JPH08126492A - 新規セルラーゼ成分ｎｃｅ２およびそれを用いた育種法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規セルラーゼおよびその遺伝子を提供す
る。 【構成】 セルラーゼ遺伝子をフミコーラ・インソレン
ス(Humicola insolens)株から単離し、セルラーゼ遺伝
子を宿主である微生物に導入し、発現させることによっ
て目的とするセルラーゼを得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本発明は、新規セルラーゼ及びその遺伝子に関し、さら
に詳細には新規セルラーゼをコードするDNA配列、該DNA
配列を含有する発現ベクター、該ベクターにより形質転
換された微生物、ならびに該微生物による新規セルラー
ゼの製造法に関する。

【０００２】背景技術 セルロースは、植物体の主要な構成成分であり、広く天
然に存在する。そしてグルコースを１ユニットとするβ
―１，４―グリコシド結合により重合した高分子多糖で
あることから、グリコシド結合を切断し、糖分を効率よ
く抽出することは、セルロース系バイオマスの有効活用
に必須である。しかし、酸・熱等の加水分解により可溶
糖分を生成させる物理化学的手法では、産物がわずかし
か得られず、特異性がないため産生物の純度も著しく不
均一である。この様な難分解性のセルロースを効率よく
加水分解し、そこからエネルギーを取り出すための一連
の反応を司るのがセルラーゼである。従って、本酵素の
特性を解明すること、ならびに本酵素を効率よく生産す
ることは、セルロース資源の有効活用にかかわる技術の
根幹をなすものといえる。

【０００３】またセルラーゼは、産業用酵素剤として市
販され、洗剤、繊維加工用製剤、飼料添加剤、消化剤と
いった種々の製品の主要成分として用いられている。よ
って、セルラーゼの特性解明は、このような実用面でも
大いに役立つものと期待されうる。

【０００４】一方セルラーゼ系は、エンドグルカナー
ゼ、エキソグルカナーゼ、β―グルコシダーゼの３種の
酵素系に大別され、これらのセルラーゼは、相互に作用
しあい、相乗効果によりセルロースの分解を担ってい
る。これらの切断様式の他にも、作用温度、作用pHなど
さまざまな特性を有するセルラーゼ成分が、多岐にわた
る微生物によって生産されており、その利用目的に応じ
て酵素系が選択されてきた。しかし、目的によっては微
生物から得られる酵素成分の組成が必ずしも適切ではな
い場合もあり、これを最適化するために、微生物の培養
条件をコントロールする他、変異株の取得や、酵素の分
画といった手段がとられている。

【０００５】一方で、これらの酵素成分を遺伝子工学的
に単離し、利用することも試みられている。この手法に
よれば、極めて精製度の高い酵素を得ることができるた
め、その酵素の特性解明、及びその有効な利用が可能に
なると考えられる。しかしながら、前述のように、セル
ラーゼは複合酵素系であることから個々のセルラーゼ遺
伝子の特定は容易ではなく、全てのセルラーゼ遺伝子の
単離は未だなされていないのが現状である。

【０００６】

【発明の概要】今般発明者らは、フミコーラ・インソレ
ンス（Humicola insolens）からセルラーゼ遺伝子を単
離し、その遺伝子から発現されるセルラーゼを得ること
に成功した。したがって、本発明は、セルラーゼおよび
前記セルラーゼをコードするDNA配列の提供をその目的
とする。また、本発明は、遺伝子組み換え操作によって
本発明によるセルラーゼを微生物中で発現させることを
目的とする。

【０００７】本発明によるタンパク質は、配列表１に記
載されるアミノ酸の一部もしくは１〜４５３番の配列か
らなるもの、および更に―２３〜─１番の配列をそのN
末端側に有してなるものである。更に、本発明によるDN
A配列は、上記アミノ酸をコードするもの、特に配列表
２に記載される塩基配列の一部または全部を有するも
の、である。

【０００８】微生物の寄託 本発明によるセルラーゼ遺伝子を含むプラスミドpM１４
―１で形質転換された大腸菌JM１０９株は、ＦＥＲＭ
Ｐ−14585 の受託番号のもと工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている。

【０００９】

【発明の具体的説明】セルラーゼ及びその遺伝子 本発明によるタンパク質は、配列表１に記載される配列
の一部もしくは１〜４５３番の配列からなるもの、であ
る。また、前記タンパク質の誘導体としては、遺伝子工
学で慣用されている方法（例えば部位指定変異など）を
用いてアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換等の改変
を行った配列表１に記載されるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質であって、依然としてセルラーゼ活性を保持す
るものは、本発明に包含される。

【００１０】本発明によって提供されるタンパク質は、
また、配列表１に記載されるアミノ酸配列の１〜４５３
番までの配列からなるものである。また、この配列のN
末端に更に配列表１の―２３〜―１番までのアミノ酸配
列を有するタンパク質も本発明に包含される。本発明に
よるこれらのタンパク質は、セルラーゼ活性を有し、特
に中性領域のpHにおいて活性を有する。

【００１１】これらのタンパク質は、H．インソレンス
に由来するものであり、この配列表１の１〜４５３番ま
での配列を有するタンパク質は成熟タンパク質であり、
―２３〜―１番の配列はシグナルペプチドである。

【００１２】なお、以下でこの配列表１に記載されるア
ミノ酸配列の１〜４５３番までの配列をセルラーゼNCE
２、その遺伝子をセルラーゼNCE２遺伝子と言う場合が
ある。

【００１３】本発明によれば、前記タンパク質のアミノ
酸配列をコードするDNA配列が提供される。このDNA配列
の典型的配列は、配列表２に記載される塩基配列の一部
または全部を有するものである。

【００１４】配列表２に記載される塩基配列は、H．イ
ンソレンスの染色体DNAを表したものである。配列表２
に記載される塩基配列は、配列番号３８９のATGで始ま
り、配列番号２０９６〜２０９８のTGAで終了するオー
プンリーディングフレーム（読み取り枠）を有する。ま
た、配列番号４５８〜２０９５の塩基配列は、４５３残
基からなる前記成熟タンパク質に対応する。更に、配列
表２の塩基配列中には４つのイントロンが存在すること
が確認された。

【００１５】タンパク質のアミノ酸配列が与えられれ
ば、それをコードするDNA配列は容易に定まり、配列表
１に記載されるアミノ酸配列の全部または一部をコード
する種々の塩基配列を選択することができる。従って、
本発明による配列表１に記載されるアミノ酸配列の一部
または全部をコードするDNA配列とは、配列表２に記載
される一部または全部の塩基配列に加え、同一のアミノ
酸をコードする配列であって縮重関係にあるコドンを塩
基配列として有する配列も意味するものとする。

