリーディングフレームを生じる。デルタ−
７ＲｅｄｃＤＮＡのコード領域は、蛋白質デルタ−７Ｒ
ｅｄをコードし、その演繹したアミノ酸配列（SEQ ID N
O:２）を図３に示す。この蛋白質の配列は、４３０アミ
ノ酸を含み、アミンは、４９．２８６ｋＤａの計算分子
質量を有する。

【００８０】ベクターｐＵＣ９Ｎ中のデルタ−７Ｒｅｄ
ｃＤＮＡ（デルタ７Ｒｅｄ／ｐＵＣ９ＮｃＤＮＡと呼
ぶ）を含む大腸菌ＤＨ５−１株の試料を、ＣＮＣＭに、
１９９５年２月１０日に、番号Ｉ−１５３５にて寄託し
た。

【００８１】Ｅ − コンセンサス配列SEQ ID NO:３の
決定配列データベース（Genbank 及びEMBL）のコンピュータ
ー検索を利用して、A.thalianaのデルタ−７Ｒｅｄ蛋白
質の配列が、他のステロールレダクターゼ、特に、R.
T. Lorentz 等（DNA Cell Biol., 11, 685-692, 1992
）及び W. Chen等（Yeast, 7, 305-308, 1991 ）によ
りそれぞれ記載された S.cerevisiae のステロールＣ−
１４レダクターゼ及びステロールＣ−２４（２８）レダ
クターゼ並びに M. Shimanuki等（Mol. Biol. Cell,
3, 263-273, 1992 ）により記載されたS.pombe の sts
１＋遺伝子の生成物及び Neurospora crassaのステロー
ルＣ−１４レダクターゼ（EMBLデータベースでの番号 X
77955 ）と幾らかの配列類似性を有することが示され
た。更に、デルタ−７Ｒｅｄ蛋白質は、H. J. Worman等
（J. Cell Biol., 111, 1535-1542, 1990 ）及び E. Sc
huler 等（J. Biol. Chem., 269, 11312-11317, 1994）
により記載されたニワトリラミンＢレセプターのＣ末端
の４００アミノ酸及び対応するヒトレセプターのそれと
の類似性を示す。

【００８２】上で得られたデルタ−７ＲｅｄｃＤＮＡか
ら演繹したアミノ酸配列SEQ ID NO:２と３つの酵母ステ
ロールレダクターゼ及び２つのラミンＢレセプターのそ
れとの間の配列同定整列（alignment ）を確立し、次い
で、下記のアミノ酸配列（SEQ ID NO:３）を有する新た
なコンセンサス配列：

【化７】（式中、７位のＸａａはＴｒｐ又はＴｙｒであり、１２
位のＸａａはＨｉｓ又はＬｙｓである）を、デルタ−
５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有す
る蛋白質をコードする新たなゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ
配列をＰＣＲにより増幅するためのプライマーとして利
用し得るオリゴヌクレオチドを調製するために規定し
た。

【００８３】Ｆ − 酵母におけるデルタ−７Ｒｅｄ蛋
白質の発現ａ）酵母において誘導可能な発現ベクターデルタ−７／
Ｖ８の構築ｐＦ２２のｃＤＮＡの非コード領域の欠失を、下記の特
異的オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅により行な
った：

【化８】5' CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3' （SE
Q ID NO:４）及び

【化９】5' CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3' （SE
Q ID NO:５）（これらは、ＢａｍＨＩ制限部位を開始コドンのすぐ上
流に導入し、ＫｐｎＩ部位を停止コドンのすぐ下流に導
入するために規定した）。

【００８４】このｃＤＮＡを、１ｎｇの「デルタ７ｒｅ
ｄ／ｐＵＣ９ＮｃＤＮＡ」から出発して、２単位のＰｆ
ｕＤＮＡポリメラーゼ及び０．２ｕＭの上記の各プライ
マーの存在下で、次の増幅条件を用いることにより増幅
した（３３サイクル）：９４℃、１０秒；５２℃、５０
秒；７４℃、９０秒（Stratagene PCRキット使用）。

【００８５】約１３００ｂｐの断片を得、次いで、制限
酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化して、C. Cullin 等
（Gene, 65, 203-217, 1988 ）により記載された E.col
i/S.cerevisiaeｐＹｅＤＰ１／８−２シャトルベクター
（Ｖ８と呼ばれる）のＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ部位に挿
入した。Ｖ８は、選択指標ＵＲＡ３を有し、酵母におけ
る発現カセットを含む（ＰＧＫ遺伝子のプロモーターＧ
ＡＬ１０／ＣＹＣ１及びターミネーター配列を含む）。
従って、この得られたベクター（デルタ−７／Ｖ８と呼
ぶ）は、ガラクトースによるデルタ−７Ｒｅｄ蛋白質の
誘導可能発現を与える。

【００８６】ｂ）デルタ−７Ｒｅｄ蛋白質の生成酵母ＦＹ１６７９株（Mata）を、上で得たデルタ−７／
Ｖ８プラスミッドで、D. Gietz等（既出）により記載さ
れた酢酸リチウム法を用いることによりトランスフォー
ムした。

【００８７】トランスフォームした酵母を、上記のＳＧ
Ｉ選択培地（但し、グルコース濃度は５ｇ／ｌ）にて、
細胞密度の飽和（ＯＤ_600nm ＝１２）が得られるまで、
２７℃で培養した。この培養物を、次いで、一容の完全
培地ＹＰ（１０ｇ／ｌのイーストエキス（Difco ）及び
１０ｇ／ｌのバクトペプトン（Difco ））を加え、次い
で、エタノール（１．５％ｖ／ｖ）を炭素源として加え
ることにより希釈する。少なくとも７×１０⁷ 細胞／ｍ
ｌの細胞濃度に達するまで成育させたときに、デルタ−
７Ｒｅｄの発現を２０ｇ／ｌの濃度のガラクトースを加
えることにより誘導した。

【００８８】この誘導を、ＳＬＩ選択用最小培地（グル
コースをガラクトース（２０ｇ／ｌ）で置き換えたＳＧ
Ｉ培地に相当）においても、２×１０⁷ 細胞／ｍｌの細
胞濃度が得られるまで行なった。

【００８９】ｃ）デルタ−５，７ステロール，デルタ−
７レダクターゼ活性のイン・ビトロ酵素試験デルタ−７Ｒｅｄ蛋白質の発現を、M. Taton等（Bioche
m. Bioph. Res. Commun., 181, 465-473, 1991）により
記載された酵素試験（但し、ＮＡＤＰＨ再生系を除き、
上記の誘導した酵母のミクロソーム又は細胞質ゾルの細
胞調製物を使用）を用いることにより示した。

【００９０】誘導した細胞の機械的破壊及び P. Urban
等（Eur. J. Biochem., 222, 843-850, 1994）により記
載された方法による超遠心分離による単離によって細胞
画分を得た。これらの細胞を集め、次いで、ＴＥ−ＫＣ
ｌ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１
ｍＭＥＤＴＡ、０．１ＭＫＣｌ）で２回洗い、０．
６ＭＴＥ−ソルビトール溶解緩衝液中に再懸濁する。
直径０．４５〜０．５ｍｍのガラスビーズ（Braun ）を
細胞懸濁液の表面を通して見えるまで加え、次いで、４
℃で５分間激しく揺り動かす。その表面上の細胞溶解物
を集め、ガラスビーズを溶解緩衝液で３回洗う。この溶
解物及び洗液を合わせ、次いで、ミトコンドリア画分を
除去するために、４℃で１３分間、２０，０００ｇで遠
心分離する。集めた上清を、４℃で１時間、１００，０
００ｇで遠心分離する。ミクロソーム画分を含むペレッ
トと細胞質ゾル画分に相当する上清をそれぞれ集める。

【００９１】得られたミクロソーム画分又は細胞質ゾル
画分を、それぞれ、基質としてツイーン８０（１．５ｇ
／ｌ）で乳化した１５０ｕｍの７−デヒドロコレステロ
ールを含む１００ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．３）中で、２ｍＭＮＡＤＰＨの存在下で、３７℃
で９０分間インキュベートする。これらのステロール
を、３容のメタノール−ジクロロメタン混合物（５０：
５０、ｖ／ｖ）の添加により抽出し、次いで、ＧＣによ
り、標準生成物との比較により分析する。

【００９２】上記のように酵母ＦＹ１６７９から得たミ
クロソーム画分（３．５ｍｇ／ｍｌの蛋白質）を用い
る、７−デヒドロコレステロール（ＲＴ＝１６．５２８
分）からのコレステロール（ＲＴ＝１５．８８７分）の
生成を図４に示す。該酵母は、デルタ−７／Ｖ８ベクタ
ーでトランスフォームし、３時間誘導したものであり、
その内因性ステロールは、一層高い保持時間を有する
（エルゴスタ５−２２ジエン３−オールのＲＴ＝１６．
６８２分；エルゴステロールのＲＴ＝１７．２４９分及
びエルゴスタ５−エン３−オールのＲＴ＝１７．６６４
分）。

【００９３】これらの結果は、一方で、デルタ−７Ｒｅ
ｄ蛋白質がトランスフォームされた酵母において発現さ
れることを示し、他方で、該蛋白質がデルタ−５，７ス
テロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有することを
示す。

