JPH0795882A - Alkaline protease and gene coding for the same - Google Patents
Alkaline protease and gene coding for the sameInfo
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- JPH0795882A JPH0795882A JP26313993A JP26313993A JPH0795882A JP H0795882 A JPH0795882 A JP H0795882A JP 26313993 A JP26313993 A JP 26313993A JP 26313993 A JP26313993 A JP 26313993A JP H0795882 A JPH0795882 A JP H0795882A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、新規なアルカリプロテ
アーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。さらに詳
しく言えば、バチルスsp.THS−1001株を培養
して得られる熱に対する安定性に優れた新規なアルカリ
プロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel alkaline protease and a gene encoding the same. More specifically, Bacillus sp. The present invention relates to a novel alkaline protease excellent in heat stability obtained by culturing THS-1001 strain and a gene encoding the same.
【0002】[0002]
【従来の技術】バチルス属細菌が分泌する典型的な菌体
外産生蛋白のアルカリプロテアーゼは、皮革加工用、食
品工業用、洗剤添加用、医薬品用など多岐にわたって利
用されている。しかし、自然界から得られる微生物由来
の野生型アルカリプロテアーゼは、その特性において十
分満足できるものではなく、産業上利用するためには、
温度、pH、酸素、溶媒、圧力、酸化剤、界面活性剤、
その他の反応液中の添加剤などに対する安定性を改良す
る必要がある。2. Description of the Related Art Alkaline protease, which is a typical extracellular protein produced by Bacillus bacteria, is widely used for leather processing, food industry, detergent addition, pharmaceutical use and the like. However, the wild-type alkaline protease derived from microorganisms obtained from the natural world is not sufficiently satisfactory in its characteristics, and for industrial use,
Temperature, pH, oxygen, solvent, pressure, oxidizer, surfactant,
It is necessary to improve the stability against other additives in the reaction solution.
【0003】特に洗浄補助剤として添加されるプロテア
ーゼは、粉末タイプのみならず、液体タイプの洗剤に配
合された状態で十分な安定性を示し、さらに十分な機能
を発揮することが望まれる。しかし、液体タイプの洗剤
中では、粉末タイプと比べてプロテアーゼの安定性が低
く、製品として保存されている間に分解を受けたり洗浄
中に失活するなどの問題があり、十分な洗浄効果を上げ
るに至っていない。[0003] In particular, it is desired that protease added as a cleaning auxiliary agent exhibits sufficient stability not only in powder type detergent but also in liquid type detergent and exhibits sufficient function. However, in liquid type detergents, the stability of protease is lower than in powder type detergents, and there are problems such as decomposition during storage as a product and deactivation during washing. It has not been raised.
【0004】そこで、新しい界面活性剤の開発、安
定化剤の添加、酵素のマイクロカプセル化等により酵
素の液体洗剤中での安定性を向上させる技術が多数開示
されている(特開平2-41398 号、米国特許第4287082
号、英国特許第2021142 号、特開昭62-596号、特開昭63
-137996 号等)。Therefore, many techniques have been disclosed for improving the stability of enzymes in liquid detergents by developing new surfactants, adding stabilizers, encapsulating enzymes, etc. (Japanese Patent Laid-Open No. 41398/1990). U.S. Pat.No. 4287082
No. 2021142, JP-A-62-596, JP-A-63
-137996 etc.).
【0005】しかし、酵素の安定化技術と共に、酵素自
体の液体洗剤中での安定性が従来品よりもより優れたも
のが強く求められるようになり、安定性に優れたアルカ
リプロテアーゼを生産する新規な微生物の探索が行なわ
れている。また、より安定性に優れ、応用価値の高いプ
ロテアーゼが常に求められており、いわゆる蛋白質工学
により、アミノ酸配列の部位特異的改変を用いたプロテ
アーゼの安定性の改良の開示もなされている(欧州特許
第0130756 号、米国特許第4760025 号等)。However, along with the technology for stabilizing the enzyme, it has been strongly demanded that the stability of the enzyme itself in a liquid detergent is superior to that of the conventional product, and a novel method for producing an alkaline protease having excellent stability is obtained. The search for various microorganisms is being conducted. Further, there is always a demand for proteases having higher stability and high application value, and so-called protein engineering has disclosed the improvement of the stability of proteases using site-specific modification of amino acid sequence (European Patent). No. 0130756, US Pat. No. 4760025).
【0006】洗剤添加用アルカリプロテアーゼは、その
殆どが比較的高温度で高い活性を示すものが多い中で、
バチルス属(Bacillus sp.)NKS−21(以下、バチ
ルスNKS−21という。)は、比較的低い温度で活性
を有するアルカリプロテアーゼAPI−21(以下、A
PI−21という。)を菌体外に生産することが知られ
ており(特公昭60-55118号)、その後この菌体の変異株
であるSD−515株(微工研菌寄第9968号)はアルカ
リプロテアーゼSDP−515(以下、SDP−515
という。)を生産することが明らかにされている(特開
平1-281084号参照) 。Alkaline proteases for detergent addition are mostly active at relatively high temperatures.
Bacillus sp. NKS-21 (hereinafter referred to as Bacillus NKS-21) is an alkaline protease API-21 (hereinafter referred to as A) having an activity at a relatively low temperature.
It is called PI-21. ) Is known to be produced outside the bacterial cell (Japanese Patent Publication No. 60-55118), and the SD-515 strain (Microtechnical Research Institute No. 9968), which is a mutant strain of this bacterial cell, is the alkaline protease SDP. -515 (hereinafter, SDP-515
Say. ) Is produced (see Japanese Patent Laid-Open No. 1-281084).
【0007】また、本出願人は、バチルスNKS−21
株由来のAPI−21のアミノ酸配列を遺伝子改変技術
を用いた特異的部位改変により、より安定なプロテアー
ゼの生産を提案している(特開平 5-91876号参照)。[0007] The applicant of the present invention has also found that Bacillus NKS-21
A more stable protease production has been proposed by modifying the amino acid sequence of the strain-derived API-21 with a specific site using a gene modification technique (see Japanese Patent Laid-Open No. 5-91876).
