JPH08208646A - 化合物ｂ９００６３ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】高血圧症、心臓血管系疾患、脳血管系疾患など
の予防薬および／または治療薬の提供。 【解決手段】式（Ｉ） 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はエンドセリン変換酵
素阻害作用を有する新規化合物Ｂ９００６３及びその製
造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】エンドセリン（ＥＴ）にはＥＴ−１、Ｅ
Ｔ−２、ＥＴ−３のisopeptideがあることが知られてい
る(A. Inoue 等, Proc. Natl. Acad. Sci.,86, 2863-28
67 (1989))。そのうちＥＴ−１は、生体内においてビッ
グエンドセリン−１（ＢｉｇＥＴ−１）にホスホラミド
ン感受性中性金属プロテアーゼ、すなわちエンドセリン
変換酵素（Endothelin-converting Enzyme: ＥＣＥ）が
働くことにより生合成される２１個のアミノ酸からなる
ペプチドである（M. Yanagisawa 等, Nature,332, 411-
415 (1988); T. Sawamura等, Biochem. Biphys. Res. C
ommun., 162,1287-1294 (1989)) 。

【０００３】ＥＴ−１は強力な血管平滑筋収縮作用を有
しており（M. Yanagisawa 等，Nature, 332, 411-415
(1988))心臓、腎臓、副腎、気道、肝臓、中枢神経系と
広範囲に分布するので高血圧症、心臓血管系疾患（例え
ば，心筋梗塞，心不全等）、脳血管系疾患（例えば，く
も膜下出血，急性脳梗塞等）、腎疾患（例えば，急性腎
不全等）などの病態と関係していると示唆されている
(M.D. Randall, Pharmacol. Ther., 50, 73-93 (199
1))。またＥＴ−１は気管支平滑筋収縮作用も有してい
るので、気管支喘息、肺高血圧との関連も推定されてい
る(C. Advenier等, Br.J. Pharmacol., 100, 168-172
(1990)) 。

【０００４】ＥＴ−１の作用はエンドセリン受容体（Ｅ
Ｔ受容体）との結合を介して発現する(M. Ihara 等, Bi
ochem. Biphys. Res. Commun.,178, 132-137 (1991);
R. C.Millar 等, Trends Pharmacol. Sci., 14, 54-60
(1993)) 為、その受容体と拮抗する化合物は上記疾患の
予防、治療薬となりうる。ペプチド性ＥＴ受容体拮抗物
質としては、例えばＦＲ−１３９３１７(K. Sogabe等,
J. Pharmacol. Exp. Ther., 264, 1040-1046 (1993))、
ＢＥ−１８２５７Ｂ(M. Ihara 等, Biochem. Biophys.
Res. Commun., 178, 132-137 (1992))、ＢＱ−１２３
(K. Ishikawa等,J. Med. Chem., 35, 2139-2142 (199
2))、ＢＱ−７８８(K. Ishikawa, Pro. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A., 91, 4892-4896 (1994)) 、ＰＤ−１４２８
９３(W.L. Cody等, J. Med. Chem., 35, 3301-3303 (19
92))、ＰＤ−１６５０６５( W.L. Cody 等, Med. Chem.
Res., 3, 154-162 (1993)) 、ＴＡＫ−０４４( 特開平
６−１７２３８４号）、ＲＥＳ−７０１−１(Y. Morish
ita, J. Antibiotics, 47, 269-275 (1994); M. Yamasa
ki, ibid., 47, 276-280 (1994))などが知られている。

【０００５】非ペプチド性エンドセリン受容体拮抗物質
としては、例えばＷＳ−００９Ａ、Ｂ（Ｓ. Miyata等,
J. Antibiotics, 45, 1029-1040 (1992); S. Miyata
等, ibid., 45, 1041-1046 (1992))、Ｒｏ−４６−２０
０５(M. Closel等, Nature,365, 759-761 (1993))、Ｒ
ｏ−４７−０２０３(P.D. Stein 等, J. Med. Chem.,3
7, 329-331 (1994))、５０−２３５(S. Mihara等, Eur.
J. Pharmacol., 246,33-38 (1993))、９７−１３９(S.
Mihara, J. Pharmacol. Exp. Ther., 268,1122-1128
(1994)) 、ＢＭＳ−１８２８７４（EP-558258-A)、ＳＢ
−２０９６７０(D.P.Brooks, Experimental Biology 9
4, Anaheim, Poster 3389 April 27, (1994))、コチン
ミシン１、２、３(Y.K. Tomy Lam等, J. Antibiotics,
45, 1709-1716 (1992); D. Zink 等, ibid., 1717-1722
(1992))等が知られている。