【００９４】実施例２：Ｃ−７位が不飽和の酵母の内因
性ステロールのイン・ビボでの還元主要ステロールがＣ−５，７位に二重結合を有する酵母
株を、実施例１で得たデルタ−７／Ｖ８ベクターでトラ
ンスフォームし、次いで、培養して実施例１に示したよ
うに誘導した。これらの内因性ステロール（そのプロフ
ィルをＧＣにより分析する）を抽出し、調製用Ｃ１８カ
ラム（１００×４．６ｍｍ）を用いて実施例１で示した
ようにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、次いで、ＩＲ、Ｕ
Ｖ、ＭＳ及びＮＭＲにより同定した。下記の３つの株
を、それぞれ、用いた： − 実施例１に記載したＦＹ１６７９株； − ｅｒｇ５変異株（ＰＬＣ１０５１と呼ぶ）。該株
は、ステロールＣ−２２デサチュラーゼの欠乏により特
徴付けられ、ＦＹ１６７９株と S. W. Molzahn等（J. G
en. Microbiol., 72, 339-348, 1972 ）により記載され
た元のｐｏｌ５株との間の交配により構築されたもので
あり、エルゴスタ５，７−ジエン３−オールを蓄積す
る。

【００９５】− ｅｒｇ４，５二重変異株（ＰＬＣ１４
５１と呼ぶ）。該株は、ステロールＣ−２２デサチュラ
ーゼ（ｅｒｇ５）及びステロールＣ−２４（２８）レダ
クターゼ（ｅｒｇ４）の欠乏により特徴付けられ、ＦＹ
１６７９株と S. W. Molzahn等（既出）により記載され
たｐｏｌ５株との間の交配により得られたものであり、
ステロールの変異体を探すための酵母の系統的スクリー
ニングの間に自然のナイスタチン耐性を獲得しており、
エルゴスタ５，７，２４（２８）トリエン３−オールを
蓄積する。その結果生じた二重変異ｅｒｇ４、ｅｒｇ５
を有する一倍体株は、ガラクトース及び非発酵性基質の
存在下で成育し、ウラシル、トリプトファン及びヒスチ
ジンについて独立栄養性である。これらのＰＬＣ１０５
１株及びＰＬＣ１４５１株を、ＣＮＣＭに、１９９５年
２月１０日に、それぞれ、番号Ｉ−１５３６及びＩ−１
５３７にて寄託した。

【００９６】上記のトランスフォームされた３つの株か
らそれぞれ同定された主要な還元されたステロールを次
の表に示す：

【表１】

【００９７】実施例３：Ｃ−７位が還元された酵母の
内因性ステロールの制限によるイン・ビトロでのプレグ
ネノロンの生成 Wada等（Arch. Biochem. Biophys., 290, 376-380, 199
1 ）により記載されたイン・ビトロでのコレステロール
側鎖の酵素的制限試験を用いることにより、プレグネノ
ロンの生成を行なう。該試験において、実施例２で得た
Ｃ−７位が還元されたステロール２６０ｕＭを、１５０
ｕｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１００
ｍＭＮａＣｌ、０．３％ツイーン２０中で、１４０
ｎＭのアドレノドキシンレダクターゼ、１．１６ｕＭの
アドレノドキシン及び０．６８ｕＭのウシ起源のチトク
ロームＰ₄₅₀ ＳＣＣ（副腎から、例えば、D. W. Seyber
t等、 J. Biol. Chem., 254, 12088-12098, 1979に従っ
て得たもの）の存在下でインキュベートする。

【００９８】１５０ｕＭのＮＡＤＰＨの添加により反応
を引き起こす。８０分間３７℃でインキュベートした後
に、一容のメタノール−ジクロロメタン混合物（５０：
５０ｖ／ｖ）を加えることにより反応を停止させる。こ
れらのステロールを、実施例１に示したように、抽出し
てＧＣにより分析する。

【００９９】図５は、それぞれ、エルゴスタ５−エン３
−オール（図５Ａ）、エルゴスタ５，２４（２８）ジエ
ン３−オール（図５Ｂ）又はエルゴスタ５，２２ジエン
３−オール（図５Ｃ）が、チトクロームＰ₄₅₀ ＳＣＣの
基質であり、コレステロールの制限により同じ条件下で
得られるプレグネノロンのＲＴと同じＲＴを有する生成
物へと導く。

【０１００】得られた結果は、デルタ−７Ｒｅｄを発現
するトランスフォームされた酵母が、イン・ビトロでの
生物学的酸化によってプレグネノロンを生成するのに直
接に利用できるステロールを蓄積することを示してい
る。

【０１０１】実施例４：イン・ビボでプレグネノロン
又はその酢酸エステルを生成する酵母株の構築Ａ − 一倍体株ＦＹ１６７９交配型ａ（ＦＹ１６７９
Ｍａｔａ）の遺伝子座ＡＤＥ２にインテグレートされた
A.thaliana のデルタ−７Ｒｅｄの発現カセットを含む
ＥＬＲ０１株の構築ａ）インテグレートプラスミッドｐＡＤデルタ−７（ｐ
ＡＤΔ７）の構築：プラスミッドｐＡＤ７の構築を、図
６に記載したように行なった。S.cerevisiaeのＡＤＥ２
遺伝子を含むＢｇｌＩＩ断片（２２４４ｂｐ）を、プラ
スミッドｐＡＳＺ１１（A. Stotz等、 Gene, 95, 91, 19
90）から単離し、pBluescriptII KS+ ベクター（Strata
gene）の多数クローニング部位のＢａｍＨＩ部位に挿入
した。

【０１０２】得られたプラスミッド（ｐＢＳ−ＡＤＥ２
と呼ぶ）を、次いで、その単一ＳｔｕＩ部位にて線状化
して、脱リン酸化した。プロモーターＧＡＬ１０／ＣＹ
Ｃ１、デルタ−７Ｒｅｄ（ステロール７レダクターゼ）
のコードフェーズ及びターミネーターＰＧＫ（ｔＰＧ
Ｋ）を含む約２．４４ｋｂの断片を、プラスミッドデル
タ−７／Ｖ８から得た。該プラスミッドは、実施例１Ｆ
において、下記のオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用いるＰＣＲ技術により得たものである：

【化１０】5' GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 3' （SEQ ID
NO:６）及び

【化１１】5' AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 3'
（SEQ ID NO:７）（これらは、それぞれ、ｔＰＧＫの３’末端及びＵＲＡ
３遺伝子の３’末端と対合するように規定したものであ
る）。テンプレートとしてのプラスミッドデルタ−７／
Ｖ８（８０ｎｇ）、天然のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ
（Stratageneが勧める緩衝液中に１単位）及び次の増幅
条件を用いた（３５サイクル）：９５℃で１分；９５℃
で５秒；５６℃で３０秒；７０℃で４分３０秒。得られ
た増幅断片を、次いで、上で線状化したプラスミッドｐ
ＢＳ−ＡＤＥ２の鈍端にクローン化してプラスミッドｐ
ＡＤΔ７を与えた。該プラスミッドにおいて、約４７２
０ｂｐのＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ断片が、デルタ−７Ｒｅｄ
の発現カセットにより中断されたＡＤＥ２遺伝子を運
ぶ。

【０１０３】ｂ）酵母ＦＹ１６７９Ｍａｔａ株における
染色体インテグレーション：制限酵素ＮｏｔＩ及びＰｓ
ｔＩで消化したプラスミッドｐＡＤΔ７から単離したＮ
ｏｔＩ−ＰｓｔＩ断片（４７２０ｂｐ）を、D. Gietz等
（既出）により記載された酢酸リチウム法を用いるトラ
ンスフォーメーションによって酵母ＦＹ１６７９Ｍａｔ
ａに導入した。

【０１０４】相同組換えによりこの断片をインテグレー
トしたトランスフォーマントをそれらのナイスタチン耐
性によって選択した（この表現型は、酵母のデルタ−
５，７ステロールをデルタ−５ステロールに変換するデ
ルタ−７Ｒｅｄの発現によるものである）。

【０１０５】これらのトランスフォームした細胞を、グ
ルコース（２０ｇ／ｌ）を含み且つアデニン（２０ｍｇ
／ｌ）を補った実施例１に記載した完全培地ＹＰ中で２
８℃で４時間インキュベートした。次いで、それらを濃
縮し、それから、ＳＬＩ−寒天最小培地（１ｇ／ｌのバ
クトカザミノ酸；７ｇ／ｌの「yeast nitrogen bas
e」；２０ｇ／ｌのガラクトース；２０ｍｇ／ｌのアデ
ニン；２０ｇ／ｌの寒天）上にプレートし、２８℃で一
晩インキュベートしてデルタ−７Ｒｅｄ遺伝子の発現を
誘導した。ウラシルの補足のない場合は、細胞の成育が
制限される。これらのクローンを集めてグループ分けし
てからガラクトース（２０ｇ／ｌ）を含み、アデニン
（２０ｍｇ／ｌ）を補った完全培地ＹＰ皿上にプレート
した（各皿は、それぞれ、０、１、２、５、２０μｇ／
ｍｌの濃度のナイスタチンを含む）。４日目に、５μｇ
／ｍｌのナイスタチン濃度にて成育した約２０クローン
が得られた。これらのクローンの内の１２を、ウラシ
ル、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジン及びアデニ
ンを豊富（それぞれ、２０ｍｇ／ｌ）にした最小培地Ｗ
Ｏ（７ｇ／ｌのアミノ酸を含まない「yeast nitrogen b
ase 」、２０ｇ／ｌのグルコース）にて、皿上でサブク
ローン化した。