【0008】さらに、本発明者らはバチルスNKS−2
1のゲノムDNAを制限酵素により部分分解した断片を
ショットガン法により導入して形質転換した微生物を培
養するスクリーニング法によりバチルスNKS−21の
ゲノムDNAの未発現部分を発現させて得られる安定性
に優れたアルカリプロテアーゼ、そのプロテアーゼをコ
ードする遺伝子、そのプロテアーゼの製造方法、および
その洗剤組成物に対する用途を先に提案している(特願
平4-296360号)。Furthermore, the present inventors have found that Bacillus NKS-2
To the stability obtained by expressing the unexpressed part of the genomic DNA of Bacillus NKS-21 by a screening method in which a fragment obtained by partially decomposing the genomic DNA of No. 1 by a restriction enzyme is introduced by the shotgun method and the transformed microorganism is cultured. An excellent alkaline protease, a gene encoding the protease, a method for producing the protease, and an application to the detergent composition have been previously proposed (Japanese Patent Application No. 4-296360).
【0009】[0009]
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、バチ
ルス属細菌由来の安定性に優れた新規なアルカリプロテ
アーゼ、およびそのプロテアーゼをコードする遺伝子を
提供することにある。An object of the present invention is to provide a novel alkaline protease derived from Bacillus bacterium with excellent stability, and a gene encoding the protease.
【0010】本発明で用いたバチルスsp.THS−1
001株は、東京都の土壌から採取したものであり、p
H10以上のアルカリ性領域で生育できるが、中性pH
では生育できない好アルカリ細菌である。The Bacillus sp. Used in the present invention. THS-1
The 001 strain was collected from soil in Tokyo, and p
Can grow in an alkaline region of H10 or higher, but has a neutral pH
It is an alkalophilic bacterium that cannot grow in.
【0011】本細菌は、グラム陽性の桿菌で、胞子を形
成することから、バチルス属に属する好アルカリ細菌で
あることが明らかになった。本細菌は、バチルスsp.
THS−1001株と命名され、工業技術院生命工学工
業技術研究所にFERMP−13869として寄託され
ている。This bacterium is a Gram-positive bacillus and forms spores, and thus it has been clarified to be an alkalophilic bacterium belonging to the genus Bacillus. The bacterium is Bacillus sp.
It is named THS-1001 strain and has been deposited as FERMP-13869 at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, AIST.
【0012】[0012]
【課題を解決するための手段】本発明は、 1)実質的に配列番号2で示されるアミノ酸配列を有
し、等電点が11以上のアルカリプロテアーゼ、 2)配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するアルカ
リプロテアーゼをコードする遺伝子、および 3)配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するアルカ
リプロテアーゼをコードする配列番号3で示される遺伝
子 を提供するものである。Means for Solving the Problems The present invention comprises: 1) an alkaline protease having substantially the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an isoelectric point of 11 or more; 2) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And 3) a gene represented by SEQ ID NO: 3 which encodes an alkaline protease having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
【0013】本発明に係る新規アルカリプロテアーゼ
は、実質的に配列番号2で示されるアミノ酸配列を有す
る。すなわち、これと必ずしも同一である必要はなく、
等電点が11以上であるという基本的な特徴が変化しな
い範囲でアミノ酸置換、欠失、または挿入した形のもの
も含まれる。The novel alkaline protease according to the present invention has substantially the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. That is, it does not have to be the same as this,
Amino acid substitution, deletion, or insertion forms are also included as long as the basic characteristic that the isoelectric point is 11 or more does not change.
【0014】本発明に係る新規アルカリプロテアーゼ
は、バチルスsp.THS−1001株を培養すること
により、または本発明の遺伝子を微生物中に導入し、そ
の微生物を培地中で培養することにより生産させ、培養
液からプロテアーゼを回収することにより取得できる。
この際用いるDNAとしては、前記バチルスsp.TH
S−1001株から得られる遺伝子が用いられるが、こ
のDNA中には少なくとも配列番号3で示される本アル
カリプロテアーゼ遺伝子または配列番号2で示されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列のDNAが含まれてい
ればよく、必ずしもバチルスsp.THS−1001株
由来の遺伝子全部を含んでいる必要はない。また、本ア
ルカリプロテアーゼ構造遺伝子部分に、別のプロモータ
ー領域やシグナル配列、ターミネーター領域等を結合し
たDNA断片を用いることもできる。この際用いるプロ
モーター領域やシグナル配列、ターミネーター領域等は
遺伝子を導入する宿主菌中でアルカリプロテアーゼを発
現、生産することができるものであれば如何なるものを
用いてもよい。The novel alkaline protease according to the present invention is Bacillus sp. It can be obtained by culturing the THS-1001 strain, or by introducing the gene of the present invention into a microorganism and culturing the microorganism in a medium to produce it, and recovering the protease from the culture solution.
The DNA used at this time is Bacillus sp. TH
The gene obtained from the S-1001 strain is used, and this DNA contains at least the DNA of the nucleotide sequence encoding the present alkaline protease gene represented by SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Suffice it to say that Bacillus sp. It is not necessary to include all genes from the THS-1001 strain. Further, a DNA fragment in which another promoter region, a signal sequence, a terminator region or the like is bound to the present alkaline protease structural gene portion can also be used. Any promoter region, signal sequence, terminator region, etc. may be used as long as they can express and produce alkaline protease in the host bacterium into which the gene is introduced.
【0015】また、宿主菌としては、目的とするプロテ
アーゼ遺伝子を導入でき、発現、生産可能なものであれ
ばどのようなものを用いてもよいが、その生育速度、プ
ロテアーゼ生産性の観点より、工業的生産においてはバ
チルス属細菌もしくは大腸菌を用いることが望ましい。
宿主菌の形質転換法は、通常用いられる方法で可能であ
る。例えば、プロトプラスト法、エレクトロポレーショ
ン法、コンピーテントセル法などにより実施可能であ
る。導入したプロテアーゼ遺伝子は、プラスミド等を用
いて染色体外に存在、複製させる方法で安定に保持させ
てもよいし、染色体中に組み込む方法でもかまわない。
染色体外の存在、複製する方法の場合には、宿主菌中で
複製可能なベクターを用いる。例えば、大腸菌を宿主菌
として用いる場合、pBR322、pUC18、Col
E1等を用いることができる。一方、バチルス属細菌の
宿主染色体中に組み込む方法では、ベクターを用いない
か、あるいは宿主菌内で複製しないものを用いることが
望ましく、例えば上記プラスミドあるいはpE194等
を用いることができるが、必ずしもこれらに限定されな
い。As the host bacterium, any host bacterium may be used as long as it can introduce the target protease gene and can express and produce it. From the viewpoint of its growth rate and protease productivity, In industrial production, it is desirable to use Bacillus bacterium or Escherichia coli.
