JPH08205873A

JPH08205873A - 組換えジベレリンｄｎａ及びその用途

Info

Publication number: JPH08205873A
Application number: JP7174303A
Authority: JP
Inventors: Tai-Ping Sun; タイ‐ピン、サン; Howard M Goodman; ハワード、エム．グッドマン; Frederick M Ausubel; フレデリック、エム．オースベル
Original assignee: General Hospital Corp; Duke University
Current assignee: General Hospital Corp; Duke University
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 1996-08-13
Also published as: CA2151627A1; EP0692537A3; HUT73216A; US5866779A; AU2168795A; HU9501780D0; EP0692537A2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】組換えＤＮＡ技術に関し、Ａ．タリアナタンパ
ク質を実質上含まないＧＡ１タンパク質、ＧＡ１タンパ
ク質と結合できる抗体と、植物細胞及び組織でＧＡ１遺
伝子の発現及びＧＡ１タンパク質の存在について調べる
方法の提供。【構成】ent-カウレンシンテターゼについてコードする
Ａ．タリアナのＧＡ１座に相当するＤＮＡのクローニン
グ及び配列決定、そのＤＮＡを含んだベクター、ＤＮＡ
を発現できるベクターと、そのベクターで形質転換され
た宿主に関する。キメラ及びトランシジェニック植物の
作成におけるＧＡ１遺伝子及びその調節領域の用途であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は組換えＤＮＡ技術に関する。詳しくは、本発明
はent-カウレンシンテターゼについてコードするアラビ
ドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)のＧＡ１座
に相当するｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ、このような遺伝
子を含んだ発現ベクター、このようなベクターで形質転
換された宿主、ＧＡ１遺伝子の調節領域、トランスジェ
ニック植物で機能的に結合された異種遺伝子の発現を指
示するこのような調節領域の用法、他のＡ．タリアナタ
ンパク質を実質上含まないＧＡ１タンパク質、ＧＡ１タ
ンパク質と結合できる抗体と、植物細胞及び組織でＧＡ
１遺伝子の発現及びＧＡ１タンパク質の存在について調
べる方法に関する。

【０００２】発明の背景Ａ．ジベレリンジベレリン（ＧＡ）はジテルペノイド植物成長ホルモン
の群であり、その一部は生物活性な成長調節因子であ
る。ＧＡは種子発芽、細胞伸長及び分裂、葉拡大、茎伸
長、開花と結実のような多種プロセスをコントロールす
るために要求される。ＧＡは多くの生理学及び生化学研
究の対象であり、ＧＡ生合成又は応答のパターンが変わ
った様々な植物変異体が研究されている(Graebe,J.E.,A
nn.Rev.Plant Physiol.,38:419-465(1987)) 。しかしな
がら、ＧＡ合成に関与する遺伝子はいずれもまだクロー
ニングされていない。

【０００３】ＧＡ応答性矮小変異体での内在ＧＡ中間体
に関する多数の生化学研究から、ＧＡ生合成経路とＧＡ
生合成に関与するいくつかの遺伝子座を決定することが
できた(Graebe,J.E.,Ann.Rev.Plant Physiol.,38:419-4
65(1987)で記載）。いくつかのＧＡ応答性矮小変異体が
トウモロコシ、エンドウ及びアラビドプシスのような様
々な植物種から単離された(Phinney,B.O.et al.,"Chemi
cal Genetics and theGibberellin Pathway"(化学遺伝
学及びジベレリン経路)in Zea mays L.in Plant Growth
Substance,ed.,P.F.Waering,New York: Academic(198
2),pp.101-110；Ingram,T.J.,ら,Planta,160:455-463(1
984) ；Koornneef,M.,Arabidopsis Inf.Serv.,15:17-20
(1978))。トウモロコシの矮小変異体（dwarf-１、dwarf
-２、dwarf-３、dwarf-５）は、生物学上重要な代謝産
物に至る特定のステップを決定することでトウモロコシ
ＧＡ生合成経路を特徴付けるために用いられた（Phinne
y,B.O.et al.,"Chemical Genetics and the Gibberelli
n Pathway" in Zea mays L.in Plant Growth Substanc
e,ed.,P.F.Waering,New York: Academic(1982),pp.101-
110；Fujioka,S.ら,Plant Physiol.,88:1367-1372(198
8)）。類似研究はエンドウ〔ピシム・サチブムＬ．(Pis
um sativum L.)〕からの矮小変異体で行われた(Ingram,
T.J.ら,Planta,160:455-463(1984))。ＧＡ欠乏変異体も
アラビドプシスから単離された（ｇａ１、ｇａ２、ｇａ
３、ｇａ４、ｇａ５）（Koornneef,M.ら,Theor.Appl.Ge
net.,58:257-263(1980))。ＧＡ変異体の最も多い遺伝子
研究の１つは小さなアブラナ科のアラビドプシス・タリ
アナで Koornneefら（Theor.Appl.Genet.,58:257-263(1
980)； Koornneefら,Genet.Res.Camb.,41:57-68(1983))
により行われた。エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）
及び高速中性子変異誘発を用いて、 KoornneefはＡ．タ
リアナのＧＡ１座に位置する９つの対立遺伝子を単離し
た(Koornneefら,Theor.Appl.Genet.,58:257-263(1980);
Koornneef ら,Genet.Res.Camb.,41:57-68(1983))。

【０００４】Ａ．タリアナｇａ１変異体は非発芽、ＧＡ
応答性の雄性不稔矮小体であって、その表現型はＧＡの
反復適用で野生型に変換することができる(Koornneef及
びvan der Veen,Theor.Appl.Genet.,58:257-263(198
0))。 Koornneefらは、Ａ．タリアナＧＡ１座の微細構
造遺伝子地図を作成するために、高速中性子衝突により
作られた３つの独立した対立遺伝子（３１．８９、２
９．９及び６．５９）と、エチルメタンスルホネート変
異誘発により作られた６つの独立した対立遺伝子（ＮＧ
４、ＮＧ５、ｄ６９、Ａ４２８、ｄ３５２及びＢｏ２
７）を用いた（図２Ａ）。高速中性子作成変異体の１つ
３１．８９は図２Ａで示された６つの対立遺伝子で組換
えることができず、遺伝子内欠失として分類された(Koo
rnneefら,Genet.Res.Camb.,41:57-68(1983))。

【０００５】ｇａ１変異体は低レベルのＧＡを含み、ｇ
ａ１変異体からの無細胞調製物におけるent-カウレンシ
ンテターゼ活性は野生型と比較して非常に低い（Barend
seら,Physiol.Plant.,67:315-319(1986)；Barendse及び
Koornneef,Arab.Inf.Serv.,19:25-28(1982))。Zeevaar
t,Plant Research,'86,Annual Report of the MSU-DOEP
lant Research Laboratory,(East Lansing,Michigan),p
p.130-131(1986) では、ent-カウレンの適用もｇａ１変
異体の成長を回復させ、¹⁴Ｃ‐ent-カウレンがこれら変
異体の葉に適用されたときＧＡに代謝されることを報告
した。これらの結果は、ｇａ１変異体でのＧＡ生合成が
ent-カウレンの形成前に阻止されているが、残りの経路
が変異で影響されていないことを示唆している。ｇａ１
変異体はクロロフィル及びカロチノイドを生産するた
め、その変異はゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰ
Ｐ）の合成に影響を与えていないらしい。したがって、
ＧＡ１座はおそらくＧＧＰＰからent-カウレンへの変換
に関与して、ent-カウレンシンテターゼの１つ又は活性
酵素の形成に必要なレギュレーターについてコードして
いるらしい。ＧＡ１座はゲノムサブトラクション(subtr
action) により単離された(Sunら,Plant Cell,4:119-12
8(1992))。

【０００６】ＧＡ１遺伝子によりコードされる酵素は、
ＧＡの生合成における主要中間体(Graebe,J.E.,Ann.Re
v.Plant Physiol.,38:419-465(1987)) 、ent-カウレン
へのＧＧＰＰの変換に関与している（Barendse及びKoor
nneef,Arabidopsis Inf.Serv.,19:25-28(1982)；Barend
seら,Physiol.Plant.,67:315-319(1986)；Zeevaart,J.
A.D.,in Plant Research,'86,Annual Report of the MS
U-DOE Plant Research Laboratory,pp.130-131(East La
nsing,MI,1986))。

【化１】 ent-カウレンシンテターゼだけが様々な植物から部分的
に精製された(Duncan,Plant Physiol.,68:1128-1134(19
81))。

【０００７】メバロン酸からＧＧＰＰの合成はテルペン
類にとり共通である。ＧＧＰＰはＧＡの前駆体であるば
かりか、クロロフィルのフィトール鎖のような他のジテ
ルペン類及びカロチノイドのようなテトラテルペン類の
前駆体でもある、分岐点代謝産物である。ＧＡ経路の第
一始動ステップは２ステップ環化反応でＧＧＰＰからen
t-カウレンへの変換である。ＧＧＰＰはent-カウレンシ
ンテターゼＡにより中間体コパリルピロリン酸（ＣＰ
Ｐ）に部分環化され、ＣＰＰは直ちにent-カウレンシン
テターゼＢでent-カウレンに変換される。ent-カウレン
はＧＡ経路の主要中間体であるため、その合成はＧＡ生
合成の調節点であるらしい。実際に、ent-カウレン生産
は、ある種において、光周期、温度及び組織の成長ポテ
ンシャルの変化により変わることが示された(Chung及び
Coolbaugh,1986；Moore 及びMoore,1991；Zeevaart及び
Gage,1993)。

【０００８】いくつかのｇａ１対立遺伝子で分子障害を
調べることにより、ＧＡ１座の遺伝子及び物理的地図の
直接補正が行われ、１０^-5cM／ヌクレオチドの組換え速
度がＡ．タリアナゲノムのこの領域について決定された
(Koornneef,Genet.Res.Comb.,41:57-68(1983))。ＧＡ生
合成に関与するＧＡ１遺伝子及び他の遺伝子のクローニ
ングに伴う困難さは、効率的形質転換／選択系の非入手
性と、入手しうるタンパク質配列の欠如にほとんど起因
するようであった。ｇａ１変異体はやがて入手できた
が、ＧＡ１遺伝子のクローニングは不可能なままであっ
た。本発明は特にこの問題を解決する。

【０００９】Ｂ．遺伝子クローニングウイルス、原核又は真核細胞から特定の望ましい遺伝子
配列を同定してクローニングする能力は、分子生物学に
とり極めて重要である。このようなクローン化遺伝子配
列は望ましい遺伝子産物を発現するために使用でき、し
たがって触媒から遺伝子置換までに及ぶ適用に使える可
能性がある。様々な方法が望ましい遺伝子配列を単離及
びクローニングするために開発された。初期の方法では
プロファージ組込み部位への近接、自己複製の能力、特
徴的な分子量、極度の豊富さ等のように独特な性質を有
する遺伝子配列を同定及び単離できるだけであった(The
Bacteriophage Lambda,A.D.Hershey,ed.,Cold Spring
Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(1971)；Miller,
J.H.,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring
Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(1971)；Molecul
ar Biology of the Gene,Watson,J.D. ら(4th ed.)Benj
amin/Cummings,Menlo Park,CA(1987)；Darnell,J.ら,Mo
lecular Biology,Scientific American Books,NY,NY(19
86)）。これらの方法は遺伝子配列の特徴的性質に依存
しているため、それらはほとんどの遺伝子配列を同定及
びクローニングする上でかなり（又は完全に）不適切で
あった。

【００１０】特徴的性質を欠いた望ましい遺伝子配列を
同定するために、よく特徴付けられた遺伝子系（例え
ば、大腸菌(Escherichia coli)、サッカロミセス・セレ
ビシア(Saccharomyces cerevisiae)、トウモロコシ、哺
乳動物細胞等）が利用された。この方法によれば、細胞
は、識別しうる遺伝子欠損を有した変異体を作るため
に、ＵＶ光、ヒドロキシルアミン等のような化学関係(M
iller,J.H.,Experiments in Molecular Genetics,Cold
Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(1971))又
はトランスポゾン標識のような遺伝手段（Davis,R.W.
ら,A Manual for Genetic Engineering,Advanced Bacte
rial Genetics,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,NY(1980)) で変異誘発される。次いで望ましい
遺伝子配列がこのような変異細胞の遺伝子欠損を補う
（即ち、直す）その能力により同定される。このような
遺伝子同定から、遺伝子配列の遺伝特徴と、遺伝子配列
を特定染色体の領域に位置付ける遺伝子地図の作成を行
えた(Taylor,Bacteriol.Rev.34:155(1970)) 。組換えＤ
ＮＡ技術の出現で、このような遺伝子上特徴付けられた
遺伝子配列をクローニングする（即ち、物理的に単離す
る）ことが可能になった。ゲノムのランダム断片は遺伝
子ライブラリーを作るために自己複製ベクター中に導入
でき、そのメンバーの各々は独特なＤＮＡ断片を含んで
いる(Maniatis,T.ら,In: Molecular Cloning,a Laborat
ory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Ha
rbor,NY(1982))。変異細胞の欠損を補えるものについて
このようなライブラリーのメンバーをスクリーニングす
ることにより、望ましい遺伝子配列をクローニングする
ことができた。

【００１１】これらの方法は多くの遺伝子配列を同定及
びクローニングできるが、それらは識別しうる欠損を付
与する変異を有した宿主細胞が存在して、遺伝子配列が
宿主細胞に入って発現される遺伝子配列送達系（例え
ば、ベクター）中にクローニングしうる場合のみ用いら
れる。ある遺伝子配列を物理的に単離する能力から、変
異又はベクターの不在下であっても望ましい遺伝子配列
を単離できる方法の開発に至った。“染色体歩行”とし
て知られる１つのこのような技術において、望ましい配
列は特定の参照配列とハイブリッド形成できる遺伝子配
列を単離することにより得られる。次いでこの単離され
た遺伝子配列は、初めに単離された配列と部分的に重複
する、隣接した遺伝子配列をクローニングするために、
後のハイブリッド形成実験で参照配列として用いられ
る。この新たに単離された配列は、初めに単離された配
列よりも、望ましい遺伝子配列に物理的に近い。このプ
ロセスは望ましい遺伝子配列が得られるまで繰り返され
る。明らかなように、遺伝子変異体又はベクターの不在
下で遺伝子配列をクローニングする能力には、ヌクレオ
チド配列に関する何らかの初期情報又は望ましい配列の
制限エンドヌクレアーゼ切断プロフィルを要する。

【００１２】一方、ウイルス又は細胞の染色体は、ヌク
レオチド配列又は制限エンドヌクレアーゼ開裂データに
基づき物理的地図（即ち、ＲＦＬＰ地図）を作るため
に、特徴付けることができる。このような地図を用いる
と、染色体の制限断片はそれらの遺伝機能に関していか
なる事前の調べもなしにクローニングできる。更に最近
になり、遺伝子クローニングは、単離されたタンパク質
のアミノ酸配列から導かれた配列を用いて、オリゴヌク
レオチド分子を合成することにより行われた。単離され
たＲＮＡ転写物のｃＤＮＡコピーが作られ、２つの異な
るＲＮＡ源又はｃＤＮＡ及びＲＮＡを用いる異なるコロ
ニー又はライブラリーサブトラクションハイブリッド形
成が望ましいクローンを同定するために行われる。これ
らの方法は変異体又は遺伝子配列送達系の不在下であっ
ても用いてよいが、それらによれば、望ましい配列に天
然で結合された配列が特徴付け及び単離されたか、ある
いはその配列又はこのような配列の制限地図が得られた
ときのみ、望ましい遺伝子配列を同定及びクローニング
できる。このようなデータはしばしば利用できないた
め、これらの方法は望ましい遺伝子配列を同定及びクロ
ーニングする上で使用できないことがある。

【００１３】２つの一般的アプローチは、ある株には存
在して他には存在しない配列のクローニングについて記
載された。第一のアプローチ、差別的スクリーニング
は、ドロソフィラ(Drosophila)からｅｓｃ遺伝子をクロ
ーニングするために用いられた。ゲノムライブラリーの
レプリカをプローブ処理するために欠失のある及び欠失
のない株からのゲノムＤＮＡを用いることは、大きなゲ
ノムについてうまくいかない技術的困難さを有する。加
えて、欠失はいかなる反復配列も含まないゲノムライブ
ラリーにおいて少くとも１つの全体インサートをカバー
していなければならない。

【００１４】第二のアプローチ、競合ハイブリッド形成
は、差別的スクリーニングの代替法を提供する。この技
術はＹ染色体に特異的なクローンを単離するために Lam
arら(Cell,37:171-177(1984)) により用いられた。この
方法によれば、女性からの過剰の剪断ＤＮＡが変性され
て、男性からの少量のＤＮＡ（付着末端を有するように
既に処理された男性由来ＤＮＡ）と一緒に再アニーリン
グされる。男性ＤＮＡのほとんどは剪断ＤＮＡと再会合
して、付着末端を欠いたクローニングしえない断片を生
じる。しかしながら、Ｙ染色体に独特な断片は（Ｙ染色
体に由来する）相補性制限鎖と再会合できただけであっ
た。このため、このような再会合は付着末端のあるクロ
ーニングしうる断片を形成した。この技術はデュシェー
ヌ筋ジストロフィー座及びコロイデレミアでの欠失に相
当するＤＮＡをクローニングするためにもうまく用いら
れた。

【００１５】残念ながら、競合ハイブリッド形成法はか
なり十分な富化度を与えない。例えば、約１００倍の富
化が上記実験で関心のある配列について得られた。この
ように低い程度の富化では、その技術は大きな欠失につ
いて扱うときのみ実用的である。実際に、欠失がゲノム
の０．１％をカバーしているとしても、多くの推定陽性
クローンはゲノムサザンブロットを標識してプローブ処
理することにより個別に試験されねばならない(Souther
n,J.,J.Molec.Biol.,98:503-517(1975))。そのため、そ
の方法はそのままでは、小さな原核ゲノムについて扱わ
ないかぎり、１kbp(キロ塩基対）程度の欠失について実
用的でない。

【００１６】このため、要するに、変異のみによって規
定される座に相当するＤＮＡをクローニングする能力
は、ゲノムライブラリーとの形質転換及び相補性が可能
である大腸菌、Ｓ．セレビシア又は他の生物で行うと
き、比較的簡単な事項である。染色体歩行技術は、変異
体がトランスポゾン標識により得られるか、座がＲＦＬ
Ｐ地図でマーカーに結合できるか、又はゲノムについて
定序化されたライブラリーが存在するならば、遺伝子上
規定された座をクローニングするために他の生物で用い
てもよい。残念ながら、興味ある表現型の変異体が単離
されたが、このような操作が開発されていない、Ａ．タ
リアナのＧＡ合成変異体のような多数の生物がある。こ
のため、多くの遺伝子配列は上記方法を用いると単離で
きない。

【００１７】Ｃ．トランスジェニック及びキメラ植物組換えＤＮＡ及び遺伝子技術に関する最近の進歩は、レ
シピエント植物で望ましい遺伝子配列を導入して発現さ
せることを可能にした。このような方法の使用により、
植物は未変化植物で正常又は天然には存在しない遺伝子
配列を含むように工学処理された。加えて、これらの技
術は天然存在遺伝子配列の変化した発現を示す植物を生
産するために用いられてきた。これら方法の使用により
生産された植物は“キメラ”又は“トランスジェニッ
ク”植物として知られている。“キメラ”植物では、植
物細胞の一部だけが導入遺伝子配列を含有及び発現し
て、他の細胞は未変化のままである。逆に、“トランス
ジェニック”植物の細胞のすべては導入遺伝子配列を含
有している。

【００１８】トランスジェニック植物は形質転換された
単一植物細胞から通常作られる。多くの植物属は単一細
胞から再生された(Friedt,W.ら,Prog.Botany,49:192-21
5(1987) ；Brunold,C.ら,Molec.Gen.Genet.,208:469-47
3(1987) ；Durand,J. ら,Plant Sci.,62:263-272(198
9)：これらの文献は参考のため本明細書に組込まれ
る）。いくつかの方法が外来遺伝子を植物細胞中に送達
して発現させるために開発された。これらには、土壌細
菌Ａ．ツメファシエンス(A.tumefaciens) からの工学処
理Ｔｉプラスミド（Czako,M.ら,Plant Mol.Biol.,6:101
-109(1986)；Jones,J.D.G.ら,EMBO J.,4:2411-2418(198
5)）、カリフラワーモザイクウイルスのような工学処理
植物ウイルス(Shah,D.M.ら,Science,233:478-481(198
6)；Shewmaker,C.K.ら,Virol.,140:281-288(1985))、植
物細胞中への遺伝子配列のマイクロインジェクション(C
rossway,A.ら,Molec.Gen.Genet.,202:179-185(1986); P
otrykus,I.ら,Molec.Gen.Genet.,199:169-177(1985))、
エレクトロポレーション（Fromm,M.E.ら,Nature,319:79
1-793(1986); Morikawa,H.ら,Gene,41:121-124(1986)）
及びＤＮＡコート粒子促進（Bolik,M.ら,Protoplasma,1
62:61-68(1991)）がある。

【００１９】トランスジェニック及びキメラ植物作成用
技術の適用は、古典的遺伝学を用いて作れなかった植物
を生産できる可能性を有している。例えば、キメラ及び
トランスジェニック植物は天然遺伝子発現のプローブと
して実質的用途を有している。食用作物に適用された場
合、その技術は改良された食品、繊維等を生じる可能性
を有している。導入された遺伝子配列の発現の特異的な
時間的及び空間的発現パターンを有するキメラ及びトラ
ンスジェニック植物が作成できる。導入された遺伝子配
列の発現は、時間的又は空間的に転写及び／又は翻訳を
指示する調節配列の選択によりコントロールできる。