【０１０６】次いで、ＡＤＥ２遺伝子の崩壊によるアデ
ニンの栄養要求性を、ウラシル、ロイシン、トリプトフ
ァン、ヒスチジンを豊富に有するがアデニンを含まない
上記の最小培地ＷＯ上で成育しないことを観ることによ
り確認した。

【０１０７】酵母のゲノム中の発現カセットの存在を、
得られたクローンのゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅（上
記の配列SEQ ID NO:６及び７を有するプライマーを使
用）により制御した。

【０１０８】インテグレートされたデルタ−７Ｒｅｄ遺
伝子の機能性を、酵母中に蓄積したステロールを、実施
例１Ｂに記載した操作方法によってアルカリ鹸化により
抽出して、その組成のＧＣ分析により確認した（５メー
トルのＳＥ３０キャピラリーカラム（Alltech ）使
用）。分析は、クローンをガラクトースの存在下で培養
した場合には、Ｃ−７位が飽和したステロールを含む改
変されたプロフィルを示す。得られた株（ＥＬＲ０１と
呼ぶ）は、エルゴスタ５，７，２２トリエン３−オール
（エルゴステロール）（図７に示すように、初期の株Ｆ
Ｙ１６７９の主要ステロール）の代わりにエルゴスタ５
エン３−オール及びエルゴスタ５，２２ジエン３−オー
ルを蓄積する。

【０１０９】この方法で構築した株ＥＬＲ０１は、プロ
モーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１による転写制御の事実の
ために、ガラクトースの存在下で培養した場合に、デル
タ−７Ｒｅｄ遺伝子を発現する。デルタ−７Ｒｅｄの発
現ユニットは、ＡＤＥ２遺伝子と同じ転写方向を有する
にもかかわらず、グルコースの存在下で培養を行なった
場合には、プロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１のリプレ
ッションの結果、ＧＣによるステロールの組成の分析に
よってデルタ−７Ｒｅｄの発現は検出されない。

【０１１０】Ｂ − 一倍体株ＦＹ１６７９交配型アル
ファ（ｍａｔ．ａｌｐｈａ）の遺伝子座ＬＥＵ２とＳＰ
Ｌ１の間にインテグレートされた成熟型ウシアドレノド
キシンレダクターゼ（ＡＤＲｍ）用の発現カセットを含
むＣＤＲ０１株の構築。ａ）シャトルベクター E.coli - S.cerevisiaeＶ１３の
構築Ｖ１３ベクターは、ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーター
（ｐＧ／Ｃ）を含む酵母における選択指標ＵＲＡ３及び
発現カセットを有するＶ８ベクター（C. Cullin 等、既
出）に対応し、該ベクターにおいては、図８に与えたダ
イヤグラムに従って、更なるＳａｌＩ部位（Ｓａ）が多
数クローニング部位に導入されている。

【０１１１】Ｖ８ベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及
びＢａｍＨＩで消化し、ＵＲＡ３遺伝子及びＧＡＬ１０
／ＣＹＣ１プロモーターを含む得られたＢａｍＨＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片（１７２２ｂｐ）（今後、「ｕｒａ−
ｇａｌ」と呼ぶ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで
消化したｐＵＣ１８ベクター（Pharmacia ）の対応部位
の間にサブクローン化した。

【０１１２】この「ｕｒａ−ｇａｌ」断片を、次いで、
得られたｐＵＣ１８／「ｕｒａ−ｇａｌ」プラスミッド
（９５℃で３０秒間変性したもの）から次の条件を用い
るＰＣＲによって増幅した（３０サイクル）：８６℃で
５秒；９５℃で１０秒；３８℃で４０秒；５５℃で５秒
及び７４℃で２分、２単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（Boehringer）（製造者の緩衝液中）及び下記のヌクレ
オチド配列を有するプライマー各１μＭを使用：

【化１２】 5' GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 3' （SEQ ID NO:８）及び

【化１３】 5' GTAAAACGAC GGCCAGT 3' （SEQ ID NO:９）プライマーSEQ ID NO:８は、「ｕｒａ−ｇａｌ」断片と
同じＢａｍＨＩ部位GGATCC、テンプレートとハイブリダ
イズしないＢａｍＨＩ部位における３つの連続したヌク
レオチド、ＳａｌＩ部位GTCGAC及びＧＡＬ１０／ＣＹＣ
１プロモーターと相同な配列を含む。プライマーSEQ ID
NO:９は、ｐＵＣ１８の多数クローニング部位のＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位に先行する配列とマッチする。増幅後に得
られた１７２２ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片
をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化して、ＧＡＬ１０／Ｃ
ＹＣ１プロモーター（ｐＧ／Ｃ）を含む２５４ｂｐの断
片を遊離させ、次いで、それを、制限酵素ＢａｍＨＩ及
びＸｈｏＩで消化したＶ８ベクター中にサブクローン化
した。

【０１１３】生成したＶ１３ベクターは、成熟ウシアド
レノドキシンレダクターゼ（ＡＤＲｍ）、成熟ウシアド
レノドキシン（ＡＤＸｍ）及びウシチトクロームＰ₄₅₀
ＳＣＣをコードするｃＤＮＡの容易なサブクローン化を
可能にする制限部位を含む。

【０１１４】このＶ１３ベクターから出発して、Ｖ１３
−ＡＤＲベクター、Ｖ１３−ＡＤＸベクター及びＶ１３
−ＳＣＣ１０ベクターを、それぞれ、下記の方法にて調
製した：

【０１１５】ａ）Ｖ１３−ＡＤＲベクターの構築ＡＤＲｍをコードするｃＤＮＡを有する１４７８ｂｐの
ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片を、欧州特許出願ＥＰ３４０８
７８の実施例２５に記載されたプラスミッドｐＧＢＡＤ
Ｒ−２から単離し、Ｖ１３ベクターの対応部位にサブク
ローン化してＶ１３−ＡＤＲベクターを与えた。

【０１１６】ｂ）Ｖ１３−ＡＤＸベクターの構築ＡＤＸｍをコードするｃＤＮＡを有する３９０ｂｐのＳ
ａｌＩＢａｍＨＩ断片を、欧州特許出願ＥＰ３４０８
７８の実施例２３に記載されたプラスミッドｐＧＢＡＤ
Ｘ−１から単離し、Ｖ１３ベクターの対応部位にサブク
ローン化してＶ１３−ＡＤＸベクターを与えた。

【０１１７】ｃ）Ｖ１３−ＳＣＣ１０ベクターの構築Ｐ₄₅₀ ＳＣＣをコードするｃＤＮＡを有する１５５４ｂ
ｐのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、欧州特許出願ＥＰ３
４０８７８の実施例６に記載されたプラスミッドｐＧＢ
ＳＣＣ−１０から単離し、Ｖ１３ベクターの対応部位に
サブクローン化してＶ１３−ＳＣＣ１０ベクターを与え
た。

【０１１８】ｂ）インテグレートプラスミッドｐＣＤ６
２−１及びｐＣＤ６２−２の構築：プラスミッドｐＣＤ
６２−１及びｐＣＤ６２−２の構築を図９に記載したよ
うにして行なった。

【０１１９】ａ）プラスミッドｐＦＬ２６ＣＤの構築ＮｏｔＩ部位を、下記の操作方法に従って、プラスミッ
ドｐＦＬ２６（N. Bonneaud 等、 Yeast, 7, 609-615, 1
991 ）中に、ｌｅｕ２遺伝子をｓｐｌ１遺伝子（ｓｐｌ
１と呼ぶ）（C. Kolman 等、 J. Bacteriol., 175, 143
3, 1933）の５’から分離する遺伝子間領域に導入し
た：

【０１２０】ｌｅｕ２の５’末端及びＳｐｌ１の３’末
端をそれぞれ運ぶ７０４ｂｐ及び３４７ｂｐの２つのＤ
ＮＡ断片を、下記のヌクレオチド配列を有するプライマ
ーを用いてＰＣＲにより合成した：

【化１４】5' TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 3'
（SEQ ID NO:１０）及び

【化１５】 5' GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 3'（S
EQ ID NO:１１）（７０４ｂｐ断片の増幅用）及び

【化１６】 5' CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3' （SEQ
ID NO:１２）及び

【化１７】5' TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3'
（SEQ ID NO:１３）（３４７ｂｐ断片の増幅用）。

【０１２１】プライマーSEQ ID NO:１１及びSEQ ID NO:
１２は、ＮｏｔＩ部位に対応する配列GGCGGCCGを有し、
その中の３塩基はテンプレートとマッチしない。プライ
マーSEQ ID NO:１０は、ｌｅｕ２の停止コドンの５３６
ｂｐ上流に位置する配列とマッチし、プライマーSEQ ID
NO:１３は、ｓｐｌ１Δの停止コドンの１９４ｂｐ上流
に位置する配列とマッチする。