A method for transforming a host bacterium can be a commonly used method. For example, it can be carried out by a protoplast method, an electroporation method, a competent cell method, or the like. The introduced protease gene may be stably retained by a method of existing and replicating extrachromosomally using a plasmid or the like, or may be incorporated into the chromosome.
In the case of extrachromosomal presence or a method of replicating, a vector replicable in the host bacterium is used. For example, when Escherichia coli is used as a host bacterium, pBR322, pUC18, Col
E1 or the like can be used. On the other hand, in the method of integrating into the host chromosome of a bacterium of the genus Bacillus, it is desirable not to use a vector or to use one that does not replicate in the host bacterium. For example, the above plasmid or pE194 can be used. Not limited.
【0016】形質転換体の選択は、スキムミルクあるい
はカゼインを加えた寒天培地上でのクリアゾーン形成
や、導入遺伝子に結合した遺伝子マーカーの発現により
行なうことができるが、必ずしもこれらに限られない。Selection of transformants can be performed by, but not necessarily limited to, clear zone formation on an agar medium containing skim milk or casein and expression of a gene marker linked to the transgene.
【0017】上記のようにして得た形質転換体、または
バチルスsp.THS−1001株を培養する培地とし
ては特に制限はなく、生育可能なものであればどのよう
な培地でも用いることができる。培養液からのプロテア
ーゼの分離精製は、一般的な蛋白質の分離精製法にした
がって行なうことができる。例えば、塩析、イオンクロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等により可
能であるが、必ずしもこれに限るものではない。The transformant obtained as described above, or Bacillus sp. The medium for culturing the THS-1001 strain is not particularly limited, and any medium that can grow can be used. Separation and purification of protease from the culture broth can be performed according to a general method for separating and purifying protein. For example, salting out, ion chromatography, hydrophobic chromatography and the like are possible, but not limited thereto.
【0018】[0018]
【酵素活性の測定法】本発明においては酵素の活性は次
のような方法で測定した。50mM Atkins-Pantin 緩
衝液(pH10.0)1.5 mlに、10mMになるように合
成基質サクシニル−ロイシル−ロイシル−バリル−チロ
シル−4−メチルクマリル−7−アミド(以下、Suc-Le
u-Leu-Val-Tyr-MCA と略す。)をジメチルスルホキシド
(DMSO)に溶解させたもの5μlを混合し、この混
合液に酵素溶液10μlを添加する。反応温度を30℃
とし、345nmの励起光より生じる7−アミノ−4メ
チルクマリン(AMC)の蛍光を440nmで検出す
る。1秒間に1モルのAMCを生成する酵素量を1ka
talとする。[Method of measuring enzyme activity] In the present invention, the activity of the enzyme was measured by the following method. Synthetic substrate succinyl-leucyl-leucyl-valyl-tyrosyl-4-methylcoumaryl-7-amide (hereinafter referred to as Suc-Le) was added to 1.5 ml of 50 mM Atkins-Pantin buffer (pH 10.0) so that the concentration was 10 mM.
Abbreviated as u-Leu-Val-Tyr-MCA. ) Is dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) and mixed with 5 μl, and 10 μl of the enzyme solution is added to this mixed solution. Reaction temperature 30 ℃
The fluorescence of 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) generated by the excitation light of 345 nm is detected at 440 nm. The amount of enzyme that produces 1 mol of AMC per second is 1 ka
tal.
【0019】[0019]
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例1:新規アルカリプロテアーゼの精製 500ml容坂口フラスコに大豆粉4g、K2HPO4
0.8g、MgSO40.08gおよび水90mlを加え、1
15℃、15分間オートクレーブで滅菌した。別にそれ
ぞれ同条件で滅菌した50%マルトース溶液10ml及び
10%Na2CO3溶液1mlを上記坂口フラスコに無
菌的に加えた。バチルスsp.THS−1001株を前
記培地に植菌し、30℃で44時間振盪培養した。得ら
れた培養液を9000×gで15分間遠心分離し、上清液
(92ml)の酵素活性を測定したところ、培養液1g
当たり125nkatalであった。この溶液を凍結乾
燥することにより粗酵素末を得た。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. Example 1: Purification of novel alkaline protease In a 500 ml Sakaguchi flask, 4 g of soybean powder and K 2 HPO 4 were added.
Add 0.8 g, 0.08 g of MgSO 4 and 90 ml of water and add 1
It was sterilized by autoclaving at 15 ° C for 15 minutes. Separately, 10 ml of 50% maltose solution and 1 ml of 10% Na 2 CO 3 solution sterilized under the same conditions were aseptically added to the Sakaguchi flask. Bacillus sp. The THS-1001 strain was inoculated into the above-mentioned medium and shake-cultured at 30 ° C. for 44 hours. The obtained culture broth was centrifuged at 9000 xg for 15 minutes, and the enzyme activity of the supernatant (92 ml) was measured.
It was 125 nkatal. The crude enzyme powder was obtained by freeze-drying this solution.
【0020】以下、精製操作はすべて4℃以下で行なっ
た。上記の粗酵素末1gを、2mMのカルシウムイオン
を含有する10mM Tris−HCl緩衝液(pH7.
2 )(以下、緩衝液Aという。)50mlに溶解させ
た。この酵素液を、予め緩衝液Aで平衡化したDEAE-TOY
OPEARL 650S カラム(3×8cm)にかけ、上記緩衝液
Aで溶出させた。未吸着の活性画分を分取し、10mM
Atkins-Pantin 緩衝液(pH10.0)で透析した後、同
緩衝液で平衡化させたCM-Sephadex C-50カラム(2×2
5cm)にかけ、0〜1.0 MのNaCl直線濃度勾配で
溶出させた。活性画分を分取し、10mM Atkins-Pan
tin 緩衝液(pH10.0)で平衡化したHW-50F−ゲルろ過
を行ない蛋白的に均一な精製酵素(活性収率10%)を
得た。Hereinafter, all the purification operations were performed at 4 ° C. or lower. 1 g of the above crude enzyme powder was added to 10 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.