【０００６】ＢｉｇＥＴ−１が有する摘出血管収縮作用
は、ＥＴが有する摘出血管収縮作用の１／５０−１／１
００である(S. Kimura等, J. Cardiovasc. Pharmacol.,
13(Supple. 5), S5-S7 (1989)) から、ＥＣＥを阻害す
る化合物は、生体内のエンドセリン濃度を低下させる事
により上記受容体拮抗物質と同じ効果が期待され、上記
疾患の予防、治療薬となりうる。ＥＣＥ阻害物質として
は天然物であるホスホラミドン(E. G. McMahon等, Am.
J. Hypertension, 6, 667-673 (1993); S. Vemulapalli
等, Life Sciences, 53, 783-793 (1993))、ホスホラミ
ドンの構造を基にしてデザインされた合成リン酸アミド
誘導体（特開平２−１４６７３７号，特開平５−１４８
２７７号，EP-518299-A2，特開平４−７９８８３号, WO
-9311154-AL , J. Med. Chem., 36, 173-176 (1993)
）、及び天然物であるＷＳ７９０８９Ａ、Ｂ、Ｃ(Y. T
surumi 等, J. Antibiotics, 47, 619-630 (1994)) 等
が知られている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、エンド
セリン変換酵素を強く且つ選択的に阻害する物質を探索
し、海洋より分離したブラストバクター（Blastobacte
r）属に属するブラストバクター エスピー（Blastobac
ter sp.）ＳＡＮＫ７１８９４株の培養液中に、Ｂ９０
０６３が生産されることを見出して本発明を完成した。
更に、本発明の他の目的は、高血圧症、心臓血管系疾患
（例えば，心筋梗塞，心不全等）、脳血管系疾患（例え
ば，くも膜下出血，急性脳梗塞等）、腎疾患（例えば，
急性腎不全等）、気管支喘息、肺高血圧などの予防薬お
よび／または治療薬を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）下記式
（Ｉ）

【０００９】

【化２】

【００１０】を有する化合物Ｂ９００６３またはその
塩、（２）以下の物理化学的性状を有する化合物Ｂ９０
０６３またはその塩、 １） 性状；黄色粉末 ２） 融点；７３−７４℃ ３） 元素分析（％）；Ｃ₂₈Ｈ₃₀Ｎ₄ Ｏ₆ Ｓ₂ ・Ｈ₂
Ｏ 実測値 C 55.75 H 5.60 N 9.35 S 10.44 計算値 C 55.99 H 5.37 N 9.33 S 10.68 ４） 分子式；Ｃ₂₈Ｈ₃₀Ｎ₄ Ｏ₆ Ｓ₂ （高分解能ＦＡＢ−ＭＳスペクトルより） ５） 分子量；５８２（ＦＡＢ−ＭＳスペクトルよ
り） ６） 紫外線吸収スペクトル（アセトニトリル中）；
λ_max ｎｍ（ε） 214 (47400), 261(37200), 340 (sh, 8100), 380 (sh,4
100) ７） 赤外線吸収スペクトル（KBr)；ν_max cm^-1 3302, 1706, 1674, 1629, 1602, 1550, 1467, 1178, 11
13, 1046,1007 ８） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；δppm, 重クロロホルム中で内部基準としてテトラメチルシラン
を使用した¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（２７０ＭＨ
ｚ）を以下に示す。

【００１１】0.93 (3H, t, J=6.6 Hz), 1.38 (4H, m),
1.79 (2H, quintet, J=7.6 Hz), 2.81 (2H, t, J=7.6 H
z),7.15 (1H, s), 8.81 (1H, s), 9.74 (1H, s) ９） ¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；δppm, 重クロロホルム中で内部基準としてテトラメチルシラン
を使用した¹³ Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（６８ＭＨｚ）を以下に示
す。

【００１２】14.6 (q), 22.9 (t), 27.0 (t), 28.4
(t), 31.9 (t), 121.2 (d),123.8 (s), 132.5 (s), 14
1.2 (s), 143.4 (d), 144.9 (s),166.3 (s), 179.6
(s), 186.3 (d) １０） 高速液体クロマトグラフィー； 分離カラム;PEGASIL-ODS(4.6φx250mm, センシュー科学
（株）社製) 移動相；０．２％トリフロロ酢酸を含む７５％メタノー
ル水 流速；１ｍｌ／ｍｉｎ 検出波長；３５０ｎｍ 保持時間；８．６分 １１） 溶解性；メタノ−ル，エタノ−ル，酢酸に可
溶。酢酸エチル，クロロホルム，アセトン，アセトニト
リルに僅かに溶けるが、ベンゼン，エ−テル，ヘキサ
ン，水に不溶。

【００１３】（３）ブラストバクター属に属するＢ９０
０６３生産菌を培養し、その培養物よりＢ９００６３を
採取することを特徴とするＢ９００６３の製造法、
（４）ブラストバクター属に属するＢ９００６３生産菌
が、ブラストバクターエスピーＳＡＮＫ７１８９４株で
ある（２）に記載の製造法、（５）ブラストバクター
エスピー (Blastobacter sp.) ＳＡＮＫ７１８９４株に
関する。

【００１４】本発明の式（Ｉ）を有する化合物Ｂ９００
６３は常法にしたがって塩にすることが出来る。その様
な塩としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リ
チウム塩、のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マ
グネシウム塩、のようなアルカリ土類金属塩；アルミニ
ウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩
等の金属塩；アンモニウム塩；ｔ−オクチルアミン塩、
ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、
フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミ
ン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチ
ルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルア
ミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、ク
ロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン
塩、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン塩、ピペラジン塩、
テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化
水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のよう
なハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、
燐酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオ
ロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低
級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−
トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；
酢酸、リンゴ酸、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸
塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシ
ン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタ
ミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げ
ることができる。