【０１２２】７０４ｂｐ及び３４７ｂｐ断片を、先ず、
プラスミッドｐＦＬ２６をテンプレートとし、ＰｆｕＤ
ＮＡポリメラーゼを酵素として用いて、供給者（Strata
gene）により記載された標準条件下で、ＰＣＲによって
増幅する。

【０１２３】得られた２つの増幅された断片は、プライ
マーSEQ ID NO:１１（７０４ｂｐ断片）及びプライマー
SEQ ID NO:１２（３４７ｂｐ断片）により生成された末
端のレベルで２０ｂｐにわたってマッチした（５’末端
から開始）（これらの２０ｂｐは、それぞれ、これらの
プライマーの各々の最初の２０ヌクレオチドに対応す
る）。

【０１２４】７０４ｂｐ（１ｎｇ）及び３４７ｂｐ（２
ｎｇ）のＤＮＡ断片の対合から生じた生成物を、プライ
マーSEQ ID NO:１０及びSEQ ID NO:１３並びに次の条件
を用いて増幅した：９５℃で１０秒、６０℃で５秒、４
５℃で１分、６５℃で５秒及び７２℃で２分を３０サイ
クル行ない、その後、７２℃で７分を１サイクル行なう
（５０μｌの反応緩衝液（Stratagene）中で、５０ｐモ
ルの各プライマー及び１単位のＰｆｕＤＮＡポリメラー
ゼを使用）。ＮｏｔＩ制限部位を含む１０３１ｂｐの増
幅された断片が得られた。この断片を、次いで、Ｂｓｔ
ＸＩ及びＮｓｉＩ酵素で消化し、得られたＮｏｔＩ部位
を含む９２０ｂｐの断片をｐＦＬ２６の初期ＢｓｔＸＩ
−ＮｓｉＩ断片の代わりに挿入してプラスミッドｐＦＬ
２６ＣＤを与えた（その地図を図９Ａに示す）。

【０１２５】ｂ）プラスミッドｐＣＤ６０の構築 − プラスミッドｐＤＰ１００３６の調製：成熟ウシア
ドレノドキシン（ＡＤＸｍ）をコードするｃＤＮＡを有
する３９０ｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を、プラス
ミッドＶ１３−ＡＤＸから単離し、次いで、プラスミッ
ドｐＴＧ１００３３の多数クローニング部位のＳａｌＩ
−ＢａｍＨＩ部位にサブクローン化した（それは、誘導
可能なプロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１及びターミネ
ーターｔｅｒＰＧＫと隣接する）。プラスミッドｐＴＧ
１００３３（その地図を図１８に示す）は、後述する操
作方法に従って調製した。該プラスミッドは、プロモー
ターＣＹＣ１及びｔｅｒＰＧＫを含む発現ベクターｐＴ
Ｇ１００３１（図１７）に対応し、その中のプロモータ
ーＣＹＣ１がプロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１で置き
換えられている。

【０１２６】こうして得られたプラスミッド（ｐＤＰ１
００３４と呼ぶ）は、ＡＤＸ発現カセット即ちＧＡＬ１
０／ＣＹＣ１及びｔｅｒＰＧＫの転写制御下でＡＤＸｍ
をコードする遺伝子を有する。従って、用語「発現カセ
ット」は、ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１及びｔｅｒＰＧＫに転
写的に依存する任意の遺伝子について使用される。

【０１２７】選択指標ＵＲＡ３及びＡＤＲ発現カセット
を有する３５９３ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を、制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミッドＶ１３−ＡＤ
Ｒから単離し、次いで、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化
したプラスミッドｐＤＰ１００３４の対応部位に挿入し
た。得られたプラスミッド（ｐＤＰ１００３６と呼ぶ）
は、マーカーＵＲＡ３により互いに分離されたＡＤＸ及
びＡＤＲ発現カセットを含む（図９Ｂ）。

【０１２８】− プラスミッドｐＣＤ６０の調製：ＡＤ
Ｒカセットを有する２７７０ｂｐのＡｆｌＩＩＩ−Ａｃ
ｃＩ断片を、プラスミッドｐＤＰ１００３６を制限酵素
ＡｆｌＩＩＩ及びＡｃｃＩで部分消化することにより単
離し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で処理して
鈍端を生成し、その鈍端でのライゲーションの後にプラ
スミッドpBlue-Script KS+（Stratagene）のＳｍａＩ部
位にサブクローン化した。得られたプラスミッド（ｐＣ
Ｄ６０と呼ぶ）において、ＡＤＲ発現カセットは、両側
をＮｏｔＩ部位にはさまれ、該部位の一つはＡｆｌＩＩ
Ｉ／ＳｍａＩライゲーション部位の２０９ｂｐ上流に位
置してサブクローン化された断片に由来し、他方は、pB
lue-Script KS+の多数クローニング部位（ＭＣＳ１）に
由来する（図９Ｂ）。

【０１２９】ｃ）プラスミッドｐＣＤ６２−１及びｐＣ
Ｄ６２−２の構築：制限酵素ＮｏｔＩで消化したプラス
ミッドｐＣＤ６０から単離した２５５８ｂｐのＮｏｔＩ
断片を、次いで、プラスミッドｐＦＬ２６ＣＤの単一Ｎ
ｏｔＩ部位にサブクローン化した。断片の挿入の方向に
よって、２種類のプラスミッド（ｐＣＤ６２−１及びｐ
ＣＤ６２−２と呼ぶ）が得られた（図９Ｃ）。

【０１３０】プラスミッドｐＣＤ６２−１において、Ａ
ＤＲ発現カセットは、ｌｅｕ２遺伝子の転写の方向に向
けられ、この向きはプラスミッドｐＣＤ６２−２におけ
る向きと逆である。

【０１３１】プラスミッドｐＣＤ６２−１を、続く構築
のために保持した。

【０１３２】ｃ）酵母ＦＹ１６７９株（Ｍａｔａｌｐｈ
ａ）における染色体インテグレーション：プラスミッド
ｐＣＤ６２−１は、ＦＹ１６７９株の染色体遺伝子座に
相同な領域を含む。これらの領域は、それぞれ、図１０
に示した１０６０ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ断片
（Ａ）、７０７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片（Ｂ）
及び６０２ｂｐのＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片（Ｃ）に対
応する。

【０１３３】このプラスミッドｐＣＤ６２−１の４８６
ｂｐのＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩ断片に対応する領域は、Ｆ
Ｙ１６７９株においては欠失し、それは、この株のロイ
シンに関する栄養要求性（ＬＥＵ２^- 株）を意味する
（R. S. Sikorski等、 Genetics, 122, 19, 1989 ）。

【０１３４】プラスミッドｐＣＤ６２−１を、制限酵素
ＸｂａＩ（その制限部位は相同領域の外に位置する）で
の消化により線状化し、次いで、ＦＹ１６７９株（Ｍａ
ｔａｌｐｈａ）に酢酸リチウム法（D. Gietz等、既出）
を用いるトランスフォーメーションにより導入した。

【０１３５】酵母による細胞のＤＮＡ修復能力（「ｇａ
ｐ修復」）及び表現型ＬＥＵ２⁺ を有する組換え体の選
択は、第１に、２つの型の組換え体を選択することを可
能にした：第１の型は、断片Ａ及びＢのレベルにおける
相同組換えの後に得られ、第２の型は、断片Ａ及びＣの
レベルにおける相同組換えの後に得られる。後者の型の
組換えだけが、表現型ＬＥＵ２⁺ の回復に加えてＡＤＲ
発現カセットのインテグレーションを与えた。

【０１３６】この第２の型のクローンを選択するため
に、ＰＣＲによるスクリーニングを、上記のプライマー
SEQ ID NO:１０及び下記のヌクレオチド配列を有するプ
ライマーを用いて、ＦＹ１６７９株（Ｍａｔａｌｐｈ
ａ）のゲノム中のＡＤＲ発現カセットの存在及び正確な
位置を確認するように行なった：

【化１８】5' TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3'
（SEQ ID NO:１４）。

【０１３７】このスクリーニングにおいて、プライマー
SEQ ID NO:１４は、専ら、ＡＤＲｍをコードする配列と
マッチし、プライマーSEQ ID NO:１０は、染色体配列
（図１０）とマッチする。

【０１３８】増幅反応を、ＦＹ１６７９株（Ｍａｔａｌ
ｐｈａ）（C. Hoffman等、 Gene, 57, 267, 1987 ）から
単離したゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）をテンプレートと
し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ、Boehringer）、
５０ｐモルの各プライマー及び３０ＰＣＲサイクル（９
５℃で１０秒、５５℃で１分、７２℃で３分）を用いて
供給者により記載された標準条件下で行なった。