2) Dissolved in 50 ml (hereinafter referred to as buffer solution A). This enzyme solution was previously equilibrated with buffer A and DEAE-TOY
It was applied to an OPEARL 650S column (3 × 8 cm) and eluted with the above buffer solution A. The non-adsorbed active fraction is collected and 10 mM
After dialysis with Atkins-Pantin buffer (pH 10.0), equilibrated with CM-Sephadex C-50 column (2 x 2)
5 cm) and eluted with a linear gradient of 0 to 1.0 M NaCl. The active fraction was collected and 10 mM Atkins-Pan
HW-50F-gel filtration equilibrated with tin buffer (pH 10.0) was performed to obtain a purified protein-uniform enzyme (activity yield 10%).
【0021】実施例2:精製酵素の性質 (1) pH安定性および至適pHの測定 pH安定性は以下のような方法で測定した。実施例1で
得られた新規アルカリプロテアーゼを、各pHに調製し
た0.1 MBritton-Robinson広域緩衝液と等量ずつ混合
し、30℃で10分間インキュベートした後、0.1 M
Atkins-Pantin 緩衝液(pH10.0)で40μM Suc-Leu
-Leu-Val-Tyr-MCAを基質として活性の測定を行なった。
pH10.0における活性を100として表示した結果を図1
に示す。また、至適pHは、上記測定で用いたのと同様
の各pHの緩衝液を用いて、30℃で、同じく Suc-Leu
-Leu-Val-Tyr-MCAを基質として活性の測定を行なうこと
により求めた。最高の活性を示したpH10.0での活性を
100として表示した結果を図2に示す。図1および2
より、本アルカリプロテアーゼは約pH 3.5〜12の範
囲で安定であり、至適pHが 9.5〜10.5であることがわ
かった。 Example 2: Properties of purified enzyme (1) Measurement of pH stability and optimum pH The pH stability was measured by the following method. The novel alkaline protease obtained in Example 1 was mixed with an equal amount of 0.1 M Britton-Robinson broad range buffer solution adjusted to each pH and incubated at 30 ° C. for 10 minutes, and then 0.1 M.
40 μM Suc-Leu with Atkins-Pantin buffer (pH 10.0)
The activity was measured using -Leu-Val-Tyr-MCA as a substrate.
Figure 1 shows the results when the activity at pH 10.0 is displayed as 100.
Shown in. In addition, the optimum pH is the same as that used in the above-mentioned measurement, using the same pH buffer solution at 30 ° C.
It was determined by measuring the activity using -Leu-Val-Tyr-MCA as a substrate. The results are shown in FIG. 2, in which the activity at pH 10.0, which shows the highest activity, is expressed as 100. 1 and 2
From this, it was found that the present alkaline protease is stable in the range of about pH 3.5 to 12, and the optimum pH is 9.5 to 10.5.
【0022】(2) 熱安定性および至適温度の測定 熱安定性は以下のような方法で測定した。すなわち、同
じく実施例1で得られた新規アルカリプロテアーゼを、
pH10.0で各温度にて10分間インキュベートした後、
Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAを基質として30℃、pH1
0.0で活性の測定を行なった。30℃で処理した時の活
性を100として表示した結果を図3に示す。図3よ
り、本アルカリプロテアーゼは約30℃まで全く安定で
あり、60℃まではかなり安定であるが、70℃で完全
失活することがわかった。また、至適温度は、pH10.0
で40μM Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAを基質とし10分
間反応させた時の各温度における活性の測定により求め
た。30℃における値を100として表示した結果は図
4に示すとおりであり、その至適温度は約50℃であ
る。(2) Measurement of thermal stability and optimum temperature Thermal stability was measured by the following method. That is, the novel alkaline protease obtained in Example 1 was
After incubating at pH 10.0 for 10 minutes at each temperature,
Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA as substrate at 30 ℃, pH1
The activity was measured at 0.0. The results are shown in FIG. 3, in which the activity when treated at 30 ° C. is expressed as 100. From FIG. 3, it was found that this alkaline protease is quite stable up to about 30 ° C., is quite stable up to 60 ° C., but is completely inactivated at 70 ° C. The optimum temperature is pH 10.0.
40 μM Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA was used as a substrate for 10 minutes and the activity was measured at each temperature. The result of displaying the value at 30 ° C. as 100 is as shown in FIG. 4, and the optimum temperature is about 50 ° C.
【0023】(3) 等電点の測定 同じく実施例1で得られた新規アルカリプロテアーゼ
を、エレクトロフォーカシング(焦点電気泳動法)を用
いて等電点を測定した。まず、アガロースゲル電気泳動
を行ない、終了後、基質の Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAを
含有する Atkins-Pantin 緩衝液(pH10.0)を含ませ
たプロッティングろ紙を置き、室温で10〜30分間反
応させた。その結果、従来公知のものでは最高の等電点
(10.6)を示すアルカリエラスターゼであるYaB(Jou
rnal of Bacteriology,171, 5232〜5236,1989 )よりも
高い等電点(11以上)を示した。本発明の酵素と一次
構造の相関性の最も高い約70%の値をもつアルカリプ
ロテアーゼ 221の等電点はpH9.4 であり(鶴大典,微
生物,5,322 頁(1989))、本発明の酵素とは明らかに
異なっている。 (4) 分子量の測定 同じく実施例1で得られた新規アルカリプロテアーゼ
を、15%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により分子量を測定したところ、約29,000であった。(3) Measurement of Isoelectric Point The isoelectric point of the novel alkaline protease obtained in Example 1 was measured by electrofocusing (focusing electrophoresis method). First, perform agarose gel electrophoresis, and after completion, place a plotting filter paper containing Atkins-Pantin buffer (pH 10.0) containing the substrate Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA at room temperature. The reaction was performed for 10 to 30 minutes. As a result, YaB (Jou), which is an alkaline elastase showing the highest isoelectric point (10.6) among the conventionally known ones.
rnal of Bacteriology, 171, 5232-5236, 1989), showing a higher isoelectric point (11 or more). The isoelectric point of alkaline protease 221 having a value of about 70%, which has the highest correlation with the enzyme of the present invention and a primary structure, is pH 9.4 (Dainori Tsuru, Microorganisms, page 5,322 (1989)). The enzyme is obviously different. (4) Measurement of molecular weight The molecular weight of the novel alkaline protease obtained in Example 1 was measured by 15% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and it was about 29,000.