【００１６】本発明によるタンパク質をコードする遺伝
子の塩基配列は、これまでにクローン化され、そして塩
基配列が明らかにされたいかなるセルラーゼ遺伝子のそ
れと相違するものである。これは、核酸データベースGe
nBank（登録商標）、R８１．０、February，１９９４に
登録されているセルラーゼ遺伝子と比較することによっ
てすでに確認されている。

【００１７】本発明によるDNAは、天然由来のものであ
っても、全合成したものであってもよい。また、天然物
由来のものの一部を利用して合成を行ったものであって
もよい。DNAの典型的な取得方法としてはH．インソレン
ス由来の染色体ライブラリーまたはcDNAライブラリーか
ら遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分
アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なDNAプロ
ーブを用いてスクリーニングを行う方法、等が挙げられ
る。また前記した寄託菌より得ることも可能である。

【００１８】本発明によるDNA配列は以下のようにして
決定した。 （１）クローン化用DNAプローブの作成 H．インソレンスを培養し、セルラーゼ活性を指標とし
て、各種クロマトグラフィーおよび２次元電気泳動を用
いてセルラーゼを精製した。次いで、この精製セルラー
ゼを各種プロテアーゼによって分解し、アミノ酸配列を
ペプチドシークエンサーによって決定した。このアミノ
酸配列に基づいて、可能な塩基配列を全て含むオリゴヌ
クレオチドの混合物を調製し、これをプライマーとした
PCR法による増幅を行った結果、約８００bpのDNAが合成
され、これをプローブとして用いた。

【００１９】（２）ゲノムDNAライブラリーの作製 H．インソレンスを培養し、集菌して菌体を得た。この
菌体より、全DNAをHiroyuki Horiuchi et al., J. Bact
eriol．170: 272〜278,1988 に記載される方法に準じて
調製した。得られたDNAを制限酵素で分解し、６〜１０k
bpの断片を主体とするDNA断片を得た。このDNAを基に、
市販されているベクター・キットを用いてゲノムDNAラ
イブラリーを作製した。

【００２０】（３）セルラーゼ遺伝子のクローン化 上記（2）により得られたDNAライブラリー（例えば、フ
ァージDNAライブラリー）を大腸菌に感染させ、生じた
プラークをナイロンメンブランにブロットし、アルカリ
変性・固定化を行った後、上記（１）により得られたプ
ローブとハイブリダイズさせ陽性プラークを選択した。

【００２１】（４）塩基配列の決定 上記の様にして選択されたクローン（計５個）のうち１
個についてDNAを調製し、DNAシークエンサーを用いて塩
基配列を決定した。また、H．インソレンスから得たmRN
Aに逆転写酵素を働かせることによりcDNAを合成し、こ
れを基にファージライブラリーを作製し、陽性プラーク
からcDNAを得た。このcDNAの全塩基配列と前記ゲノムの
塩基配列とを比較することにより、イントロン、読み取
り枠の存在が明らかになった（実施例６参照）。

【００２２】（５）セルラーゼ遺伝子の発現 微生物内での発現用セルラーゼNCE２遺伝子を選択マー
カー遺伝子と共にプラスミド化し、H．インソレンスに
形質転換した。その結果、得られた形質転換体は選択マ
ーカーに対する耐性が付与されると共に、セルラーゼ活
性が向上していた（実施例１０参照）。

【００２３】発現ベクター及び形質転換された微生物 また、本発明によれば、前記の本発明によるDNA配列
を、宿主微生物内で複製可能でかつそのDNA配列がコー
ドするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベ
クターが提供される。この宿主―ベクター系は特に限定
されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、カビなどを用
いた系、及び、それらを用いた他のタンパク質との融合
タンパク質発現系などを用いることができる。本発明に
よるベクター構築の手順および方法は、遺伝子工学の分
野で慣用されているものを用いることができる。

【００２４】本発明による発現ベクターは、これを実際
に宿主微生物内に導入して所望のタンパク質を発現させ
るためには、前記の本発明によるDNA配列の他に、その
発現を制御するDNA配列や微生物を選択するための遺伝
子マーカーなどを含んでもよい。配列表２の塩基配列
は、これらの制御配列も含んでいると考えられることか
ら、この塩基配列をそのまま利用することも場合によっ
て有利である。また、この発現ベクターは、セルラーゼ
をコードするDNA配列を反復した形（タンデム）で含ん
でもよい。これらは常法に従い発現ベクターに存在させ
てよく、このベクターによる微生物の形質転換の方法
も、この分野で慣用されているものを用いることができ
る。

【００２５】この形質転換体を適当な培地で培養し、そ
の培養物から上記した本発明によるタンパク質を単離し
て得ることができる。したがって、本発明の別の態様に
よれば、前記の本発明による新規タンパク質の製造法が
提供される。形質転換体の培養及びその条件は、使用す
る微生物についてのそれと本質的に同様であってよい。
また、培養液からの本発明による新規タンパク質の回
収、精製も常法にしたがって行うことができる。

【００２６】

【実施例】実施例１ セルラーゼNCE２の精製 H．インソレンス株を（Ｎ）培地中で37℃で培養した
（（Ｎ）培地組成：5.0%アビセル、2.0% 酵母エキス、
0.1%ポリペプトン、0.03% 塩化カルシウム、0.03%硫酸
マグネシウム、pH 6.8）。7日間培養の後、得られた培
養液を7000rpmで20分間遠心することにより、菌体を除
いた。得られた培養上澄を凍結乾燥後、5%(w/v)となる
ように25mMトリス塩酸緩衝液（pH 9.0）に溶解し、陰イ
オン交換カラム（monoQ (60/100)、ファルマシアバイオ
テク社製）に適用し、25mMトリス塩酸緩衝液（pH 9.0）
で溶出した。このカラムに吸着しなかった画分を、凍結
乾燥後、10%(w/v)となるように50mMトリス塩酸緩衝液
（pH9.4）に溶解し、フェニルスーパーロースカラム(ph
enyl-superose HR5/5, ファルマシアバイオテク社製）
に適用し、50mMトリス塩酸緩衝液（pH 9.4）に1.5〜0M
の濃度勾配をかけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、分
画した。このうち、0Mの濃度勾配のとき得られた画分
は、pHが中性の領域においてセルラーゼ活性を示すこと
が確認された。クロマトグラフ処理したセルラーゼNCE
２を SDS-PAGEにより分析した。電気泳動的に分離され
た蛋白質をクマーシーブルーR250で染色したところ、ゲ
ルは単一の染色バンドを示した。この蛋白質の見かけ分
子量を、既知のマーカータンパク質の移動度と比較し
て、約63000ダルトンであると算定した。