【０１３９】増幅は、発現カセットがインテグレートさ
れた場合には、２．９ｋｂの対応する断片の単離へと導
いた。逆の場合には、増幅生成物は、検出されなかっ
た。

【０１４０】ＡＤＲインテグレートされた発現カセット
を含むこの方法で選択されたＦＹ１６７９株（Ｍａｔａ
ｌｐｈａ）は、ＣＤＲ０１と呼ばれた。

【０１４１】この株によるＡＤＲの発現は、実施例１Ｆ
に記載したプロトコールに従って調製した細胞質ゾルの
細胞画分から、抗−ＡＤＲ抗体により認識される蛋白質
の免疫検出によって示された。

【０１４２】ＣＤＲ０１株によって発現されたＡＤＲの
機能性を、実施例３に記載したイン・ビトロでのコレス
テロールの側鎖の酵素的制限試験（精製ＡＤＲ（０．２
８ｐモル）を、１００ｕｇの全蛋白質を含むＣＤＲ０１
株の細胞質ゾルの細胞画分で置き換えた）にて確認し
た。約２５％のコレステロールからプレグネノロンへの
生物学的変換率が認められ、これは、精製ＡＤＲで得ら
れたものに匹敵した。

【０１４３】Ｃ − A. Thaliana のデルタ−７Ｒｅｄ
とＡＤＲｍとを同時発現するＥＣ０１二倍体株の構築。
ＥＣ０１二倍体株を、上で得たＣＤＲ０１及びＥＬＲ０
１一倍体株を G. Sprague 等（Methods in Enzymology,
194, 77, 1991）により記載されたプロトコールに従っ
て交配させることによって得た：

【０１４４】ウラシル、トリプトファン及びヒスチジン
を豊富に（各２０ｍｇ／ｌ）含むがロイシンを含まない
前述した最小培地ＷＯ上での第１の選択は、二倍体クロ
ーンＬＥＵ２⁺ （ＡＤＲ発現カセットの存在を示す原栄
養体特性）の単離を可能にする。これらのクローンを、
次いで、それらの５μｇ／ｍｌナイスタチンに対する耐
性（デルタ−７Ｒｅｄの発現カセットの存在を示す耐性
特性）について、前記の固体合成ＳＬＩ−寒天培地上で
試験した。

【０１４５】ＥＣ０１と呼ばれる株が、この方法におい
て、ナイスタチン耐性のクローンから任意に単離され
た。

【０１４６】Ｄ − プレグネノロン及びプレグネノロ
ン３−アセテートを生成するＥＣ０１／ｐＣＤ６３株の
構築。ａ）発現プラスミッドｐＣＤ６３の構築プラスミッドｐＣＤ６３の構築を、図１１に記載したよ
うに行なった。

【０１４７】ＡＤＸ発現カセット、選択指標ＵＲＡ３及
びＡＤＲ発現カセットを含む４９６１ｂｐのＮｏｔＩ断
片を、上で調製したプラスミッドｐＤＰ１００３６から
単離して、制限酵素ＮｏｔＩで消化し、次いで、プラス
ミッドｐＦＬ４５Ｌ（N. Bonneaud 等、 Yeast, 7, 609,
1991 ）の多数クローニング部位のＮｏｔＩ部位にクロ
ーン化した。こうして得られたベクター（ｐＤＰ１００
３７と呼ぶ）を図１１に示す。

【０１４８】一方において、プラスミッドｐＤＰ１００
３７を、ＡＤＲｍをコードする遺伝子内に制限部位があ
る酵素Ｔｔｈ１１１Ｉで消化して線状化した。

【０１４９】他方において、Ｐ₄₅₀ ＳＣＣの発現カセッ
ト及びＵＲＡ３マーカーの５’末端を含む３４７６ｂｐ
のＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、前に得たプラスミッ
ドＶ１３−ＳＣＣ１０から精製して制限酵素ＰｖｕＩＩ
及びＥｃｏＲＶで消化した。

【０１５０】これらの別々に得た２種類の線状ＤＮＡ
は、図１１Ａに示すように、一方で遺伝子ＵＲＡ３の
５’末端及びＧＡＬ１０／ＣＹＣ１に対応し、他方で、
ｔｅｒＰＧＫに対応する相同領域を有する。

【０１５１】これらの２種類の断片を、次いで、酢酸リ
チウム法（D. Gietz等、既出）を用いる同時トランスフ
ォーメーションによって酵母ＦＹ１６７９株（Ｍａｔ
ａ）に導入した。

【０１５２】続く原栄養性組換え体のウラシル及びトリ
プトファン（ＵＲＡ３⁺ 、ＲＴＰ１⁺ ）についての選択
は、制限酵素Ｔｔｈ１１１Ｉでの消化により生じた二本
鎖破壊が、相同組換えによる発現カセットＰ₄₅₀ ＳＣＣ
のインテグレーションの結果修復されたクローンの単離
を与えた。

【０１５３】組換え体（ＵＲＡ３⁺ 、ＲＴＰ１⁺ ）の選
択を、ロイシン、ヒスチジン及びロイシンに富む（各２
０ｍｇ／ｌ）がウラシル及びトリプトファンを含まない
最小培地ＷＯ上で行なった。５０の集めたクローンから
出発して、全ＤＮＡを C. Hoffman 等（Gene, 57, 267,
1987 ）により記載された方法によって抽出し、次い
で、エレクトロポレーションにより大腸菌ＸＬ１−Ｂｌ
ｕｅ株（Stratagene）に導入した。「ｇａｐ修復」によ
り生成したプラスミッドによりトランスフォームしたク
ローンを、５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む豊富な培
地ＬＢ（トリプトファン１％、イーストエキス０．５
％、ＮａＣｌ１％）にて選択した。選択したクローン
の１つから出発して、ｐＣＤ６３と呼ばれるプラスミッ
ドを、J. Sambrook 等、 Molecular Cloning, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, 1989に記載された方法に
従って抽出した。得られたプラスミッドｐＣＤ６３は、
図１１Ｂに示したように、選択指標ＵＲＡ３により分離
された発現カセットＡＤＸ及びＰ₄₅₀ ＳＣＣを含む。

【０１５４】ｂ）ＥＣ０１株のプラスミッドｐＣＤ６３
によるトランスフォーメーションプラスミッドｐＣＤ６３を、酢酸リチウム法（D. Gietz
等、既出）によるトランスフォーメーションにより上で
得たＥＣ０１株に導入した。トランスフォームした酵母
を、次いで、ウラシル、トリプトファン、アデニン及び
ロイシンを含まないがヒスチジン（２０ｍｇ／ｌ）を補
った前述の最小培地ＷＯ上で培養した。

【０１５５】ＥＣ０１／ｐＣＤ６３と呼ばれる株をこの
方法で単離した。この株の試料（ＥＣ０１／ｐＣＤ６３
として言及する）を、ＣＮＣＭに、１９９５年２月１０
日に、番号Ｉ−１５３８で寄託した。

【０１５６】ｃ）プレグネノロン及びプレグネノロン３
−アセテートのイン・ビボでの産生。ＥＣ０１／ｐＣＤ６３株を、３リットルのエルレンマイ
ヤーフラスコにて、グルコース濃度が５ｇ／ｌの実施例
１Ａに記載したＳＧＩ選択培地中で、定常成育期（ＤＯ
６００＝１２〜１３）に達するまで、好気条件（１３０
ｒ／分）下で、２８℃で培養した。次いで、培養物を、
上記の完全培地ＹＰ一容の添加と、続く炭素源としての
エタノール（０．５％ｖ／ｖ）の添加によって希釈す
る。新たな定常成育期に到達したとき（ＤＯ６００＝１
２〜１３）に、ガラクトースを、それぞれプロモーター
ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１の制御下にあるＡＤＸｍ、ＡＤＲ
ｍ、Ｐ₄₅₀ ＳＣＣ及びデルタ−７Ｒｅｄをコードする遺
伝子の発現を同時に誘導するために、濃溶液（５００ｇ
／ｌ）の形態で培養に添加する。

【０１５７】これらの４つの遺伝子の同時発現は、それ
ぞれ細胞及び培養上清に蓄積したステロールの下記の操
作方法による分析により示される：

【０１５８】この培養の５０ｍｌの試料を、誘導の９時
間及び２４時間後に採取する。各試料を、細胞を培養培
地から分離するために遠心分離する（４０００ｇ、１０
分、４℃）。

【０１５９】一方において、これらの細胞を、実施例１
Ｆに記載した方法により、ガラスビーズの存在下で機械
的破壊によって溶解させる。こうして得られた溶解物か
ら出発し、次いで、細胞内ステロールを一容のヘキサン
の添加によって抽出する。

【０１６０】他方において、培養培地中に存在するステ
ロールを、一容のヘキサンの添加によって直接抽出す
る。

【０１６１】抽出したステロールの組成を、実施例１に
記載したように、ＧＣによって、標準生成物と比較して
分析する。

【０１６２】９時間又は２４時間の誘導の後に得られた
結果を、それぞれ、図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。

【０１６３】９時間の誘導の後、図１２Ａは、下記を示
す： − 細胞溶解物において、存在する主要化合物は、標準
プレグネノロンアセテート（ＲＴ＝１１．８分）と同じ
保持時間を有し、１つの非常に弱いピークがプレグネノ
ロンの保持時間（ＲＴ＝９．９分）に存在するだけであ
る。Ｃ−７位が還元されたこの酵母の内因性ステロール
（エルゴスタ５−エン３−オール及びエルゴスタ５，２
２ジエン３−オール）が少量、それぞれ、ＲＴ＝１８分
及びＲＴ＝１７分にて同定される。分析前の細胞溶解物
のアルカリ鹸化は、プレグネノロンと同時移動する主要
化合物の存在へと導く。これは、１１．８分のＲＴを有
する蓄積した化合物がプレグネノロンアセテートに相当
することの確認を与える。