【００２０】発明の要旨本発明はＡ．タリアナのＧＡ１座に相当する単離された
ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ、このようなＤＮＡを含有し
たベクター、このようなベクターで形質転換された宿
主、ＧＡ１タンパク質の発現をコントロールする調節領
域と、異種遺伝子の発現を指示するこのような調節配列
の用途に関する。本発明は、ＧＡ１アンチセンスＤＮＡ
と、それから転写されたＧＡ１アンチセンスＲＮＡに更
に関する。本発明は、ＧＡ１コードＤＮＡを含むベクタ
ーと、宿主細胞におけるＧＡ１ＤＮＡによりコードされ
たＧＡ１タンパク質の発現に更に関する。本発明は、Ｇ
Ａ１アンチセンスＤＮＡを含むベクターと、宿主細胞に
おけるＧＡ１アンチセンスＲＮＡの発現に更に関する。
本発明は、本発明のＧＡ１コードＤＮＡで形質転換され
た宿主細胞と、本発明のＧＡ１ＤＮＡの維持又はＧＡ
１タンパク質の発現のためのこのような宿主細胞の用途
に更に関する。本発明は、本発明のＧＡ１アンチセンス
ＤＮＡで形質転換された宿主細胞と、本発明のＧＡ１
ＤＮＡの維持又はＧＡ１タンパク質の発現の阻害のため
のこのような宿主細胞の用途に更に関する。本発明は、
他のＡ．タリアナタンパク質を実質上含まないＧＡ１タ
ンパク質、ＧＡ１タンパク質と結合できる抗体と、この
ようなＧＡ１タンパク質及びそれに対する抗体の用途に
更に関する。本発明は、ＧＡ１コード又はＧＡ１アンチ
センスＤＮＡ配列で形質転換された、あるいはＧＡ１遺
伝子の調節配列によりコントロールされる異種遺伝子で
形質転換されたキメラ及びトランスジェニック植物に更
に関する。本発明は、本発明のＧＡ１コード又はＧＡ１
アンチセンスＤＮＡを用いて植物成長を変えるための方
法に更に関する。本発明は、本発明の組換え作成ＧＡ１
タンパク質を用いて植物成長を変えるための方法に更に
関する。本発明は、ＧＡ１の発現を指示して、ＧＡ１遺
伝子配列と結合する調節タンパク質を単離するための、
ＧＡ１タンパク質コード配列及びＧＡ１タンパク質と結
合できる抗体の用途に更に関する。

【００２１】好ましい態様の説明ゲノムサブトラクションを用いて、ＧＡの合成に関与す
る遺伝子が単離された。ゲノムサブトラクションは、あ
る核酸集団に存在するが、他には存在しない遺伝子配列
を富化して、クローン単離するための方法である。ＧＡ
１遺伝子のクローニングを実証する本明細書で記載され
た操作に従い、ＧＡ合成に関与する他の遺伝子を単離す
ることも可能である。

【００２２】Ａ．Ａ．タリアナからのＧＡ１遺伝子ゲノムサブトラクションの技術を用いて、Ａ．タリアナ
のＧＡ１座によりコードされるＧＡの合成に関与する遺
伝子がクローニングされた（以下ＧＡ１遺伝子、例
１）。本発明の一態様において、ＧＡ１タンパク質又は
その断片についてコードするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ
を含んだベクターが提供される。具体的には、このよう
なベクターは、他のＡ．タリアナＤＮＡを実質上含まな
いＧＡ１配列を大量に作ることができる。本明細書で用
いられる植物とは、被子植物（単子葉及び双子葉植物）
及び裸子植物を含めた、光合成できる多細胞分化生物に
関するものとして理解されるべきである。

【００２３】本明細書で用いられる植物細胞とは、植物
の構造的及び生理学的単位に関するものとして理解され
るべきである。“植物細胞”という用語は、植物の一部
である又はそれに由来するあらゆる細胞に関する。本発
明に包含される細胞の一部の例には、生育植物の一部で
ある分化細胞；培養中の分化細胞；培養中の未分化細
胞；カルス又は腫瘍のような未分化組織の細胞がある。
本明細書で用いられる植物細胞子孫とは、カルス；茎、
根、果実、葉又は花のような植物部分；植物；植物種
子；花粉；植物胚を含めた植物細胞に由来するあらゆる
細胞又は組織に関するものとして理解されるべきであ
る。胎芽とは、有性又は無性増殖させるか、あるいはイ
ンビボ又はインビトロで増殖させることができる、あら
ゆる植物物質に関するものとして理解されるべきであ
る。このような胎芽は、好ましくは再生植物の原形質
体、細胞、カルス、組織、胚又は種子からなる。

【００２４】トランスジェニック植物とは、遺伝物質中
に安定的に組み込まれた外来ＤＮＡを有する植物に関す
るものとして理解されるべきである。その用語には、例
えば環状、直鎖又は超コイル形の裸ＤＮＡ、ヌクレオソ
ーム、染色体、核又はそれらの部分の中に含まれるＤＮ
Ａ、他の分子と複合化又は会合されたＤＮＡ、リポソー
ム、スフェロプラスト、細胞又は原形質体中に封入され
たＤＮＡを含めて、様々な形で細胞又は原形質体中に導
入しうる外来ＤＮＡを含んでいる。

【００２５】変異とは、娘細胞とできればそれに続く世
代にも伝達されて、変異細胞又は変異生物を生じる、遺
伝物質で検出しうる変化に関するものとして理解される
べきである。変異細胞の子孫が多細胞生物で体細胞のみ
を生じるならば、細胞の変異箇所又は部分が現れる。有
性生殖生物の生殖系における変異は配偶子により次世代
に伝達されて、体及び生殖双方の細胞で新たな変異状態
にある個体を生じる。変異は化学的又は物理的構成、変
異性、複製、表現型機能又は１以上のデオキシリボヌク
レオチドの組換えに影響を与えるいかなる検出しうる自
然でない変化（又は組合せ）であってもよく、ヌクレオ
チドは付加、欠失、置換、逆位されても、又は逆位を伴
い及び伴わずに新たな位置に転位されてもよい。変異は
自然に起きても、変異原の適用で実験的に誘導してもよ
い。核酸分子の変異バリエーションは変異による。変異
ポリペプチドは変異核酸分子によるものでもよい。

【００２６】種とは、現実的又は潜在的交配自然集団の
グループに関するものとして理解されるべきである。核
酸分子又はタンパク質の種バリエーションは種の中で起
きる核酸又はアミノ酸配列の変化であり、問題となって
いる分子のＤＮＡ配列決定により調べてもよい。

【００２７】様々な宿主系で所定配列を増殖するための
ベクターは周知であり、ベクターがＧＡ１配列を含ん
で、望ましい宿主で増殖されるように、当業者により容
易に変更することができる。このようなベクターにはプ
ラスミド及びウイルスがあり、このような宿主には真核
生物及び細胞、例えば酵母、昆虫、植物、マウス又はヒ
ト細胞と、原核生物、例えば大腸菌及び枯草菌(B.subti
lis)がある。

【００２８】本明細書で用いられる配列は、サンプル又
はベクター中に存在する唯一のＡ．タリアナＤＮＡが具
体的に言及された配列であるとき、“他のＡ．タリアナ
ＤＮＡを実質上含まない”と言われる。本明細書で用い
られる“ＤＮＡ組立体”とは、組換え人工ＤＮＡに関す
る。本明細書で用いられる“その断片”とは、全ＧＡ１
配列のあらゆるポリヌクレオチドサブ集団に関する。最
も好ましい断片は、ＧＡ１によりコードされる酵素の活
性部位、又は各々ＧＡ１タンパク質及び遺伝子の調節領
域を含んだものである。

【００２９】本発明の別の態様では、他のＡ．タリアナ
タンパク質を実質上含まずに、大量のＧＡ１タンパク質
を発現及び生産できる発現ベクターが記載されている。
本明細書で用いられるタンパク質とは、サンプル中に存
在する唯一のＡ．タリアナタンパク質が発現タンパク質
であるとき、“他のＡ．タリアナタンパク質を実質上含
まない”と言われる。他のＡ．タリアナタンパク質と相
同的であるタンパク質がサンプル中に存在していても、
サンプル中に含まれる相同的タンパク質がＡ．タリアナ
から得られる遺伝子から発現されないかぎり、“他の
Ａ．タリアナタンパク質を実質上含まない”となお言わ
れる。

【００３０】ＤＮＡのような核酸分子は、それが転写及
び翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含み、このよ
うな配列がポリペプチドについてコードするヌクレオチ
ド配列に“機能的に結合されている”ならば、ポリペプ
チドを“発現できる”と言われる。機能的結合鎖とは、
調節ＤＮＡ配列と発現させたいＤＮＡ配列とが遺伝子配
列を発現させるような仕方で連結されている結合鎖であ
る。遺伝子配列発現に必要な調節領域の正確な性質は生
物毎に違うが、原核細胞においては、（ＲＮＡ転写の開
始を指示する）プロモーターと、ＲＮＡに転写されると
きに遺伝子合成の開始を知らせるＤＮＡ配列とを双方と
も含んだ、プロモーター領域を一般的に含む。このよう
な領域は、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡ
ＡＴ配列等のような、転写及び翻訳の開始に関与する
５′非コード配列を通常含む。所望であれば、ＧＡ１遺
伝子についてコードする遺伝子配列の３′側にある非コ
ード領域は前記方法で得られる。この領域は、終結及び
ポリアデニル化のような、その転写終結調節配列のため
に留めてもよい。このため、ＧＡ１遺伝子についてコー
ドするＤＮＡ配列と自然に連続する３′領域を留めるこ
とにより、転写終結シグナルが設けられてもよい。転写
終結シグナルが発現宿主細胞で十分に機能的でない場合
は、宿主細胞で機能的な３′領域が代用される。

【００３１】２つのＤＮＡ配列（例えば、プロモーター
領域配列及びＧＡ１遺伝子コード配列）は、２つのＤＮ
Ａ配列間の結合鎖の性質が（１）フレームシフト変異の
導入を行うか、（２）ＧＡ１遺伝子配列の転写を指示す
るプロモーター領域配列の能力を妨げるか、又は（３）
プロモーター領域配列により転写されるＧＡ１遺伝子配
列の能力を妨げる、ということがないならば、機能的に
結合されていると言われる。このため、プロモーター領
域は、プロモーターがＤＮＡ配列の転写を行えるなら
ば、そのＤＮＡ配列に結合されている。

【００３２】本明細書で用いられるストリンジェントハ
イブリッド形成条件とは、ＤＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡ
の相補性部分間で少くとも９０％の相同率を確立するた
めに、当業者により通常用いられる条件であると理解す
べきである。少くとも７０％の相同率又は好ましくは少
くとも８０％のような、それより少ない相同率も望まし
く、ハイブリッド形成条件を変えることで得られる。

【００３３】ＤＮＡの変性鎖とのハイブリッド形成が起
きるには、３つだけの要件がある。（１）サンプル中に相補的な一本鎖がなければならな
い。（２）一本鎖ＤＮＡの溶液のイオン強度は、塩基が
互いに接近できるほどかなり高くなければならない；操
作上、これは０．２Ｍ以上を意味する。（３）ＤＮＡ濃
度は分子間衝突が妥当な頻度で起きる上で十分高くなけ
ればならない。第三条件は、再生／ハイブリッド形成が
起きるかどうかではなく、速度だけに影響を与えること
である。

【００３４】当業者により日常的に用いられる条件は、
すぐ入手できる操作テキスト、例えば参考のため本明細
書に組み込まれるCurrent Protocol in Molecular Biol
ogy,Vol.I,Chap.2.10,John Wiley & Sons,Publishers(1
994)又はSambrookら,Molecular Cloning,Cold Spring H
arbor(1989) で示されている。当業者により知られるよ
うに、最終的なハイブリッド形成の厳密さは現実のハイ
ブリッド形成条件とハイブリッド形成後の洗浄条件双方
に影響を与えるが、これらの条件を変えて望ましい結果
を得るための方法は周知である。前ハイブリッド形成溶
液は、望ましい温度と、望ましい前ハイブリッド形成時
間で、固体マトリックス上の非特異的部位とのハイブリ
ッド形成を行う上で、十分な塩及び非特異的ＤＮＡを含
有しているべきである。例えば、下記組成からなる、Ch
urch及びGilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1991-199
5(1984) の場合のような公知のハイブリッド形成混合液
も使用できる：１％結晶グレード牛血清アルブミン／１
mMＥＤＴＡ／０．５ＭＮａＨＰＯ_４、ｐＨ７．２／７
％ＳＤＳ。前ハイブリッド形成及びハイブリッド形成は
６５℃で起きる。洗浄は６５℃で２×塩化ナトリウム、
クエン酸ナトリウム溶液（ＳＳＣ）（１×ＳＳＣは０．
１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ；ｐＨ
７．０である）で５分間にわたり２回、その後６５℃で
２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳで３０分間にわたり２回、そ
の後室温で０．１×ＳＳＣで５分間にわたり２回行われ
る。

【００３５】一方、ストリンジェントハイブリッド形成
の場合、このような前ハイブリッド形成溶液は６×シン
グルストレンクスクエン酸塩（ＳＳＣ）、５×デンハー
ト溶液、０．０５％ピロリン酸ナトリウムと、１００μ
g/mlの非特異的ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質、例えば
ニシン精子ＤＮＡを含有することができる。適切なスト
リンジェントハイブリッド形成混合液は６×ＳＳＣ、１
×デンハート溶液、１００μg/mlの非特異的ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ又はタンパク質、例えば酵母ｔＲＮＡと、０．０５
％ピロリン酸ナトリウムを含有することができる。ＤＮＡ‐ＤＮＡ分析用の別の代替条件では以下を要す
る：１）室温で前ハイブリッド形成及び６８℃でハイブリッ
ド形成；２）室温で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄；３）所望であれば、４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％
ＳＤＳで追加洗浄（中度厳密洗浄）；又は４）所望であれば、６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％
ＳＤＳで追加洗浄（高度厳密）。

【００３６】別の代替の、但し類似した反応条件はSamb
rookら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor(1989)
でもみられる。ホルムアミドも、所望であれば前ハイブ
リッド形成／ハイブリッド形成溶液中に含有させてよ
い。これらの条件は限定的又は制限的であることを意味
せず、望ましい目的を達成する上で当業者により要求さ
れるように調整してもよいことが理解されるべきであ
る。こうして、適切な宿主により認識されるＧＡ１遺伝
子転写及び翻訳シグナルを発現させることが必要であ
る。

【００３７】本発明は原核又は真核細胞でＧＡ１遺伝子
タンパク質（又はその機能性誘導体）の発現にも関す
る。好ましい原核宿主には、大腸菌、バチルス(Bacillu
s)、ストレプトミセス(Streptomyces)、シュードモナス
(Pseudomonas) 、サルモネラ(Salmonella)、セラチア(S
erratia)等のような細菌がある。最も好ましい原核宿主
は大腸菌である。特に興味ある細菌宿主には大腸菌Ｋ１
２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、大腸菌χ１７７６
（ＡＴＣＣ３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ^-、ラ
ムダ^-、原栄養性（ＡＴＣＣ２７３２５））、他の腸内
細菌、例えばサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella
typhimurium)又はセラチア・マルセセンス(Serratia ma
rcescens) と、様々なシュードモナス種がある。このよ
うな条件下で、ＧＡ１遺伝子はグリコシル化されない。
原核宿主は発現プラスミドにおけるレプリコン及びコン
トロール配列と適合しなければならない。

【００３８】原核細胞（例えば、大腸菌、Ｂ．ズブチリ
ス、シュードモナス、ストレプトミセス等）でＧＡ１遺
伝子（又はその機能性誘導体）を発現させるためには、
ＧＡ１遺伝子コード配列を機能性原核プロモーターに機
能的に結合させることが必要である。このようなプロモ
ーターは構成的でも、又は更に好ましくは調節性（即
ち、誘導性又は抑制解除性）であってもよい。構成プロ
モーターの例には、バクテリオファージλのｉｎｔプロ
モーター、ｐＢＲ３２２のβ‐ラクタマーゼ遺伝子配列
のｂｌａプロモーター、ｐＢＲ３２５のクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴ
プロモーター等がある。誘導性原核プロモーターの例に
は、バクテリオファージλの主要右及び左プロモーター
（Ｐ_L及びＰ_R）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃ
Ｚ、ｌａｃＩ、ｇａｌプロモーター、α‐アミラーゼ
（Ulmanen,I.ら,J.Bacteriol.,162:176-182(1985))、
Ｂ．ズブチリスのζ‐２８‐特異的プロモーター(Gilma
n,M.Z.ら,Gene sequence,32:11-20(1984))、バチルスの
バクテリオファージのプロモーター(Gryczan,T.J.,In:
The Molecular Biology of the Bacilli,Academic Pres
s,Inc.,NY(1982))及びストレプトミセスプロモーター(W
ard,J.M.ら,Mol.Gen.Genet.,203:468-478(1986))があ
る。

【００３９】原核プロモーターはGlick,B.R.(J.Ind.Mic
robiol.,1:277-282(1987))；Cenatiempo,Y.(Biochimie,
68:505-516(1986)) 及びGottesman,S.(Ann.Rev.Genet.,
18:415-442(1984)) により示されている。

【００４０】原核細胞での適正な発現には、遺伝子配列
コード配列の上流にリボソーム結合部位の存在も要す
る。このようなリボソーム結合部位は、例えば Gold,L.
ら(Ann.Rev.Microbiol.,35:365-404(1981)) により開示
されている。好ましい真核宿主には、インビボ又は組織
培養いずれかの、酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞
がある。宿主として有用である哺乳動物細胞には、ＶＥ
ＲＯ又はＣＨＯ‐Ｋ１のような繊維芽細胞源の細胞、あ
るいはハイブリドーマＳＰ２／Ｏ‐ＡＧ１４又はミエロ
ーマＰ３×６３Ｓｇ８のようなリンパ様源の細胞と、そ
れらの誘導体がある。好ましい哺乳動物宿主細胞には、
ＳＰ２／０及びＪ５５８Ｌと、正確な翻訳後プロセッシ
ングのために良い能力を示すＩＭＲ３３２のような神経
芽腫細胞系がある。

【００４１】哺乳動物宿主の場合には、いくつかの可能
なベクター系がＧＡ１遺伝子の発現に利用しうる。様々
な転写及び翻訳調節配列が、宿主の性質に応じて用いら
れる。転写及び翻訳調節シグナルは、調節シグナルが高
レベルの発現を有する特定遺伝子配列と関連している、
アデノウイルス、牛パピローマウイルス、シミアンウイ
ルス等のようなウイルス源に由来していてもよい。一
方、アクチン、コラーゲン、ミオシン等のような哺乳動
物発現産物からのプロモーターも用いてよい。遺伝子配
列の発現が調節されうるように抑制又は活性化を行える
転写開始調節シグナルが選択できる。温度を変えること
で発現が抑制又は開始されるように温度感受性である
か、あるいは化学的（例えば、代謝産物）調節に付され
る調節シグナルが興味ある。

【００４２】酵母は、それが翻訳後ペプチド修飾も行え
るという実質的利点を示す。酵母で望ましいタンパク質
の生産に利用できる強プロモーター配列及び高コピー数
プラスミドを利用するいくつかの組換えＤＮＡ戦略が存
在する。酵母はクローン化哺乳動物遺伝子配列産物でリ
ーダー配列を認識して、リーダー配列を保有するペプチ
ド（即ち、プレペプチド）を分泌する。酵母がグルコー
スに富む培地で増殖されたとき多量に生産される解糖系
酵素についてコードする、活発に発現される遺伝子配列
からのプロモーター及び終結要素を組み込んだ一連の酵
母遺伝子配列発現系のいずれもが利用できる。公知の解
糖系遺伝子配列は非常に効率的な転写コントロールシグ
ナルも与えることができる。例えば、ホスホグリセリン
酸キナーゼ遺伝子配列のプロモーター及びターミネータ
ーシグナルが利用できる。

【００４３】もう１つの好ましい宿主は昆虫細胞、例え
ばドロソフィラ幼虫である。宿主として昆虫細胞を用い
ると、ドロソフィラアルコールデヒドロゲナーゼプロモ
ーターが使用できる。Rubin,G.M.,Science,240:1453-14
59(1988)。一方、バキュロウイルスベクターは昆虫細胞
で多量のＧＡ１遺伝子を発現するように工学処理できる
(Jasny,B.R.,Science,238:1653(1987)；Miller,D.W.
ら,in Genetic Engineering(1986),Setlow,J.K. ら,ed
s.,Plenum,Vol.8,pp.277-297)。前記のように、真核宿
主でのＧＡ１遺伝子の発現には真核調節領域の使用を要
する。このような領域は、一般的に、ＲＮＡ合成の開始
を指示する上で十分なプロモーター領域を含む。好まし
い真核プロモーターには、マウスメタロチオネインＩ遺
伝子配列のプロモーター（Hamer,D.ら,J.Mol.Appl.Ge
n.,1:273-288(1982)) 、ヘルペスウイルスのＴＫプロモ
ーター(McKnight,S.,Cell,31:355-365(1982)) 、ＳＶ４
０初期プロモーター（Benoist,C.ら,Nature(London),29
0:304-310(1981))、酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモータ
ー(Johnston,S.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),79:697
1-6975(1982)；Silver,P.A. ら,Proc.Natl.Acad.Sci.(U
SA),81:5951-5955(1984)) がある。

【００４４】広く知られているように、真核ｍＲＮＡの
翻訳は第一メチオニンについてコードするコドンで開始
される。この理由から、真核プロモーターとＧＡ１遺伝
子（又はその機能性誘導体）についてコードするＤＮＡ
配列との間の結合鎖がメチオニンについてコードできる
いかなる介在コドン（即ち、ＡＵＧ）も含んでいないこ
とを保証することが好ましい。このようなコドンの存在
は、（ＡＵＧコドンがＧＡ１遺伝子コードＤＮＡ配列と
同様の読取枠にあるならば）融合タンパク質の形成又は
（ＡＵＧコドンがＧＡ１遺伝子コード配列と同様の読取
枠にないならば）フレームシフト変異を起こす。

【００４５】ＧＡ１遺伝子コード配列及び機能的に結合
されたプロモーターは、直鎖分子又は更に好ましくは共
有結合閉環分子である非複製ＤＮＡ（又はＲＮＡ）分子
として、レシピエント原核又は真核細胞中に導入され
る。このような分子は自律的複製できないため、ＧＡ１
遺伝子の発現は導入配列の一時的発現を介して起きる。
一方、永続的発現は宿主染色体中への導入配列の組込み
を介して起きる。一態様において、宿主細胞染色体中に
望ましい遺伝子配列を組込むことができるベクターが用
いられる。導入ＤＮＡを染色体中に安定的に組込んだ細
胞は、発現ベクターを含んだ宿主細胞の選択を行える１
種以上のマーカーも導入することにより選択できる。マ
ーカーは栄養要求性宿主に原栄養性、即ち殺生物耐性、
例えば抗生物質、又は銅のような重金属等の耐性を付与
できる。選択しうるマーカー遺伝子配列は発現されるＤ
ＮＡ遺伝子配列に直接結合させても、又はコトランスフ
ェクションにより同細胞中に導入してもよい。追加の要
素も一本鎖結合タンパク質ｍＲＮＡの最適合成にとり要
求できる。これらの要素にはスプライスシグナルと、転
写プロモーター、エンハンサー及び終結シグナルがあ
る。このような要素を組込んだｃＤＮＡ発現ベクターに
は、Okayama,H.,Molec.Cell.Biol.,3:280(1983) により
記載されたものがある。