【００２７】実施例２ セルラーゼNCE２の部分アミノ
酸配列 （１） N末端側アミノ酸残基の同定 実施例１で精製したタンパク質を、マルチフォーII電気
泳動装置（ファルマシアバイオテク社製）を用いて泳動
後、PVDF膜（ミリポア社製）に、タンパク質を電気的に
写しとった。これをポンソーＳ色素で染色した後、6300
0ダルトンのタンパク質がブロットされた部分を切り出
し、水で洗浄後、風乾した。これをプロテインシーケン
サーPSQ-1（島津製作所社製）に供し、N末端側アミノ酸
配列の決定を試みたが、エドマン分解により切り出され
るアミノ酸が得られず、N末端側アミノ酸が修飾保護さ
れていることが判明した。そこで、同ブロットされたタ
ンパク質を、Podell, D. N.らの方法（Podell, D. N. e
t al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 81:176,1978
）に従い、仔牛肝臓ピログルタミン酸アミノペプチダ
ーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）で修飾N末端残
基を除去し、水で洗浄、風乾後、再度プロテインシーケ
ンサーPSQ-1により、N末端側アミノ酸配列を６残基決定
した。得られた配列は、Asn-(Cys)-Ala-Ser-Thr-Trpの
順序であった。

【００２８】（２）ペプチドマッピング タンパク質内部のアミノ酸配列を決定するため、実施例
１のタンパク質をModel 172μプレパラティブHPLCシス
テム（パーキンエルマー社製）でカラムクロマトグラフ
ィーを行い（カラム：C8 220×2.1mm、0-70%アセトニ
トリルグラジェント）主要なピークを分取した。これを
凍結乾燥後、50mM重炭酸アンモニウム緩衝液（pH 7.8）
に溶解した。200pmolのタンパク質に対し約1/50モル量
のV8プロテアーゼ（和光純薬社製）を添加し、37℃、一
晩反応させた。同分解産物を前述のHPLCシステムを用い
てカラムクロマトグラフィー（カラム：C8 220×2.1m
m、0-35%アセトニトリルグラジェント）を行い、３種の
ペプチドを分取した。得られたペプチド断片のアミノ酸
配列をプロテインシーケンサーModel 476A（パーキンエ
ルマー社製）により決定した。得られたペプチドのアミ
ノ酸配列を以下に示す。 V8-2：Val-Gln-Leu-Trp-Ala-Asn-Asn-Tyr-Tyr-Arg-Ser-Glu（１２残基） * * * * * * V8-3：Phe-Ile-Val-Asp-Gln-Gly-Arg-Ser-Gly-Lys-Gln-Pro-Thr（１３残基） * * * * * * V8-8：Ala-Gly-Gln-Tyr-Phe-Gln-Ala-Tyr-Phe-Glu（１０残基） これらのアミノ酸配列は、トリコデルマ リーセイ株
（Trichoderma reesei）から得られたcbh-IIのアミノ酸
配列（Chung Mong Cen et al., Bio/Technology5:274-2
78,1987 ）と相同性を示すことから、同タンパク質は、
セルラーゼの一種であることを強く示唆した。また、上
記配列をProtein Identification Resource (PIR) R44.
0, March, 1994、またはSWISS-PROT R28.0, January, 1
994 に登録されている配列と比較したところ、前述cbh-
IIと相同性を示す配列はあるものの、同一のものはな
く、新規なタンパク質であることが明らかとなった。

【００２９】実施例３ ゲノムDNAライブラリーの作製 ゲノムDNAの単離はHoriuchiらの方法（Hiroyuki Horiuc
hi et al., J. Bacteriol. 170: 272-278,1988 ）に従
った。まず、H．インソレンス株を実施例１の（Ｎ）培
地で2日間培養し、遠心分離（3500rpm, 10分）によって
菌体を回収した。得られた菌体をフェノール処理、プロ
テイナーゼK及びリボヌクレアーゼA処理、さらにPEG沈
殿化によりゲノムDNAを得た。つぎに、H．インソレンス
ゲノムDNAをEcoRIにより消化した。これをアガロースゲ
ル電気泳動に供し、６―１０kbpの断片をセファグラス
・バンドプレップキット（ファルマシアバイオテク社
製）によりゲルから回収した。同DNA断片をファージベ
クター、λZAP IIクローニングキット（ストラタジーン
社）のEcoRIアームにT4ＤＮＡリガーゼを用いて連結さ
せた。これをエタノール沈殿後、TE緩衝液（10mMトリス
塩酸（pH 8.0）、1mM EDTA）に溶解した。連結混合物の
全量をHohn, B.の方法（ Hohn, B.,Methods in Enzymol
ogy 68:299-309,1979）に従って凍結したパッケージ成
分（ストラタジーン社製ギガパックIIパッケージングキ
ット）を用いて、ラムダヘッドにパッケージし、得られ
たファージを大腸菌XL1-Blue MRF'株に感染させた。こ
の方法により得られた７×１０⁴個のファージライブラ
リーを用いて目的遺伝子のクローニングを行った。

【００３０】実施例４ PCR法による長鎖プローブの作
成 DNAプローブは、H．インソレンスの全DNAを鋳型にし、P
CR法により増幅させたロングプローブを作成し、これを
用いた。各プライマーは、実施例２のペプチドV8-2、V8
-3の＊で示したアミノ酸に対応するDNAを合成した。即
ち、Chung Mong Cenらの報告（Chung Mong Cen et al.,
Bio/Technology 5:274-278,1987）より、V8-2がV8-3よ
りN末端側に位置すると予測し、以下のような配列の合
成オリゴヌクレオチドを作成した。作成した各プライマ
ーの塩基配列は以下の通りである。 V8-2U: 5'-TGG GC(ACGT) AA(CT) AA(CT) TA(CT) TA-3' V8-3L: 5'-CC (CT)TG (AG)TC (ACGT)AC (AGT)AT (AG)AA
-3' PCR反応は、まず、H．インソレンスゲノムDNA1μgに対
し、プライマーを各1μM加え、dNTP存在下、94℃、10分
間熱変性を行った。その後、Taqポリメラーゼ（リコン
ビナントTaq、宝酒造社製）を加え、94℃1分間、50℃2
分間、72℃3分間の反応条件を30回繰り返すことにより
増幅した。その結果、８００bpのDNAが増幅した。これ
を以降のスクリーニングのプローブとして用いた。