【０１６４】− 培養培地において、プレグネノロン又
はそのアセテートは、有意に、存在しない。

【０１６５】２４時間の誘導の後、図１２Ｂは、下記を
示す： − 細胞溶解物において、少量のプレグネノロン（ＲＴ
＝１０．２分）及びプレグネノロンアセテート（ＲＴ＝
１２分）並びにこの酵母の還元された内因性ステロール
（ＲＴ＝１７分及びＲＴ＝１８分）が存在する。コレス
テロール（ＲＴ＝１６．２分）は、抽出前に加えた内部
標準である。

【０１６６】− 培養培地において、主に存在するのは
プレグネノロンアセテートであり、プレグネノロンは、
少量である。

【０１６７】対照用プラスミッド例えば前述のｐＦＬ４
５ＬでトランスフォームしたＥＣ０１株を用いて並行し
て行なった実験は、遊離のプレグネノロン又はアセテー
ト形態のプレグネノロンに対応するピークを示さなかっ
た。

【０１６８】この方法で行なったステロールの同定は、
酵母ＥＣ０１／ｐＣＤ６３株が、外因性ステロール源の
不在において、ガラクトースの存在下での誘導の後、９
時間の誘導の後の主要な産生を伴って、プレグネノロン
及びプレグネノロンアセテートを蓄積したことを示す。

【０１６９】これらの結果は、一方において、ＥＣ０１
株のＣ−７位が還元された内因性ステロールの効果的な
流動化を、他方において、内因性ステロールの側鎖の制
限反応のカップリングの極度の効果を示す。

【表２】

【０１７０】実施例４の準備：プラスミッドｐＴＧ１０
０３３の構築１．新しい多数クローニング部位を有するｐＵＣ１９の
誘導体：クローニングベクターＭ１３ｍｐ１９（C. Yan
ish-Peron 等、 Gene, 33, 103,1985 ）を、下記のオリ
ゴヌクレオチドを用いて突然変異誘発し：

【化１９】5' GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 3'
SEQ ID NO:１５ＮｏｔＩ部位を切り詰めたｌａｃＩ遺伝子の配列中に導
入して、プラスミッドＭ１３ＴＧ７２４を与えた。

【０１７１】次いで、ＥｃｏＲＩ、ＳｎａＢＩ及びＮｏ
ｔＩ部位を含む「ポリリンカー」を、下記のオリゴヌク
レオチドを用いてプラスミッドＭ１３ＴＧ７２４のＥｃ
ｏＲＩ部位に導入し：

【化２０】5' AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3'
SEQ ID NO:１６及び

【化２１】5' AATTCATACG TACGCGGCCG C 3'
SEQ ID NO:１７プラスミッドＭ１３ＴＧ７２４４を与えた（増幅段階に
おいて、インサートの改変が認められた）。プラスミッ
ドＭ１３ＴＧ７２４４のインサートは、下記のヌクレオ
チド配列を有する：

【化２２】GAATTC ATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCACTGGCCGT （式中、ＥｃｏＲＩ、ＳｎａＢＩ及びＳｓｔＩ部位に下
線を引き、又、右端の９ヌクレオチドは、ｐＵＣ１９の
ｌａｃＺ配列である）。制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｓｔ
ＩによるプラスミッドＭ１３ＴＧ７２４４の消化の後
に、ＭｌｕＩ及びＡｖｒＩＩ部位を含む「ポリリンカ
ー」を、下記のオリゴヌクレオチドを用いて導入した：

【化２３】5' CAACGCGTCC TAGG 3'
SEQ ID NO:１８

【化２４】5' AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3'
SEQ ID NO:１９。

【０１７２】酵素ＰｖｕＩＩでの消化の後に、得られた
ＰｖｕＩＩ断片を、ｐＵＣ１９（C.Yanish-Porch 等、
既出）にてサブクローン化してプラスミッドｐＴＧ７４
５７（図１３）を与えた。

【０１７３】２．ＰＧＫターミネーターのサブクローン
化ｐＵＣ１９を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消
化し、下記のオリゴヌクレオチドを用いて、新たな「ポ
リリンカー」ＢａｍＨＩＳｓｔＩを導入した：

【化２５】 5' GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3' SEQ
ID NO:２０、

【化２６】 5' AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 3' SEQ ID NO:２１、

【化２７】 5' CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 3' SEQ
ID NO:２２及び

【化２８】5' AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3'
SEQ ID NO:２３。

【０１７４】この方法で得たプラスミッドｐＴＧ７４５
３（図１４）を、次いで、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｓ
ｔＩで消化した。ＢａｍＨＩとＳｓｔＩの間の「ポリリ
ンカー」の部位を、上で得たプラスミッドｐＴＧ７４５
７の誘導体に導入して、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｓｔ
Ｉで消化した。得られた新たなプラスミッドは、Ｐｖｕ
ＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＳｍａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳｓｔＩ（＝Ｓａｃ
Ｉ）、ＭｌｕＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｎａＢ
Ｉ、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＰｖｕＩ部位を含む。

【０１７５】この新しいプラスミッドを、制限酵素Ｂｇ
ｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＰＧＫプロモータ
ー（R. A. Hitzeman等、 Nucleic Acids Res., 10, 779
1, 1982）を含むＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を前
者に挿入してプラスミッドｐＴＧ１００１４（図１５）
を与えた。

【０１７６】３．プロモーターのサブクローニング：ａ）ＣＹＣ１プロモータープラスミッドｐＴＧ７４５３のＢａｍＨＩとＳｓｔＩの
間の「ポリリンカー」の部位を、上で同定したプラスミ
ッドｐＴＧ７４５７の誘導体に導入した。得られた新し
いプラスミッドを制限酵素ＳｎａＢＩで消化し、次い
で、ファージｆ１の複製オリジンを含むプラスミッドｐ
ＥＭＢＬ８（L. Dente等、 Nucleic AcidsRes., 11, 164
5, 1983）の４５６ｂｐのＲｓａＩ−ＤｒａＩ断片を導
入してプラスミッドｐＴＧ７５０３を与えた。

【０１７７】欧州特許出願ＥＰ０３４０３７８の実施例
６において調製したプラスミッドｐＧＢＳＣＣ−９の
０．７８ｋｂのＢａｍＨＩＨｉｎｄＩＩＩ断片（S.ce
revisiaeのＣＹＣ１プロモーター、「ポリリンカー」及
び K.lactis のラクターゼターミネーターを含む）を、
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラ
スミッドｐＴＧ７５０３中にサブクローン化してプラス
ミッドｐＴＧ１０００４（図１６）を与えた。

【０１７８】次いで、ＣＹＣ１プロモーターのＸｈｏＩ
及びＭｌｕＩ部位を、下記のオリゴヌクレオチドを用い
る、プラスミッドｐＴＧ１０００４の二本鎖ＤＮＡの位
置指定突然変異導入法によって除去した：

【化２９】 5' GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 3' SEQ ID NO:２４。こうして得られたプラスミッドｐＴＧ１０００５を、次
いで、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化し、それか
ら、ＭｌｕＩ部位を、下記のオリゴヌクレオチドを用い
て導入して：

【化３０】5' TCGACGGACG CGTGG 3'
SEQ ID NO:２５及び

【化３１】5' TCGACCACGC GTCC 3'
SEQ ID NO:２６プラスミッドｐＴＧ１０００６を与えた。

【０１７９】ｂ）ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモータープラスミッドｐＹｅＤＰ１／８−２（C. Cullin 等、 Ge
ne, 203, 1988 ）を、制限酵素ＸｈｏＩで開いた。生成
した粘着末端を、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を
用いて埋め、次いで、そのプラスミッドを再結合（reli
gated ）した。こうして得られたプラスミッドｐＴＧ１
００１０（ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターは、もは
やＸｈｏＩ部位を含まない）を、ＰＣＲ増幅のためのテ
ンプレートとして用いる。

【０１８０】４．発現ベクターｐＴＧ１００３１の構築ｌａｃＺをコードする配列の残りの部分を、下記のオリ
ゴヌクレオチドを用いる位置指定突然変異導入法によ
り、プラスミッドｐＴＧ７５０３において除去して：

【化３２】 5' TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 3' SEQ
ID NO:２７プラスミッドｐＴＧ７５４９を与えた。

【０１８１】プラスミッドｐＴＧ７５４９中に存在する
ＬａｃＺプロモーターを、次いで、下記のオリゴヌクレ
オチドを用いて削除して：

【化３３】5' GGCCGCAAAA CCAAA 3'
SEQ ID NO:２８及び

【化３４】5' AGCTTTTGGT TTTGC 3'
SEQ ID NO:２９（これらは、予め制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
で消化したプラスミッド中に挿入されており、２つの部
位を回復する）プラスミッドｐＴＧ７５５３を与えた。