【００１５】本発明の一般式（Ｉ）を有する化合物Ｂ９
００６３またはその塩は、大気中に放置したり、又は、
再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付い
たり、水和物となる場合があり、そのような水和物も本
発明に包含される。

【００１６】本発明のＢ９００６３を生産するブラスト
バクター エスピーＳＡＮＫ７１８９４株は、宮城県牡
鹿半島の海岸で採取した海水から分離した海洋細菌であ
る。本菌株の菌学的性状は以下の通りである。

【００１７】１． 形態学的性状 マリンアガ−（ディフコ社製）上で２３℃、２日間培養
後の観察では、細胞は円筒形、楕円形、球形で、その大
きさは幅０．３−０．７μｍ、長さ０．５−１．３μｍ
である。グラム陰性で、出芽で増殖する。細胞は運動し
ない。胞子を形成しない。

【００１８】２． 培養学的性状 マリンアガ−（ディフコ社製）上で２３℃、７日間培養
したコロニ−は暗緑色であり、不透明で円形、扁平状、
全縁である。水溶性色素を生成しない。

【００１９】３． 生理学的性状 ａ）海水の要求性：生育に海水を要求する。

【００２０】ｂ）Ｏ−Ｆ（オキシダティブ−ファ−メン
タティブ）テスト：− （マリンブロスにグルコ−ス１％，ブロモチモ−ルブル
−０．００８％，寒天０．２％を加えた場合）。 ｃ）カタラ−ゼ活性： ＋ ｄ）オキシダ−ゼ活性： ＋ ｅ）生育温度： １０−３７℃ ４． クロロフィルの有無： − ５． ＤＮＡのＧＣ含量： ５７．３％ ６． キノン型： ユビキノンＱ−１０。

【００２１】ＳＡＮＫ７１８９４は出芽で増殖するが、
その様式や細胞の形はア−カイブス・オブ・マイクロバ
イオロジ−（Archives of Microbiology，１４７，９２
−９９（１９８７年））やバ−ジ−ス・マニュアル・オ
ブ・システマティク バクテリオロジ−(Bergey's Manu
al of Systematic Bacteriology, ３巻，１９６３−１
９６８（１９８９））に記載されている出芽細菌のブラ
ストバクター属にもっとも近い。又、ＤＮＡのＧＣ含量
やキノン型もブラストバクター属の値と一致する。従っ
て、ＳＡＮＫ７１８９４株はブラストバクター属に属す
る。しかし、ＳＡＮＫ７１８９４株は海水から分離さ
れ、生育に海水を要求するのに対し、既知のブラストバ
クター属細菌は陸上環境から分離され、生育に海水を要
求しない。また、コロニ−が暗緑色のブラストバクター
属細菌は報告されていない。それ故、本発明者は本菌株
をブラストバクター属の新種、ブラストバクター エス
ピーＳＡＮＫ７１８９４とした。なお、本菌株は、１９
９４年９月１６日に通商産業省工業技術院生命工学工業
研究所に寄託され、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８０２
を付された。

【００２２】以上、Ｂ９００６３生産菌について説明し
たが、細菌の諸性質は一定したものではなく、自然にあ
るいは人工的に容易に変化することは周知の通りであ
り、本発明のＳＡＮＫ７１８９４株もこの点は同じであ
る。本発明にいうＳＡＮＫ７１８９４株はそのすべての
変異株を含有する。また、これらの変異株には遺伝学的
方法、例えば組換え、形質導入、形質転換等によりえら
れたものも包含される。すなわち、エンドセリン変換酵
素阻害物質を生産するＳＡＮＫ７１８９４株、その変異
株およびそれらと明確に区別されない菌株は、すべてＳ
ＡＮＫ７１８９４株に包含されるものである。

【００２３】本発明の新規な医薬、特に「エンドセリン
変換酵素阻害剤」、特に、「高血圧症、心臓血管系疾
患、脳血管系疾患、腎疾患、気管支喘息または肺高血圧
症の予防薬および／または治療薬」はＢ９００６３を有
効成分として含有する。

【００２４】

【発明の実施の形態】本発明のＢ９００６３を得るため
のこれらの微生物の培養は一般の発酵生産物生産用培地
中で行われる。この様な培地には、微生物が資化できる
炭素源、窒素源及び無機塩を含有する。培地の調製には
天然海水、あるいはジャマリン−Ｓ（ジャマリンラボラ
トリ−社製）またはマリンブロス（ディフコ社製）を蒸
留水に溶かした人工海水を用いる。