【００４６】好ましい態様において、導入配列はレシピ
エント宿主で自律複製できるプラスミド又はウイルスベ
クター中に組込まれる。様々なベクターのうちいずれも
この目的のために使用できる。特定のプラスミド又はウ
イルスベクターを選択する上で重要なファクターには、
ベクターを含むレシピエント細胞が認識されて、そのベ
クターを含まないレシピエント細胞から選択できる容易
性；特定宿主で望まれるベクターのコピー数；異なる種
の宿主細胞間でベクターを“運搬”できることが望まし
いかどうかということがある。好ましい原核ベクターに
は、大腸菌で複製できるようなプラスミド（例えば、ｐ
ＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１
８４、πＶＸ）がある。このようなプラスミドは、例え
ば Maniatis,T.ら(In: Molecular Cloning,A Laborator
y Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb
or,NY(1982))により開示されている。バチルスプラスミ
ドにはｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７等がある。
このようなプラスミドはGryczan,T.(In: The Molecular
Biology of the Bacilli,Academic Press,NY(1982),p
p.307-329) により開示されている。適切なストレプト
ミセスプラスミドにはｐＩＪ１０１（Kendall,K.J.ら,
J.Bacteriol.,169:4177-4183(1987))及びφＣ３１のよ
うなストレプトミセスバクテリオファージ(Chater,K.F.
ら,In: Sixth International Symposium on Actinomyce
tales Biology,Akademiai Kaido,Budapest,Hungary(198
6),pp.45-54)がある。シュードモナスプラスミドは Joh
n,J.F.ら(Rev.Infect.Dis.,8:693-704(1986)) 及びIzak
i,K.(Jpn.J.Bacteriol.,33:729-742(1978)) により示さ
れている。

【００４７】好ましい真核プラスミドにはＢＰＶ、ワク
シニア、ＳＶ４０、２‐ミクロンサークル等、又はそれ
らの誘導体がある。このようなプラスミドは当業界で周
知である(Botstein,D.ら,Miami Wntr.Symp.,19:265-274
(1982)；Broach,J.R.,In: The Molecular Biology of t
he Yaest Saccharomyces: Life Cycle and Inheritanc
e,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbo
r,NY,p.445-470(1981)；Broach,J.R.,Cell,28:203-204
(1982) ；Bollon,D.P. ら,J.Clin.Hematol.Oncol.,10:3
9-48(1980) ；Maniatis,T.,In: Cell Biology: A Compr
ehensive Treatise,Vol.3,Gene sequence Expression,A
cademic Press,NY,pp.563-608(1980)）。組立体を含ん
だベクター又はＤＮＡ配列が発現用に作られると、その
ＤＮＡ組立体は、様々な適切な手段：形質転換、トラン
スフェクション、複合化、原形質体融合、エレクトロポ
レーション、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロイン
ジェクション等のいずれかにより、適切な宿主細胞中に
導入される。ベクターの導入後、レシピエント細胞はベ
クター含有細胞の増殖について選択する選択培地で増殖
される。クローン化遺伝子配列の発現は、ＧＡ１遺伝子
又はその断片の生産を起こす。これはそのままで、又は
（例えば、神経芽腫細胞等へのブロモデオキシウラシル
の投与による）分化されるこれら細胞の誘導後に、形質
転換細胞中で起きる。

【００４８】適切な宿主で発現後に、ＧＡ１タンパク質
は、他のＡ．タリアナタンパク質を含まないＧＡ１タン
パク質を生産するために、イムノクロマトグラフィー又
はＨＰＬＣのような標準技術を用いて容易に単離するこ
とができる。染色体歩行技術を用いることにより、当業
者はＧＡ１の他の全長ゲノムコピーと、ＧＡ１コード領
域の５′側にある調節配列を含んだクローンを容易に単
離することができる。本明細書で用いられる“全長ゲノ
ムコピー”とは、タンパク質の全コード領域を含んだＤ
ＮＡセグメントに関する。

【００４９】本明細書で用いられる“調節配列”とは、
機能的結合ＤＮＡ／ＲＮＡ配列の転写及び／又は翻訳を
指示できるＤＮＡ配列に関する。このような調節配列に
はプロモーター、リボソーム結合部位及び調節タンパク
質結合部位があるが、それらに制限されない。当業者で
あれば、コード領域の５′でみられる配列をコンピュー
タープログラム“モチーフ”及び“コンセンサス”によ
り認識されるような公知の調節配列モチーフと比較する
ことにより、ある調節配列を容易に同定することができ
る。詳しくは、本明細書で開示されたＧＡ１ＤＮＡ配
列は染色体歩行でＡ．タリアナゲノムＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングするために用いられた。Ａ．タリア
ナに関するゲノムＤＮＡライブラリーは市販されている
か〔クロンテック・ラボラトリーズ社（Clontech Labor
atories Inc.) 及びアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション〕、又は当業界で知られる様々な技術を用
いて作ることができる（Sambrookら,Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press(198
9)）。ある配列の５′又は３′側で重複して生じるクロ
ーンを単離することにより、図６の配列とハイブリッド
形成する配列が同定及び単離された。このような配列は
ベクターｐＧＡ１‐４（ＡＴＣＣ No.７５３９５）及び
λＧＡ１‐３中に含まれている。

【００５０】調節配列はコード領域の５′側に通常出現
する。本発明の好ましい調節配列は、ＧＡ１開始コドン
（ＡＴＧ／Ｍｅｔ）の５′側に約−２kb〜０bpで出現す
るものである。更に好ましい配列は約−５００〜０bpで
出現し、最も好ましくは約−２５０〜０bpの配列であ
る。当業界で知られる技術と本明細書で記載されたクロ
ーンを用いると、ＧＡ１遺伝子の機能性誘導体とこの遺
伝子の調節配列を作成することができる。このような誘
導体によれば、所定の生物活性を特定の配列及び／又は
構造にもたせて、変化した生物学的又は物理的性質のあ
る誘導体をデザイン及び作成することを当業者に可能と
する。このような調節領域によれば、ハイブリッド性質
を有した望ましいハイブリッド構造を与えるように、非
相同性（即ち、ＧＡ１ではない）要素を調節要素機能性
誘導体と機能的に結合させることを当業者に可能とす
る。

【００５１】機能性誘導体の作成は、例えば部位特定変
異誘発により行える（Sambrookら,Molecular Cloning:
A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(198
9)）。部位特定変異誘発によれば、望ましい変異ＤＮＡ
配列を含んだ特異的オリゴヌクレオチドの使用により、
機能性誘導体の生産を行える。配列バリエーションを導
入するための部位は既定されているが、変異自体は既定
する必要がない。例えば、所定部位で変異の実施を最適
化するためには、ランダム変異誘発が標的領域で行われ
て、新たに作成された配列は望ましい活性の最適な組合
せについてスクリーニングすることができる。

【００５２】こうして作成された機能性誘導体は、異種
遺伝子と機能的に結合されたときに、天然配列と同質の
生物活性を示すことができる。しかしながら、その誘導
体は植物ホルモンに応答した誘導レベルについてこのよ
うな特徴に実質上異なることがある。当業者であれば、
誘導体の機能がルーチンスクリーニングアッセイにより
評価できると認識している。例えば、部位特定変異誘発
で作られた機能性誘導体はβ‐グルクロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）のようなレポーター遺伝子と機能的に結合させて、
それからキメラ遺伝子はキメラ又はトランスジェニック
植物、あるいは一時的発現系で植物ホルモン応答性につ
いて定量スクリーニングすることができる。レポーター
遺伝子及びＧＡ１調節要素を用いると、ＧＡ１プロモー
ターの組織特異性及び強度を変える変異が行える。ＧＡ
１調節要素の配列を分析することにより、当業者はＧＡ
１プロモーターに存在する様々なタンパク質結合モチー
フを認識して、変異誘発活性をこれらの領域に振り向け
る。

【００５３】本発明のもう１つの態様では、ＧＡ１タン
パク質と結合する抗体が提供される。詳しくは、ＧＡ１
タンパク質と結合する抗体は、当業界で知られる技術を
用いて、様々な方法で作成できる。特に、１つのこのよ
うな方法では、発現宿主又は植物組織から精製されたＧ
Ａ１タンパク質が適切な哺乳動物宿主を免疫するために
用いられる。当業者であればポリクローナル及びモノク
ローナル双方の抗ＧＡ１抗体を作るために既知操作を容
易に適合させる(Harlow,Antibodies,Cold Spring Harbo
r Press(1989))。

【００５４】一方、抗ＧＡ１抗体は合成ペプチドを用い
て作成できる。本明細書で記載されたＧＡ１遺伝子によ
りコードされる演繹アミノ酸配列を用いると、適切な宿
主に投与されたときにＧＡ１タンパク質と結合する抗体
が作られるように、合成ペプチドは作成できる。

【００５５】本発明の別の態様において、細胞又は組織
でＧＡ１遺伝子の発現又はＧＡ１タンパク質の存在を検
出するための操作が記載されている。特に、本発明の抗
体及びＤＮＡ配列を用いると、当業者はＧＡ１コードＲ
ＮＡ又はＧＡ１タンパク質自体の存在を検出するため
に、現場ハイブリッド形成、ＥＬＩＳＡ及びタンパク質
又は核酸ブロッティング技術のような既知アッセイ方式
を容易に適合させることができる。このような検出系を
利用すると、ＧＡ１遺伝子を転写又は翻訳する特定の組
織及び細胞を同定することができる。

【００５６】Ｂ．発現がＧＡ１遺伝子に似た遺伝子を含
むトランスジェニック又はキメラ植物本発明のもう１つの態様において、植物がＧＡ１と同様
の時間的及び空間的様式で発現される１以上の外来供給
遺伝子を含んでいる、キメラ又はトランスジェニック植
物を作る方法が記載されている。詳しくは、キメラ又は
トランスジェニック植物は、それが外来供給発現モジュ
ールを含むように作られる。発現モジュールは、異種遺
伝子に機能的に結合された、ＧＡ１遺伝子の調節要素を
含んでいる。

【００５７】最初の方で記載されたように、ＧＡ１遺伝
子の調節領域はＧＡ１開始コドン（Ｍｅｔ）の５′側で
約−２kb〜０bpの領域に含まれる。当業者であれば、こ
の領域又はその断片を含んだ発現モジュールを容易に作
成することができる。異種遺伝子を調節領域に結合させ
て、その後植物で異種遺伝子を発現させる方法は、当業
界で周知である(Weissbachら,Methods for Plant Molec
ular Biology,Academic Press,San Diego,CA(1988)) 。
当業者は、ＧＡ１調節要素を利用するために、エレクト
ロポレーション、Ｔｉプラスミド媒介形質転換、粒子促
進及び植物再生のような植物細胞形質転換に関する操作
を容易に適合させる。発現モジュールにおいて、原形質
体が全再生植物を得るために単離及び培養しうるすべて
の植物は、本発明の発現モジュールで形質転換させるこ
とができる。発現の効力は利用される植物に応じて植物
種毎に違う。しかしながら、当業者であればＧＡ１調節
要素が機能する植物変種を容易に決定することができ
る。

【００５８】本発明のもう１つの態様において、キメラ
又はトランスジェニック植物でＧＡ１コードＲＮＡの翻
訳を調節する方法が記載されている。本発明で用いられ
る調節では、翻訳の自然発生レベルの増加又は減少を伴
う。特に、ＧＡ１コードＲＮＡの翻訳はアンチセンスク
ローニングの技術を用いて減少させることができる。ア
ンチセンスクローニングは植物系で有効であることが証
明され、ＧＡ１遺伝子を利用するため当業者により容易
に適合させることができる（Oellerら,Science,254:437
-439(1991)) 。

【００５９】一般的に、アンチセンスクローニングでは
ＧＡ１コードＲＮＡ（センス）に相補的なＲＮＡ（アン
チセンス）についてコードする発現モジュールの作成を
要する。センス鎖を発現する細胞でアンチセンスＲＮＡ
を発現させることにより、２つのＲＮＡ種間でハイブリ
ッド形成が生じて、翻訳の阻止を起こす。本発明のもう
１つの態様において、ＧＡ１タンパク質の活性を調節す
る方法が記載されている。特に、ＧＡ１の活性は、抗Ｇ
Ａ１抗体についてコードする発現モジュールで植物を形
質転換することにより、トランスジェニック又はキメラ
植物で抑制できる。発現された抗体は遊離ＧＡ１と結合
し、こうして機能するタンパク質能力を損なう。当業者
は、抗ＧＡ１抗体についてコードするＤＮＡが当業界で
公知の技術を用いて容易に得られることを認識してい
る。一般的に、このようなＤＮＡはｃＤＮＡとして得ら
れ、抗ＧＡ１抗体を生産するハイブリドーマから単離さ
れたｍＲＮＡから作成される。このようなハイブリドー
マを得る方法は初めの方で記載されている。

【００６０】Ｃ．植物における遺伝子発現の研究のため
の系本発明のもう１つの態様において、ＧＡ１遺伝子の誘導
に関与するタンパク質と分子相互作用を確認するための
方法が記載されている。詳しくは、ＧＡ１遺伝子の調節
配列を用いると、このような配列と結合するタンパク質
を単離することができる。特異的ＤＮＡ配列と結合でき
る調節因子の単離のための操作は、当業界で周知であ
る。１つのこのような方法はアフィニティクロマトグラ
フィーである。調節配列を含んだＤＮＡはセファロース
のような適切なマトリックス上に固定されて、クロマト
グラフィーでアフィニティマトリックスとして用いられ
る(Arcangioli,B.ら,Eur.J.Biochem.179:359-364(198
9)) 。

【００６１】ＧＡ１調節要素と結合するタンパク質は、
ＧＡ１遺伝子を発現する植物組織から抽出できる。この
ような方式で得られたタンパク質抽出物は、固定された
ＧＡ１調節領域を含有したカラムに適用される。ＤＮＡ
配列と結合しないタンパク質はカラムから洗い出され
て、ＤＮＡ配列と結合するタンパク質は塩勾配を用いた
カラムから除去される。こうして得られたＤＮＡ結合タ
ンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、高性能液
体クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィ
ーのような操作を用いて、更に精製することができる。
ＤＮＡ結合タンパク質の精製中に、タンパク質はゲル遅
延アッセイを用いて容易に調べることができる(Garner,
M.M.ら,Nucl.Acid Res.9:3047(1981) 及びFried,M.ら,N
ucl.Acid Res.9:6506(1981))。ＤＮＡ結合タンパク質が
精製されると、部分アミノ酸配列はタンパク質のＮ末端
から得ることができる。一方、タンパク質はトリプシン
地図化して、断片の１つのアミノ酸配列が決定できる。

【００６２】次いで、導かれたアミノ酸配列はオリゴヌ
クレオチドプローブを作成するために用いられる。プロ
ーブの配列は生物でより多く用いられることが知られた
コドン（コドン優先）に基づいていても、一方プローブ
はポリペプチドについてコードするすべての可能なコド
ン組合せ（縮重）の混合物からなっていてもよい。この
ようなプローブは、ＤＮＡ結合タンパク質をコードする
配列についてｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリ
ーニングするために使用できる。ＤＮＡ結合タンパク質
についてコードする遺伝子が得られたら、結合タンパク
質についてコードするＤＮＡの配列が決定でき、その遺
伝子は発現系を用いて多量のタンパク質を得るために使
用できるか、又は変異分析においてＤＮＡと相互作用す
るタンパク質内の機能性領域を更に規定するために使え
る。

【００６３】一方、ＧＡ１調節要素と結合するタンパク
質は、サウスウェスタンブロッティングの技術を用いて
このようなタンパク質を発現するクローンを同定するこ
とにより単離できる（Sharp,Z.D.ら,Biochim.Biophys A
cta,1048:306-309(1990)；Gunther,C.V.ら, Genes De
v.,4:667-679(1990)；Walker,M.D. ら,Nucleic Acids R
es.,18:1159-1166(1990)) 。サウスウェスタンブロット
では、発現タンパク質がコロニー又はプラーク移転でフ
ィルター上に固定されたｃＤＮＡ発現ライブラリーをス
クリーニングするために、標識ＤＮＡ配列が用いられ
る。標識ＤＮＡ配列は特定ＤＮＡ配列と結合できるタン
パク質を発現するコロニー又はプラークと結合する。標
識ＤＮＡ配列と結合するタンパク質を発現するクローン
は精製でき、ＤＮＡ結合タンパク質についてコードする
ｃＤＮＡインサートが単離及び配列決定できる。単離さ
れたＤＮＡは、更に精製及び研究のため多量のタンパク
質を発現させるか、ｃＤＮＡに相当するゲノム配列を単
離するか、又は結合タンパク質の機能性誘導体を作るた
めに用いることができる。

【００６４】Ｄ．他の植物種から単離されたＧＡ１と相
同的なＤＮＡここまでに記載されたＡ．タリアナから単離されるＤＮ
Ａ配列を用いると、他の植物変種からの相同的配列を単
離することができる。特に、図６のＧＡ１ＤＮＡ配列
又はその断片を用いると、当業者であればルーチンの操
作を用いて、ＧＡ１と有意に相同的な相当ＤＮＡ配列を
得るために、他の植物変種からのゲノム又はｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングすることができる。このよ
うな相同的配列を得ることにより、植物界内部における
ＧＡ１遺伝子の進化を研究することができる。加えて、
様々な起源から単離されるＧＡ１の酵素活性に関する差
異と、その差異と配列多様性との相関関係を調べること
により、特定の機能バリエーションをタンパク質内部の
領域と関連させることができる。

【００６５】ここまでに記載された本発明はＧＡ１遺伝
子に関するものであった。当業者であれば、本明細書で
記載された操作がＧＡ合成に関与する他の酵素について
コードするＤＮＡを得るために使用できると認識してい
る。本発明について一般的に記載しており、本発明は下
記例を参考にして更に容易に理解されるが、それは説明
のために示されていて、指摘されないかぎり本発明の制
限とはみなされない。

【００６６】例例１Ａ．タリアナランズバーグ・エレクタＤＮＡとｇａ１
３１．８９ＤＮＡとの間のゲノムサブトラクション
は、下記修正を加えて、既に記載されたように行った
（Straus及びAusubel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1889
-1893(1990))。Ａ．タリアナランズバーグ・エレクタ
ＤＮＡ及びｇａ１変異体（３１．８９）ＤＮＡを記載ど
おりに単離して、ＣｓＣｌ勾配遠心により精製した(Aus
ubelら,in Current Protocols in Molecular Biology,V
ol.1(Greene Publishing Associates/Wiley-Interscien
ce,New York,1990))。第一サイクルのサブトラクション
では、Ｓａｕ３Ａで切断されたランズバーグ・エレクタ
ＤＮＡ０．２５μｇを、剪断及び光ビオチニル化された
ｇａ１変異体３１．８９ＤＮＡ１２．５μｇとハイブリ
ッド形成させた。ビオチニル化３１．８９ＤＮＡ１０μ
ｇを各追加サイクルで加えた。ハイブリッド形成は６５
℃においてＤＮＡ３μg/μＬの濃度で少くとも２０時間
行った。５サイクルのサブトラクション後、増幅された
産物をＳａｕ３Ａアダプターに結合させ、ＰＣＲにより
増幅させ、ｐＵＣ１３のＳｍａＩ部位中に結合させた。

【００６７】５サイクルのサブトラクションハイブリッ
ド形成後、残留ＤＮＡ断片を野生型ＤＮＡに存在するも
のの３１．８９ＤＮＡを欠いた配列について富化させ
た。これらのＤＮＡ断片をポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により増幅させ、クローニングした。試験された６
つのクローンのうち１つ（ｐＧＡ１‐１）は、３１．８
９ＤＮＡから欠失された２５０bpＳａｕ３Ａ断片を含ん
でいた。ランズバーグ・エレクタ及びｇａ１対立遺伝子
３１．８９、２９．９及び６．５９からのＨｉｎｄIII
切断ＤＮＡ１μｇを１％アガロースゲル上で分別し、ジ
ーンスクリーン(GeneScreen)膜〔ニューイングランド・
ヌクレア(New England Nuclear) 〕に移し、ゲル精製さ
れて³²Ｐで標識されたｐＧＡ１‐１及びｐＧＡ１‐２
（ＡＴＣＣ No.７５３９４）中の２５０bp及び６kbイン
サートでプローブ処理した（図３）。ハイブリッド形成
条件はChurch及びGilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:
1991-1995(1984) に記載されたとおりであった。

【００６８】ｐＧＡ１‐１中のインサートは、野生型ラ
ンズバーグ・エレクタとｇａ１変異体２９．９及び６．
５９から単離されたＤＮＡサンプル中の１．４kbＨｉｎ
ｄIII 断片とハイブリッド形成したが、３１．８９ＤＮ
Ａとはハイブリッド形成しなかった（図３Ａ）。ｐＧＡ
１‐１により同定される３１．８９ＤＮＡでの欠失の程
度を調べるために、ｐＧＡ１‐１ＤＮＡは３１．８９で
の欠失に相当するより大きなゲノム断片を単離するため
にハイブリッド形成プローブとして用いた。これらのク
ローン化断片は図２Ｂで示されている。

【００６９】λＧＡ１‐３は、プローブとして³²Ｐ標識
ｐＧＡ１‐１を用いて、λＦ１Ｘ（Voytasら,Genetics,
126:713-721(1990))で組み立てられたランズバーグ・エ
レクタゲノムライブラリーから単離した。ｐＧＡ１‐２
（ＡＴＣＣ No.７５３９４）は、ｐブルースクリプトII
ＳＫ〔ストラタジーン(Stratagene)〕のＸｈｏＩ及びＥ
ｃｏＲＩ部位中にλＧＡ１‐３からの６kbＳａｌＩ‐Ｅ
ｃｏＲＩ断片を結合させることにより得た。ｐＧＡ１‐
４（ＡＴＣＣ No.７５３９５）は、植物ゲノム中へのク
ローン化ＤＮＡの効率的移転に要求されるＴ‐ＤＮＡボ
ーダーを含んだ二元ベクターｐＯＣＡ１８(Olszewski
ら,Nucl.Acid Res.,16:10765-10782(1988)) で組み立て
られたＡ．タリアナ生態型コロンビアＤＮＡのゲノムラ
イブラリーから単離した(Olszewskiら,Nucl.Acid Res.,
16:10765-10782(1988)) 。

【００７０】ｐＧＡ１‐１中のインサートに及ぶ６kb断
片を含んだプラスミドｐＧＡ１‐２（ＡＴＣＣ No.７５
３９４）は（図２Ｂ）、野生型Ａ．タリアナ及びいくつ
かのｇａ１変異体からのＨｉｎｄIII 切断ＤＮＡを含ん
だサザンブロットをプローブ処理するために用いた。図
３Ｂ及び４Ｂで示されるように、ｐＧＡ１‐２（ＡＴＣ
Ｃ No.７５３９４）は３１．８９変異体からのＤＮＡに
存在しない野生型ＤＮＡ中の４つのＨｉｎｄIII 断片
（１．０kb、１．２kb、１．４kb及び５．６kb）とハイ
ブリッド形成した。欠失変異は３１．８９ＤＮＡで余分
なＨｉｎｄIII 断片（４．２kb）を生じる。これらの結
果と追加制限地図化（示さず）では、３１．８９ＤＮＡ
での欠失が５kbであって、Ａ．タリアナゲノムの０．０
０５％（５kb／１０^５kb）に相当することを示した（図
２Ｂ参照）。