【０１８２】ＣＹＣ１プロモーターを含むＢａｍＨＩ
ＭｌｕＩ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＭｌｕＩで消
化したプラスミッドｐＴＧ１０００６から得て、ＰＧＫ
プロモーターを含むＭｌｕＩＨｉｎｄＩＩＩ断片を、
制限酵素ＭｌｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラス
ミッドｐＴＧ１００１５から単離した。これらの２種の
断片をライゲートし、得られたライゲーション生成物
を、制限酵素ＭｌｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで予め消化し
たプラスミッドｐＴＧ７５５３に挿入した。

【０１８３】下記のオリゴヌクレオチド：

【化３５】5' GATCTATCGA TGCGGCCGCG 3'
SEQ ID NO:３０を下記のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせたも
の

【化３６】5' CGCGCGCGGC CGCATCGATA 3'
SEQ ID NO:３１（該ハイブリッド分子は、ＣｌａＩ及びＮｏｔＩ部位を
含むＢａｍＨＩＭｌｕＩ「リンカー」を構成する）を
加えて、ライゲートして発現ベクターｐＴＧ１００３１
（図１７）を与えた。

【０１８４】プラスミッドｐＹｅＤＰ１／８−２から上
で得たＰＣＲにより増幅した断片を制限酵素ＣｌａＩ及
びＳａｌＩで消化し、次いで、予め同じ制限酵素で消化
したプラスミッドｐＴＧ１００３１に導入してプラスミ
ッドｐＴＧ１００３３（図１８）を与えた。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】酵母ＦＹ１６７９中のA.thalianaライブラリ
ーのスクリーニングにより得られたナイスタチン耐性の
クローンＦ２２から抽出した全ステロールのプロフィル
を示す図である。２０５ｎｍ若しくは２８５ｎｍでのＲ
Ｐ−ＨＰＬＣにより、トランスフォームしてない酵母Ｆ
Ｙ１６７９と比較して、分析を行なう。

【図１Ｂ】酵母ＦＹ１６７９中のA.thalianaライブラリ
ーのスクリーニングにより得られたナイスタチン耐性の
クローンＦ２２から抽出した全ステロールのプロフィル
を示す図である。２０５ｎｍ若しくは２８５ｎｍでのＧ
Ｃにより、トランスフォームしてない酵母ＦＹ１６７９
と比較して、分析を行なう。

【図２】プラスミッドｐＦ２２のＮｏｔＩ断片の制限地
図及び配列決定のストラテジーを示す図である。

【図３Ａ】ｃＤＮＡデルタ−７Ｒｅｄのヌクレオチド配
列（SEQ ID NO:１）及び対応するアミノ酸配列（SEQ ID
NO:２）を示す図である。

【図３Ｂ】ｃＤＮＡデルタ−７Ｒｅｄのヌクレオチド配
列（SEQ ID NO:１）及び対応するアミノ酸配列（SEQ ID
NO:２）を示す図（続き）である。

【図３Ｃ】ｃＤＮＡデルタ−７Ｒｅｄのヌクレオチド配
列（SEQ ID NO:１）及び対応するアミノ酸配列（SEQ ID
NO:２）を示す図（続き）である。

【図３Ｄ】ｃＤＮＡデルタ−７Ｒｅｄのヌクレオチド配
列（SEQ ID NO:１）及び対応するアミノ酸配列（SEQ ID
NO:２）を示す図（続き）である。

【図３Ｅ】ｃＤＮＡデルタ−７Ｒｅｄのヌクレオチド配
列（SEQ ID NO:１）及び対応するアミノ酸配列（SEQ ID
NO:２）を示す図（続き）である。

【図４】誘導可能発現ベクター「デルタ−７／Ｖ８」で
トランスフォームしたＦＹ１６７９のミクロソーム画分
のデルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクター
ゼ活性のイン・ビトロでの測定を示す図である。ＧＣを
用いて分析を行ない、内因性ステロール５，２２ジエン
３−オール（ＲＴ＝１６．６８２）；エルゴステロール
（ＲＴ＝１７．２４９）；エルゴスタ５−エン３−オー
ル（ＲＴ＝１７．６６４）の存在下での基質７−デヒド
ロコレステロール（ＲＴ＝１６．５２８）のコレステロ
ール（ＲＴ＝１５．８８７）へのトランスフォームを示
す。

【図５Ａ】エルゴスタ５−エン３−オールの制限による
イン・ビトロでのプレグネノロンの生成（デルタ−７Ｒ
ｅｄを発現するトランスフォームした酵母から精製し、
次いで、Ｐ₄₅₀ ＳＣＣ、ＡＤＸ及びＡＤＲとインキュベ
ートする）を示す図である。コレステロールの対照制限
と比較したＧＣにより分析を実施する。

【図５Ｂ】エルゴスタ５，２４（２８）ジエン３−オー
ルの制限によるイン・ビトロでのプレグネノロンの生成
（デルタ−７Ｒｅｄを発現するトランスフォームした酵
母から精製し、次いで、Ｐ₄₅₀ ＳＣＣ、ＡＤＸ及びＡＤ
Ｒとインキュベートする）を示す図である。コレステロ
ールの対照制限と比較したＧＣにより分析を実施する。

【図５Ｃ】エルゴスタ５，２２ジエン３−オールの制限
によるイン・ビトロでのプレグネノロンの生成（デルタ
−７Ｒｅｄを発現するトランスフォームした酵母から精
製し、次いで、Ｐ₄₅₀ ＳＣＣ、ＡＤＸ及びＡＤＲとイン
キュベートする）を示す図である。コレステロールの対
照制限と比較したＧＣにより分析を実施する。

【図６Ａ】デルタ−７Ｒｅｄ（ステロールデルタ−７レ
ダクターゼ）をコードするｃＤＮＡのインテグレーショ
ンを可能にするインテグレートプラスミッドｐＡＤデル
タ−７の構築を示す図である。

【図６Ｂ】デルタ−７Ｒｅｄ（ステロールデルタ−７レ
ダクターゼ）をコードするｃＤＮＡのインテグレーショ
ンを可能にするインテグレートプラスミッドｐＡＤデル
タ−７の構築を示す図（続き）である。

【図７】ＦＹ１６７９株及びインテグレートされたＥＬ
Ｒ０１株（ガラクトースの存在下で培養）のアルカリ鹸
化により抽出した全ステロールのＧＣによる分析を示す
図である。

【図８】多数クローニング部位に単一ＳａｌＩ（Ｓａ）
を含むシャトルベクターE.coli-S.cerevisiae Ｖ１３の
構築を示す図式表示である。

【図９Ａ】ＡＤＲ発現カセットのｌｅｕ２とｓｐｌ１デ
ルタとの遺伝子間領域への挿入を可能にするインテグレ
ートプラスミッドｐＣＤ６２−１及びｐＣＤ６２−２の
構築の段階を示す図である。ＭＣＳ１及びＭＣＳ２：多数クローニング部位

【図９Ｂ】ＡＤＲ発現カセットのｌｅｕ２とｓｐｌ１デ
ルタとの遺伝子間領域への挿入を可能にするインテグレ
ートプラスミッドｐＣＤ６２−１及びｐＣＤ６２−２の
構築の段階を示す図（続き）である。ＭＣＳ１及びＭＣＳ２：多数クローニング部位

【図９Ｃ】ＡＤＲ発現カセットのｌｅｕ２とｓｐｌ１デ
ルタとの遺伝子間領域への挿入を可能にするインテグレ
ートプラスミッドｐＣＤ６２−１及びｐＣＤ６２−２の
構築の段階を示す図（続き）である。ＭＣＳ１及びＭＣＳ２：多数クローニング部位

【図１０】ＣＤＲ０１株の構築ストラテジーを示す図で
ある。

【図１１Ａ】２つの発現カセットＡＤＸ及びＰ₄₅₀ ＳＣ
Ｃを含む発現プラスミッドｐＣＤ６３の構築の段階を示
す図である。

【図１１Ｂ】２つの発現カセットＡＤＸ及びＰ₄₅₀ ＳＣ
Ｃを含む発現プラスミッドｐＣＤ６３の構築の段階を示
す図（続き）である。

【図１２Ａ】ガラクトースにより９時間にわたって誘導
した後に、細胞（細胞溶解物）又は培養培地（ＥＣ０１
／ｐＣＤ６３から単離）から抽出したステロールのＧＣ
による分析を示す図である。

【図１２Ｂ】ガラクトースにより２４時間にわたって誘
導した後に、細胞（細胞溶解物）又は培養培地（ＥＣ０
１／ｐＣＤ６３から単離）から抽出したステロールのＧ
Ｃによる分析を示す図である。

【図１３】プラスミッドｐＴＧ７４５７の構造を示す図
である。

【図１４】プラスミッドｐＴＧ７４５３の構造を示す図
である。

【図１５】プラスミッドｐＴＧ１００１４の構造を示す
図である。

【図１６】プラスミッドｐＴＧ１０００４の構造を示す
図である。

【図１７】プラスミッドｐＴＧ１００３１の構造を示す
図である。

【図１８】プラスミッドｐＴＧ１００３３の構造を示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｐ 33/00 Ｃ１２Ｐ 33/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/573 33/573 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 33/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者エリク・ルカンフランス国カシャン、アブニュ・カルノ、 70 (72)発明者ドニ・ポンポンフランス国ジフ・スュール・イベット、プラス・デュ・マルシェ・ヌフ、９ (54)【発明の名称】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有するＡ．Ｔｈａｌｉａｎａの蛋白質をコードするＤＮＡ配列、デルタ７−Ｒｅｄ蛋白質、製造方法、トランスフォームした酵母株、及び利用