【００２５】一般に、炭素源としてグルコース、フラク
ト−ス、マルト−ス、シュ−クロ−ス、マンニト−ル、
グリセロ−ル、デキストリン、オ−トミ−ル、ライ麦、
ト−モロコシ澱粉、ジャガイモ、大豆粉、綿実油、糖
蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、あるいは併用して用
いることができる。一般には培地量の１−１０重量％用
いる。窒素源としては一般に蛋白質を含有する物質を発
酵工程に用いる。適当な窒素源としては大豆粉、フス
マ、落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水分解物、
ファ−マミン、魚粉、ペプトン、肉エキス、イ−ストエ
キス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム等である。窒素源は単一に又は併
用して培地量の０．２−０．６重量％用いる。培地中に
取り入れる栄養無機塩はナトリウム、アンモニウム、カ
ルシウム、フォスフェ−ト、サルフェート、クロリド、
カ−ボネ−ト等のイオンを与える通常の塩類である。
又、カリウム、コバルト、マンガン、マグネシウム等の
微量の金属も含む。液体培養に際してはシリコン油、植
物油、界面活性剤が消泡剤として用いられる。

【００２６】Ｂ９００６３を得るためにブラストバクタ
ー エスピーＳＡＮＫ７１８９４を培養する時のｐＨは
６．５−９．０、好適には６．５−８．５、最適には
７．０−８．５である。菌の生育温度は１０−３０℃、
好適には２０−２５℃、最適には２２−２４℃である。

【００２７】Ｂ９００６３はブラストバクター エスピ
ーＳＡＮＫ７１８９４を好気的に培養して得られるが、
好気的培養法としては液体振とう培養法、通気撹拌液体
培養法等が用いられる。スラントより前述の炭素源、窒
素源、及び無機塩を適当に含み、１２０℃，１５分間加
熱滅菌した培養培地中へ接種し、２２−２４℃で３−４
日間前培養する。その後同じ培養培地へ接種して２２−
２４℃で３−４日間本培養する。培養は三角フラスコ中
で行われる。

【００２８】培養終了後、培養液を遠心分離（３，００
０−８，０００ｒｐｍ）に供して菌体と上清とに分け
る。その上清を酢酸エチルで抽出して中性もしくはアル
カリ性物質を除去する。この水層に塩酸を加えてｐＨを
３に調整し、再度酢酸エチルで抽出する。この酸性酢酸
エチルエキスは更に吸着剤、例えば活性炭、アンバーラ
イトＸＡＤ−１、ＸＡＤ−４（ロ−ム＆ハ−ス社製）、
ダイヤイオンＨＰ−２０、ＣＨＰ−２０、ＨＰ−５０
（三菱化成（株）社製）等を用いて精製できる。あるい
は上記の遠心分離に供した上清を酢酸エチル抽出して中
性もしくはアルカリ性物質を除去し、ｐＨ３に調整した
水層を直接吸着剤、例えば活性炭、アンバ−ライトＸＡ
Ｄ−１、ＸＡＤ−４（ロ−ム＆ハ−ス社製）、ダイヤイ
オンＨＰ−２０、ＣＨＰ−２０、ＨＰ−５０（三菱化成
（株）社製）等に付しても精製できる。

【００２９】この様にして得られたエキスは更にセファ
デックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等の分配カラ
ムクロマトグラフィー、あるいはオクチル化またはオク
タデシル化されたシリカゲルを充填剤として用いたロー
バーカラム（ＲＰ−８、１８（メルク社製））、ＨＰＬ
Ｃ（センシューパックＯＤＳ−Ｈ、Ｓ；ペガシルＯＤＳ
（センシュー科学（株）社製））等で精製できる。

【００３０】また精製過程におけるＢ９００６３の挙動
はエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）阻害活性の有無を確
認することにより知ることができる。ＥＣＥ阻害活性は
ＢｉｇＥＴ−１を基質、ヒト血管内皮細胞から調製した
ＥＣＥを酵素としてＥＴ−１を生成する酵素反応を利用
する。ＥＣＥは岡田らの方法（K. Okada等, Biochem.Bi
phys. Res. Commun., 171, 1192-1198 (1990)) に従っ
て調製することができる。Ｂ９００６３存在下、および
非存在下で上述の酵素反応をおこさせ、生成するＥＴ−
１をサンドイッチＥｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓ
ａｙ（ＥＩＡ）法で定量する。更にその測定値をもとに
ＥＴ−１の濃度を求めて下記の式にあてはめれば、ＥＣ
Ｅ阻害率を算出することができる。

【００３１】 ＥＣＥ阻害活性 ＝｛１−（Ａ／Ｂ）｝×１００
（％） Ａ：阻害物質存在下でのＥＴ−１生成量 Ｂ：阻害物質非存在下でのＥＴ−１生成量 ＥＣＥは中性でエンドペプチダーゼ活性を示す酵素であ
り、このＥＣＥと同じく分類される酵素のひとつにNeut
ral Endopeptidase(ＮＥＰ: EC.3.4.24.11) がある。Ｎ
ＥＰに対する阻害活性を測定し、ＥＣＥ阻害活性と比較
する(Y. Tsurumi 等, J. Antibiotics, 47, 619-630 (1
994)) ことにより選択性を知ることができる。