【００７１】３系統の証拠は、変異体３１．８９で特徴
付けられた５．０kb欠失がＧＡ１座に相当することを示
している。第一に、ハイブリッド形成プローブとしてλ
ＧＡ１‐３（図２Ｂ）を用いて、Nam,H.G.ら,Plant Cel
l,1:699-705(1989) で詳述された操作により行われたＲ
ＦＬＰ地図作成分析では、λＧＡ１‐３が染色体４の上
にあるテロメア近位領域に位置して、ＧＡ１座がKoornn
eef ら(J.Hered.,74:265-272(1983)) により既に位置決
めされた箇所と一致することを示した。

【００７２】第二に、３１．８９での欠失に及ぶ野生型
（コロンビア）ＤＮＡの２０kbインサートを含んだコス
ミドクローンｐＧＡ１‐４（ＡＴＣＣ No.７５３９５）
（図２Ｂ）は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
媒介形質転換株の表現型により決定されるように、３
１．８９でｇａ‐１変異を補った（図４Ａ）。図８のア
ミノ酸配列、図６及び７の部分ｃＤＮＡ配列と、図９及
び１０の全長ｃＤＮＡ配列は、コスミドクローンｐＧＡ
１‐４（ＡＴＣＣ No.７５３９５）によりコードされて
いる。コスミドクローンでの配列は、ＧＡ１イントロン
についてコードするＤＮＡを更に含んでいる。

【００７３】ｐＧＡ１‐４を含むアグロバクテリウム・
ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４をｇａ１変異体３
１．８９の根外植片に感染させるために用いて、カナマ
イシン耐性（Ｋｍ^ｒ）トランシジェニック植物を記載の
ように選択した(Valvekensら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
85:5536-5540(1988)) 。外来ＧＡの不在下で種子をつけ
た１３０のＫｍ^ｒ植物を再生させた（Ｔ１世代）。４つ
の異なるＴ１植物の各々からの５０〜３００種子はｇａ
１及びＫｍ^ｒ表現型の１００％結合を示し、ｇａ１／Ｋ
ｍ^ｓ表現型に対して約３：１で分離した（Ｔ２世代）。
トランスジェニックｇａ１及び野生型植物の種子をカナ
マイシンと共に又はそれなしで１×ムラシゲ＆スクッグ
(Skoog) 塩及び２％スクロース含有のアガロースプレー
ト（ＭＳプレート）上で発芽させた。ｇａ１変異体３
１．８９の種子をＭＳプレート上で発芽させる前に４日
間１００μＭＧＡ_３中に浸漬した。７日齢実生を土壌
に移した。

【００７４】矮小表現型を示すために、ＧＡ_３を発芽後
変異体３１．８９に追加しなかった。サザンブロット分
析を図３で記載されたように行った。ｐＧＡ１‐４（Ａ
ＴＣＣ No.７５３９５）中のインサートはコロンビア生
態系から単離した。パネルＢの列１及び２でみられるよ
うに、ｐＧＡ１‐２（ＡＴＣＣ No.７５３９４）はラン
ズバーグ（５．６kb）とコロンビア（５．０kb）のＤＮ
Ａ間でＲＦＬＰを検出した。パネルＢの列１、２及び３
におけるＤＮＡはＣｓＣｌ密度勾配遠心により精製し、
パネルＢの列４及び５におけるＤＮＡはミニプレプ操作
により精製した。これは、列４及び５と比較して列１、
２及び３のハイブリッド形成バンド移動度の小さな差異
を説明している。

【００７５】３１．８９ゲノムに組込まれたｐＧＡ１‐
４（ＡＴＣＣ No.７５３９５）のインサートを含むいく
つかの独立Ｔ２世代トランスジェニック植物は、正常な
成長のために外来ＧＡを要求しなかった。発芽、茎伸長
及び種子つけは、外来ＧＡ処理なしで、野生型植物の場
合と、トランスジェニック植物において同様であった。
プローブとしてｐＧＡ１‐２（ＡＴＣＣ No.７５３９
４）からの６kb断片を用いたサザンブロット分析では、
内在ｇａ１３１．８９座（４．２kb）及び野生型ＧＡ
１ＤＮＡ（５．０、１．４、１．２及び１．０kbＨｉ
ｎｄIII 断片）の双方が２つの独立Ｔ３世代トランスジ
ェニック植物に存在することを示した（図４Ｂ）。

【００７６】更に、プローブとしてＴ‐ＤＮＡボーダー
配列を含むベクターｐＯＣＡ１８を用いたサザンブロッ
ト分析では、２つのボーダー断片だけが双方のトランス
ジェニック植物のゲノムに存在することを示した（図４
Ｃ）。これらの結果は、野生型ＧＡ１ＤＮＡが双方の
トランスジェニック植物のゲノムで単一の座に組込まれ
ていることを示した。

【００７７】第三に、３１．８９中の５．０kb欠失がＧ
Ａ１座に相当する明白な証拠を得るために、我々は４つ
の追加ｇａ１対立遺伝子が遺伝子地図により予想される
順序で３１．８９で欠失された領域内に野生型配列から
の変化を含むことを示した。この分析を助けるために、
ポリＡを含んで１．２kbＨｉｎｄIII 断片（図２Ｂ）に
相当する部分ＧＡ１ｃＤＮＡクローン（０．９kb）
（図６の配列）を、Ａ．タリアナ生態型コロンビアの長
角果（莢）から単離されたＲＮＡより組み立てられたｃ
ＤＮＡライブラリーから単離した。１．２kbＨｉｎｄII
I 断片における４つのエキソン及び３つのイントロンを
ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列の比較により導いた（図
２Ｂ、配列データは示さず）。このｃＤＮＡクローンの
同定は、１．２kbＨｉｎｄIII 断片がＧＡ１遺伝子の
３′末端に位置することを示し、ｇａ１対立遺伝子３
１．８９、Ｂｏ２７、６．５９、ｄ３５２及びＡ４２８
での変異もＧＡ１遺伝子の３′末端に位置することを示
唆した。

【００７８】３１．８９対立遺伝子に加えて、他の２つ
のｇａ１対立遺伝子６．５９及び２９．９を高速中性子
変異誘発により誘導した(Koornneefら,Genet.Res.Cam
b.,41:57-68(1983))。図３Ｂで示されるように、６．５
９ＤＮＡ中の１．２kbＨｉｎｄIII 断片は隣接１．４kb
及び５．６kb断片の変化なしに１．３kb及び３．３kbの
２つの新たな断片で置き換っていた。更に６．５９ＤＮ
Ａ鋳型からのＰＣＲ産物のサザンブロット分析及び直接
ＤＮＡ配列決定では、６．５９対立遺伝子がｃＤＮＡク
ローンで規定される最終イントロンで１．２kbＨｉｎｄ
III 断片に３．４kb以上の挿入を含むことを示した。プ
ローブとしてｐＧＡ１‐２（ＡＴＣＣ No.７５３９４）
及びｐＧＡ１‐４（ＡＴＣＣ No.７５３９５）を用いた
サザンブロット分析では、２９．９ＤＮＡに認識できる
欠失又は挿入がないことを示した。更に３つのｇａ１対
立遺伝子Ａ４２８、ｄ３５２及びＢｏ２７は、遺伝子地
図で６．５９対立遺伝子又はその近くに位置している
（図２Ａ）。Ｂｏ２７、Ａ４２８及びｄ３５２変異体Ｄ
ＮＡ鋳型から増幅されたＰＣＲ産物の直接配列決定で
は、３つすべての変異体において、１．２kbＨｉｎｄII
I 断片中最後の２つのエキソン内に単一のヌクレオチド
変化を示した。遺伝子地図の片側を規定する変異体Ｂｏ
２７は、最も遠位のＧＡ１エキソンに単一のヌクレオチ
ド変化を含んでいた。変異体Ｂｏ２７、Ａ４２８及びｄ
３５２における単一のヌクレオチド変化は、変異体Ａ４
２８及びｄ３５２の漏出性表現型と一致するミスセンス
変異を起こす(Koornneefら,Genet.Res.Camb.,41:57-68
(1983))。変異体Ｂｏ２７、Ａ４２８及びｄ３５２で観
察される塩基変化がＰＣＲ人為結果であるか又はＧＡ１
座の高多形性によるということはありそうもなく、その
理由は変異体ＮＧ４及びＮＧ５双方から増幅及び配列決
定された１．２kbＨｉｎｄIII 断片が野生型配列を有す
るからであった。更に、ＰＣＲ産物を直接配列決定し
て、配列分析を試験された各対立遺伝子に関する２つの
独立増幅の産物を用いて２回行った。

【００７９】我々はKoornneef ら(Genet.Res.Camb.,41:
57-68(1983))により報告された異なるｇａ１対立遺伝子
間の組換え頻度を用いて、塩基対当たりの組換え頻度が
ＧＡ１座内部で約１０^-5cMであることを計算した。この
計算は、ｇａ１対立遺伝子Ａ４２８又はｄ３５２とＢｏ
２７との間で報告された０．５×１０^-2cMの組換え頻度
と、ｄ３５２及びＢｏ２７とＡ４２８及びＢｏ２７との
変異が各々４３２及び４２７bpで分離されているという
我々の観察に基づいていた。この計算は、変異体２９．
９及びＢｏ２７により規定される全ＧＡ１座の大きさが
約７kbであることを示唆した。この座の予想サイズなら
ば、ハイブリッド形成プローブとしてＧＡ１ｃＤＮＡ
を用いて野生型植物で検出される２．８kbｍＲＮＡをと
りこむことができる（図５）。

【００８０】４週齢及び５週齢植物のポリ（Ａ）⁺ＲＮ
Ａは全植物から得たが、但し根及び長角果ＲＮＡは既に
記載されたように未成熟長角果と一部の花芽及び茎から
得た(Ausubelら,in Current Protocols in Molecular B
iology,Vol.1(Greene Publishing Associates/Wiley-In
terscience,New York,1990) ；Maniatisら,in Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual,197-201(Cold Spring
Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1982)) 。
各サンプルのＲＮＡ約２μｇを１％アガロースゲルでサ
イズ分別し（Maniatisら,in Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual,197-201(Cold Spring Harbor Laborato
ry,Cold Spring Harbor,NY,1982)) 、ジーンスクリーン
膜に移し、ＧＡ１ｃＤＮＡからの³²Ｐ標識０．９kbＥ
ｃｏＲＩＤＮＡ断片とハイブリッド形成させた（図
５）。ＲＮＡブロットもＡ．タリアナｃａｂ遺伝子（Ａ
Ｂ１６５）を含む³²Ｐ標識１．６５kbＥｃｏＲＩ断片と
ハイブリッド形成させた(Leutwilerら,Nucl.Acid Res.1
4:4051-4064(1986))。列３におけるｃａｂプローブのハ
イブリッド形成減少は、ｃａｂ遺伝子が長角果で高度に
は発現されないという事実を反映している。

【００８１】予想どおりに、２．８kbＲＮＡは欠失変異
体で検出できなかった（図５）。Ａ．タリアナの連鎖地
図は約６００cMであり、ゲノムサイズは約１．０８×１
０^８bpである(Goodmanら、未公表結果）。これは約６×
１０^-6cM／塩基対に相当し、ＧＡ１座で観察される組換
え頻度と良く一致している。

【００８２】Ａ．タリアナＧＡ１遺伝子のクローニング
から、ＧＡ生合成の調節及び部位を研究する様々な実験
機会を提供した。ent-カウレンがＧＡ生合成で最初の始
動中間体であるため、ent-カウレンの形成に要するＧＡ
１遺伝子はＧＡ生合成のための調節点であるらしい(Gra
ebe,J.E.,Ann.Rev.Plant Physiol.,38:419-465(1987)；
Moore,T.C.,in Biochemistry and Physiology of Plant
Hormones,113-135(Springer-Verlag,New York,1989))
。実際に、ent-カウレンの生合成は若伸長節間近くに
ある未成熟種子、苗条先、葉柄及び托葉のような急速に
成長している組織で優先的に起きることが示された（Mo
ore,T.C.,in Biochemistry and Physiology of Plant H
ormones,113-135(Springer-Verlag,New York,1989)；Ch
ung 及びCoolbaugh,Plant Physiol.80:544-548(198
6)）。

【００８３】ゲノムサブトラクションは労働集約的でな
く、ここで報告された結果はゲノムサブトラクションが
他の非必須Ａ．タリアナ遺伝子をクローニングするため
にルーチンで用いうることを示している。必要なこと
は、高頻度で欠失を作る方法だけである。高速中性子変
異誘発により誘導される変異体３１．８９でのｇａ１欠
失に加えて、〔Koornneef ら,Genet.Res.Camb.,41:57-6
8(1983) ；Dellaert,L.W.M.,"X-ray-and Fast Neuron-I
nduced Mutations in Arabidopsis thaliana,andthe Ef
fect of Dithiothreitol upon the Mutant Spectrum"
(アラビドプシス・タリアナでのＸ線及び高速中性子誘
導変異誘発と、変異体スペクトルでのジチオスレイトー
ルの効果),Ph.D.thesis,Wageningen(1980)；Koornneef
ら,MutationResearch,93:109-123(1982) 〕、Ｘ線及び
γ線照射もＡ．タリアナにおいて短い認識しうる欠失を
ｃｈｌ‐３(Wilkinson及びCrawford,Plant Cell,3:461-
471(1991))、ｔｔ‐３(B.Shirley及びH.M.Goodman,未公
表結果）及びｇｌ‐１座(D.Marks,Mol.General Genetic
s,241:586-594(1993))で誘導することが示された。

【００８４】例２アンチセンスＧＡ１ＲＮＡの発現センス鎖ＧＡ１ＲＮＡと相補的なＲＮＡを発現するよ
うな発現ベクターを、既に記載されたように組み立て
る。アンチセンスＧＡ１ＲＮＡは、所定宿主植物で構
成上発現されるプロモーター、例えばカリフラワーモザ
イクウイルス３５Ｓプロモーターを用いて、構成上発現
させる。一方、アンチセンスＲＮＡは組織特異性プロモ
ーターを用いて組織特異的に発現させる。初めの方で記
載されたように、このようなプロモーターは当業界で周
知である。一例において、アンチセンス組立体ｐＰＯ３
５（Oellerら,Science,254:437-439(1991)) をＢａｍＨ
Ｉ及びＳＡＣＩで切断して、ｔＡＣＣ２ｃＤＮＡ配列
を除去する。ｔＡＣＣ２ｃＤＮＡ配列の除去後、ベク
ターを大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処
理して末端を補充し、図６で記載された配列を、プロモ
ーターに機能的に結合された鎖がＧＡ１アンチセンスＲ
ＮＡ配列を転写するものであるように、ベクター中に平
滑末端結合させる。結合されたベクターを用いて、適切
な大腸菌株を形質転換させる。

【００８５】結合ベクターを含むコロニーは、ベクター
に含まれる３５Ｓプロモーターから転写されたときにア
ンチセンスＲＮＡを生産する向きでＧＡ１ｃＤＮＡを
含むベクターを得るために、コロニーハイブリッド形成
又はサザンブロッティングを用いてスクリーニングす
る。アンチセンスＧＡ１ベクターを、適正な向きを有す
ると確認されたコロニーから単離し、ＤＮＡを初めの方
で記載された技術の１つ、例えばエレクトロポレーショ
ン又はアグロバクテリム／Ｔｉプラスミド媒介形質転換
により植物細胞中に導入する。形質転換細胞から再生さ
れた植物はアンチセンスＧＡ１ＲＮＡを発現する。発
現されたアンチセンスＧＡ１ＲＮＡはセンス鎖ＧＡ１
ＲＮＡと結合し、こうして翻訳を妨げる。

【００８６】例３Ａ．タリアナＧＡ１遺伝子の全長ｃＤＮＡ及びタンパク
質配列上記及び下記技術を用いて、ＧＡ１の完全ｃＤＮＡ配列
を含むｃＤＮＡクローン（ｐＧＡ１‐２９）を組み立て
た。このクローンでのＧＡ１配列を決定し、コスミドク
ローンｐＧＡ１‐４のゲノム配列の場合と比較した。図
９及び１０は（ｐＧＡ１‐２９に由来するクローンｐＧ
Ａ１‐４１から得られた）ＧＡ１タンパク質の完全ｃＤ
ＮＡ配列について示している。イントロンの位置は、ゲ
ノムクローン及びｃＤＮＡクローン（ｐＧＡ１‐２９）
の配列を比較することにより決定した。配列上の逆向き
矢印はイントロンジャンクションである。同定された変
異（例えば、ｇａ１‐６Ｃ→Ｔ及びｇａ１‐８Ｃ→
Ａ）は、示された天然配列中で対応塩基上に名称及び塩
基変化により表示されている。ｇａ１‐４、ｇａ１‐７
及びｇａ１‐９ＤＮＡの位置も表示されている。ＧＡ１
タンパク質の完全アミノ酸配列をｃＤＮＡ配列から決定
し、図８で示している。

【００８７】例４ＧＡ１遺伝子の特徴付けＡ．２．６kbＧＡ１ｃＤＮＡクローンの単離２．６kbｃＤＮＡクローン、ｐＧＡ１‐２９は、ハイブ
リッド形成プローブとして³²Ｐ標識０．９kbＧＡ１ｃ
ＤＮＡ(Sunら,Plant Cell,4:119-128(1992);ｐＧＡ１‐
２４）を用いて、アラビドプシス・タリアナ生態系コロ
ンビア（Giraudatら,Plant Cell,4:1251-1261(1992))の
緑長角果から単離されたＲＮＡから組み立てられたｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離
した。

【００８８】Ｂ．プラスミド組立てＧＡ１遺伝子の第一ＡＴＧコドン周辺のＤＮＡ配列を、
ＰＣＲでＡｆｌIII 部位又はＮｃｏＩ部位を含むように
修飾した。ＡｆｌIII 部位への変換はコード配列を変え
なかった。ＡＴＧコドンにおけるＮｃｏＩ部位の導入
は、第二コドンで単一の塩基変化を生じた（ＴＣＴ→Ｇ
ＣＴ；Ｓｅｒ→Ａｌａ）。ＰＣＲ増幅０．５kbＡｆｌII
I-ＳｐｈＩ及びＮｃｏＩ‐ＳｐｈＩＤＮＡ断片をｐＵ
Ｃ１９（ｐＧＡ１‐４１）のＡｆｌIII-ＳｐｈＩ部位及
びｐＵＣ１８（ｐＧＡ１‐３２）のＮｃｏＩ（Ｈｉｎｄ
III 部位から変換された）‐ＳｐｈＩ部位中にクローニ
ングした。クローン化ＰＣＲ断片は、変異が増幅中に導
入されていないことを保証するために配列決定した。全
長ＧＡ１タンパク質に関するコード配列の残りをＳｐｈ
Ｉ及びＥｃｏＲＩによりｐＧＡ１‐２９から切出し（ク
レノウ酵素で平滑末端化されている）、ｐＧＡ１‐４１
のＳｐｈＩ及びＨｉｎｃII部位に結合させて、開始コド
ンにＡｆｌIII 部位のある全長ＧＡ１ｃＤＮＡを作成
した。ＧＡ１ｃＤＮＡの全コード領域を２．５kbＤＮＡ
としてＡｆｌIII 及びＢａｍＨＩにより切出し、ｐＥＴ
‐８ｃベクターのＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ部位中に挿入
した(Studierら,Methods Enzymol.,185:60-89(1990))。
得られたプラスミドは、翻訳融合でＴ７プロモーターの
コントロール下に２．５kbＧＡ１ｃＤＮＡを含んでお
り、ｐＧＡ１‐４３と命名した。このプラスミドを大腸
菌細胞で全長ＧＡ１タンパク質を発現させるために用い
た。０．９kbｃＤＮＡ中コード配列の残りをＳｐｈＩ及
びＢａｍＨＩによりｐＧＡ１‐２４から切出し、ｐＧＡ
１‐３２のＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩ部位に結合させた。
０．９kbコード配列をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより切
出し、ｐＥＴ‐８ｃベクター中にクローニングした。こ
のプラスミドはｐＧＡ１‐４０と命名し、大腸菌細胞で
３０kD端部切除ＧＡ１タンパク質を発現させるために用
いた。

【００８９】２．５kbＡｆｌIII-ＢａｍＨＩＧＡ１
ｃＤＮＡは、下記操作によりタバコ・エッチ(tobacco e
tch)ウイルスからの二重エンハンサー及び５′非翻訳領
域と共にＣａＭＶ‐３５Ｓプロモーターと融合させた。
二重エンハンサー、ＴＥＶ‐ＮＴＲ及びＣａＭＶ３５
ＳポリＡシグナルと共にＣａＭＶ‐３５Ｓプロモーター
を含んだ１．２kbＨｉｎｄIII カセットをｐＲＴＬ２
（Restrepoら,Plant Cell,2:987-998(1990))から切出
し、ｐＳＫベクターのＨｉｎｄIII 部位に結合させた。
２．５kbＡｆｌIII-ＢａｍＨＩｃＤＮＡは、ＧＡ１
ｃＤＮＡがＣａＭＶ‐３５Ｓプロモーター及びＴＥＶ‐
ＮＴＲリーダー配列の後にセンス向きであるように、上
記プラスミドのＮｃｏＩ‐ＢａｍＨＩ部位中に挿入した
（ｐＧＡ１‐４８）。ＴＥＶ‐ＮＴＲ‐ＧＡ１ＤＮＡ
を有する２．６kbＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ断片をｐＧＡ
１‐４８から切出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼと共にイ
ンキュベートして、平滑末端を作った。次いでこのＤＮ
Ａは、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ
でポリＡ尾部のあるＧＡ１転写物を作るために、ｐＳＰ
６４（ポリＡ）〔プロメガ(Promega) 〕のＨｉｎｃII部
位中に結合させた（ｐＧＡ１‐８４）。ＣａＭＶ３５
Ｓ‐ＴＥＶ‐ＮＴＲ‐ＧＡ１遺伝子融合体を含んだｐＧ
Ａ１‐４８の４kbＳｍａＩ‐ＳａｌＩ断片を二元ベクタ
ーｐＢＩＮ１９(Bevan,M.,Nucl.Acids Res.,12:8711-87
21(1984)) のＳｍａＩ‐ＳａｌＩ部位中に挿入し、得ら
れたプラスミドをｐＧＡ１‐４９と命名した。