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７
レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする配列を含
む核酸配列であって、該核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであ
る、上記の核酸配列。
【請求項２】核酸がｃＤＮＡである、請求項１に記載
の核酸配列。
【請求項３】コード配列がデルタ−５，７ステロー
ル，デルタ−７レダクターゼ活性を有する A.thaliana
蛋白質をコードし、下記のSEQ ID NO:１のヌクレオチド
配列を有する、請求項２に記載のｃＤＮＡ配列：【化１】並びに、この配列の対立遺伝子変異体。
【請求項４】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７
レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードし、且つ平均
的緊縮条件若しくは高緊縮条件下で請求項３に規定した
配列とハイブリダイズし又はこの配列と約６０％以上の
配列同一性を有するＤＮＡ配列。
【請求項５】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７
レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードし、且つ下記
のSEQ ID NO:３のアミノ酸配列を有するコンセンサス配
列をコードするプライマーオリゴヌクレオチドを用いる
ＰＣＲ技術により増幅し得るＤＮＡ配列：【化２】（式中、７位のＸａａはＴｒｐ又はＴｙｒであり、１２
位のＸａａはＨｉｓ又はＬｙｓである）。
【請求項６】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７
レダクターゼ活性を有し、且つ下記のSEQ ID NO:２のア
ミノ酸配列を有する A.thaliana 蛋白質：【化３】並びに、この配列の対立遺伝子変異体。
【請求項７】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７
レダクターゼ活性を有し、且つSEQ ID NO:２のアミノ酸
配列を有し、且つデルタ−７Ｒｅｄと呼ばれる A.thali
ana 蛋白質。
【請求項８】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７
レダクターゼ活性を有し、請求項７に規定したSEQ ID N
O:２の配列と約６０％以上の配列同一性を有するアミノ
酸配列を有する蛋白質。
【請求項９】デルタ−５，７ステロール，デルタ−７
レダクターゼ活性を有し、且つ請求項７に規定した A.t
haliana デルタ−７Ｒｅｄ蛋白質と交差免疫反応性を有
する蛋白質。
【請求項１０】請求項１〜５の何れか１つに記載のＤ
ＮＡ配列を含む宿主細胞における発現により得られるデ
ルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性
を有する蛋白質。
【請求項１１】 SEQ ID NO:２のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ配列を含む宿主細胞における発現により得ら
れるデルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクター
ゼ活性を有する A.thaliana 蛋白質。
【請求項１２】宿主細胞が酵母である、請求項１０又
は１１に記載の蛋白質。
【請求項１３】請求項６〜１２の何れか１つに記載の
デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活
性を有する蛋白質に対する抗体。
【請求項１４】請求項１〜５の何れか１つに記載のＤ
ＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項１５】請求項１４に記載のベクターによりト
ランスフォームされた宿主細胞。
【請求項１６】デルタ−５，７ステロール，デルタ−
７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸の
微生物におけるクローニング方法であって、下記より選
択するスクリーニング方法を含む、該クローニング方法 − 微生物のナイスタチン耐性又は毒性がＣ−７位に不
飽和を有するステロールの存在に依存する類似化合物に
対する耐性、 − 核酸の、SEQ ID NO:１の配列のヌクレオチド配列と
のハイブリダイゼーション、 − ランダムに単離したＤＮＡ配列からのデータ処理技
術を利用することによる核酸の同定、 − 蛋白質の直接的発現及びその後の、SEQ ID NO:２の
アミノ酸配列を有する蛋白質に対する抗体を用いる免疫
検出。
【請求項１７】請求項１６に規定した方法によって得
られたＤＮＡ又はＲＮＡ核酸配列。
【請求項１８】請求項１７に記載のＤＮＡ配列を含む
ベクターによりトランスフォームされた宿主細胞。
【請求項１９】宿主が酵母又は糸状菌である、請求項
１５又は１８に記載のトランスフォームされた宿主細
胞。
【請求項２０】請求項１５、１８又は１９の何れか１
つに記載のトランスフォームされた宿主細胞を培養し
て、発現された蛋白質を単離する、デルタ−５，７ステ
ロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質の
製造方法。
【請求項２１】宿主細胞がトランスフォームされた酵
母であり、該酵母において、コードＤＮＡ配列が酵母プ
ロモーターの制御下に置かれている、請求項２０に記載
の方法。
【請求項２２】Ｃ−７位が不飽和のステロールのイン
・ビトロでの還元方法であって、還元すべきステロール
を請求項２０又は２１に従って得られた蛋白質とインキ
ュベートし、得られる還元されたステロールを適宜単離
する、上記の還元方法。
【請求項２３】Ｃ−７位が不飽和の外因性ステロール
のイン・ビボでの還元方法であって、ステロールを、請
求項１５、１８又は１９の何れか１つに記載のトランス
フォームされた宿主細胞とインキュベートし、得られる
還元されたステロールを適宜単離する、上記の還元方
法。
【請求項２４】Ｃ−７位が不飽和の内因性ステロール
のイン・ビボでの還元方法であって、請求項１９に記載
のトランスフォームされた宿主株を培養し、蓄積する還
元されたステロールを適宜単離する、上記の方法。
【請求項２５】請求項２２〜２４の何れか１つに記載
のイン・ビトロ又はイン・ビボでの還元方法であって、
得られる還元されたステロールがコレステロールの側鎖
の制限酵素（Ｐ₄₅₀ ＳＣＣ）の基質である、該還元方
法。
【請求項２６】請求項２５に記載のイン・ビボでの還
元方法であって、還元すべき内因性ステロールがエルゴ
スタ５，７ジエン３−オール、エルゴスタ５，７，２４
（２８）トリエン３−オール若しくはエルゴスタ５，
７，２２トリエン３−オール又はこれらの混合物であ
る、上記の還元方法。
【請求項２７】プレグネノロンの製造方法であって、
請求項１９に記載のトランスフォームされた宿主細胞を
培養し、蓄積した内因性ステロール又はＣ−７位が還元
されたステロールを適宜単離し、これらの還元されたス
テロールをＰ₄₅₀ ＳＣＣ及び、適宜、アドレノドキシン
レダクターゼ（ＡＤＲ）及びアドレノドキシン（ＡＤ
Ｘ）の存在下でインキュベートし、得られるプレグネノ
ロンを適宜単離する、上記の製造方法。
【請求項２８】宿主細胞が酵母である、請求項２７に
記載の方法。
【請求項２９】プレグネノロンの製造方法であって、
デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ、
Ｐ₄₅₀ ＳＣＣ活性及び適宜ＡＤＲ及びＡＤＸ活性を有す
る蛋白質の同時発現を与える１つ以上のベクターにより
トランスフォームされた酵母を培養し、遊離の若しくは
エステル化したプレグネノロンを適宜単離する、上記の
方法。
【請求項３０】デルタ−５，７ステロール，デルタ−
７レダクターゼ、Ｐ₄₅₀ ＳＣＣ、ＡＤＲ及びＡＤＸ活性
を有する蛋白質を同時発現するトランスフォームされた
酵母を培養する、請求項２９に記載のプレグネノロンの
製造方法。
【請求項３１】デルタ−５，７ステロール，デルタ−
７レダクターゼ活性を有する蛋白質が A.thaliana デル
タ−７Ｒｅｄ蛋白質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】酵母株がＥＣ０１／ｐＣＤ６３株であ
る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】デルタ−５，７ステロール，デルタ−
７レダクターゼ、Ｐ₄₅₀ ＳＣＣ、ＡＤＲ及びＡＤＸ活性
を有する蛋白質を同時発現して、遊離の又はエステル化
したプレグネノロンを蓄積するトランスフォームされた
酵母株。
【請求項３４】デルタ−５，７ステロール，デルタ−
７レダクターゼ活性を有する蛋白質が A.thaliana デル
タ−７Ｒｅｄ蛋白質である、請求項３３に記載の酵母
株。
【請求項３５】ＥＣ０１／ｐＣＤ６３と呼ばれる、請
求項３４に記載の酵母株。
【請求項３６】デルタ−５，７ステロール，デルタ−
７レダクターゼの先天的欠乏を診断するためのプローブ
として用いられる、請求項１７に記載のヒトＤＮＡ配
列。
【請求項３７】デルタ−５，７ステロール，デルタ−
７レダクターゼの欠乏を検出する方法であって、ヒトゲ
ノムＤＮＡを含む試料の請求項３６に記載のプローブと
の標準ハイブリダイゼーション条件下でのインキュベー
ション及びプローブのゲノムＤＮＡへの固定又は該固定
のないこと表示を含み、該固定のないこと又は後者の還
元がデルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクター
ゼの先天的欠乏を示す、上記の方法。