【００３２】ＮＥＰ阻害活性は、ＮＥＰ画分をマルフロ
イらの方法（B. Malfroy等, J. Biol. Chem., 259, 143
65-14370 (1984))に従いラット摘出腎臓から調製し、フ
レンチらの方法（J. F. French等, J. Pharmacol. Exp.
Ther., 268, 180-186 (1994))に従って測定することが
できる。すなわちN-dansyl-D-Ala-Gly-(p-nitro)Phe-Gl
y-OHを基質、上述のＮＥＰ画分を酵素とする酵素反応を
本物質存在下、及び非存在下で行い、基質が加水分解さ
れて生成するダンシルクロライドの蛍光を蛍光光度計で
測定する。この測定を経時的に行い１分間あたりの測定
値の変化を反応速度と考え、下記の式に代入しＮＥＰ阻
害率を求めることができる。

【００３３】 ＮＥＰ阻害率 ＝｛１−（ａ／ｂ）｝×１００ （％） ａ：阻害物質存在下における反応速度 ｂ：阻害物質非存在下における反応速度 本発明のＢ９００６３またはその塩は文献未記載の新規
化合物であり、in vitroで選択的にＢｉｇＥＴ−１をＥ
Ｔ−１へ変換するＥＣＥを阻害する。従って、本化合物
は高血圧症、心臓血管系疾患（例えば心筋梗塞、心不全
等）、脳血管系疾患（例えばくも膜下出血、急性脳梗塞
等）、腎疾患（例えば急性腎不全等）、気管支喘息、肺
高血圧症などの予防薬および／または治療薬として有用
である。

【００３４】その投与形態としては、例えば錠剤、カプ
セル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与、また注
射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、坐薬等による非経口投
与を挙げることができる。これらの製剤は賦形剤、滑沢
剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤など
の添加剤を用いて周知の方法で製造される。ここに、賦
形剤としては、例えば乳糖、白糖、ぶどう糖、マンニッ
ト、ソルビットのような糖誘導体；トウモロコシデンプ
ン、バレイショデンプン、α−デンプン、デキストリ
ン、カルボキシメチルデンプンのような澱粉誘導体；結
晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシ
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシ
ウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム
のようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラ
ン；プルラン；などの有機系賦形剤；および軽質無水珪
酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネ
シウムのような珪酸塩誘導体；燐酸カルシウムのような
燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウ
ムのような硫酸塩；などの無機系賦形剤をあげることが
できる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸、ステア
リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのような
ステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーガ
ム、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸：アジピン酸；硫
酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；
安息香酸ナトリウム；ＤＬ−ロイシン；脂肪酸ナトリウ
ム塩；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシ
ウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物の
ような珪酸類；および、上記澱粉誘導体などをあげるこ
とができる。結合剤としては、例えばポリビニルピロリ
ドン、マクロゴールおよび前記賦形剤と同様の化合物を
あげることができる。崩壊剤としては、例えば前記賦形
剤と同様の化合物およびクロスカルメロースナトリウ
ム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビ
ニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セル
ロース類をあげることができる。安定剤としては、例え
ばメチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキ
シ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルア
ルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコー
ル類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾール
のようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；
およびソルビン酸をあげることができる。矯味矯臭剤と
しては、例えば通常使用される、甘味料、酸味料、香料
等をあげることができる。

【００３５】本発明の式（Ｉ）を有する化合物Ｂ９００
６３またはその塩の使用量は症状、年齢、投与方法等に
よって異なるが、例えば経口投与の場合には、成人に対
して１日あたり、下限として０．１ｍｇ（好ましくは１
ｍｇ）、上限として、１０００ｍｇ（好ましくは１００
ｍｇ）を１回または数回に分けて、症状に応じて投与す
ることが望ましい。静脈内投与の場合には、成人に対し
て１日当たり、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは
０．１ｍｇ）、上限として、１００ｍｇ（好ましくは１
０ｍｇ）を１回または数回に分けて、症状に応じて投与
することが望ましい。

【００３６】製剤例１． カプセル剤 本発明の新規化合物Ｂ９００６３またはその塩を含有す
るカプセル剤を製造する場合は、例えば以下のように製
造することができる。Ｂ９００６３ １０ｇ、乳糖 １
０ｇ、トウモロコシ澱粉 １５．８ｇおよびステアリン
酸マグネシウム ０．２ｇをＶ型混合機を用いて混合し
た後、３号カプセルに１８０ｍｇずつ充填すると、カプ
セル剤が得られる。該カプセル剤は１カプセル当たりＢ
９００６３ ５０ｍｇを含有する。

【００３７】

【実施例】以下に実施例を挙げて更に詳細に説明するが
本発明はこれに限定されない。

【００３８】実施例１ （１） 培養 ブラストバクター エスピーＳＡＮＫ７１８９４をその
スラントから１２０℃、２０分間滅菌した後述の組成の
培地２０ｍｌを含む１００ｍｌ三角フラスコに１白金耳
接種した。次いで、これを２３℃で３日間、２００ｒｐ
ｍで振とうしながら前培養した。緑色となった前培養液
０．５ｍｌを前培養で用いた培地と同じ培地１００ｍｌ
を含む５００ｍｌ三角フラスコ３５本それぞれに接種し
た。これを２３℃で４日間、２００ｒｐｍで振とうしな
がら培養した。