【００９０】ｐＧＡ１‐２９中の２．６kbｃＤＮＡはｐ
ＳＫのＥｃｏＲＩ部位に位置し、Ｔ７プロモーターの後
にアンチセンス向きである。このプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉで切断し、再結合させ、反対向きでインサートを有す
るプラスミドについてスクリーニングした。得られたプ
ラスミドはｐＧＡ１‐３０と命名した。２．６kbＧＡ１
ｃＤＮＡをＸｂａＩ及びＫｐｎＩ制限酵素によりｐＧ
Ａ１‐２９及び‐３０から切出し、ｐＢＩＮ１９‐３５
ＳでＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとｎｏｓターミネー
ターとの間に位置するＸｂａＩ及びＫｐｎＩ部位中に挿
入した。ベクターｐＢＩＮ１９‐３５ＳはDr.Mark Conk
lingからの贈呈品であり、ｐＷＰＦ１２６(Fitzmaurice
ら,Plant Mol.Biol.,20:177-198(1992))中にｎｏｓター
ミネーターを挿入することにより作成した。得られたプ
ラスミドはｐＧＡ１‐４５（センス向き）及びｐＧＡ１
‐４７（アンチセンス）と命名した。

【００９１】Ｃ．野生型及び変異体ＧＡ１ＤＮＡのＤ
ＮＡ配列決定分析ＧＡ１ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡのＤＮＡ配列は、シー
クエナーゼ(Sequenase) 〔ＵＡバイオケミカル社(U.S.B
iochemical Corp.) 〕と一本及び二本鎖双方のＤＮＡ鋳
型と共にジデオキシ法(Ausubelら,Current Protocols i
n Molecular Biology,Green Publ.Assoc./Wiley-Inters
cience,1990)を用いて得た。ｇａ１‐９変異体中の１．
４kbＨｉｎｄIII ＤＮＡをポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により増幅させ、非対称ＰＣＲにより再増幅させ
て、一本鎖ＤＮＡ鋳型を直接配列決定した(Innisら,PCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications,Ac
ademicPress,San Diego,1990)。イントロン１２〜エキ
ソン１５に及ぶ１．４kbＤＮＡ断片をＰＣＲによりｇａ
１‐４及びｇａ１‐４から単離されたゲノムＤＮＡから
増幅させた。これらのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＳＫベ
クターのＳｍａＩ部位中にクローニングし、ＤＮＡ配列
をいくつかの独立クローンから単離された二本鎖ＤＮＡ
鋳型を用いることにより得た。

【００９２】アラビドプシスＧＡ１座に相当するゲノム
ＤＮＡクローン（１０〜２０kb）及び部分ｃＤＮＡクロ
ーン（０．９kb）を予め単離した(Sunら,Plant Cell,4:
119-128(1992))。２．６kbの更に１つのＧＡ１ｃＤＮ
Ａクローンを、アラビドプシス生態型コロンビアの長角
果ライブラリーからの５×１０^５ｃＤＮＡクローンをス
クリーニングすることにより得た。ｃＤＮＡクローン及
びＧＡ１ゲノムクローンのＤＮＡ配列分析は、ＧＡ１座
の完全構造を特徴付けるために行った（図９，１０及び
１１）。２．６kbｃＤＮＡは、我々が既にＧＡ１ｍＲ
ＮＡを２．８kbと決定しているように、ほぼ全長である
(Sunら,Plant Cell,4:119-128,1992) 。２．６kbｃＤＮ
Ａの４８〜５０位におけるＡＴＧコドンは、それが第一
ＡＴＧコドンであることから、ＧＡ１タンパク質の翻訳
開始部位であると考えられ、その後に２４０６bpの長オ
ープン読取枠及びポリＡ尾部と続き（図９及び１０）、
このクローンは８６kDタンパク質についてコードし、こ
れは下記のようにＧＡ１タンパク質の初期サイズであ
る。２．４kbオープン読取枠は約７kbのゲノムＤＮＡに
及び、１５のエキソンと１４のイントロンを含んでいる
（図１１）。すべてのイントロンは５′‐ＧＴ及び３′
‐ＡＧスプライスジャンクション共通配列を含む。推定
翻訳開始コドンからヌクレオチド−２８７〜−２８０上
流に位置する推定ＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡＡＣ
Ａ）と、翻訳停止コドンからヌクレオチド１１７〜１２
８下流に位置するポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡ
Ａ）のタンデム反復がある。

【００９３】加えて、低ストリンジェントハイブリッド
形成条件（同緩衝液中５２℃でハイブリッド形成及び洗
浄）下でプローブとして部分ＧＡ１ｃＤＮＡ（図１１
の０．９kb断片）を用いたサザンブロット分析では、野
生型アラビドプシス生態系ランズバーグ・エレクタ及び
ｇａｌ１‐３変異体の双方に存在するＤＮＡ断片を更に
示す。この遺伝子はＧＡ１相同体又は他の関連テルペン
シクラーゼのいずれかについてコードする。

【００９４】Koornneefら,Genet.Res.Camb.,41:57-68(1
983) は、後でSun ら,Plant Cell,4:119-128,1992によ
り再命名された９つのｇａ１対立遺伝子を用いて、ＧＡ
１座の微細構造遺伝子地図を作成した。表１と図９，１
０及び１１は、９つのｇａ１変異のうち８つの性質及び
位置についてまとめている。変異のうち５つ、ｇａ１‐
２（逆位又は挿入）、ｇａ１‐３（５kb欠失）及びｇａ
１‐６、７、８（点変異）は、既に記載されたように物
理的地図上で定められた(Sunら,Plant Cell,4:119-128,
1992) 。ゲノム地図の片側を規定する変異体ｇａ１‐７
は、０．９kbｃＤＮＡ中において最も遠いエキソン（エ
キソン５）で点変異を含んでいた（図１１）。しかしな
がら、２．６kbｃＤＮＡの単離は、０．９kbｃＤＮＡが
クローニング人為結果又はイントロン６で転写の未成熟
終結によるらしいことを示した。ＰＣＲ及びＤＮＡ配列
決定分析は、３つの追加ｇａ１対立遺伝子、ｇａ１‐
１、４、９の位置を決定するために行った。これら対立
遺伝子のうち２つ、ｇａ１‐１及び４はＧＡ１ゲノム地
図の他方側を規定し、ｇａ１‐９はゲノム地図の中間に
位置して、ｇａ１‐３欠失変異と重複している。配列分
析では、ｇａ１‐４が最終エキソン（エキソン１５、図
９，１０及び１１）で１４ヌクレオチドの小さな欠失を
含むことを示した。ｇａ１‐１及びｇａ１‐９は、各々
イントロン１２（ＡＧ→ＡＡ）及びエキソン６（ＴＧＧ
→ＴＡＧ、アンバーコドン）における３′スプライスジ
ャンクションで単一の塩基変化を含んでいる。３つすべ
ての対立遺伝子における変異は０．９kbｃＤＮＡにより
規定されるコード配列から下流に位置する（図１１）。
その結果は、０．９kbｃＤＮＡが機能性ＧＡ１タンパク
質についてコードしていないことを示している。

【００９５】

【表１】様々なｇａ１変異（表１及び図１１）の位置は遺伝子地
図上におけるそれらの位置とよく対応するが(Koornneef
ら,Genet.Res.Camb.,41:57-68(1983))、但しｇａ１‐７
変異は、遺伝子地図の一端にあるのと対照的に、我々の
物理的地図ではｇａ１‐２とｇａ１‐９との間に位置す
る。ｇａ１‐６、７及び８間の組換え頻度を用いて、我
々は既にＧＡ１座内部の組換え頻度がヌクレオチド当た
り〜１０^-5cMであると推定した(Sunら,Plant Cell,4:11
9-128(1992))。我々はｇａ１‐６、ｇａ１‐９及びｇａ
１‐４を用いてこの値を調べたところ、ＧＡ１座内部の
組換え頻度はヌクレオチド当たり〜１．２×１０^-5cMで
ある。これはアラビドプシスゲノムの平均組換え頻度と
よく一致する（ヌクレオチド当たり〜５．２×１０^-6c
M、Hauge ら,Plant J.,3:745-754(1993))。

【００９６】例５相補分析ＧＡ１ｃＤＮＡの２．４kbオープン読取枠がアラビド
プシスの機能性タンパク質についてコードしているかど
うかを調べるために、我々はｇａ１‐３欠失変異体植物
でＧＡ１ｃＤＮＡを発現させた。２．６kbＧＡ１ｃ
ＤＮＡを二元ベクターｐＢＩＮ１９でセンス（ｐＧＡ１
‐４５）及びアンチセンス（ｐＧＡ１‐４７）双方の向
きにＣａＭＶ‐３５Ｓプロモーターと転写上で融合させ
た。ＧＡ１ｃＤＮＡの発現を最大化するために、２．
４kbコード配列もタバコ・エッチウイルスからの二重エ
ンハンサー及び５′非翻訳領域と共にＣａＭＶ‐３５Ｓ
プロモーターと翻訳上で融合させた（ＴＥＶ‐ＮＴ
Ｒ）。ＴＥＶ‐ＮＴＲはインビボ及びインビトロで翻訳
の効力を高めることが示された（Carrington及びFreed,
J.Virol.,64:1590-1597,1990) 。

【００９７】ＣａＭＶ‐３５Ｓ‐ＴＥＶ‐ＮＴＲ‐ＧＡ
１遺伝子融合体を含んだＤＮＡカセットを二元ベクター
ｐＢＩＮ１９中に挿入し、得られたプラスミドをｐＧＡ
１‐４９と命名した。プラスミドｐＧＡ１‐４５、４７
及び４９中の遺伝子融合体をアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス媒介形質転換によりｇａ１‐３ゲノム中に
各々移した。いくつか（ｐＧＡ１‐４５、４７及び４９
について各々３、７及び８つ）の独立カナマイシン耐性
（Ｋｍ^ｒ）トランスジェニック植物（Ｔ１世代）を再生
した。センスＧＡ１組立体ｐＧＡ１‐４５及びｐＧＡ１
‐４９に由来するすべてのＴ１植物は外来ＧＡの不在下
で種子をつけた。各Ｔ１トランシジェニック系からの種
子（３０〜４００個）はＧＡ１⁺及びＫｍ^ｒ表現型の１
００％結合を示し、そのほとんど（すべてのｐＧＡ１‐
４５系及び７つのｐＧＡ１‐４９系）はＧＡ^-／カナマ
イシン感受性（Ｋｍ^ｓ）表現型に対して約３：１で分離
した（Ｔ２世代）。すべてのＴ２世代ＧＡ１⁺／Ｋｍ^ｒ
トランスジェニック植物は外来ＧＡ処理なしに成長し
て、種子をつけた。この結果は２．４kbオープン読取枠
がこれらのトランスジェニック植物でｇａ１‐３変異を
補う活性ＧＡ１タンパク質についてコードしていること
を示した。コントロールｐＧＡ１‐４７（アンチセンス
ＧＡ１）に由来するいくつかのＫｍ^ｒＴ１植物を再生さ
せた。原ｇａ１‐３植物の表現型と同様に、これらのト
ランスジェニック植物はすべて栄養成長、開花及び種子
つけについて外来ＧＡ_３処理を要求した。

【００９８】例６ＧＡ１タンパク質の機能分析ＧＡ１タンパク質の機能を研究するために、全長（２．
６kb）及び端部切除（０．９kb）ＧＡ１ｃＤＮＡを大
腸菌で過剰発現させた。図３は、ｐＧＡ１‐４３中の
２．６kbｃＤＮＡが８６kDの全長ＧＡ１タンパク質につ
いてコードし（列２）、ｐＧＡ１‐４０中の０．９kbｃ
ＤＮＡが３０kDの端部切除ＧＡ１タンパク質を生産する
（列５）ことを示している。３０kDタンパク質及び８６
kDタンパク質は双方とも、封入体の単離(Marston,DNA C
loning: A Practical Approach,IRLPress,Oxford Engla
nd,1987) 、その後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動及び電気溶出により、大腸菌抽出物から精製した。
ゲル精製タンパク質をクマシーブルー染色によりＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル上で単一バンドとして検出した
（図１２、列３及び６）。３０kDタンパク質はＮ基分析
で更に試験したところ、ｃＤＮＡ配列により予想される
６つのアミノ酸配列をＮ末端に有することが示された。
一方、８６kDタンパク質のＮ末端はブロックされてい
た。３０kD及び８６kDＧＡ１タンパク質に対する抗体
は、ゲル精製タンパク質でウサギの免疫により得た。

【００９９】Sandmann及びMisawa,FEMS Micro.Lett.,9
0:253-258(1992)では、エルウィニア・ウレドボラ(Erwi
nia uredovora) のｃｒｔＥ遺伝子がファルネシルピロ
リン酸からＧＧＰＰへの変換を触媒するＧＧＰＰシンタ
ーゼについてコードしていることを明らかにした。ｃｒ
ｔＥ遺伝子を有する大腸菌細胞は多量のＧＧＰＰを蓄積
する（Sandmann及びMisawa,FEMS Micro.Lett.,90:253-2
58(1992)) 。これは微量のＧＧＰＰを生産するだけであ
る正常大腸菌細胞と対照的である。ｃｒｔＥ遺伝子を含
むプラスミドｐＡＣＣＲＴ‐Ｅを大腸菌細胞中にコント
ロールプラスミドｐＧＡ１‐４０（０．９kbＧＡ１ｃ
ＤＮＡ）又はｐＧＡ１‐４３（２．６kbＧＡ１ｃＤＮ
Ａ）と一緒に導入して共形質転換させた。ＧＧＰＰ及び
ＣＰＰはｐＡＣＣＲＴ‐Ｅ単独、ｐＡＣＣＲＴ‐Ｅ及び
ｐＧＡ１‐４０、又はｐＡＣＣＲＴ‐Ｅ及びｐＧＡ１‐
４３を有する細胞から抽出し、加水分解抽出物はガスク
ロマトグラフィー／質量スペクトル測定（ＧＣ／ＭＳ）
を用いて分析した。産物は全走査ＧＣ／ＭＳにより同定
した。図１３はゲラニルゲラニオール（ＧＧｏｌ）及び
コパロールの分子イオンのサイズであるｍ／ｚ２９０に
おける質量クロマトグラフィーのパターンを示す。ｐＡ
ＣＣＲＴ‐Ｅ単独、又はｐＡＣＣＲＴ‐Ｅ及びｐＧＡ１
‐４０双方を有する細胞からの抽出物は高レベルのＧＧ
ｏｌを含有していたが、検出しうるコパロールを何も有
していなかった（図１３Ｃ及びＤ）。逆に、コパロール
はｐＡＣＣＲＴ‐Ｅ及びｐＧＡ１‐４３双方を有する細
胞でかなり高レベルに蓄積され、その結果ＧＧＰＰシン
ターゼ及び８６kDＧＡ１タンパク質を双方とも生産した
（図４Ｅ）。これらの結果は、ＧＡ１ｃＤＮＡで２．
４kbオープン読取枠によりコードされる８６kDタンパク
質がＧＧＰＰからＣＰＰへの変換を触媒するent-カウレ
ンシンテターゼＡ酵素であることを示している。端部切
除３０kDＧＡ１タンパク質はこの酵素活性を有しない。

【０１００】例７様々な遺伝子融合体を含んだ野生型及びトランスジェニ
ック系におけるＧＡ１タンパク質レベルＡ．アラビドプシス根外移植片のアグロバクテリウム・
ツメファシエンス媒介形質転換形質転換操作は、わずかな修正(Sunら,Plant Cell,4:11
9-128(1992))の他は、既に記載されたとおりであった(V
alvekensら,1988)。ｐＧＡ１‐４５、４７及び４９をエ
レクトロポレーションによりアグロバクテリウムＬＢＡ
４４０４中に導入した(Ausubelら,Current Protocols i
n Molecular Biology(New York: GreenPublishing Asso
ciates/Wiley-Interscience)(1990))。ＬＢＡ４４０４
中におけるプラスミドのインサートの安定性をＮａＯＨ
／ＳＤＳミニ調製操作により精製されたプラスミドＤＮ
Ａの制限切断及びゲル電気泳動により試験した(Ausubel
ら,Current Protocols in Molecular Biology(New Yor
k: Green Publishing Associates/Wiley-Interscience)
(1990))。個別のプラスミドを有するＬＢＡ４４０４の
新鮮一夜培養物を用いて、４週齢ｇａ１‐３変異体の根
外移植片に感染させた。Ｋｍ^ｒトランスジェニック植物
を記載どおりに再生させた(Valvekensら,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,85:5536-5540(1988)) 。トランスジェニック
植物の種子をカナマイシン（５０μg/ml）含有ＭＳ寒天
プレート上で発芽させた。非発芽種子を８日後に１００
μＭＧＡ_３及び５０μg/mlカナマイシン含有ＭＳプレ
ート上に移して、ＧＡ⁺／Ｋｍ^ｒ及びＧＡ^-／Ｋｍ^ｓ分
離率について計算した。

【０１０１】センス及びアンチセンス双方のトランスジ
ェニックアラビドプシス植物におけるＧＡ１タンパク質
のレベルを、免疫ブロット分析により野生型植物（生態
系ランズバーグ・エレクタ）でのレベルと比較した（図
１４）。ent-カウレンシンテターゼ活性のほとんどを含
む上澄分画を組織抽出及び遠心により得た（Bensen及び
Zeevaart,J.Plant Growth Regul.,9:237-242(1990)) 。
７６kDの主要タンパク質バンドを試験された３つの過剰
発現系でＧＡ１抗体により標識した（図１４、列３、４
及び５）。このタンパク質は、ＣａＭＶ‐３５Ｓ‐ＧＡ
１を有する植物よりも、ＣａＭＶ‐３５Ｓ‐ＴＥＶ‐Ｎ
ＴＲ‐ＧＡ１組立体を含む植物（列４及び５）の場合に
高レベルで蓄積した。このタンパク質は列２及び６で不
在であり、そこでは各々アンチセンストランスジェニッ
ク系及び野生型植物から抽出されるタンパク質を含有し
ている。この分析の感度では大腸菌で生産されるゲル精
製８６kDＧＡ１タンパク質を約１ngの低さでも検出でき
た。内在ＧＡ１遺伝子は極端に低いレベルで発現される
ため(Sunら,Plant Cell,4:119-128(1992))、ＧＡ１抗体
が野生型植物で内在ＧＡ１タンパク質を検出できなかっ
たことは意外ではない。加えて、プロモーター‐グルク
ロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子融合体を用いて、内在ＧＡ
１遺伝子の発現のパターンを調べることができる。この
分析からのデータは、特定の植物器官でＧＡ生合成を操
作するために、植物器官特異的プロモーター及びｃＤＮ
Ａ遺伝子融合体をデザインする上で用いられる。

【０１０２】免疫ブロット分析２週齢アラビドプシス実生からのタンパク質を、４℃に
おいて１０，０００ｇで１０分間、その後１００，００
０ｇで９０分間の遠心により抽出及び分別した（Bensen
及びZeevaart,J.Plant Growth Regul.,9:237-242(199
0)) 。１００，０００ｇ上澄分画（各５０mg）を８％Ｓ
ＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上にのせ、電気泳動に付し、ジーン
スクリーン膜〔デュポン(Du Pont)-ニューイングランド
・ヌクレア〕に移した。免疫ブロット分析は記載どおり
に行った（Sambrookら,Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Har
bor,N.Y.1989) 。膜を１０００倍希釈３０kDＧＡ１抗血
清（一次抗体）、その後２５００倍希釈ペルオキシダー
ゼ複合化ヤギ抗ウサギ抗血清〔二次抗体、シグマ(Sigm
a) 〕と共にインキュベートし、高化学発光試薬〔ＥＣ
Ｌ、アマーシャム(Amersham)〕、その後オートラジオグ
ラフィーを用いて検出した。

【０１０３】例８大腸菌でのＧＡ１タンパク質の過剰発現及びＧＡ１抗体
作成操作ｐＧＡ１‐４０及びｐＧＡ１‐４３組立体をＤＥ３溶原
性大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入して形質転換さ
せた(studierら,Methods Emzymol.185:60-89(1990)) 。
ＧＡ１ｃＤＮＡの発現は、吸光度（６００nm）＝０．
８で０．４mMイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、３７℃において２時
間のインキュベートで誘導させた。細胞培養物３０mlを
遠心により回収し、５０mMトリス（ｐＨ８．０）、２mM
ＥＤＴＡ１０mlで洗浄して、それに再懸濁した。細胞を
氷上でブランソン(Branson) マイクロチップによりセッ
ティング４において４回の２０sec パルスで音波処理し
た。音波処理物を１％トリトンＸ‐１００と混合し、氷
上で５分間インキュベートし、その後４℃において１２
０００ｇで１０分間遠心して、封入体を単離した(Marst
on,DNA Cloning: APractical Approach,Oxford Englan
d: IRL Press,1987;わずかな修正）。

【０１０４】３０kD及び８６kDＧＡ１タンパク質を電気
分離系でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び電
気溶出により大腸菌抽出物の封入体分画から精製した(S
chleicher & Schuell)。精製タンパク質をクマシーブル
ー染色によりＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で単一バ
ンドとして検出した。３０kD又は８６kDＧＡ１タンパク
質に対するウサギ抗体を完全フロイントアジュバント中
ゲル精製タンパク質の皮下注射により得た(Harlow and
Lane,Antibodies: A Laboratory Manual,ColdSpring Ha
rbor,NY,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。Ｎ基
分析のため、タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分別し、その後トリス‐グリシン及び
１０％メタノール中イモビロン(Immobilon) 膜（ミリポ
ア）に移した。膜を最初にポンソーＳ(Ponceau S) で染
色し、脱イオン水で脱染し、３０kD及び８６kDタンパク
質バンドをＮ基分析用に切出した。

【０１０５】例９大腸菌細胞中ＧＡ１ｃＤＮＡ及びＧＧＰＰシンターゼ
遺伝子の同時発現ＣＰＰの蓄積の検出のために、２．５kbＧＡ１ｃＤＮ
Ａ及びＧＧＰＰシンターゼ遺伝子ＣｒｔＥを含むｐＧＡ
１‐４３及びｐＡＣＣＲＴ‐Ｅを各々大腸菌株ＨＭＳ１
７４（ＤＥ３）中に導入して同時形質転換させた。コン
トロールとして、端部切除ＧＡ１ｃＤＮＡ及びｐＡＣ
ＣＲＴ‐Ｅプラスミドを含むｐＧＡ１‐４０もＨＭＳ１
７４（ＤＥ３）中に導入して同時形質転換させた。各培
養物２００mlについて、新鮮一夜培養物４mlを３０μg/
mlのクロラムフェニコール及び１００μg/mlのアンピシ
リン含有のＬＢブロス２００ml中に接種し、３７℃で激
しく振盪しながらインキュベートした。吸光度（６００
nm）が０．９に達したとき、０．１ＭＩＰＴＧ２００
μＬを加え、培養物を３７℃で更に１時間インキュベー
トした。細胞を遠心でペレット化し、１０mMトリス（ｐ
Ｈ８．０）、０．１ＭＮａＣｌ、１mMＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）１００mlで洗浄し、凍結乾燥させた。