【００３１】実施例５ セルラーゼ成分NCE２遺伝子の
クローニング （１）プラークハイブリダイゼーションによるスクリー
ニング PCR法により増幅させた８００bpのDNA断片100ngを、あ
らかじめECLダイレクトDNA/RNAラベリング検出システム
（アマシャム社製）により標識化しておいた。実施例３
のように作成したファージプラークは、ハイボンドN⁺ナ
イロントランスファーメンブラン（アマシャム社製）に
写しとり、0.4N水酸化ナトリウムで変性後、5倍濃度SSC
（15mMクエン酸３ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム）
で洗浄し、乾燥させDNAを固定した。前述キットに記載
の方法に従って、1時間のプレハイブリダイゼーション
（42℃）の後、先の標識化したプローブを添加し、4時
間（42℃）ハイブリダイゼーションを行った。ラベルの
洗浄はキットに記載の方法に従った。まず、0.4% SDS、
6M尿素添加0.5倍濃度SSCで42℃、20分間の洗浄を２回繰
り返し、次に2倍濃度SSCで室温、5分間の洗浄を2回行っ
た。プローブの洗浄を行ったナイロン膜は、添付されて
いる検出溶液に１分間浸したあと、ハイパーフィルム―
ECL（アマシャム社製）に感光させ、５個の陽性クロー
ンを得た。

【００３２】（２）ファージDNAの調製 陽性クローンからのDNAの調製は、キットに記載の方法
に従い、プラスミドDNAとして調製した。アンピシリン
に耐性をしめす大腸菌SOLR^TMから、プラスミド（pMII）
を調製し、これをEcoRIで消化し、アガロースゲル電気
泳動に供した。その結果、全ての陽性クローン由来のプ
ラスミドは7kbpのEcoRI断片を含んでいた。これは、H．
インソレンスのゲノムサザン解析の結果と一致した。

【００３３】実施例６ 塩基配列の決定 ゲノムDNAの塩基配列解析 塩基配列解析装置は、A.L.F. DNAシーケンサーII（ファ
ルマシアバイオテク社製）を用いた。シーケンシングゲ
ルは、レディミックスゲル（ファルマシアバイオテク社
製）、又はハイドロリンクロングレンジャー（AT Bioch
em社製）のアクリルアミド担体を使用した。ゲル作成用
各種試薬（N, N, N', N'-テトラメチルエチレンジアミ
ン、尿素、過硫酸アンモニウム）はA.L.Fグレード（フ
ァルマシアバイオテク社製）の試薬を用いた。塩基配列
解読反応は、オートリードシーケンシングキット又はオ
ートサイクルシーケンシングキット（ファルマシアバイ
オテク社製）を用いた。ゲル作成条件、反応条件と泳動
条件の各々は、各説明書の詳細を参照して設定した。

【００３４】（１）塩基配列解読用鋳型プラスミド（以
下単に「テンペレート」と記す）の調製 塩基配列解読を速やかに進めるため、以下のサブクロー
ンを作成した。まず、プラスミドpMIIをEcoRI-XbaIで消
化し、EcoRI-XbaI消化pUC119にクローン化した（pM14-
1、図１）。更に、EcoRI-BamHIまたはBamHI-XbaIで消化
し、同様の制限酵素で消化したpUC119に連結したものも
作成した（それぞれpM14-1U、pM14-1L、図２）。

【００３５】（２）塩基配列の解読 pM14-1、pM14-1U、pM14-1L、の各テンペレート10μgを2
M水酸化ナトリウムでアルカリ変性後、オートリードシ
ーケンシングキット添付のユニバーサルおよびリバース
各プライマーとアニーリングさせ、伸長反応を行った。
反応産物をシーケンサーで解読したところ、８２６〜１
６６１bpの塩基配列が判明した。この結果から、WATA-3
1、WATA-32なるFITC標識シーケンシングプライマーを作
成し、pM14-1に対して反応させ、さらに解読を進めた。
その結果、２９３〜２２７６bpの配列を解読した。EcoR
I認識部位からXbaI認識部位間での連結は、WATA-34、WA
TA-35なるプライマーを作成し、pM14-1に対して反応さ
せることにより行った。 WATA-31： 5'-CTC AAG GCA GGG TCG GTG ATC TG-3' (23mer) WATA-32： 5'-CTA CGA CGA GAA GCA CTA CAT CG-3' (23mer) WATA-34： 5'-TCC TTA ATT GAC GTC GCA CCG AGC-3' (24mer) WATA-35： 5'-CTT GTT TGA CCG TGT GCC GTG AGG-3' (24mer)

【００３６】（３）塩基配列の決定 前述（２）の結果をもとに、WATA-41〜WATA-53なるFITC
標識シーケンシングプライマーDNAを合成し、これらプ
ライマーとpM14-1とのオートリードシーケンシングキッ
トによる反応を行った。まず、10μgのプラスミドをア
ルカリ変性し、これを各々のプライマーとアニーリング
し、T7ポリメラーゼで反応させた。また、テンペレート
の２次構造上判読不能なところは、オートサイクルシー
ケンシングにより解読した。 WATA-41： 5'-TTC CCA CAC GAA GCA TTC TCC AGC-3' (24mer) WATA-42： 5'-CGA CTT CGA GCT CGT CGA CCA CC-3' (23mer) WATA-43： 5'-TCG AGA CCC TCT CTG AGA TCC GC-3' (23mer) WATA-44： 5'-ATC GAG CCC GAC TCG CTG GCC AAC-3' (24mer) WATA-46： 5'-CCC GCT ACG ACT ACC ACT GCG GTC-3' (24mer) WATA-47： 5'-GAC GTC GCT TAA TGC ATT GAG GGG-3' (24mer) WATA-48： 5'-TCT TGT CCA ACA ATG GCA GAT GC-3' (23mer) WATA-49： 5'-CCT CAG GGG CGG GCT TGA GGG CG-3' (23mer) WATA-50： 5'-CGA TGT AGT GCT TCT CGT CGT AG-3' (23mer) WATA-51： 5'-GGG CTC GAT AAC CAG AAT CGT GC-3' (23mer) WATA-52： 5'-CGA CGA GCA GGG TGT CGA CCG TG-3' (23mer) WATA-53： 5'-ACC GGT CCT GGT GGT CGA GGT GGC-3' (24mer) その結果、EcoRI-XbaI断片の内、２４０９bpの塩基配列
を配列表２の様に決定した。

【００３７】実施例７ イントロンの決定 イントロンの決定には、H．インソレンスからmRNAを調
製し、逆転写酵素によりcDNAを合成し、これとゲノムの
塩基配列から同領域を判定した。