【0024】(5) 合成基質に対する各種セリンプロテア
ーゼとの活性の比較測定 本発明および各種既知のセリンプロテアーゼを用い、基
質として表1に示すMCA基質を用い、各々1%になる
ように調製し、pH10.0にて活性測定を行なった(表1
中、基質を構成するアミノ酸はアルファベット1文字略
号で示す)。Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAに対する活性を
100とする相対活性により表示した結果を表1に示
す。各種合成基質に対する本新規アルカリプロテアーゼ
の活性は、既知のアルカリプロテアーゼに見られないユ
ニークな特異性を示している。(5) Comparative measurement of activity of various serine proteases against synthetic substrate Using the present invention and various known serine proteases, MCA substrates shown in Table 1 were used as substrates and prepared to be 1% each, The activity was measured at pH 10.0 (Table 1
Among them, the amino acids that make up the substrate are indicated by the one-letter abbreviation. Table 1 shows the results displayed by relative activity with the activity against Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA being 100. The activity of the novel alkaline protease on various synthetic substrates shows a unique specificity not found in known alkaline proteases.
【0025】[0025]
【表1】 [Table 1]
【0026】また、配列番号4に示すアミノ酸配列を有
する過ギ酸酸化インシュリンB鎖を基質として同様に本
発明および既知のセリンプロテアーゼ8種[酵素221
(H.Tamaki et al., Biosci. Biotech. Biochem.,56,333
-334(1992) )、エラスターゼYaB(同上)、AH101
(バチルスsp.No. AH−101菌の耐熱性アルカリ
プロテアーゼ(同上))、BYA(バチルスsp.Yの
生産するアルカリ耐性プロテアーゼ(H.Shimogaki et a
l.,Agric.Biol.Chem.,55,2251-2258(1991)))、ALPI
(バチルスsp.NKS−21の生産するアルカリプロ
テアーゼ( O.Tsuchida et al., Curr. Microbiol., 1
4, 7-12(1986) )、スブチリシンCarls-berg (上記Ta
makiらの報文)、スブチリシンBPN´(同上)、NA
T(納豆菌バチルス・ナットーの生産するセリンプロテ
アーゼ(E.Ichishima et al.,Biochim. Biophys. Acta,
869,178-184(1986))]を用い反応させ、生成するぺプ
チドの分析により、作用結合部位を調べた結果を図5に
示す(図5中、上欄の酸化インシュリンB鎖のアミノ酸
は、アルファベットからなる1文字略号で示されてい
る。なお、C*はシステインを示す)。In addition, the present invention and eight known serine proteases [enzyme 221 are also used with the formate-insulated insulin B chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 as a substrate.
(H. Tamaki et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56,333
-334 (1992)), Elastase YaB (same as above), AH101
(Heat-resistant alkaline protease of Bacillus sp. No. AH-101 (same as above)), BYA (Alkali-resistant protease produced by Bacillus sp. Y (H. Shimogaki et a
l., Agric. Biol. Chem., 55, 2251-2258 (1991))), ALPI
(Alkaline protease produced by Bacillus sp. NKS-21 (O. Tsuchida et al., Curr. Microbiol., 1
4, 7-12 (1986)), Subtilisin Carls-berg (Ta above)
maki et al.), Subtilisin BPN '(same as above), NA
T (serine protease produced by Bacillus natto of Bacillus natto (E. Ichishima et al., Biochim. Biophys. Acta,
869, 178-184 (1986))], and the peptides formed are analyzed to determine the action binding site. The results are shown in FIG. It is represented by a one-letter abbreviation consisting of, where C * represents cysteine).
【0027】表1および図5の結果から本発明のアルカ
リプロテアーゼは既知のセリンプロテーアーゼとは異な
る基質特異性を有することが分かる。 (6) 化学物質による活性阻害 表2に記載されている濃度の各種化学物質の存在下、4
℃で20時間インキュベートした後、合成基質Suc-Leu-
Leu-Val-Tyr-MCA (40μM)を用いて蛍光分光法によ
り活性を測定した。化学物質を添加しない場合(対照
区)の阻害率を0(%)として示した結果を表2に示
す。From the results shown in Table 1 and FIG. 5, it can be seen that the alkaline protease of the present invention has a substrate specificity different from that of known serine proteases. (6) Inhibition of activity by chemical substances In the presence of various chemical substances at the concentrations shown in Table 2, 4
After incubating at ℃ for 20 hours, the synthetic substrate Suc-Leu-
The activity was measured by fluorescence spectroscopy using Leu-Val-Tyr-MCA (40 μM). Table 2 shows the results when the inhibition rate when no chemical substance was added (control group) was 0 (%).
【0028】[0028]
【表2】 [Table 2]
【0029】この結果より、本アルカリプロテアーゼは
キモスタチン、アンチパインおよびフェニルメタンスル
フォニルフルオリド(PMSF)によりほぼ完全に阻害
され、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン(T
PCK)、エラスタチナールにより阻害されることがわ
かった。From these results, this alkaline protease was almost completely inhibited by chymostatin, antipain and phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), and tosylphenylalanyl chloromethyl ketone (T
PCK), which was found to be inhibited by elastatinal.
【0030】(7) 界面活性剤に対する安定性 本発明に係る酵素溶液に、表3に記載した界面活性剤
(10%溶液)を各々設定濃度(0.05、0.1 、1%)に
なるように加え、60分間、30℃、pH10.0でインキ
ュベートした後、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA を用いて活
性測定を行なった。結果を表3に示す。(7) Stability against surfactants To the enzyme solution according to the present invention, the surfactants (10% solution) shown in Table 3 were added so as to have respective set concentrations (0.05, 0.1, 1%). After incubation for 60 minutes at 30 ° C. and pH 10.0, the activity was measured using Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA. The results are shown in Table 3.
【0031】[0031]
【表3】 [Table 3]
【0032】表3より、本アルカリプロテアーゼは非イ
オン性界面活性剤に対して安定であることがわかる。From Table 3, it can be seen that the present alkaline protease is stable to nonionic surfactants.