【０１０６】Ａ．大腸菌細胞からのＧＧＰＰ及びＣＰＰ
の抽出凍結乾燥細胞をＨ_２Ｏ１mlに再懸濁し、０℃において
メタノール２mlで３回抽出した。遠心後、透明なメタノ
ール‐水抽出物を３０℃でロータリー蒸発により減圧下
で濃縮させた。少量の水を濃縮溶液に加え、再び濃縮し
て、水溶液から残留メタノールを除去した。最終残渣を
２５mMＮａ_２ＣＯ_３２mlで希釈し、ヘキサン１mlで３回
抽出した。得られた水相をＧＣ／ＭＳ分析用に集めた。

【０１０７】Ｂ．ピロリン酸溶液の加水分解とＧＣ／Ｍ
Ｓ分析によるゲラニルゲラニオール及びコパロールの分
析ピロリン酸溶液の１／５を３０℃において１００mMトリ
ス‐ＨＣｌ、ｐＨ９．０及び２mMＭｇＣｌ_２中で１８単
位の細菌アルカリホスファターゼ（タカラ、日本）によ
り１５時間かけて加水分解し、その後３回ヘキサン抽出
した。プールしたヘキサン抽出液を穏やかなＮ_２流によ
り濃縮し、ヘキサン２００μＬに溶解し、このサンプル
１μＬを全走査ＧＣ／ＭＳにより分析した。ＧＣ／ＭＳ
は、記載どおりに、キャピラリーカラム〔ＤＢ‐１、
０．３２mmｉｄ×３０ｍ、Ｊ＆Ｗサイエンティフィック
社(J & W Scientific Inc.) 、ＵＳＡ〕装備のＨＰ‐５
８９０Ａガスクロマトグラフ〔フィニガン(Finnigan)Ｍ
ＡＴ〕に接続されたフィニガンＭＡＴＩＮＣＯＳ５０
質量スペクトロメーターで行った(Saitoら,Plant Cell
Physiol.,32:239-245,1991) 。実験は２回繰り返した。
真正のゲラニルゲラニオール及びコパロールは各々 Dr.
T.タキガワ（クラレ中央研究所）及び Dr.T.ナカノ〔ベ
ネズエラ・サイエンス・インスティチュート(Venezuela
Science Institute) 〕からの贈呈品であった。

【０１０８】例１０他のテルペンシクラーゼとの配列比較国立バイオテクノロジーセンター(National Center for
Biotechnology) のＢＬＡＳＴネットワークサービス
（Altschulら,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990))とファ
ーストＡ(FastA) 及びベストフィット(BestFit) ＧＣＧ
プログラムをペプチド間の配列相同性に関するサーチに
用いた。配列並びはＧＣＧプログラムでパイルアップ(P
ileUp)及びラインアップ(LineUp)を用いることにより作
成した。ジーンバンクデータベースで配列に関する予想
ＧＡ１アミノ酸配列（８０２アミノ酸）の比較では、Ｇ
Ａ１タンパク質での１２４アミノ酸（３２８〜４５１）
及び１６５アミノ酸（３３４〜４９８）の部分がタバコ
セスキテルペンシクラーゼ（Facchini及びChappell,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,89:11088-11092(1992)) とモノテ
ルペンシクラーゼ、スペアミントリモネンシンターゼ(C
olbyら,J.Biol.Chem.,268:23016-23024(1993))の場合と
各々７２％（３６％同一率）及び７２％（３２％同一
率）の配列類似性を有することを示した。ジテルペンシ
クラーゼ、トウゴマ(castor bean) カスベンシンターゼ
(Colbyら,J.Biol.Chem.,268:23016-23024(1993))もＧＡ
１タンパク質で１８２アミノ酸（３２９〜５１０）の部
分と７２％（３０％同一率）の配列類似性を有する。図
１６はこれら３種のテルペンシクラーゼの部分ペプチド
配列に関する予想ＧＡ１配列（３２７〜６０４）の並び
方を示している。配列ＤＤＸＸＤは、プレニル基質の二
価金属イオン‐ピロリン酸錯体と結合する上で機能する
ことが提示されたが(Ashbyら,Molecular Biologyof Ath
erosclerosis,Elsevier Science Publishers B.V.,Amst
erdam,1990)、ＧＡ１タンパク質配列には不在である。
この配列は他の３種のテルペンシクラーゼ及び他のいく
つかのプレニルトランスフェラーゼ間で高度に保存され
ている（Facchini及びChappell,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,89:11088-11092(1992)；Jenningsらら,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,88:6038-6042(1991)) 。これらの酵素はすべ
て環化テルペン又はそれより高級のプレニルピロリン酸
を生産するアリル系ピロリン酸の縮合反応を触媒する。
逆に、ＧＡ１はピロリン酸基の除去なしに環化反応を触
媒する。別のアスパラギン酸に富むモチーフ、ＤＸＤＤ
ＴＡは、ＧＡ１配列の残基３７７‐３８２で確認され
た。この配列はジモモナス・モビリス(Zymomonasmobili
s) （ジーンバンク／ＥＭＢＬ No.Ｘ７３５６１）及び
バチルス・アシドカルダリウス(Bacillus acidocaldari
us)(Ochsら,1992)から単離されたスクアレン‐ホペンシ
クラーゼでもみられる。これらの酵素はホパノイド類を
形成するためにトリテルペン、スクアレンの直接環化を
触媒し、基質スクアレンはピロリン酸を含まない。これ
ら酵素とＧＡ１タンパク質との共通触媒性質は、テルペ
ノイド化合物の閉環反応である。スクアレン‐ホペンシ
クラーゼはＧＡ１タンパク質と広範囲の配列類似性を有
しないが、ＤＸＤＤＴＡモチーフはこれら酵素の触媒活
性に関与しているかもしれない。

【０１０９】例１１完全エンドウ葉緑体中へのインビトロ合成ＧＡ１タンパ
ク質の輸送ＴＥＶ‐ＮＴＲ‐ＧＡ１ｃＤＮＡを含むプラスミドｐ
ＧＡ１‐８４をＥｃｏＲＩ酵素と共にインキュベートす
ることにより直鎖化し、ジグアノシン三リン酸〔ファル
マシア(Pharmacia) 〕及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ
（ニューイングランド・バイオラボ；Krainer ら,Cell,
36:993-1005(1984))の存在下でインビトロ転写用の鋳型
として用いた。得られた５′キャップ化ＧＡ１転写物
は、プロメガ(Promega) マニュアルに従い、³⁵Ｓ標識メ
チオニン／システイン（ＩＣＮ）と共にプロメガウサギ
網状赤血球翻訳系を用いてインビトロで翻訳した。翻訳
混合物を４℃において１００，０００ｇで１５分間遠心
した。後リボソーム上澄を輸送実験に用いた。完全エン
ドウ葉緑体中へのタンパク質輸送は、わずかな修正を加
えて（Kohornら,J.Cell Biol.,102:972-981(1986))、記
載どおりに行った（Grossmanら,J.Biol.Chem.,257:1558
-1563(1982))。単離されたエンドウ葉緑体とのインキュ
ベート後、２００μg/mlのプロテアーゼタイプＸ（サー
モリシン、シグマ）を加えて、完全葉緑体で隔離されて
いないタンパク質を分解させた。トリトンＸ‐１００
（０．１％）をサーモリシン処理中に１／１０のサンプ
ルに加えた。完全葉緑体をＳＤＳ‐ポリアクリルアミド
ゲルで分析前に３５％パーコール(Percoll) で遠心によ
り再精製し、その後ｐーオートラジオグラフィーに付し
た。

【０１１０】免疫ブロット及びインビトロタンパク質輸
送実験では、ＧＡ１タンパク質が葉緑体中に移送され
て、プロセッシングされうることを示している。ＧＡ１
タンパク質の最初の５０Ｎ末端アミノ酸は１０．２の推
定ｐＩでセリン（２６％）及びトレオニン（１２％）に
富んでいる。これらの性質は多くの葉緑体タンパク質の
トランジット(transit) ペプチドの共通特徴である（Ke
egstraら,Ann.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.,40:4
71-501(1989))。８６kDの³⁵Ｓ標識メチオニン／システ
イン標識ＧＡ１タンパク質を、ＳＰ６ＲＮＡポリメラー
ゼ及びウサギ網状赤血球翻訳系を用いてインビトロで合
成した（図１５、列３）。このインビトロ翻訳タンパク
質のサイズは大腸菌細胞で発現される場合と同様である
（図１５、列１）。８６kDインビトロ翻訳産物を単離さ
れたエンドウ葉緑体と共にインキュベートしたとき、そ
れはもっと小さな７６kDにプロセッシングされたが、こ
れは外部から加えられたプロテアーゼによる切断から保
護された（図６、列４）。このタンパク質は、葉緑体を
０．１％トリトンＸ‐１００で破壊したときに、プロテ
アーゼで分解された（図１５、列５）。免疫ブロット分
析では、トランスジェニック植物でＧＡ１ｃＤＮＡに
より生産されたＧＡ１タンパク質が７６kDタンパク質と
して移動することを示した（図１５、列２）。これらの
結果は、ＧＡ１タンパク質が植物で葉緑体に向かって、
プロセッシングされることを示唆している。

【０１１１】例１２ＧＡ１タンパク質についてコードするＲＮＡの翻訳の調
節植物でＧＡ１タンパク質についてコードするＲＮＡの翻
訳は、機能的に結合されたプロモーターからアンチセン
スＧＡ１ＲＮＡの転写を行える発現ベクターを作成す
ることにより調節される。植物はアンチセンスＧＡ１
ＲＮＡベクターについてコードする発現ベクターでトラ
ンスフェクトされる。

【０１１２】例１３ＧＡ１タンパク質についてコードするＤＮＡのクローニ
ングＧＡ１タンパク質についてコードするＤＮＡ分子は、ス
トリンジェントハイブリッド形成条件下で、望ましいＤ
ＮＡ分子を図９及び１０の配列又はアンチセンス配列、
あるいはその断片とハイブリッド形成させることにより
クローニングする。プローブ配列とハイブリッド形成す
るＤＮＡ分子を選択し、宿主細胞中に導入して形質転換
させる。ＧＡ１を発現する形質転換株を選択及びクロー
ニングする。

【０１１３】例１４ＧＡ１タンパク質についてコードするＤＮＡのクローニ
ングに関するハイブリッド形成条件ＧＡ１タンパク質についてコードするＤＮＡのクローニ
ングに関するハイブリッド形成条件は下記のとおりであ
る：１）６５℃で１時間かけて前ハイブリッド形成させる；２）ハイブリッド形成緩衝液中６５℃で一夜かけてハイ
ブリッド形成させる；３）２×ＳＳＣ中６５℃で５分間にわたり２回、その後
２×ＳＳＣ及び１．０％ＳＤＳ中６５℃で３０分間にわ
たり２回洗浄する；及び４）０．１×ＳＳＣ中室温で５分間にわたり２回洗浄す
る。

【０１１４】例１５分子量マーカー組換え生産されたＧＡ１タンパク質は当業界でルーチン
の方法により精製する(Current Protocol in Molecular
Biology,Vol.2,Chap.10,John Wiley & Sons,Publisher
s(1994))。演繹されたアミノ酸配列が公知であるため、
このタンパク質の分子量は正確に決定でき、そのタンパ
ク質はゲル電気泳動用の分子量マーカーとして使用でき
る。演繹核酸配列に基づき計算されたＧＡ１タンパク質
の分子量は約９３kDa である。

【０１１５】結論本明細書で言及されたすべての参考文献は、その開示に
より参考のため組み込まれる。本発明はその特定の態様
に関して記載されてきたが、それは更に修正することが
でき、この出願は、一般的に本発明の原理に従い、しか
も本発明が関係する業界内で公知の又は慣習的な実務内
に入って、添付された請求の範囲で示される前記の必須
特徴に適用されるような本開示からの展開を含めて、本
発明のいかなるバリエーション、用途又は適応例もカバ
ーしているものと理解される。

【０１１６】

【配列表】

配列番号：１ (i) 配列の特徴 (A) 配列の長さ：９０３塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖 (ii)分子の型：ｃＤＮＡ〜ｍＲＮＡ (vi)起源 (A) 生物：アラビドプシス・タリアナ (xi)配列：配列番号１ CTGCAGGAAT TCCTTTTTTT TTTTTTTTTT TGGCTTTGAG TGAAGTACAT AGGACCCATC 60 TATATATACT TTGAAATATA TTCATATAAA AATAGAATGT TCAAATGTAT ATTTTTTGGC 120 CCAACACACA AACCTTGTAA GCTTTAGCTC TTTCTTGGCG TATATATCTT TTAAGACCGG 180 AGAATCGTAC GGTACATCAA TGTTTATTCC TCGAGCTATC TCAAGCAACG ATGGGAATGC 240 TACTTCGAAT CCGATTGGCA TATGCTCATC ATTTTCGTCT TCTAGCTTCC CAATATTTTC 300 CCGGAAAAAC GTGATTCCTT TGTTGCATTG ATGAGGAAAG AGATTCCATG ATCTTAGAGC 360 AACGACGCAT GCAAGGGTAT TGATGAGACG ATCATGATAA GAGAAGAGAT ACGCATCTCC 420 CCAAGAACCA TCGGAAAGTT GGTTCTCGGC GATCCATTTC ACGGCGGAGG GAAACGCCGG 480 AGTTTTATCT CCGGCATCGA TCAATGCAAC CCAAGCTGTA TCGTAAGCCG ATATCGTAAT 540 TTCCCCGTCC GTTAGGTTTC TCAAGATCGT TTTCACACTC TTCACTGCTT CTTTGAATGC 600 ATTACTATTA CTTCCAACAC TAATCTGAGG AGCATCTTCT CCTTGAAGCT GTTGCCACTC 660 ATGTATTAGA GGCAAATCAT GTTGAACCTC TTGAGAATTA ATGTATTCTT GAGTTCGAAG 720 CTTTGAACAA TGTATGGAAC CGCTTCTGGA TTTGTCTCTA GCGACATTGA GAGGAGATCC 780 TGAGATGGTA AGGAAAGAAG AAGATATTGT TGTTTTAGTA GAACTGAGAA AGGTTGTACT 840 TGGAATGGAG TTTAGAACAT GATACTGAAG AGACATGGCT TTAAAAAAAA AAAAAAGGAA 900 TTC 903

【０１１７】配列番号：２ (i) 配列の特徴 (A) 配列の長さ：９０３塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖 (ii)分子の型：ｃＤＮＡ (vi)起源 (A) 生物：アラビドプシス・タリアナ (xi)配列：配列番号２ GAATTCCTTT TTTTTTTTTT TAAAGCCATG TCTCTTCAGT ATCATGTTCT AAACTCCATT 60 CCAAGTACAA CCTTTCTCAG TTCTACTAAA ACAACAATAT CTTCTTCTTT CCTTACCATC 120 TCAGGATCTC CTCTCAATGT CGCTAGAGAC AAATCCAGAA GCGGTTCCAT ACATTGTTCA 180 AAGCTTCGAA CTCAAGAATA CATTAATTCT CAAGAGGTTC AACATGATTT GCCTCTAATA 240 CATGAGTGGC AACAGCTTCA AGGAGAAGAT GCTCCTCAGA TTAGTGTTGG AAGTAATAGT 300 AATGCATTCA AAGAAGCAGT GAAGAGTGTG AAAACGATCT TGAGAAACCT AACGGACGGG 360 GAAATTACGA TATCGGCTTA CGATACAGCT TGGGTTGCAT TGATCGATGC CGGAGATAAA 420 ACTCCGGCGT TTCCCTCCGC CGTGAAATGG ATCGCCGAGA ACCAACTTTC CGATGGTTC 480 TGGGGAGATG CGTATCTCTT CTCTTATCAT GATCGTCTCA TCAATACCCT TGCATGCGTC 540 GTTGCTCTAA GATCATGGAA TCTCTTTCCT CATCAATGCA ACAAAGGAAT CACGTTTTTC 600 CGGGAAAATA TTGGGAAGCT AGAAGACGAA AATGATGAGC ATATGCCAAT CGGATTCGAA 660 GTAGCATTCC CATCGTTGCT TGAGATAGCT CGAGGAATAA ACATTGATGT ACCGTACGAT 720 TCTCCGGTCT TAAAAGATAT ATACGCCAAG AAAGAGCTAA AGCTTACAAG GTTTGTGTGT 780 TGGGCCAAAA AATATACATT TGAACATTCT ATTTTTATAT GAATATATTT CAAAGTATAT 840 ATAGATGGGT CCTATGTACT TCACTCAAAG CCAAAAAAAA AAAAAAAAAA GGAATTCCTG 900 CAG 903