【００３９】

【表１】 培地組成 マリンブロス（ディフコ社製） ３７．４ｇ ファイトン（ＢＢＬ社製） １０．０ｇ グルコース １０．０ｇ 蒸留水 １，０００ｍｌ ──────────────────────── ｐＨ無調整 （２） 単離 ａ） （１）に示した培養をおこなって得た暗緑色培養
液を８，０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離に供して菌体
と上清（３リットル）に分けた。活性物質は上清に認め
られた。上清（ｐＨ７．５６）を同量の酢酸エチルを用
いて抽出し、その水層に１Ｎ塩酸を加えてｐＨを３．０
に調整し、同量の酢酸エチルで二回抽出した。抽出液を
半量の水で２回で洗い、更に半量の飽和食塩水で１回洗
った後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。減圧
下、酢酸エチルを留去して０．３６２ｇの緑色油状物を
得た。この緑色油状物をカラムクロマトグラフィ−（カ
ラム：ロ−バ−カラム ＲＰ−１８，Ｂサイズ（メルク
社製），移動相：８０％メタノ−ル水，流速：９ｍｌ／
分）に付し、８−１１分の分画を集めた。集めた分画を
減圧下で濃縮して４２．１ｍｇの暗褐色アモルファスを
得た。これを高速液体クロマトグラフィー（カラム：Se
nshu Pak PEGASIL ODS, 20φx250mm（センシュー科学
（株）社製）, 移動相：０．２％トリフロロ酢酸を含む
７５％メタノール水，流速：１０ｍｌ／分）に注入して
１９−２０分の分画を集めた。減圧下溶媒を留去して、
３０ｍｇのＢ９００６３を得た。

【００４０】ｂ） （１）に示した培養をおこなって得
た暗緑色培養液を８，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分
離に供して菌体と上清（３リットル）に分けた。ダイヤ
イオンＨＰ−２０（三菱化成（株）社製） ５００ｍｌ
をカラム（６φ×２０cm）に充填して水で平衡化し、そ
のカラムに上清（３リットル）を付した。これを水、１
０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０
％、８０％、９０％メタノール水、メタノールそれぞれ
５００ｍｌによる段階的濃度勾配により溶出した。８０
％、９０％メタノール水およびメタノール溶出画分を集
め、これを減圧下で濃縮して緑色油状物４００ｍｇを得
た。この油状物をカラムクロマトグラフィ−（カラム：
ロ−バ−カラム ＲＰ−１８，Ｂサイズ（メルク社
製），移動相：８０％メタノ−ル水，流速：９ｍｌ／
分）に付し、８−１１分の分画を集めた。この分画を減
圧下で濃縮して得られた薄緑色アモルファスを高速液体
クロマトグラフィー（カラム：Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ
ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ， ２０φx250mm（センシュー
科学（株）社製）, 移動相：０．２％トリフロロ酢酸を
含む７５％メタノール水，流速：１０ｍｌ／分）に注入
して、１９−２０分の分画を集めた。この分画を減圧下
で濃縮して６４．７ｍｇのＢ９００６３を得た。

【００４１】

【発明の効果】試験例１ エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）阻害率の測
定 ＥＣＥ画分の調製は岡田らの方法（k. Okada等, Bioche
m. Biphys. Res. Commun., 171, 1192-1198 (1990)) を
参照した。すなわち、ヒト臍帯静脈内皮細胞（倉敷紡績
（株）製）を血管内皮細胞増殖改変培地（Ｍ１１９（シ
グマ社製）、０．１５％炭酸ナトリウム（シグマ社
製）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン（大日本製薬（株）
製）、５０μＭストレプトマイシン（大日本製薬（株）
製）、２．５μｇ／ｍｌファンギゾン（ライフテクノロ
ジー社製）、１０Ｕ／ｍｌヘパリン（小玉（株）製）、
２０μｇ／ｍｌウシ内皮細胞増殖因子（バイオメディカ
ルテクノロジー社製）、１０％ウシ胎児血清（ハイクロ
ンラボラトリー社製）中、３７℃、加湿、５％炭酸ガス
雰囲気下、培養した。増殖した後、内皮細胞をかきと
り、内皮細胞５×１０⁸ 個をプロテアーゼ阻害剤（１ｍ
Ｍ Ｅ−６４、０．４ｍＭロイペプチン、１０μＭペプ
スタチンＡ（いずれもペプチド研究所製））を含む５０
mMリン酸緩衝液（以下この緩衝液を緩衝液Ａという）
３０ｍｌ中でポリトロンを用いて破砕した。これを１６
００×ｇの遠心分離に供して得られた上清を集めた。次
に、１０５０００×ｇの遠心分離に供して得た沈殿（ミ
クロソーム画分）を集め、更に０．５％トライトンＸ−
１００を含む緩衝液Ａ用いて可溶化し、１０５０００×
ｇで遠心分離に供して得た上清をＥＣＥ画分とした。