【0033】実施例3:新規アルカリプロテアーゼをコ
ードするDNAの単離 バチルスsp.THS−1001株からのクローニング
はショットガン法を用いて行なった。すなわち、バチル
スsp.THS−1001株のゲノムDNAを制限酵素
Sau3AIで部分消化して断片を得た。次にこれをア
ガロースゲル電気泳動にかけ、ジーンクリーン(GENECLE
AN) (Bio101社製)を用いて2〜6kbのDNA
断片のみを調製した。 Example 3: A novel alkaline protease
Isolation of the DNA that carries Bacillus sp. Cloning from the THS-1001 strain was performed using the shotgun method. That is, Bacillus sp. The genomic DNA of the THS-1001 strain was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI to obtain a fragment. Next, this is subjected to agarose gel electrophoresis, and Geneclean (GENECLE
AN) (manufactured by Bio101) using 2 to 6 kb of DNA
Only fragments were prepared.
【0034】ベクターとしてプラスミドpUC119を
用い、制限酵素BamHIで消化した。これをフェノー
ル処理、アルカリホスファターゼ処理した後、アガロー
スゲル電気泳動し、同じくジーンクリーン(GENECLEAN)
(Bio101社製)を用いて切断断片を調製した。ゲ
ノムDNAの制限酵素切断断片とベクタープラスミドと
のライゲーションを行ない、バチルスsp.THS−1
001株由来のゲノムDNAの断片が組込まれたプラス
ミドDNAを得た。The plasmid pUC119 was used as a vector and digested with the restriction enzyme BamHI. After this was treated with phenol and alkaline phosphatase, it was electrophoresed on an agarose gel and the same as GENECLEAN.
A cleavage fragment was prepared using (manufactured by Bio101). Ligation of a restriction enzyme digestion fragment of genomic DNA with a vector plasmid was performed, and Bacillus sp. THS-1
A plasmid DNA in which a genomic DNA fragment derived from strain 001 was incorporated was obtained.
【0035】このプラスミドDNAを用い、大腸菌HB
101株に形質転換を行ない、アンピシリン(50μl
/ml)が添加されたLB−スキムミルク寒天培地で3
7℃、24〜28時間培養し、アンピシリン耐性の形質
転換体の中からコロニー周辺のクリアゾーン形成を指標
として目的の形質転換体を選択した。これらの形質転換
体を新たな同一プレート上で培養し、クリアゾーンを形
成させた。培地上でのクリアゾーン形成部分からパンチ
で断片を切り取り、電気泳動用のアガロースゲルにはめ
込み、そのままアガロース電気泳動にかけた。Using this plasmid DNA, E. coli HB
101 strain was transformed and ampicillin (50 μl
/ Ml) on LB-skimmed milk agar
After culturing at 7 ° C. for 24 to 28 hours, the desired transformant was selected from the ampicillin-resistant transformants, using the clear zone formation around the colony as an index. These transformants were cultured on a new identical plate to form a clear zone. Fragments were cut out from the clear zone forming portion on the medium with a punch, mounted on an agarose gel for electrophoresis, and directly subjected to agarose electrophoresis.
【0036】電気泳動終了後、基質として40μMの合
成基質 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAを含有する0.1 M At
kins-Pantin 緩衝液(pH10.0)を含ませたプロッティ
ングろ紙を置き、室温で10〜30分間反応させると、
実施例1で得られた新規アルカリプロテアーゼと等しく
トランスイルミネーター上で11以上の等電点を有する
プロテアーゼを得、 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAの Tyr-M
CA間の結合の切断により生じた7−アミノ−4−メチル
クマリン(AMC)の蛍光が生じるのが確認できた。こ
のプロテアーゼ生産株は、約15,000株に1株の割合で得
られた。After completion of electrophoresis, 0.1 M At containing 40 μM of the synthetic substrate Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA as a substrate.
Put a plotting filter paper containing kins-Pantin buffer (pH 10.0), and let it react at room temperature for 10 to 30 minutes.
A protease having an isoelectric point of 11 or more on the transilluminator equivalent to the novel alkaline protease obtained in Example 1 was obtained, and Tyr-M of Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA was obtained.
It was confirmed that the fluorescence of 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) generated by the cleavage of the bond between CAs was generated. This protease producing strain was obtained at a ratio of about 15,000 strains.
【0037】実施例4:アルカリプロテアーゼのDNA
塩基配列及びアミノ酸配列の決定 実施例3で得られたアルカリプロテアーゼをコードする
遺伝子の塩基配列をサンガー法により決定し解析を行な
ったところ、配列番号1に示すようにTTGより始まる
1.15kbのオープンリーディングフレームを見出した。
さらに実施例1で得られた新規アルカリプロテアーゼの
N末端から10残基をアプライドバイオシステムズ社製
473A プロテイン・シ−ケンサ−により決定した
結果、配列番号1で示されるアミノ酸配列のはじめの1
0残基と完全に一致し、取得した遺伝子は、実施例1で
得られた新規アルカリプロテアーゼをコードするもので
あることが確認された。 Example 4: DNA of alkaline protease
Determination of Nucleotide Sequence and Amino Acid Sequence The nucleotide sequence of the gene encoding the alkaline protease obtained in Example 3 was determined by Sanger's method and analyzed. As shown in SEQ ID NO: 1, it begins with TTG.
We have found an open reading frame of 1.15 kb.
Further, 10 residues from the N-terminal of the novel alkaline protease obtained in Example 1 were determined by 473A Protein Sequencer manufactured by Applied Biosystems, and as a result, the first 1 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was determined.
It was confirmed that the gene completely matched with 0 residue and encodes the novel alkaline protease obtained in Example 1.
【0038】既知のプロテアーゼとの相同性を調べたと
ころ、好アルカリ性バチルスsp.221のアルカリセ
リンプロテアーゼ(等電点:9.4 、鶴大典,微生物,
5,322 (1989))と最も高い相同性を示すが、その相同
性は約70%であり、本酵素が新規な酵素であることが
明かとなった。When the homology with known proteases was examined, the alkalophilic Bacillus sp. 221 alkaline serine protease (isoelectric point: 9.4, Daisuke Tsuru, microorganism,
5,322 (1989)), the homology is about 70%, revealing that this enzyme is a novel enzyme.
【0039】本酵素は 269残基のアミノ酸よりなる分子
量27,232のタンパク質で、そのN末端にはアスパラギン
が存し、構造的にも、従来にない新規なセリンプロテア
ーゼであることが明らかとなった。This enzyme is a protein consisting of 269 amino acid residues and having a molecular weight of 27,232. Asparagine is present at the N-terminal of the protein, and it was revealed that it is a novel serine protease structurally unprecedented.