【００３８】（１）全RNAの調製 H．インソレンスをセルラーゼ誘導培地、好ましくは実
施例１の（Ｎ）培地で２日間培養し、菌体を遠心分離
（3500rpm, 10分）により回収した。そのうち2gの菌体
を滅菌水で洗浄し、液体窒素で凍結したままブレンダー
（日本精機社製ホモジナイザーAM-3）で粉砕した。これ
を4Mグアニジンチオシアン酸塩を含む変性溶液10ml（4M
グアニジンチオシアン酸塩、25mMクエン酸３ナトリウ
ム、0.5% N-ラウリルサルコシン酸ナトリウム、0.1Mメ
ルカプトエタノール）に懸濁した。室温で数分間攪拌の
後、1mlの2M酢酸ナトリウム（pH4.5）で中和し、10mlの
TE飽和フェノールを加えさらに攪拌した。ここに2mlの
クロロホルム―イソアミルアルコール（24：1）を加
え、よく攪拌の後、遠心分離（3500rpm, 10分）により
フェノールで変性した菌体成分を除去した。上層（水
層）を吸い取り、10mlのイソプロパノールで核酸を沈殿
化した。同沈殿を遠心分離（3500rpm, 10分）で核酸を
回収し、70%エタノール―水で再遠心分離により沈殿を
洗った。同沈殿は、3.5mlのTE緩衝液に溶解の後、880μ
lの10M塩化リチウム溶液を加え、５℃で２時間冷蔵の
後、遠心分離（12000rpm, 10分）により沈殿を回収し
た。同沈殿は70%―エタノールで洗い、これを全RNA画分
とした。収量は2.7mg,収率は0.14%であった。

【００３９】（２）ポリAテイル+RNA（＝mRNA）の調製 mRNAの調製はmRNAピュアリフィケーションキット（ファ
ルマシアバイオテク社製）を用いて行った。まず（１）
で調製した全RNAのうち1mgを1mlのエリューションバッ
ファーに溶解し、これに65℃、10分間の熱変性処理を加
えた。氷中で急冷の後、0.2mlのサンプルバッファーを
加えた。この全量のRNA溶液をオリゴ（dT）セルロース
カラムに適用し、ハイソルトバッファーで3回、ロウソ
ルトバッファーで3回カラムを洗浄の後、65℃に加温し
たエリューションバッファーで溶出した。このカラム操
作を2回繰り返し、mRNA画分とした。収量は19.2μg、収
率は2%であった。

【００４０】（３）cDNAの合成 cDNA合成はタイムセーバーcDNA合成キット（ファルマシ
アバイオテク社製）を使用した。まず、5μgのmRNAを20
μlのサンプルバッファーに溶解した。65℃、10分間の
熱処理後、ファーストストランド合成ミックスにジチオ
スレイトール溶液、オリゴ（dT）プライマーと共に添加
し、37℃で1時間反応させた。次に、この全量をセカン
ドストランドミックスに加え、12℃で30分間、次いで22
℃で1時間反応させ、これをcDNAとした。

【００４１】（４）セルラーゼ成分NCE2cDNAのクローニ
ング 合成した全cDNAを末端リン酸化し、EcoRI-NotIアダプタ
ーを連結した。この全量をλgt11クローニングキット
（ストラタジーン社製）を用いてファージライブラリー
を作成した。約１０⁵個のプラークをナイロンメンブラ
ンに転写し、実施例４のPCR増幅断片をプローブにスク
リーニングを行った。その結果、1５個の陽性プラーク
を選抜した。このファージを大腸菌Y1088株に感染さ
せ、8時間後ファージ粒子を集め、Ｄ．Grossbergerの方
法（Grossberger, D.,Neucleic acid Res.15:6737,198
7）により、プロテイナーゼＫ及びフェノール処理後、
エタノール沈殿により、ファージDNAを分離した。これ
をEcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動で解析した
ところ、２個のファージ由来DNAが同様の制限酵素地図
を示すこと、EcoRI断片が1.8kbpの大きさであることか
らこれをpUC118にクローン化し（pPR2）、塩基配列解読
用テンペレートとした。

【００４２】（５）cDNAの塩基配列解析 シーケンシング反応は前述同様オートリードシーケンシ
ングキットを用いて行った。プラスミドpPR2を2M水酸化
ナトリウムでアルカリ変性し、エタノールで沈殿化し
た。この一本鎖プラスミドをテンペレートとし、T7ポリ
メラーゼで反応させた。プライマーはキット添付のユニ
バーサルとリバース、前記合成プライマーWATA-42、 WA
TA-43、 WATA-44、WATA-32、WATA-46、 WATA-47、WATA-
48、WATA-49、WATA-50、WATA-51、WATA-52、WATA-53を
用いた。その結果、４７８〜５３５bp (Intron I)、１
０３０〜１１４１1bp (Intron II)、１７６２〜１８１
５bp (Intron III)と１９９０〜２０４４bp (Intron I
V)の計４つのイントロンが存在していることが判明し
た。

【００４３】配列表２において、イントロン配列の非翻
訳開始配列、その終了配列、およびイントロン内部の調
節配列は下記の通りである（数字は配列表２の配列番号
である）。 Intron I ：４７８〜４８３、５３３〜５３５、５１８
〜５２４ Intron II ：１０３０〜１０３５、１１３９〜１１４
１、１１２４〜１１３０ Intron III：１７６２〜１７６７、１８１３〜１８１
５、１７９９〜１８０５ Intron IV ：１９９０〜１９９５、２０４２〜２０４
４、２０２９〜２０３５

【００４４】実施例８ H．インソレンス用形質転換ベ
クターの構築 H．インソレンスにNCE２遺伝子を再導入するために、ま
ず、アスペルギルスニデュランス(Aspergillus nidulan
s)由来trpC遺伝子のプロモーターとターミネーター（Mu
llaney E.J. et al., Mol. Gen. Genet. 199:37-45,1
985 ）を用いてビアラホス耐性遺伝子(bar：Thompson,
C. J. et al., EMBO J. 6: 2519-2523,1987）をH．イン
ソレンスで発現可能にした遺伝子を作製した。これをNC
E２遺伝子を含むプラスミドpM14-1のXbaIサイトに導入
し、組み換えプラスミドpNCE4を作製した。