【０１１８】配列番号：３ (i) 配列の特徴 (A) 配列の長さ：２５８７塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖 (ii)分子の型：ｃＤＮＡ (vi)起源 (A) 生物：アラビドプシス・タリアナ (ix)特徴 (A) 名称／キー：ＣＤＳ (B) 位置：４８．．２４５３ (xi)配列：配列番号３ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＡＡＡＴＡＣＴＴＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＧ
ＡＧＣＴＴＴＴＴＡＡＡＧＣＣＡＴＧＴＣＴＣＴＴ５６
ＭｅｔＳｅｒＬｅｕ
１ＣＡＧＴＡＴＣＡＴＧＴＴＣＴＡＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡ
ＡＧＴＡＣＡＡＣＣＴＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＴ１０４ＧｌｎＴｙｒＨｉｓＶａｌＬｅｕＡｓｎＳｅｒＩｌｅＰｒｏ
ＳｅｒＴｈｒＴｈｒＰｈｅＬｅｕＳｅｒＳｅｒ５１０
１５ＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣ
ＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴ１５２ＴｈｒＬｙｓＴｈｒＴｈｒＩｌｅＳｅｒＳｅｒＳｅｒＰｈｅ
ＬｅｕＴｈｒＩｌｅＳｅｒＧｌｙＳｅｒＰｒｏ２０２５
３０３５ＣＴＣＡＡＴＧＴＣＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＧＡ
ＡＧＣＧＧＴＴＣＣＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＣＡ２００ＬｅｕＡｓｎＶａｌＡｌａＡｒｇＡｓｐＬｙｓＳｅｒＡｒｇ
ＳｅｒＧｌｙＳｅｒＩｌｅＨｉｓＣｙｓＳｅｒ４０
４５５０ＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＴＡＣＡＴＴＡＡＴ
ＴＣＴＣＡＡＧＡＧＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＴ２４８ＬｙｓＬｅｕＡｒｇＴｈｒＧｌｎＧｌｕＴｙｒＩｌｅＡｓｎ
ＳｅｒＧｌｎＧｌｕＶａｌＧｌｎＨｉｓＡｓｐ５５６０
６５ Leu Pro Leu Ile His Glu Trp Gln Gln Leu Gln Gly Glu Asp Ala Pro 70 75 80 CAG ATT AGT GTT GGA AGT AAT AGT AAT GCA TTC AAA GAA GCA GTG AAG 344 Gln Ile Ser Val Gly Ser Asn Ser Asn Ala Phe Lys Glu Ala Val Lys 85 90 95 AGT GTG AAA ACG ATC TTG AGA AAC CTA ACG GAC GGG GAA ATT ACG ATA 392 Ser Val Lys Thr Ile Leu Arg Asn Leu Thr Asp Gly Glu Ile Thr Ile 100 105 110 115 TCG GCT TAC GAT ACA GCT TGG GTT GCA TTG ATC GAT GCC GGA GAT AAA 440 Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Leu Ile Asp Ala Gly Asp Lys 120 125 130 ACT CCG GCG TTT CCC TCC GCC GTG AAA TGG ATC GCC GAG AAC CAA CTT 488 Thr Pro Ala Phe Pro Ser Ala Val Lys Trp Ile Ala Glu Asn Gln Leu 135 140 145 TCC GAT GGT TCT TGG GGA GAT GCG TAT CTC TTC TCT TAT CAT GAT CGT 536 Ser Asp Gly Ser Trp Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ser Tyr His Asp Arg 150 155 160 CTC ATC AAT ACC CTT GCA TGC GTC GTT GCT CTA AGA TCA TGG AAT CTC 584 Leu Ile Asn Thr Leu Ala Cys Val Val Ala Leu Arg Ser Trp Asn Leu 165 170 175 TTT CCT CAT CAA TGC AAC AAA GGA ATC ACG TTT TTC CGG GAA AAT ATT 632 Phe Pro His Gln Cys Asn Lys Gly Ile Thr Phe Phe Arg Glu Asn Ile 180 185 190 195 GGG AAG CTA GAA GAC GAA AAT GAT GAG CAT ATG CCA ATC GGA TTC GAA 680 Gly Lys Leu Glu Asp Glu Asn Asp Glu His Met Pro Ile Gly Phe Glu 200 205 210 GTA GCA TTC CCA TCG TTG CTT GAG ATA GCT CGA GGA ATA AAC ATT GAT 728 Val Ala Phe Pro Ser Leu Leu Glu Ile Ala Arg Gly Ile Asn Ile Asp 215 220 225 GTA CCG TAC GAT TCT CCG GTC TTA AAA GAT ATA TAC GCC AAG AAA GAG 776 Val Pro Tyr Asp Ser Pro Val Leu Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Lys Glu 230 235 240 CTA AAG CTT ACA AGG ATA CCA AAA GAG ATA ATG CAC AAG ATA CCA ACA 824 Leu Lys Leu Thr Arg Ile Pro Lys Glu Ile Met His Lys Ile Pro Thr 245 250 255 ACA TTG TTG CAT AGT TTG GAG GGG ATG CGT GAT TTA GAT TGG GAA AAG 872 Thr Leu Leu His Ser Leu Glu Gly Met Arg Asp Leu Asp Trp Glu Lys 260 265 270 275 CTC TTG AAA CTT CAA TCT CAA GAC GGA TCT TTC CTC TTC TCT CCT TCC 920 Leu Leu Lys Leu Gln Ser Gln Asp Gly Ser Phe Leu Phe Ser Pro Ser 280 285 290 TCT ACC GCT TTT GCA TTC ATG CAG ACC CGA GAC AGT AAC TGC CTC GAG 968 Ser Thr Ala Phe Ala Phe Met Gln Thr Arg Asp Ser Asn Cys Leu Glu 295 300 305 TAT TTG CGA AAT GCC GTC AAA CGT TTC AAT GGA GGA GTT CCC AAT GTC 1016 Tyr Leu Arg Asn Ala Val Lys Arg Phe Asn Gly Gly Val Pro Asn Val 310 315 320 TTT CCC GTG GAT CTT TTC GAG CAC ATA TGG ATA GTG GAT CGG TTA CAA 1064 Phe Pro Val Asp Leu Phe Glu His Ile Trp Ile Val Asp Arg Leu Gln 325 330 335 CGT TTA GGG ATA TCG AGA TAC TTT GAA GAA GAG ATT AAA GAG TGT CTT 1112 Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tyr Phe Glu Glu Glu Ile Lys Glu Cys Leu 340 345 350 355 GAC TAT GTC CAC AGA TAT TGG ACC GAC AAT GGC ATA TGT TGG GCT AGA 1160 Asp Tyr Val His Arg Tyr Trp Thr Asp Asn Gly Ile Cys Trp Ala Arg 360 365 370 TGT TCC CAT GTC CAA GAC ATC GAT GAT ACA GCC ATG GCA TTT AGG CTC 1208 Cys Ser His Val Gln Asp Ile Asp Asp Thr Ala Met Ala Phe Arg Leu 375 380 385 TTA AGA CAA CAT GGA TAC CAA GTG TCC GCA GAT GTA TTC AAG AAC TTT 1256 Leu Arg Gln His Gly Tyr Gln Val Ser Ala Asp Val Phe Lys Asn Phe 390 395 400 GAG AAA GAG GGA GAG TTT TTC TGC TTT GTG GGG CAA TCA AAC CAA GCA 1304 Glu Lys Glu Gly Glu Phe Phe Cys Phe Val Gly Gln Ser Asn Gln Ala 405 410 415 GTA ACC GGT ATG TTC AAC CTA TAC CGG GCA TCA CAA TTG GCG TTT CCA 1352 Val Thr Gly Met Phe Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Gln Leu Ala Phe Pro 420 425 430 435 AGG GAA GAG ATA TTG AAA AAC GCC AAA GAG TTT TCT TAT AAT TAT CTG 1400 Arg Glu Glu Ile Leu Lys Asn Ala Lys Glu Phe Ser Tyr Asn Tyr Leu 440 445 450 CTA GAA AAA CGG GAG AGA GAG GAG TTG ATT GAT AAG TGG ATT ATA ATG 1448 Leu Glu Lys Arg Glu Arg Glu Glu Leu Ile Asp Lys Trp Ile Ile Met 455 460 465 AAA GAC TTA CCT GGC GAG ATT GGG TTT GCG TTA GAG ATT CCA TGG TAC 1496 Lys Asp Leu Pro Gly Glu Ile Gly Phe Ala Leu Glu Ile Pro Trp Tyr 470 475 480 GCA AGC TTG CCT CGA GTA GAG ACG AGA TTC TAT ATT GAT CAA TAT GGT 1544 Ala Ser Leu Pro Arg Val Glu Thr Arg Phe Tyr Ile Asp Gln Tyr Gly 485 490 495 GGA GAA AAC GAC GTT TGG ATT GGC AAG ACT CTT TAT AGG ATG CCA TAC 1592 Gly Glu Asn Asp Val Trp Ile Gly Lys Thr Leu Tyr Arg Met Pro Tyr 500 505 510 515 GTG AAC AAT AAT GGA TAT CTG GAA TTA GCA AAA CAA GAT TAC AAC AAT 1640 Val Asn Asn Asn Gly Tyr Leu Glu Leu Ala Lys Gln Asp Tyr Asn Asn 520 525 530 TGC CAA GCT CAG CAT CAG CTC GAA TGG GAC ATA TTC CAA AAG TGG TAT 1688 Cys Gln Ala Gln His Gln Leu Glu Trp Asp Ile Phe Gln Lys Trp Tyr 535 540 545 GAA GAA AAT AGG TTA AGT GAG TGG GGT GTG CGC AGA AGT GAG CTT CTC 1736 Glu Glu Asn Arg Leu Ser Glu Trp Gly Val Arg Arg Ser Glu Leu Leu 550 555 560 GAG TGT TAC TAC TTA GCG GCT GCA ACT ATA TTT GAA TCA GAA AGG TCA 1784 Glu Cys Tyr Tyr Leu Ala Ala Ala Thr Ile Phe Glu Ser Glu Arg Ser 565 570 575 CAT GAG AGA ATG GTT TGG GCT AAG TCA AGT GTA TTG GTT AAA GCC ATT 1832 His Glu Arg Met Val Trp Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Lys Ala Ile 580 585 590 595 TCT TCT TCT TTT GGG GAA TCC TCT GAC TCC AGA AGA AGC TTC TCC GAT 1880 Ser Ser Ser Phe Gly Glu Ser Ser Asp Ser Arg Arg Ser Phe Ser Asp 600 605 610 CAG TTT CAT GAA TAC ATT GCC AAT GCT CGA CGA AGT GAT CAT CAC TTT 1928 Gln Phe His Glu Tyr Ile Ala Asn Ala Arg Arg Ser Asp His His Phe 615 620 625 AAT GAC AGG AAC ATG AGA TTG GAC CGA CCA GGA TCG GTT CAG GCC AGT 1976 Asn Asp Arg Asn Met Arg Leu Asp Arg Pro Gly Ser Val Gln Ala Ser 630 635 640 CGG CTT GCC GGA GTG TTA ATC GGG ACT TTG AAT CAA ATG TCT TTT GAC 2024 Arg Leu Ala Gly Val Leu Ile Gly Thr Leu Asn Gln Met Ser Phe Asp 645 650 655 CTT TTC ATG TCT CAT GGC CGT GAC GTT AAC AAT CTC CTC TAT CTA TCG 2072 Leu Phe Met Ser His Gly Arg Asp Val Asn Asn Leu Leu Tyr Leu Ser 660 665 670 675 TGG GGA GAT TGG ATG GAA AAA TGG AAA CTA TAT GGA GAT GAA GGA GAA 2120 Trp Gly Asp Trp Met Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Glu Gly Glu 680 685 690 GGA GAG CTC ATG GTG AAG ATG ATA ATT CTA ATG AAG AAC AAT GAC CTA 2168 Gly Glu Leu Met Val Lys Met Ile Ile Leu Met Lys Asn Asn Asp Leu 695 700 705 ACT AAC TTC TTC ACC CAC ACT CAC TTC GTT CGT CTC GCG GAA ATC ATC 2216 Thr Asn Phe Phe Thr His Thr His Phe Val Arg Leu Ala Glu Ile Ile 710 715 720 AAT CGA ATC TGT CTT CCT CGC CAA TAC TTA AAG GCA AGG AGA AAC GAT 2264 Asn Arg Ile Cys Leu Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Asn Asp 725 730 735 GAG AAG GAG AAG ACA ATA AAG AGT ATG GAG AAG GAG ATG GGG AAA ATG 2312 Glu Lys Glu Lys Thr Ile Lys Ser Met Glu Lys Glu Met Gly Lys Met 740 745 750 755 GTT GAG TTA GCA TTG TCG GAG AGT GAC ACA TTT CGT GAC GTC AGC ATC 2360 Val Glu Leu Ala Leu Ser Glu Ser Asp Thr Phe Arg Asp Val Ser Ile 760 765 770 ACG TTT CTT GAT GTA GCA AAA GCA TTT TAC TAC TTT GCT TTA TGT GGC 2408 Thr Phe Leu Asp Val Ala Lys Ala Phe Tyr Tyr Phe Ala Leu Cys Gly 775 780 785 GAT CAT CTC CAA ACT CAC ATC TCC AAA GTC TTG TTT CAA AAA GTC 2453 Asp His Leu Gln Thr His Ile Ser Lys Val Leu Phe Gln Lys Val 790 795 800 TAGTAACCTC ATCATCATCA TCGATCCATT AACAATCAGT GGATCGATGT ATCCATAGAT 2513 GCGTGAATAA TATTTCATGT AGAGAAGGAG AACAAATTAG ATCATGTAGG GTTATCAAAA 2573 AAAAAAAAAA AAAA 2587

【０１１９】配列番号：４ (i) 配列の特徴 (A) 配列の長さ：８０２アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖 (ii)分子の型：タンパク質 (xi)配列：配列番号４ Met Ser Leu Gln Tyr His Val Leu Asn Ser Ile Pro Ser Thr Thr Phe 1 5 10 15 Leu Ser Ser Thr Lys Thr Thr Ile Ser Ser Ser Phe Leu Thr Ile Ser 20 25 30 Gly Ser Pro Leu Asn Val Ala Arg Asp Lys Ser Arg Ser Gly Ser Ile 35 40 45 His Cys Ser Lys Leu Arg Thr Gln Glu Tyr Ile Asn Ser Gln Glu Val 50 55 60 Gln His Asp Leu Pro Leu Ile His Glu Trp Gln Gln Leu Gln Gly Glu 65 70 75 80 Asp Ala Pro Gln Ile Ser Val Gly Ser Asn Ser Asn Ala Phe Lys Glu 85 90 95 Ala Val Lys Ser Val Lys Thr Ile Leu Arg Asn Leu Thr Asp Gly Glu 100 105 110 Ile Thr Ile Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Leu Ile Asp Ala 115 120 125 Gly Asp Lys Thr Pro Ala Phe Pro Ser Ala Val Lys Trp Ile Ala Glu 130 135 140 Asn Gln Leu Ser Asp Gly Ser Trp Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ser Tyr 145 150 155 160 His Asp Arg Leu Ile Asn Thr Leu Ala Cys Val Val Ala Leu Arg Ser 165 170 175 Trp Asn Leu Phe Pro His Gln Cys Asn Lys Gly Ile Thr Phe Phe Arg 180 185 190 Glu Asn Ile Gly Lys Leu Glu Asp Glu Asn Asp Glu His Met Pro Ile 195 200 205 Gly Phe Glu Val Ala Phe Pro Ser Leu Leu Glu Ile Ala Arg Gly Ile 210 215 220 Asn Ile Asp Val Pro Tyr Asp Ser Pro Val Leu Lys Asp Ile Tyr Ala 225 230 235 240 Lys Lys Glu Leu Lys Leu Thr Arg Ile Pro Lys Glu Ile Met His Lys 245 250 255 Ile Pro Thr Thr Leu Leu His Ser Leu Glu Gly Met Arg Asp Leu Asp 260 265 270 Trp Glu Lys Leu Leu Lys Leu Gln Ser Gln Asp Gly Ser Phe Leu Phe 275 280 285 Ser Pro Ser Ser Thr Ala Phe Ala Phe Met Gln Thr Arg Asp Ser Asn 290 295 300 Cys Leu Glu Tyr Leu Arg Asn Ala Val Lys Arg Phe Asn Gly Gly Val 305 310 315 320 Pro Asn Val Phe Pro Val Asp Leu Phe Glu His Ile Trp Ile Val Asp 325 330 335 Arg Leu Gln Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tyr Phe Glu Glu Glu Ile Lys 340 345 350 Glu Cys Leu Asp Tyr Val His Arg Tyr Trp Thr Asp Asn Gly Ile Cys 355 360 365 Trp Ala Arg Cys Ser His Val Gln Asp Ile Asp Asp Thr Ala Met Ala 370 375 380 Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Tyr Gln Val Ser Ala Asp Val Phe 385 390 395 400 Lys Asn Phe Glu Lys Glu Gly Glu Phe Phe Cys Phe Val Gly Gln Ser 405 410 415 Asn Gln Ala Val Thr Gly Met Phe Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Gln Leu 420 425 430 Ala Phe Pro Arg Glu Glu Ile Leu Lys Asn Ala Lys Glu Phe Ser Tyr 435 440 445 Asn Tyr Leu Leu Glu Lys Arg Glu Arg Glu Glu Leu Ile Asp Lys Trp 450 455 460 Ile Ile Met Lys Asp Leu Pro Gly Glu Ile Gly Phe Ala Leu Glu Ile 465 470 475 480 Pro Trp Tyr Ala Ser Leu Pro Arg Val Glu Thr Arg Phe Tyr Ile Asp 485 490 495 Gln Tyr Gly Gly Glu Asn Asp Val Trp Ile Gly Lys Thr Leu Tyr Arg 500 505 510 Met Pro Tyr Val Asn Asn Asn Gly Tyr Leu Glu Leu Ala Lys Gln Asp 515 520 525 Tyr Asn Asn Cys Gln Ala Gln His Gln Leu Glu Trp Asp Ile Phe Gln 530 535 540 Lys Trp Tyr Glu Glu Asn Arg Leu Ser Glu Trp Gly Val Arg Arg Ser 545 550 555 560 Glu Leu Leu Glu Cys Tyr Tyr Leu Ala Ala Ala Thr Ile Phe Glu Ser 565 570 575 Glu Arg Ser His Glu Arg Met Val Trp Ala Lys Ser Ser Val Leu Val 580 585 590 Lys Ala Ile Ser Ser Ser Phe Gly Glu Ser Ser Asp Ser Arg Arg Ser 595 600 605 Phe Ser Asp Gln Phe His Glu Tyr Ile Ala Asn Ala Arg Arg Ser Asp 610 615 620 His His Phe Asn Asp Arg Asn Met Arg Leu Asp Arg Pro Gly Ser Val 625 630 635 640 Gln Ala Ser Arg Leu Ala Gly Val Leu Ile Gly Thr Leu Asn Gln Met 645 650 655 Ser Phe Asp Leu Phe Met Ser His Gly Arg Asp Val Asn Asn Leu Leu 660 665 670 Tyr Leu Ser Trp Gly Asp Trp Met Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp 675 680 685 Glu Gly Glu Gly Glu Leu Met Val Lys Met Ile Ile Leu Met Lys Asn 690 695 700 Asn Asp Leu Thr Asn Phe Phe Thr His Thr His Phe Val Arg Leu Ala 705 710 715 720 Glu Ile Ile Asn Arg Ile Cys Leu Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Ala Arg 725 730 735 Arg Asn Asp Glu Lys Glu Lys Thr Ile Lys Ser Met Glu Lys Glu Met 740 745 750 Gly Lys Met Val Glu Leu Ala Leu Ser Glu Ser Asp Thr Phe Arg Asp 755 760 765 Val Ser Ile Thr Phe Leu Asp Val Ala Lys Ala Phe Tyr Tyr Phe Ala 770 775 780 Leu Cys Gly Asp His Leu Gln Thr His Ile Ser Lys Val Leu Phe Gln 785 790 795 800 Lys Val

【０１２０】配列番号：５ (i) 配列の特徴 (A) 配列の長さ：２７９アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：無関係 (D) トポロジー：無関係 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号５ Lys Leu Ala Asp Thr Leu Asn Leu Ile Asp Ile Ile Glu Arg Leu Gly 1 5 10 15 Ile Ser Tyr His Phe Glu Lys Glu Ile Asp Glu Ile Leu Asp Gln Ile 20 25 30 Xaa Xaa Tyr Asn Gln Asn Xaa Xaa Xaa Ser Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Cys Asn Asp Leu Cys Thr Ser Ala Leu Gln Phe Arg Leu Leu Arg Gln 50 55 60 His Gly Phe Asn Ile Ser Pro Glu Ile Phe Ser Lys Phe Gln Asp Glu 65 70 75 80 Asn Gly Xaa Xaa Lys Phe Lys Glu Ser Leu Ala Ser Asp Val Leu Gly 85 90 95 Leu Leu Asn Leu Tyr Glu Ala Ser His Val Arg Thr His Ala Asp Asp 100 105 110 Ile Leu Glu Asp Ala Leu Ala Phe Ser Thr Ile His Leu Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Glu Ser Ala Ala Pro His Xaa Xaa Leu Lys Ser Pro Leu 130 135 140 Arg Glu Gln Val Thr His Ala Leu Glu Gln Cys Leu His Lys Gly Val 145 150 155 160 Pro Arg Val Glu Thr Arg Phe Phe Ile Ser Ser Ile Tyr Asp Lys Glu 165 170 175 Gln Ser Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn 180 185 190 Asn Val Leu Leu Arg Phe Ala Lys Leu Asp Phe Asn Leu Leu Gln Met 195 200 205 Leu His Lys Gln Glu Leu Ala Gln Val Ser Arg Trp Trp Lys Asp Leu 210 215 220 Asp Phe Val Thr Thr Leu Pro Tyr Ala Arg Asp Arg Val Val Glu Cys 225 230 235 240 Tyr Phe Trp Ala Leu Gly Val Tyr Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Gln Ala 245 250 255 Arg Val Met Leu Val Lys Thr Ile Ser Met Ile Ser Ile Val Asp Asp 260 265 270 Thr Phe Asp Ala Tyr Gly Thr 275

【０１２１】配列番号：６ (i) 配列の特徴 (A) 配列の長さ：２７９アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：無関係 (D) トポロジー：無関係 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号６ Asp Ser Val Glu Thr Val Ile Leu Ile Asp Leu Leu Cys Arg Leu Gly 1 5 10 15 Val Ser Tyr His Phe Glu Asn Asp Ile Glu Glu Leu Leu Ser Lys Ile 20 25 30 Xaa Xaa Phe Asn Ser Gln Xaa Xaa Xaa Pro Asp Leu Val Asp Glu Lys 35 40 45 Glu Cys Asp Leu Tyr Thr Ala Ala Ile Val Phe Arg Val Phe Arg Gln 50 55 60 His Gly Phe Lys Met Ser Ser Asp Val Phe Ser Lys Phe Lys Asp Ser 65 70 75 80 Asp Gly Xaa Xaa Lys Phe Lys Glu Ser Leu Arg Gly Asp Ala Lys Gly 85 90 95 Met Leu Ser Leu Phe Glu Ala Ser His Leu Ser Val His Gly Glu Asp 100 105 110 Ile Leu Glu Glu Ala Phe Ala Phe Thr Lys Asp Tyr Leu Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Gln Ser Ser Ala Val Glu Xaa Xaa Leu Phe Pro Asn Leu 130 135 140 Lys Arg His Ile Thr Asn Ala Leu Glu Gln Pro Phe His Ser Gly Val 145 150 155 160 Pro Arg Leu Glu Ala Arg Lys Phe Ile Asp Leu Tyr Glu Ala Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn 180 185 190 Glu Thr Leu Leu Glu Phe Ala Lys Leu Asp Tyr Asn Arg Val Gln Leu 195 200 205 Leu His Gln Gln Glu Leu Cys Gln Phe Ser Lys Trp Trp Lys Asp Leu 210 215 220 Asn Leu Ala Ser Asp Ile Pro Tyr Ala Arg Asp Arg Met Ala Glu Ile 225 230 235 240 Phe Phe Trp Ala Val Ala Met Tyr Phe Glu Pro Asp Tyr Ala His Thr 245 250 255 Arg Met Ile Ile Ala Lys Val Val Leu Leu Ile Ser Leu Ile Asp Asp 260 265 270 Thr Ile Asp Ala Tyr Ala Thr 275

【０１２２】配列番号：７ (i) 配列の特徴 (A) 配列の長さ：２７９アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：無関係 (D) トポロジー：無関係 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号７ Asp Gln Ile Arg Gln Leu Glu Leu Ile Asp Asp Leu Gln Arg Met Gly 1 5 10 15 Leu Ser Asp His Phe Gln Asn Glu Phe Lys Glu Ile Leu Ser Ser Ile 20 25 30 Xaa Xaa Tyr Leu Asp His His Tyr Tyr Lys Asn Pro Phe Pro Lys Glu 35 40 45 Glu Arg Asp Leu Tyr Ser Thr Ser Leu Ala Phe Arg Leu Leu Arg Glu 50 55 60 His Gly Phe Gln Val Ala Gln Glu Val Phe Asp Ser Phe Lys Asn Glu 65 70 75 80 Glu Gly Xaa Xaa Glu Phe Lys Glu Ser Leu Ser Asp Asp Thr Arg Gly 85 90 95 Leu Leu Gln Leu Tyr Glu Ala Ser Phe Leu Leu Thr Glu Gly Glu Thr 100 105 110 Thr Leu Glu Ser Ala Arg Glu Phe Ala Thr Lys Phe Leu Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Glu Glu Lys Val Asn Glu Gly Gly Val Asp Gly Asp Leu 130 135 140 Leu Thr Arg Ile Ala Tyr Ser Leu Asp Ile Pro Leu His Trp Arg Ile 145 150 155 160 Lys Arg Pro Asn Ala Pro Val Trp Ile Glu Trp Tyr Arg Lys Arg Pro 165 170 175 Asp Xaa Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn 180 185 190 Pro Val Val Leu Glu Leu Ala Ile Leu Asp Leu Asn Ile Val Gln Ala 195 200 205 Gln Phe Gln Glu Glu Leu Lys Glu Ser Phe Arg Trp Trp Arg Asn Thr 210 215 220 Gly Phe Val Glu Lys Leu Pro Phe Ala Arg Asp Arg Leu Val Glu Cys 225 230 235 240 Tyr Phe Trp Asn Thr Gly Ile Ile Glu Pro Arg Gln His Ala Ser Ala 245 250 255 Arg Ile Met Met Gly Lys Val Asn Ala Leu Ile Thr Val Ile Asp Asp 260 265 270 Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr 275

【０１２３】配列番号：８ (i) 配列の特徴 (A) 配列の長さ：２７９アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：無関係 (D) トポロジー：無関係 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号８ Asp Leu Phe Glu His Ile Trp Ile Val Asp Arg Leu Gln Arg Leu Gly 1 5 10 15 Ile Ser Arg Tyr Phe Glu Glu Glu Ile Lys Glu Cys Leu Asp Tyr Val 20 25 30 His Arg Tyr Trp Thr Asp Asn Gly Ile Cys Trp Ala Arg Cys Ser His 35 40 45 Val Gln Asp Ile Asp Asp Thr Ala Met Ala Phe Arg Leu Leu Arg Gln 50 55 60 His Gly Tyr Gln Val Ser Ala Asp Val Phe Lys Asn Phe Glu Lys Glu 65 70 75 80 Gly Glu Phe Phe Cys Phe Val Gly Gln Ser Asn Gln Ala Val Thr Gly 85 90 95 Met Phe Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Gln Leu Ala Phe Pro Arg Glu Glu 100 105 110 Ile Leu Lys Asn Ala Lys Glu Phe Ser Tyr Asn Tyr Leu Leu Glu Lys 115 120 125 Arg Glu Arg Glu Glu Leu Ile Asp Lys Trp Ile Ile Met Lys Asp Leu 130 135 140 Pro Gly Glu Ile Gly Phe Ala Leu Glu Ile Pro Trp Tyr Ala Ser Leu 145 150 155 160 Pro Arg Val Glu Thr Arg Phe Tyr Ile Asp Gln Tyr Gly Gly Glu Asn 165 170 175 Asp Val Trp Ile Gly Lys Thr Leu Tyr Arg Met Pro Tyr Val Asn Asn 180 185 190 Asn Gly Tyr Leu Glu Leu Ala Lys Gln Asp Tyr Asn Asn Cys Gln Ala 195 200 205 Gln His Gln Leu Glu Trp Asp Ile Phe Gln Lys Trp Tyr Glu Glu Asn 210 215 220 Arg Leu Xaa Ser Glu Trp Gly Val Arg Arg Ser Glu Leu Leu Glu Cys 225 230 235 240 Tyr Tyr Leu Ala Ala Ala Thr Ile Phe Glu Ser Glu Arg Ser His Glu 245 250 255 Arg Met Val Trp Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Lys Ala Ile Ser Ser 260 265 270 Ser Phe Gly Glu Ser Ser Asp 275