【0040】[0040]
【発明の効果】本発明のアルカリプロテアーゼは、新規
なアルカリプロテアーゼであり、洗浄補助剤をはじめと
する工業用酵素として有用である。また、本発明の遺伝
子は、それを導入した形質転換微生物を培養することに
より、本発明のアルカリプロテアーゼを効率良く得るこ
とができる他、タンパク質工学用試料として用いること
もできるので、産業上有用である。INDUSTRIAL APPLICABILITY The alkaline protease of the present invention is a novel alkaline protease and is useful as an industrial enzyme such as a cleaning aid. In addition, the gene of the present invention is industrially useful because the alkaline protease of the present invention can be efficiently obtained by culturing a transformed microorganism into which the gene has been introduced, and can also be used as a sample for protein engineering. is there.
【0041】[0041]
【0042】配列番号:1 配列の長さ:1152 配列の型:核酸とアミノ酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:バチルスsp.THS−1001(Bacillus s
p.THS-1001) 配列 TTGAAAAAGTTATTTACAAAGGTA 24 GTGGCAAGTGCCGCGTTATTATTGTCCATCTCTTTAACCGCAACATCCGTCTCAGCCGAGGAA 88 CAAAAGAAACAGTATTTAATTGGTTTTGAAAATCAACTACAAGTAACGGAATTTGTAGAAAGC 152 AGTGATAAAGGGCAAAGTGAAATGTCTCTTTTTGCTGAAGTGAATGATGAATCAATTGAAATG 216 GAACTTCTTTATGAATTCGAGGACATTCCAGTTGTATCAGTTGAATTGAGTCCAGAAGATGTA 280 AAGGACTTAGAAAAGGACCCTTCGATTACTTATATTGAGGAAGATATAGAAGTCACTATTACC 344 AAT CAA GTG ACT CCT TGG GGG ATT ACA CGT GTA CAA GCC CCT ACG GCA 392 Asn Gln Val Thr Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Ala 1 5 10 15 TGG ACT AGA GGA TAT ACT GGT ACG GGA GTT CGG GTA GCG GTA CTT GAT 440 Trp Thr Arg Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Val Arg Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 ACA GGG ATT TCT ACA CAT CCT GAT TTA AAT ATT CGA GGT GGA GTA AGT 488 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Val Ser 35 40 45 TTT GTT CCT GGT GAA CCA TCC TAT CAA GAT GGA AAT GGT CAT GGA ACA 536 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 CAT GTG GCA GGT ACA ATT GCT GCT TTA AAT AAT TCG ATT GGT GTT GTT 584 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Val 65 70 75 80 GGT GTA GCT CCA AAT GCG GAG CTC TAT GCC GTG AAA GTA CTA GGG GCA 632 Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 AAT GGT TCA GGC TCT GTT AGT TCA ATT GCT CAG GGA TTA CAA TGG ACA 680 Asn Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Gln Trp Thr 100 105 110 GCC CAA AAT AAT ATT CAT GTT GCT AAT TTA AGT TTA GGT AGT CCA GTA 728 Ala Gln Asn Asn Ile His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Val 115 120 125 GGA AGT CAA ACA CTA GAG TTA GCT GTT AAT CAA GCT ACA AAT GCA GGT 776 Gly Ser Gln Thr Leu Glu Leu Ala Val Asn Gln Ala Thr Asn Ala Gly 130 135 140 GTT TTA GTG GTA GCA GCA ACT GGT AAT AAT GGT TCT GGT ACA GTT TCT 824 Val Leu Val Val Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Ser 145 150 155 160 TAT CCC GCT CGT TAT GCG AAT GCT TTA GCG GTA GGT GCA ACA GAT CAA 872 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Leu Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 AAT AAT AAT CGT GCT AGC TTT TCA CAA TAT GGG ACA GGT TTA AAT ATC 920 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Leu Asn Ile 180 185 190 GTA GCT CCA GGA GTC GGA ATT CAG AGT ACG TAT CCT GGT AAC AGA TAT 968 Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr 195 200 205 GCA AGT TTA AGT GGA ACA TCA ATG GCT ACT CCT CAT GTT GCT GGG GTC 1016 Ala Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val 210 215 220 GCT GCA CTC GTT AAG CAG AAG AAC CCA AGC TGG TCT AAT ACA CAA ATT 1064 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Thr Gln Ile 225 230 235 240 AGA CAA CAT CTT ACG TCT ACG GCC ACT TCA CTT GGG AAT TCA AAC CAG 1112 Arg Gln His Leu Thr Ser Thr Ala Thr Ser Leu Gly Asn Ser Asn Gln 245 250 255 TTT GGC AGT GGA CTT GTG AAT GCA GAA GCT GCA ACA AGG TAA 1152 Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg * 260 265 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 1152 Sequence type: Nucleic acid and amino acid Number of chains: Double strand Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Origin organism name: Bacillus sp. THS-1001 (Bacillus s
p.THS-1001) SEQ TTGAAAAAGTTATTTACAAAGGTA 24 GTGGCAAGTGCCGCGTTATTATTGTCCATCTCTTTAACCGCAACATCCGTCTCAGCCGAGGAA 88 CAAAAGAAACAGTATTTAATTGGTTTTGAAAATCAACTACAAGTAACGGAATTTGTAGAAAGC 152 AGTGATAAAGGGCAAAGTGAAATGTCTCTTTTTGCTGAAGTGAATGATGAATCAATTGAAATG 216 GAACTTCTTTATGAATTCGAGGACATTCCAGTTGTATCAGTTGAATTGAGTCCAGAAGATGTA 280 AAGGACTTAGAAAAGGACCCTTCGATTACTTATATTGAGGAAGATATAGAAGTCACTATTACC 344 AAT CAA GTG ACT CCT TGG GGG ATT ACA CGT GTA CAA GCC CCT ACG GCA 392 Asn Gln Val Thr Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Ala 1 5 10 15 TGG ACT AGA GGA TAT ACT GGT ACG GGA GTT CGG GTA GCG GTA CTT GAT 440 Trp Thr Arg Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Val Arg Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 ACA GGG ATT TCT ACA CAT CCT GAT TTA AAT ATT CGA GGT GGA GTA AGT 488 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Val Ser 35 40 45 TTT GTT CCT GGT GAA CCA TCC TAT CAA GAT GGA AAT GGT CAT GGA ACA 536 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 CAT GTG GCA GGT ACA ATT GCT GCT TTA AAT AAT TCG ATT GGT GTT GTT 584 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Val 70 70 75 80 GGT GTA GCT CCA AAT GCG GAG CTC TAT GCC GTG AAA GTA CTA GGG GCA 632 Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 AAT GGT TCA GGC TCT GTT AGT TCA ATT GCT CAG GGA TTA CAA TGG ACA 680 Asn Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Gln Trp Thr 100 105 110 GCC CAA AAT AAT ATT CAT GTT GCT AAT TTA AGT TTA GGT AGT CCA GTA 728 Ala Gln Asn Asn Ile His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Val 