【００４５】実施例９ H．インソレンスの形質転換 H．インソレンスを（Ｓ）培地中37℃で培養し、24時間
後、3000rpm、10分間遠心分離により集菌した。（Ｓ）
培地の組成は、実施例１の（Ｎ）培地にグルコース（3.
0％）を加え、アビセルを除いたものである。得られた
菌体を0.5Ｍシュークロースで洗浄し、0.45μmのフィル
ターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（5mg/ml Nov
ozyme 234、5mg/ml Cellulase Onozuka R-10、0.5Mシュ
ークロース）10mlに懸濁した。30℃で60〜90分間振盪
し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過
した後、2500rpmで10分間遠心分離してプロトプラスト
を回収し、SUTC緩衝液（0.5Mシュークロース、10mM塩化
カルシウム、10mMトリス塩酸（pH7.5））で洗浄した。
以上のように調製したプロトプラストを1mlのSUTC緩衝
液に懸濁し、この100μlに対し、実施例８で得られたプ
ラスミドpNCE4のDNA（TE）溶液10μg（10μl）を加え、
氷中に5分間静置した。つぎに、400μlのPEG溶液（60%
PEG4000、10mM塩化カルシウム、10mMトリス塩酸（pH7.
5））を加え、氷中に20分間静置した後、10mlのSUTC緩
衝液を加え、2500rpmで10分間遠心分離した。集めたプ
ロトプラストを1mlのSUTC緩衝液に懸濁した後、4000rpm
で5分間遠心分離して、最終的に100μlのSUTC緩衝液に
懸濁した。以上の処理を加えたプロトプラストを、ビア
ラホス（200μg/ml）添加YMG培地（1%グルコース、0.4%
酵母エキス、0.2%モルトエキス、1%寒天（pH6.8）)上
に、YMG軟寒天とともに重層し、37℃で５日間培養後、
形成したコロニーを形質転換体とした。

【００４６】実施例１０ H．インソレンス形質転換体
のセルラーゼ活性 実施例９の様にプラスミドpNCE4をH．インソレンスに導
入し、ビアラホスに耐性を示す株を６１株選抜した。こ
のうち、ビアラホス耐性の高いもの５株（７５０〜１０
００μg/ml）を実施例１の（Ｎ）培地で培養した。培養
上澄をSDS-PAGEにより解析したところ、NCE２は親株の
２〜４倍分泌されていた。セルラーゼ活性は、W. A. Wo
odらの方法（W. A. Wood, S. T. Kellogg. "Methods in
Enzymology, vol. 160, Biomass part A, Cellulose a
nd Hemicellulose"(ACADEMIC PRESS, INC.): p97）に従
って、上澄のアビセル分解活性を測定した。その結果、
形質転換体は親株の１４１％の比活性であった。

【００４７】

【表１】

【００４８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４７６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Lys Phe Phe Leu Thr Ala Ala Phe Ala Ala Ala Ala Leu Ala -20 -15 -10 Ala Pro Val Val Glu Glu Arg Gln Asn Cys Ala Pro Thr Trp Gly Gln -5 1 5 Cys Gly Gly Ile Gly Phe Asn Gly Pro Thr Cys Cys Gln Ser Gly Ser 10 15 20 25 Thr Cys Val Lys Gln Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Gly Ser 30 35 40 Gln Val Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Ser Ser Ser Thr Thr 45 50 55 Ser Arg Ala Thr Ser Thr Thr Arg Thr Gly Gly Val Thr Ser Ile Thr 60 65 70 Thr Ala Pro Thr Arg Thr Val Thr Ile Pro Gly Gly Ala Thr Thr Thr 75 80 85 Ala Ser Tyr Asn Gly Asn Pro Phe Glu Gly Val Gln Leu Trp Ala Asn 90 95 100 105 Asn Tyr Tyr Arg Ser Glu Val His Thr Leu Ala Ile Pro Gln Ile Thr 110 115 120 Asp Pro Ala Leu Arg Ala Ala Ala Ser Ala Val Ala Glu Val Pro Ser 125 130 135 Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val Thr Val Asp Thr Leu Leu Val Glu 140 145 150 Thr Leu Ser Glu Ile Arg Ala Ala Asn Gln Ala Gly Ala Asn Pro Pro 155 160 165 Tyr Ala Ala Gln Ile Val Val Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala 170 175 180 185 Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Trp Ala Ile Ala Asn Asn Gly Ala Asn 190 195 200 Asn Tyr Lys Gly Tyr Ile Asn Arg Ile Arg Glu Ile Leu Ile Ser Phe 205 210 215 Ser Asp Val Arg Thr Ile Leu Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn 220 225 230 Met Val Thr Asn Met Asn Val Ala Lys Cys Ser Gly Ala Ala Ser Thr 235 240 245 Tyr Arg Glu Leu Thr Ile Tyr Ala Leu Lys Gln Leu Asp Leu Pro His 250 255 260 265 Val Ala Met Tyr Met Asp Ala Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro 270 275 280 Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala Glu Leu Phe Ala Lys Ile Tyr Glu Asp 285 290 295 Ala Gly Lys Pro Arg Ala Val Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn 300 305 310 Tyr Asn Ala Trp Ser Ile Ser Ser Pro Pro Pro Tyr Thr Ser Pro Asn 315 320 325 Pro Asn Tyr Asp Glu Lys His Tyr Ile Glu Ala Phe Arg Pro Leu Leu 330 335 340 345 Glu Ala Arg Gly Phe Pro Ala Gln Phe Ile Val Asp Gln Gly Arg Ser 350 355 360 Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Lys Glu Trp Gly His Trp Cys Asn Ala 365 370 375 Ile Gly Thr Gly Phe Gly Met Arg Pro Thr Ala Asn Thr Gly His Gln 380 385 390 Tyr Val Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys Asp Gly 395 400 405 Thr Ser Asp Thr Thr Ala Ala Arg Tyr Asp Tyr His Cys Gly Leu Glu 410 415 420 425 Asp Ala Leu Lys Pro Ala Pro Glu Ala Gly Gln Trp Phe Gln Ala Tyr 430 435 440 Phe Glu Gln Leu Leu Arg Asn Ala Asn Pro Pro Phe 445 450