【０１２４】配列番号：９ (i) 配列の特徴 (A) 配列の長さ：２７９アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：無関係 (D) トポロジー：無関係 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号９ Asp Leu Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Leu Gln Arg Leu Gly 1 5 10 15 Ile Ser Xaa Xaa Phe Glu Xaa Glu Ile Lys Glu Xaa Leu Asp Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Thr Ala Xaa Ala Phe Arg Leu Leu Arg Gln 50 55 60 His Gly Xaa Gln Val Ser Xaa Asp Val Phe Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Gly 85 90 95 Met Xaa Asn Leu Tyr Xaa Ala Ser Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 100 105 110 Ile Leu Xaa Xaa Ala Xaa Glu Phe Ser Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Leu 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Ala Leu Glu Ile Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Pro Arg Val Glu Thr Arg Phe Xaa Ile Asp Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn 180 185 190 Asn Xaa Xaa Leu Glu Leu Ala Lys Xaa Asp Tyr Asn Xaa Xaa Gln Ala 195 200 205 Gln His Gln Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Lys Trp Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Leu Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Leu Xaa Glu Cys 225 230 235 240 Tyr Xaa Xaa Ala Xaa Ala Xaa Ile Phe Glu Xaa Xaa Xaa Ser His Xaa 245 250 255 Arg Met Xaa Xaa Ala Lys Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa 260 265 270 Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の好ましい態様の富化及びクローニング
方法の図。ＤＮＡは実線で示される；ビオチニル化ＤＮ
Ａはストライプの黒／白線で示される；Ｓａｕ３ａアダ
プターはオープンラインで示される；アビジンビーズは
斑点円で示される；放射性標識断片は星印で示される。

【図２】Ａ．タリアナＧＡ１座の遺伝子及び物理的地
図。（Ａ）：９つのＡ．タリアナｇａ‐１対立遺伝子（２
９．９、ＮＧ５、ＮＧ４、ｄ６９、Ａ４２８、ｄ３２
５、６．５９、Ｂｏ２７、３１．８９）の遺伝子地図ｃ
Ｍ×１０^-2(Koornneefら,Genet.Res.Camb.,41:57-68(19
83))。３１．８９の推定的欠失は水平線で示されてい
る。（Ｂ）：ＧＡ１領域の物理的地図。太い水平線はＧＡ１
座を含んだランズバーグ・エレクタ(Landsberg erecta)
ＤＮＡのＨｉｎｄIII 制限地図である。ＨｉｎｄIII 制
限部位は水平線の下に伸びる縦線印で示されている。太
い水平線のすぐ下の数字は各ＨｉｎｄIII 制限断片のキ
ロ塩基対サイズを表す。３１．８９における欠失の位置
はハッチングボックスで示されている。制限地図上の水
平線は、λクローンλＧＡ１‐３、プラスミドｐＧＡ１
‐２〔ロックビル，メリーランド，ＵＳＡ２０８５２(R
ockville,Maryland,U.S.A.20852)のアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(American Type Culture C
ollection)（ＡＴＣＣ）に、手続上の微生物の寄託の国
際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の
規定により、１９９３年１月７日付で寄託され、ＡＴＣ
Ｃ受託 No.７５３９４で識別される〕及びコスミドクロ
ーンｐＧＡ１‐４〔ロックビル，メリーランド，ＵＳＡ
２０８５２のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ＡＴＣＣ）に、手続上の微生物の寄託の国際的
承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定
により、１９９３年１月７日付で寄託され、ＡＴＣＣ受
託 No.７５３９５で識別される〕に含まれる配列の大き
さについて示す。水平線の下にある図は、１．２kbＨｉ
ｎｄIII 制限断片内にあるＧＡ１遺伝子のイントロン
（線）及びエキソン（オープンボックス）の位置、対立
遺伝子６．５９における挿入変異の位置と、対立遺伝子
ｄ３５２、Ａ４２８及びＢｏ２７における点変異につい
て示している。

【図３】各々３１．８９及び６．５９における欠失及び
挿入の検出を示す電気泳動の写真。オートラジオグラム
は、（Ａ）ｐＧＡ１‐１からの２５０bpＳａｕ３Ａ断片
（例１参照）及び（Ｂ）３１．８９における全欠失領域
をカバーしているｐＧＡ１‐２（ＡＴＣＣ No.７５３９
４）からの６kb断片でプローブ処理されたサザンブロッ
トについて示されている（図１Ｂ）。双方のブロットＡ
及びＢはランズバーグ・エレクタ（列１）、３つのｇａ
‐１変異体、３１．８９（列２）、２９．９（列３）及
び６．５９（列４）から単離されたＨｉｎｄIII 切断Ｄ
ＮＡを含んでいる。パネルＢの矢印は３１．８９（４．
２kb）及び６．５９（１．３及び３．３kb）の変化した
ＨｉｎｄIII 断片について示している。

【図４】ＧＡ１遺伝子を含む野生型及びトランスジェニ
ック植物の生物の形態を示す写真（Ａ）、及びサザンブ
ロット（電気泳動の写真）（Ｂ及びＣ）。（Ａ）６週齢
Ａ．タリアナランズバーグ・エレクタ植物の写真。左か
ら右に：ｇａ‐１変異体（３１．８９）、ｐＧＡ１‐４
（ＡＴＣＣ No.７５３９５）からの２０kbインサートを
含んだトランスジェニックｇａ‐１変異体（３１．８
９）植物、野生型ランズバーグ・エレクタ植物。オート
ラジオグラムは、（Ｂ）ｐＧＡ１‐２（ＡＴＣＣ No.７
５３９４）からの６kb断片及び（Ｃ）ｐＧＡ１‐４（Ａ
ＴＣＣ No.７５３９５）用のベクターであるｐＯＣＡ１
８ＤＮＡでプローブ処理されたサザンブロットについ
て示されている（図２参照）。ブロットＢ及びＣはラン
ズバーグ・エレクタ（Ｂの列１）、コロンビア(Columbi
a)（Ｂの列２、Ｃの列１）、３１．８９（Ｂの列３、Ｃ
の列２）と、ｐＧＡ１‐４（ＡＴＣＣ No.７５３９５）
で形質転換された２つのＴ３世代トランスジェニックｇ
ａ‐１（３１．８９）植物（Ｂの列４、５；Ｃの列３、
４）からのＨｉｎｄIII 切断ＤＮＡを含んでいる。

【図５】ＧＡ１ｃＤＮＡプローブを用いた２．８kbｍ
ＲＮＡの検出。³²Ｐ標識０．９kbＧＡ１ｃＤＮＡ又は
ｃａｂｃＤＮＡ（クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質
遺伝子）でプローブ処理されたＲＮＡブロットのオート
ラジオグラム（電気泳動の写真）。ＲＮＡは野生型４週
齢植物（列１）、５週齢野生型植物（列２）、未成熟野
生型長角果（列３）及び４週齢ｇａ‐１変異体３１．８
９植物（列４）からであった。

【図６】ＧＡ１遺伝子の部分ｃＤＮＡ配列。ＧＡ１ｍ
ＲＮＡに相補的なＧＡ１ＤＮＡ鎖は５′→３′方向に
示されている。ＧＡ１変異型ｄ３５２は、４２５位でＧ
からＡへの置換を除き、示された場合と同一の配列を有
する。ＧＡ１変異型Ａ４２８は、４２０位でＣからＴへ
の置換を除き、示された場合と同一の配列を有する。Ｇ
Ａ１変異型Ｂｏ２７は、２４６位でＣからＴへの置換を
除き、示された場合と同一の配列を有する。

【図７】ＧＡ１遺伝子の部分ｃＤＮＡ配列。示されたＧ
Ａ１ＤＮＡはＧＡ１ｍＲＮＡと類似しており、図６
で示された鎖と相補的である。ＧＡ１変異型ｄ３５２
は、４７９位でＣからＴへの置換を除き、示された場合
と同一の配列を有する。ＧＡ１変異型Ａ４２８は、４８
４位でＧからＡへの置換を除き、示された場合と同一の
配列を有する。ＧＡ１変異型Ｂｏ２７は、６５８位でＧ
からＡへの置換を除き、示された場合と同一の配列を有
する。

【図８】ＧＡ１タンパク質の完全アミノ酸配列が、図９
及び図１０のｃＤＮＡ配列から決定されるように、示さ
れている。

【図９】２．６kbＧＡ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
及び予想アミノ酸配列。そのヌクレオチド配列は受託 N
o.Ｕ１１０３４としてジーンバンク(GenBank) に寄託さ
れた。ヌクレオチド１は２４０６bpのオープン読取枠の
開始コドンに相当する。（−）はｃＤＮＡ及びゲノムＤ
ＮＡ配列の比較により導かれるようなイントロンの位置
を表す。ｇａｌ‐６、７、８及び９対立遺伝子における
単一ヌクレオチド変化の位置は下線で示され、置換塩基
は配列の上である。ｇａｌ‐４対立遺伝子は、２つの矢
印で示されるように、２３７５〜２３８８の１４ヌクレ
オチドの小さな欠失を含んでいる。

【図１０】図９の続き。２．６kbＧＡ１ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列及び予想アミノ酸配列。そのヌクレオチ
ド配列は受託 No.Ｕ１１０３４としてジーンバンク(Gen
Bank) に寄託された。ヌクレオチド１は２４０６bpのオ
ープン読取枠の開始コドンに相当する。（−）はｃＤＮ
Ａ及びゲノムＤＮＡ配列の比較により導かれるようなイ
ントロンの位置を表す。ｇａｌ‐６、７、８及び９対立
遺伝子における単一ヌクレオチド変化の位置は下線で示
され、置換塩基は配列の上である。ｇａｌ‐４対立遺伝
子は、２つの矢印で示されるように、２３７５〜２３８
８の１４ヌクレオチドの小さな欠失を含んでいる。

【図１１】ＧＡ１座の物理的地図。上の水平線はＨｉｎ
ｄIII 制限地図を示し、太線はＧＡ１遺伝子のコード領
域を示す。推定ＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡＡ）及び
ポリＡシグナル（ＡＡＴＡＡＡ）は矢印で表示されてい
る。ｇａｌ‐３変異体における５kb欠失の位置は２つの
矢印で示されている。制限地図の下にある図は、ＧＡ１
遺伝子の２つのｃＤＮＡクローン（２．６kb及び０．９
kb）に由来するイントロン（線）及びエキソン（シェー
ドボックス）を示している。０．９kbｃＤＮＡの５番目
エキソンは更に４８ヌクレオチドを付随していた（オー
プンボックス）。ｇａｌ‐２（逆位又は挿入）、ｇａｌ
‐４（１４bp欠失）及びｇａｌ‐１、６、７、８、９
（点変異）における変異の位置は、２．６kbｃＤＮＡの
図い沿って示されている。

【図１２】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現系を用いた大腸
菌でのアラビドプシスＧＡ１遺伝子の過剰発現を示す電
気泳動の写真。列１及び４は非誘導（−ＩＰＴＧ）粗製
抽出物を含み、列２及び５は各々０．９kb及び２．６kb
ＧＡ１ｃＤＮＡを有する細胞からの誘導（＋ＩＰＴ
Ｇ）封入体分画を含んでいる。列３及び６は、各々３０
kD（端部切除）及び８６kDのゲル精製ＧＡ１タンパク質
を含んでいる。

【図１３】大腸菌の加水分解メタノール抽出物からのＧ
Ｇｏｌ及びコパロールのＧＣ‐ＭＳ同定。Ａ〜Ｅはｍ／
ｚ２９０（ＧＧｏｌ及びコパロールの分子イオン）にお
ける質量クロマトグラムである。Ａ及びＢは各々真正の
ＧＧｏｌ及びコパロール標準である。Ｃ、Ｄ及びＥは各
々ｐＡＣＣＲＴ‐Ｅ（ＧＧＰＰシンターゼ）のみ、ｐＡ
ＣＣＲＴ‐Ｅ及びｐＧＡ１‐４０（３０kD端部切除ＧＡ
１タンパク質）、ｐＡＣＣＲＴ‐Ｅ及びｐＧＡ１‐４３
（８６kDＧＡ１タンパク質）を有する細胞からの加水分
解大腸菌抽出物を含んでいる。

【図１４】ＧＡ１抗血清を用いた、アラビドプシスから
の可溶性タンパク質分画中におけるＧＡ１タンパク質の
免疫ブロット分析を示す電気泳動の写真。２週齢アラビ
ドプシス実生からのタンパク質抽出物が１００，０００
ｇの遠心で分別され、上澄分画が８％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
ゲルで分離された。タンパク質ゲルブロットは３０kDＧ
Ａ１抗血清及びペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗血
清と共にインキュベートされ、ＥＣＬ試薬、その後オー
トラジオグラフィーを用いて検出された。ブロットはｐ
ＧＡ１‐４３を有する大腸菌から生産されたゲル精製８
６kDタンパク質１５ngを含んでいる（列１）；ＣａＭＶ
３５ＳプロモーターアンチセンスＧＡ１を有するトラン
スジェニック植物からの１００，０００ｇ上澄分画５０
mg（列２）；ＣａＭＶ３５ＳプロモーターＧＡ１（列
３）；ＣａＭＶ３５Ｓ‐ＴＥＶ‐ＮＴＲ‐ＧＡ１（列
４及び５）；ランズバーグ・エレクタ（列６）。

【図１５】単離されたエンドウ葉緑体中へのＧＡ１タン
パク質の輸送を示す電気泳動の写真。列１及び２は、各
々、ｐＧＡ１‐４３を有する大腸菌から生産されたゲル
精製８６kDタンパク質１０ng、ＣａＭＶ３５Ｓ‐ＴＥ
Ｖ‐ＮＴＲ‐ＧＡ１遺伝子融合体を有するアラビドプシ
ストランスジェニック系からの１００，０００ｇ上澄分
画１５mgの免疫ブロットである。列３〜５は異なる処理
に付された³⁵Ｓ標識ＧＡ１タンパク質のフルオログラム
からである。列３は³⁵Ｓ標識ＧＡ１タンパク質を有する
全体インビトロ翻訳産物の一部である。列４及び５は、
単離された完全エンドウ葉緑体による取込みと、その後
各々０．１％トリトンＸ‐１００の不在又は存在下での
プロテアーゼ処理の後における標識タンパク質サンプル
である。

【図１６】タバコセスキテルペンシクラーゼ(tobsqpc)
、カスベンシンターゼ及びリモネンシンターゼと比較
したＧＡ１タンパク質の配列並び。共通配列における大
文字の活字は、４種すべてのタンパク質が同アミノ酸残
基を含むことを示している。最初の３種のペプチドで少
くとも１つの活字がＧＡ１タンパク質の場合と同様であ
るとき、共通記号は小文字である。ドットは、最初の３
種のタンパク質とＧＡ１タンパク質との間に相同性がな
いことを示している。推定二価金属イオン‐ピロリン酸
錯体結合部位（ＤＤＸＸＤ）はボックスでマークされて
いる。ＧＡ１配列のＤＸＤＤＴＡモチーフは肉太活字で
強調されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ０１Ｋ 67/033 Ｃ０７Ｈ 21/02 21/04 ＢＣ０７Ｋ 14/415 8517−4Ｈ 16/16 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＣＣ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 392015468 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイションＴＨＥＧＥＮＥＲＡＬＨＯＳＰＩＴＡＬＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮアメリカ合衆国02114マサチューセッツ州ボストン、フルート・ストリート（番地の表示なし) (72)発明者タイ‐ピン、サンアメリカ合衆国ノースカロライナ州、ダラム、ウッドウィンズ、ドライブ、529 (72)発明者ハワード、エム．グッドマンアメリカ合衆国マサチューセッツ州、ニュートン、センター、ザ、レッジス、ロード、10 (72)発明者フレデリック、エム．オースベルアメリカ合衆国マサチューセッツ州、ニュートン、レイク、アベニュ、271

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis
thaliana) のＧＡ１遺伝子のアミノ酸配列についてコー
ドするＤＮＡを含んだＤＮＡ組立体。
【請求項２】ＧＡ１遺伝子がｐＧＡ１‐２９のＧＡ１
ＤＮＡ配列又は図９及び１０で示されたＤＮＡ配列のい
ずれかを有する、請求項１に記載のＤＮＡ組立体。
【請求項３】図８のアミノ酸配列についてコードするＤ
ＮＡからなるＤＮＡ組立体。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか一項に記載された
配列を含んだベクター。
【請求項５】請求項４に記載のベクターの１つで形質転
換された宿主。
【請求項６】宿主が細菌、酵母、植物、昆虫又は哺乳動
物からなる群より選択される、請求項５に記載の宿主。
【請求項７】宿主が植物細胞である、請求項６に記載の
宿主。
【請求項８】植物細胞が双子葉植物細胞である、請求項
７に記載の宿主。
【請求項９】請求項８に記載の植物細胞から再生された
植物。
【請求項１０】請求項９に記載の植物の子孫。
【請求項１１】請求項１０に記載の植物の胎芽。
【請求項１２】請求項１１に記載の子孫により生産され
た種子。
【請求項１３】１）プロモーターに機能的に結合された
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組立体で宿主を形
質転換する；２）上記形質転換宿主細胞において上記組立体でＤＮＡ
からＧＡ１タンパク質を発現させる；ことからなる、Ｇ
Ａ１タンパク質の発現方法。
【請求項１４】遺伝子がＧＡ１の同様な時間的及び空間
的発現パターンを有するように、植物で遺伝子の発現を
指示する方法であって、１）上記遺伝子をＧＡ１の調節配列に機能的に結合させ
て、発現モジュールを作る；及び２）上記植物を上記発現モジュール（１）で形質転換す
る；ステップからなる方法。
【請求項１５】調節配列がＧＡ１コード領域の５′側、
約−２kb〜０bpの配列を含んでなる、請求項１４に記載
の方法。
【請求項１６】調節配列がＧＡ１コード領域の５′側、
約−５００bp〜０bpの配列を含んでなる、請求項１４に
記載の方法。
【請求項１７】調節配列がＧＡ１コード領域の５′側、
約−２５０bp〜０bpの配列を含んでなる、請求項１４に
記載の方法。
【請求項１８】植物でＧＡ１についてコードするＲＮＡ
の翻訳を調節する方法であって、１）アンチセンスＧＡ１ＲＮＡについてコードする発
現ベクターを作る；２）上記植物を上記発現ベクター（１）でトランスフェ
クトする；ステップからなる方法。
【請求項１９】植物でＧＡ１タンパク質の活性を調節す
る方法であって、１）ＧＡ１タンパク質と結合できる抗体又はその断片に
ついてコードする発現ベクターを作る；２）植物を上記発現ベクターで形質転換する；ステップ
からなる方法。
【請求項２０】ＧＡ１タンパク質と結合できる抗体又は
その断片。
【請求項２１】ＧＡ１遺伝子の調節領域と結合できるタ
ンパク質。
【請求項２２】ＧＡ１を発現する細胞又は組織を同定す
る方法であって、１）ＧＡ１タンパク質又はＧＡ１についてコードするＲ
ＮＡと結合できる物質と共に上記細胞又は上記組織をイ
ンキュベートする；及び２）結合物質の存在を検出する；ステップからなる方
法。
【請求項２３】ＧＡ１タンパク質と結合できる物質が抗
体またはその断片である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】ＧＡ１についてコードするＲＮＡと結合
できる物質がＲＮＡ及びＤＮＡからなる群より選択され
る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】組立体が核酸配列から本質的になり、そ
の核酸配列が：１）ＧＡ１ポリペプチドについてコードし；しかも２）ハイブリッド形成がストリンジェントハイブリッド
形成条件下で行われるとき、図９及び１０のＤＮＡのセ
ンス又はアンチセンス配列あるいはその断片とハイブリ
ッド形成する；単離されたＤＮＡ組立体。
【請求項２６】ＧＡ１タンパク質についてコードする単
離されたＤＮＡ分子であって、１）望ましいＤＮＡ分子を図９及び１０のセンス又はア
ンチセンス配列あるいはその断片とハイブリッド形成さ
せる（但し、ハイブリッド形成はストリンジェントハイ
ブリッド形成条件下で行われる）；２）上記配列とハイブリッド形成する上記集団のＤＮＡ
分子を選択する；及び３）上記ＧＡ１タンパク質についてコードするパート
（２）のＤＮＡ分子を選択する；ことからなるプロセス
により製造されたＤＮＡ分子。
【請求項２７】ＤＮＡ分子が：１）６５℃で１時間かけて前ハイブリッド形成させる；２）ハイブリッド形成緩衝液中６５℃で一夜かけてハイ
ブリッド形成させる；３）６５℃で２×ＳＳＣ中５分間にわたり２回、その後
６５℃で２×ＳＳＣ及び１．０％ＳＤＳ中３０分間にわ
たり２回洗浄する；及び４）０．１×ＳＳＣ中室温で５分間にわたり２回洗浄す
る；ことからなるプロセスにより製造された、請求項２
５又は２６に記載のＧＡ１タンパク質についてコードす
る単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２８】ＧＡ１タンパク質についてコードするＤ
ＮＡ分子をクローニングする方法であって、１）望ましいＤＮＡ分子を図９及び１０のセンス又はア
ンチセンス配列あるいはその断片とハイブリッド形成さ
せる（ハイブリッド形成はストリンジェントハイブリッ
ド形成条件下で行われる）；２）上記配列とハイブリッド形成する上記集団のＤＮＡ
分子を選択する；３）パート（２）の上記ＤＮＡを宿主細胞中に導入して
形質転換する；及び４）上記ＧＡ１を発現する形質転換株を選択する；こと
からなる方法。
【請求項２９】ハイブリッド形成条件が：１）６５℃で１時間かけて前ハイブリッド形成させる；２）ハイブリッド形成緩衝液中６５℃で一夜かけてハイ
ブリッド形成させる；３）６５℃で２×ＳＳＣ中５分間にわたり２回、その後
６５℃で２×ＳＳＣ及び１．０％ＳＤＳ中３０分間にわ
たり２回洗浄する；及び４）０．１×ＳＳＣ中室温で５分間にわたり２回洗浄す
る；ことから本質的になる、請求項２８に記載の方法。