【００４２】得られたＥＣＥに対する阻害作用をＢ９０
０６３とホスホラミドンについて調べた。ダルベッコ改
変リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）１３０μl 、ま
たはダルベッコ改変リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
４）にＢ９００６３またはホスホラミドンを加えて調製
した溶液１３０μｌを、抗ＥＴ−１ ^15-21ウサギＩｇＧ
（（株）免疫生物研究所製）を固相化した９６穴のマイ
クロタイタープレートのウェルに加えた。そこに更に２
０ｎＭＢｉｇＥＴ−１（（株）ペプチド研究所製）１０
μl とＥＣＥ画分１０μl を加えて反応を開始し、３７
℃で２時間反応させた。このマイクロタイタープレート
を４℃に冷却することによりＢｉｇＥＴ−１分解反応を
停止した。

【００４３】この反応で生成したＥＴ−１をサンドイッ
チＥＩＡ法にて定量した。即ち、４℃に冷却した上記マ
イクロプレ−トのウエルを３０分間放置し、ＥＴ−１と
抗ＥＴ−１ ^15-21ウサギＩｇＧの結合を安定化させた。
反応液を捨て、水洗した後、ペルオキシダ−ゼで標識し
た抗ＥＴ−１ ^15-21ウサギＩｇＧ（Ｆａｂ’）−ＨＲＰ
（（株）免疫生物研究所製）を加えＥＴ−１に結合させ
た。結合しなかった過剰の抗ＥＴ−１ ^15-21ウサギＩｇ
Ｇ（Ｆａｂ’）−ＨＲＰを洗い流した後、このＩｇＧ−
（ＥＴ−１）−ＩｇＧ（Ｆａｂ’）−ＨＲＰ複合体をペ
ルオキシダ−ゼ反応により発色させ比色定量した。

【００４４】このペルオキシダーゼ反応は基質溶液とし
てオルト−フェニレンジアミン（o-phenylenediamine）
１３ｍｇを０．２Ｍリン酸カリウム−クエン酸緩衝液
（ｐＨ５．１）７ｍｌに溶かした溶液１００μｌを加え
て反応を開始させ、室温で１５分間反応させた後、１Ｎ
硫酸１００μｌを加えて反応を停止した。

【００４５】こうして発色させた反応液の吸光度をもと
にしてＥＴ−１濃度を求め、ＥＣＥ阻害率を以下の式に
より算出した。

【００４６】 ＥＣＥ阻害率 ＝｛１−（Ａ／Ｂ）｝×１００ （％） Ａ：阻害物質を加えた反応液のＥＴ−１濃度 Ｂ：阻害物質を加えない反応液のＥＴ−１濃度 Ｂ９００６３のＥＣＥに対する５０％阻害濃度（Ｉ
Ｃ₅₀）は１．０μＭ、ホスホラミドンのＥＣＥに対する
５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）は０．９μＭであった。すな
わちＢ９００６３はｉｎ ｖｉｔｒｏでホスホラミドン
と同程度にＥＣＥを阻害する。

【００４７】試験例２ 中性エンドペプチダ−ゼ（ＮＥ
Ｐ）阻害率の測定 摘出ラット腎臓７匹分を１２５ｍＭ Ｄ−マンニトー
ル、１２ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７．４の５ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液２００ｍｌ中でポリトロンを用い
て破砕し、マルフロイらの方法（B. Malfroy等, J. Bio
l. Chem., 259, 14365-14370 (1984))に従い７，０００
ｘｇで遠心分離に供して得た沈殿を粗膜画分として集め
た。次に、１％トライトンＸ−１００を含む５ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）２０ｍｌに可溶性の画分
を８０，０００ｘｇ遠心分離に供してその上清を除き、
更に５％トライトンＸ−１００を含む５ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．４）１５ｍｌを用いて可溶化後，８
０，０００ｘｇで遠心分離に供して得られた上清を可溶
化中性エンドペプチダ−ゼ画分（ＮＥＰ）とした。

【００４８】このＮＥＰに対するＢ９００６３とホスホ
ラミドンの阻害活性を、フレンチらの方法（J. F. Fren
ch等, J. Pharmacol. Exp. Ther., 268, 180-186 (199
4))に従って測定した。即ち、ＮＥＰ画分４０μl に、
５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４） １．９２ｍ
ｌ，５０ｍＭアスコルビン酸 ２０μl に溶かして酵素
溶液とした。コントロールとしてはこのままの酵素溶液
を利用し、阻害活性の試験を行うものにはさらにＢ９０
０６３またはホスホラミドンを加えた。ここに４ｍＭの
N-dansyl-D-Ala-Gly-(p-nitro)Phe-Gly-OH （シグマ社
製） ２０μｌを基質として加えて反応を開始し、２５
℃で６分間反応させた。基質が加水分解されて生成する
ダンシルクロリドが発する蛍光を蛍光光度計により経時
的に測定した。１分間あたりの蛍光強度の変化量を反応
速度として以下の式に代入することによりＮＥＰ阻害率
を求めた。

【００４９】 ＮＥＰ阻害率 ＝｛１−（ａ／ｂ）｝×１００ （％） ａ：阻害物質存在下での反応速度 ｂ：阻害物質非存在下での反応速度 Ｂ９００６３のＮＥＰに対する５０％阻害濃度（Ｉ
Ｃ₅₀）は７０μＭ、ホスホラミドンのＮＥＰに対する５
０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）は４．５ｎＭであった。すなわ
ちＢ９００６３はホスホラミドンに比べ、ＮＥＰ阻害活
性が著しく低かった。