【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：２４０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：Ｈ．インソレンス(Humicola insolens) 配列の特徴 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：３８９．．４５７ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：４５８．．２０９８ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ 存在位置：４７８．．５３５ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ 存在位置：１０３０．．１１４１ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ 存在位置：１７６２．．１８１５ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ 存在位置：１９９０．．２０４４ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖｅｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置：６８８．．６９３ 他の情報：ＳｍａＩ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖｅｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置：１２５３．．１２５９ 他の情報：ＢａｍＨＩ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖｅｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置：１５０５．．１５１０ 他の情報：ＢｇｌII 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖｅｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置：１６４３．．１６４８他の情報：ＳｔｕＩ 配列 TGCTGGACCT TGGATGCGTC TGCCGAGCTG TGCGTGCGGA AGAGTCGAGC GTGATTCCGG 60 CATCACTGAA CACTCGCTGG TTGCTGGTTC TGGAAGCGGT ACGTCCGGCG CAAACCAGCA 120 AAAGCAGGTT TGCGCTGCCT TGGCCTCCGT GAGAGGCATG ATGCCAAGGA TGAATGGTTC 180 CTCTGCGGAC TCAACCATCC GCACTTCGAG CCCGACGATC CGGGCCCCCT GCTCCGGCGC 240 GGAGAGCCGT GGTGAGCTCC AAGTGATGCG GAATCGGTGA TGTGCAAGAT GCGGAGGGCA 300 TAAAAAGGCT GTTTCCCACA CGAAGCATTC TCCAGCTTGT TTCCTCACGG CACACGGTCA 360 AACAAGTCTG TGCAGTACCT GGGACAAG ATG GCC AAG TTC TTC CTT ACT GCT 412 Met Ala Lys Phe Phe Leu Thr Ala -20 GCC TTT GCG GCT GCC GCT CTC GCC GCT CCC GTT GTT GAG GAG CGC CAG 460 Ala Phe Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ala Pro Val Val Glu Glu Arg Gln -15 -10 -5 1 AAC TGT GCC CCG ACT TG GTGAGCAATG GTGTTTCATG GATCGTGTCT TTGGATGTGC 517 Asn Cys Ala Pro Thr Tr 5 GGCTAACAAC CATTCCAG G GGC CAG TGC GGT GGC ATC GGC TTC AAT GGC 566 p Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Asn Gly 10 15 CCG ACT TGC TGC CAG TCT GGT AGC ACC TGC GTG AAG CAG AAC GAC TGG 614 Pro Thr Cys Cys Gln Ser Gly Ser Thr Cys Val Lys Gln Asn Asp Trp 20 25 30 TAC TCC CAG TGC TTG CCC GGT AGC CAG GTC ACC ACG ACC TCG ACT ACG 662 Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Gly Ser Gln Val Thr Thr Thr Ser Thr Thr 35 40 45 TCG ACT TCG AGC TCG TCG ACC ACC TCC CGG GCC ACC TCG ACC ACC AGG 710 Ser Thr Ser Ser Ser Ser Thr Thr Ser Arg Ala Thr Ser Thr Thr Arg 50 55 60 65 ACC GGT GGT GTG ACC TCG ATC ACC ACT GCT CCC ACC CGC ACC GTC ACC 758 Thr Gly Gly Val Thr Ser Ile Thr Thr Ala Pro Thr Arg Thr Val Thr 70 75 80 ATC CCT GGC GGT GCC ACC ACC ACG GCC AGC TAC AAC GGC AAC CCC TTC 806 Ile Pro Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ser Tyr Asn Gly Asn Pro Phe 85 90 95 GAG GGT GTC CAG CTC TGG GCC AAC AAC TAC TAC CGC TCT GAG GTC CAC 854 Glu Gly Val Gln Leu Trp Ala Asn Asn Tyr Tyr Arg Ser Glu Val His 100 105 110 ACC CTC GCC ATT CCT CAG ATC ACC GAC CCT GCC TTG AGG GCT GCG GCC 902 Thr Leu Ala Ile Pro Gln Ile Thr Asp Pro Ala Leu Arg Ala Ala Ala 115 120 125 TCG GCC GTC GCT GAG GTC CCG AGC TTC CAG TGG CTC GAC CGC AAC GTC 950 Ser Ala Val Ala Glu Val Pro Ser Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val 130 135 140 145 ACG GTC GAC ACC CTG CTC GTC GAG ACC CTC TCT GAG ATC CGC GCC GCG 998 Thr Val Asp Thr Leu Leu Val Glu Thr Leu Ser Glu Ile Arg Ala Ala 150 155 160 AAC CAG GCG GGC GCG AAC CCC CCG TAT GCC G GTAAGTGCGG TGTCACCACC 1049 Asn Gln Ala Gly Ala Asn Pro Pro Tyr Ala A 165 170 ACCAACCCTA ACCCTGACCC CTGACCACCA CATCATCAAC ATCACCACAC ATCTCCCACA 1109 TCATTCTGGA CGCAAATTAA CGCCAAATCC AG CC CAG ATC GTC GTT TAC GAC 1161 la Gln Ile Val Val Tyr Asp 175 CTT CCT GAC CGC GAC TGC GCT GCC GCG GCT TCG AAC GGC GAG TGG GCG 1209 Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Trp Ala 180 185 190 ATC GCC AAC AAC GGC GCC AAC AAC TAC AAG GGA TAC ATC AAC CGG ATC 1257 Ile Ala Asn Asn Gly Ala Asn Asn Tyr Lys Gly Tyr Ile Asn Arg Ile 195 200 205 210 CGC GAG ATT CTC ATT TCG TTC TCG GAT GTC CGC ACG ATT CTG GTT ATC 1305 Arg Glu Ile Leu Ile Ser Phe Ser Asp Val Arg Thr Ile Leu Val Ile 215 220 225 GAG CCC GAC TCG CTG GCC AAC ATG GTC ACC AAC ATG AAC GTC GCC AAG 1353 Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Met Val Thr Asn Met Asn Val Ala Lys 230 235 240 TGC AGC GGT GCC GCC TCG ACC TAC CGC GAG TTG ACC ATC TAT GCC CTC 1401 Cys Ser Gly Ala Ala Ser Thr Tyr Arg Glu Leu Thr Ile Tyr Ala Leu 245 250 255 AAG CAG CTC GAC CTC CCG CAC GTC GCC ATG TAC ATG GAC GCC GGC CAC 1449 Lys Gln Leu Asp Leu Pro His Val Ala Met Tyr Met Asp Ala Gly His 260 265 270 GCT GGC TGG CTT GGC TGG CCC GCC AAC ATC CAG CCC GCT GCT GAG CTC 1497 Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala Glu Leu 275 280 285 290 TTC GCC AAG ATC TAC GAG GAT GCC GGC AAG CCC CGC GCC GTC CGC GGT 1545 Phe Ala Lys Ile Tyr Glu Asp Ala Gly Lys Pro Arg Ala Val Arg Gly 295 300 305 CTC GCC ACC AAC GTC GCC AAC TAC AAC GCC TGG AGC ATC TCG AGC CCG 1593 Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Ala Trp Ser Ile Ser Ser Pro 310 315 320 CCG CCG TAC ACC AGC CCC AAC CCC AAC TAC GAC GAG AAG CAC TAC ATC 1641 Pro Pro Tyr Thr Ser Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Glu Lys His Tyr Ile 325 330 335 GAG GCC TTC CGC CCT CTC CTC GAG GCC CGC GGC TTC CCC GCC CAG TTC 1689 Glu Ala Phe Arg Pro Leu Leu Glu Ala Arg Gly Phe Pro Ala Gln Phe 340 345 350 ATC GTC GAC CAG GGC CGC AGC GGC AAG CAG CCC ACC GGC CAG AAG GAA 1737 Ile Val Asp Gln Gly Arg Ser Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Lys Glu 355 360 365 370 TGG GGC CAC TGG TGC AAT GCC ATT GTACGTTAAG GTTAGGGTTA CATATTTGCG 1791 Trp Gly His Trp Cys Asn Ala Ile 375 TTCCCATGAC TAACATCCTT CCAG GGC ACC GGC TTC GGT ATG CGC CCG ACT 1842 Gly Thr Gly Phe Gly Met Arg Pro Thr 380 385 GCC AAC ACC GGC CAC CAG TAC GTC GAC GCC TTC GTC TGG GTC AAG CCC 1890 Ala Asn Thr Gly His Gln Tyr Val Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro 390 395 400 GGC GGT GAG TGC GAC GGC ACC AGC GAC ACG ACC GCT GCC CGC TAC GAC 1938 Gly Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asp Thr Thr Ala Ala Arg Tyr Asp 405 410 415 TAC CAC TGC GGT CTC GAG GAC GCC CTC AAG CCC GCC CCT GAG GCC GGC 1986 Tyr His Cys Gly Leu Glu Asp Ala Leu Lys Pro Ala Pro Glu Ala Gly 420 425 430 435 CAG GTGAGCACCA AACCCGACCA CAACAAGAAA TGTACCAAAG GCTAACCAAC TCCAG 2044 Gln TGG TTC CAA GCC TAC TTT GAG CAA TTA CTT CGT AAT GCC AAT CCG CCG 2092 Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Arg Asn Ala Asn Pro Pro 440 445 450 TTC TGA GCGGTTTGAG GCGTTTGGCG CGATGTTGGC GATGTTTAGG ATCAAAAAGG 2148 Phe *** GGGGGAAAAG GCGAAAAGGG GCCGGTCCGG GAGGCCCCAC AATATCGGCC CCACCCTCCG 2208 ATCACGTGCT CCCCGCATCG GCACAGACGT CGCTTAATGC ATTGAGGGGG TTGACAAAAT 2268 TCAAGTCTTC TTCTGTAAAT AGTTGGCATC TGCCATTGTT GGACAAGATT TAGTCTTTCG 2328 AGTATATACA CTTTGTTCCA ACGGGGTCTA GTAACTTCCG AGGTCATCTC ATCAAGCATT 2388 GTTTGAGTCT CGCGTTTATA C 2409

【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Cys Ala Ser Thr Trp 1 5

【００５１】配列番号：4 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Gln Leu Trp Ala Asn Asn Tyr Tyr Arg Ser Glu 1 5 10

【００５２】配列番号：５ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Ile Val Asp Gln Gly Arg Ser Gly Lys Gln Pro Thr 1 5 10

【００５３】配列番号：６ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Gly Gln Tyr Phe Gln Ala Tyr Phe Glu 1 5 10

【００５４】配列番号：７ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGG GCN AAY AAY TAY TA 17

【００５５】配列番号：８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CC YTG RTC NAC DAT RAA 17

【００５６】配列番号：９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTC AAG GCA GGG TCG GTG ATC TG 23

【００５７】配列番号：１０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTA CGA CGA GAA GCA CTA CAT CG 23

【００５８】配列番号：１１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCC TTA ATT GAC GTC GCA CCG AGC 24

【００５９】配列番号：１２ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTT GTT TGA CCG TGT GCC GTG AGG 24

【００６０】配列番号：１３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTC CCA CAC GAA GCA TTC TCC AGC 24

【００６１】配列番号：１４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGA CTT CGA GCT CGT CGA CCA CC 23

【００６２】配列番号：１５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCG AGA CCC TCT CTG AGA TCC GC 23

【００６３】配列番号：１６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATC GAG CCC GAC TCG CTG GCC AAC 24

【００６４】配列番号：１７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCC GCT ACG ACT ACC ACT GCG GTC 24

【００６５】配列番号：１８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAC GTC GCT TAA TGC ATT GAG GGG 24

【００６６】配列番号：１９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCT TGT CCA ACA ATG GCA GAT GC 23

【００６７】配列番号：２０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCT CAG GGG CGG GCT TGA GGG CG 23

【００６８】配列番号：２１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGA TGT AGT GCT TCT CGT CGT AG 23

【００６９】配列番号：２２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGG CTC GAT AAC CAG AAT CGT GC 23

【００７０】配列番号：２３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGA CGA GCA GGG TGT CGA CCG TG 23

【００７１】配列番号：２４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACC GGT CCT GGT GGT CGA GGT GGC 24

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpM14-1の制限酵素地図を示した図で
ある。

【図２】NCE２遺伝子と各プラスミドの構成を示した図
である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/11 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 青柳 薫 神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株式 会社薬品技術研究所内 (72)発明者 矢内 耕二 埼玉県坂戸市千代田５−３−１ 明治製菓 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 浜谷 徹 埼玉県坂戸市千代田５−３−１ 明治製菓 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 村上 健 神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株式 会社薬品技術研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表１に記載されるアミノ酸配列の一部
   もしくは１〜４５３番の配列からなるタンパク質または
   その誘導体。
2. 【請求項２】配列表１の―２３〜―１番の配列をN末端
   側にさらに有してなる、請求項１に記載のタンパク質。
3. 【請求項３】セルラーゼ活性を有する、請求項１または
   ２に記載のタンパク質。
4. 【請求項４】請求項１〜３いずれか一項に記載のアミノ
   酸配列をコードするDNA配列。
5. 【請求項５】DNA配列が配列表２に記載される塩基配列
   の一部または全部を有する、請求項４に記載のDNA配
   列。
6. 【請求項６】DNA配列が、配列表２の３８９〜２０９８
   番の塩基配列を有する、請求項５に記載のDNA配列。
7. 【請求項７】請求項５または６いずれか一項に記載のDN
   A配列を含んでなる、発現ベクター。
8. 【請求項８】請求項７に記載の発現ベクターによって形
   質転換した微生物。
9. 【請求項９】請求項８に記載の微生物を培養し、そして
   培養物から請求項１〜３いずれか一項に記載のタンパク
   質を採取することを含んでなる、請求項１〜３いずれか
   一項に記載のタンパク質の製造法。