【００５０】本発明のＢ９００６３またはその塩は高血
圧症、心臓血管系疾患（例えば心筋梗塞、心不全等）、
脳血管疾患（例えばくも膜下出血、急性脳梗塞等）、腎
疾患（例えば急性腎不全等）、気管支喘息、肺高血圧症
の予防および／または治療薬として有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 9/99 (Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 根岸 昭明 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 (72)発明者 高松 安行 福島県いわき市泉町下川字大剱389−４ 三共株式会社内 (72)発明者 春山 英幸 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 (72)発明者 木下 武 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 (72)発明者 小玉 健太郎 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内 (72)発明者 石井 晃 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式（Ｉ） 【化１】 を有する化合物Ｂ９００６３またはその塩。
2. 【請求項２】以下の物理化学的性状を有する化合物Ｂ９
   ００６３またはその塩； １） 性状；黄色粉末 ２） 融点；７３−７４℃ ３） 元素分析（％）；Ｃ₂₈Ｈ₃₀Ｎ₄ Ｏ₆ Ｓ₂ ・Ｈ₂
   Ｏ 実測値 C 55.75 H 5.60 N 9.35 S 10.44 計算値 C 55.99 H 5.37 N 9.33 S 10.68 ４） 分子式；Ｃ₂₈Ｈ₃₀Ｎ₄ Ｏ₆ Ｓ₂ （高分解能ＦＡＢ−ＭＳスペクトルより） ５） 分子量；５８２ （ＦＡＢ−ＭＳスペクトルよ
   り） ６） 紫外線吸収スペクトル（アセトニトリル中）；
   λ_max ｎｍ（ε） 214 (47400), 261(37200), 340 (sh, 8100), 380 (sh,4
   100) ７） 赤外線吸収スペクトル（KBr)；ν_max cm^-1 3302, 1706, 1674, 1629, 1602, 1550, 1467, 1178, 11
   13,1046, 1007 ８） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；δppm, 重クロロホルム中でテトラメチルシランを内部基準とし
   て使用した¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（２７０ＭＨ
   ｚ）を以下に示す。 0.93 (3H, t, J=6.6 Hz), 1.38 (4H, m),1.79 (2H, qui
   ntet, J=7.6 Hz), 2.81 (2H, t, J=7.6 Hz),7.15 (1H,
   s), 8.81 (1H, s), 9.74 (1H, s) ９） ¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；δppm, 重クロロホルム中でテトラメチルシランを内部基準とし
   て使用した¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（６８ＭＨｚ）
   を以下に示す。 14.6 (q), 22.9 (t), 27.0 (t), 28.4 (t), 31.9 (t),
   121.2 (d),123.8 (s), 132.5 (s), 141.2 (s), 143.4
   (d), 144.9 (s),166.3 (s), 179.6 (s), 186.3 (d) １０） 高速液体クロマトグラフィー； 分離カラム;PEGASIL-ODS(4.6φx250mm, センシュー科学
   （株）社製) 移動相；０．２％トリフロロ酢酸を含む７５％メタノー
   ル水 流速；１ｍｌ／ｍｉｎ 検出波長；３５０ｎｍ 保持時間；８．６分 １１） 溶解性；メタノ−ル，エタノ−ル，酢酸に可
   溶。酢酸エチル，クロロホルム，アセトン，アセトニト
   リルに僅かに溶けるが、ベンゼン，エ−テル，ヘキサ
   ン，水に不溶。
3. 【請求項３】ブラストバクター属に属するＢ９００６３
   生産菌を培養し、その培養物よりＢ９００６３を採取す
   ることを特徴とするＢ９００６３の製造法。
4. 【請求項４】ブラストバクター属に属するＢ９００６３
   生産菌が、ブラストバクター エスピーＳＡＮＫ７１８
   ９４株である請求項２に記載の製造法。
5. 【請求項５】ブラストバクター エスピーＳＡＮＫ７１
   ８９４株。
6. 【請求項６】化合物Ｂ９００６３またはその塩を有効成
   分として含有する医薬。
7. 【請求項７】化合物Ｂ９００６３またはその塩を有効成
   分として含有するエンドセリン変換酵素阻害剤。
8. 【請求項８】化合物Ｂ９００６３またはその塩を有効成
   分として含有する高血圧症予防薬および／または治療
   薬。
9. 【請求項９】化合物Ｂ９００６３またはその塩を有効成
   分として含有する心臓血管系疾患予防薬および／または
   治療薬。
10. 【請求項１０】化合物Ｂ９００６３またはその塩を有効
    成分として含有する脳血管系疾患予防薬および／または
    治療薬。
11. 【請求項１１】化合物Ｂ９００６３またはその塩を有効
    成分として含有する腎疾患予防薬および／または治療
    薬。
12. 【請求項１２】化合物Ｂ９００６３またはその塩を有効
    成分として含有する気管支喘息予防薬および／または治
    療薬。
13. 【請求項１３】化合物Ｂ９００６３またはその塩を有効
    成分として含有する肺高血圧予防薬および／または治療
    薬