115 120 125 GGA AGT CAA ACA CTA GAG TTA GCT GTT AAT CAA GCT ACA AAT GCA GGT 776 Gly Ser Gln Thr Leu Glu Leu Ala Val Asn Gln Ala Thr Asn Ala Gly 130 135 140 GTT TTA GTG GTA GCA GCA ACT GGT AAT AAT GGT TCT GGT ACA GTT TCT 824 Val Leu Val Val Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Ser 145 150 155 160 TAT CCC GCT CGT TAT GCG AAT GCT TTA GCG GTA GGT GCA ACA GAT CAA 872 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Leu Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 AAT AAT AAT CGT GCT AGC TTT TCA CAA TA T GGG ACA GGT TTA AAT ATC 920 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Leu Asn Ile 180 185 190 GTA GCT CCA GGA GTC GGA ATT CAG AGT ACG TAT CCT GGT AAC AGA TAT 968 Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr 195 200 205 GCA AGT TTA AGT GGA ACA TCA ATG GCT ACT CCT CAT GTT GCT GGG GTC 1016 Ala Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val 210 215 220 GCT GCA CTC GTT AAG CAG AAG AAC CCA AGC TGG TCT AAT ACA CAA ATT 1064 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Thr Gln Ile 225 230 235 240 AGA CAA CAT CTT ACG TCT ACG GCC ACT TCA CTT GGG AAT TCA AAC CAG 1112 Arg Gln His Leu Thr Ser Thr Ala Thr Ser Leu Gly Asn Ser Asn Gln 245 250 255 TTT GGC AGT GGA CTT GTG AAT GCA GAA GCT GCA ACA AGG TAA 1152 Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg * 260 265
【0043】配列番号:2 配列の長さ:269 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Asn Gln Val Thr Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Ala 16 Trp Thr Arg Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Val Arg Val Ala Val Leu Asp 32 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Val Ser 48 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 64 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Val 80 Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 96 Asn Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Gln Trp Thr 112 Ala Gln Asn Asn Ile His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Val 128 Gly Ser Gln Thr Leu Glu Leu Ala Val Asn Gln Ala Thr Asn Ala Gly 144 Val Leu Val Val Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Ser 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Leu Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 176 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Leu Asn Ile 192 Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr 208 Ala Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val 224 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Thr Gln Ile 240 Arg Gln His Leu Thr Ser Thr Ala Thr Ser Leu Gly Asn Ser Asn Gln 256 Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg * 269SEQ ID NO: 2 Sequence length: 269 Sequence type: Amino acid Number of chains: Single chain Topology: Linear Sequence type: Peptide sequence Asn Gln Val Thr Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Ala 16 Trp Thr Arg Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Val Arg Val Ala Val Leu Asp 32 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Val Ser 48 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 64 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Val 80 Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 96 Asn Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Gln Trp Thr 112 Ala Gln Asn Asn Ile His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Val 128 Gly Ser Gln Thr Leu Glu Leu Ala Val Asn Gln Ala Thr Asn Ala Gly 144 Val Leu Val Val Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Ser 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Leu Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 176 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Leu Asn Ile 192 Val Ala P ro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr 208 Ala Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val 224 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Thr Gln Ile 240 Arg Gln His Leu Thr Ser Thr Ala Thr Ser Leu Gly Asn Ser Asn Gln 256 Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg * 269
【0044】配列番号:3 配列の長さ:810 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列 AAT CAA GTG ACT CCT TGG GGG ATT ACA CGT GTA CAA GCC CCT ACG GCA 48 TGG ACT AGA GGA TAT ACT GGT ACG GGA GTT CGG GTA GCG GTA CTT GAT 96 ACA GGG ATT TCT ACA CAT CCT GAT TTA AAT ATT CGA GGT GGA GTA AGT 144 TTT GTT CCT GGT GAA CCA TCC TAT CAA GAT GGA AAT GGT CAT GGA ACA 192 CAT GTG GCA GGT ACA ATT GCT GCT TTA AAT AAT TCG ATT GGT GTT GTT 240 GGT GTA GCT CCA AAT GCG GAG CTC TAT GCC GTG AAA GTA CTA GGG GCA 288 AAT GGT TCA GGC TCT GTT AGT TCA ATT GCT CAG GGA TTA CAA TGG ACA 336 GCC CAA AAT AAT ATT CAT GTT GCT AAT TTA AGT TTA GGT AGT CCA GTA 384 GGA AGT CAA ACA CTA GAG TTA GCT GTT AAT CAA GCT ACA AAT GCA GGT 432 GTT TTA GTG GTA GCA GCA ACT GGT AAT AAT GGT TCT GGT ACA GTT TCT 480 TAT CCC GCT CGT TAT GCG AAT GCT TTA GCG GTA GGT GCA ACA GAT CAA 528 AAT AAT AAT CGT GCT AGC TTT TCA CAA TAT GGG ACA GGT TTA AAT ATC 576 GTA GCT CCA GGA GTC GGA ATT CAG AGT ACG TAT CCT GGT AAC AGA TAT 624 GCA AGT TTA AGT GGA ACA TCA ATG GCT ACT CCT CAT GTT GCT GGG GTC 672 GCT GCA CTC GTT AAG CAG AAG AAC CCA AGC TGG TCT AAT ACA CAA ATT 720 AGA CAA CAT CTT ACG TCT ACG GCC ACT TCA CTT GGG AAT TCA AAC CAG 768 TTT GGC AGT GGA CTT GTG AAT GCA GAA GCT GCA ACA AGG TAA 810SEQ ID NO: 3 Sequence length: 810 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA sequence AAT CAA GTG ACT CCT TGG GGG ATT ACA CGT GTA CAA GCC CCT ACG GCA 48 TGG ACT AGA GGA TAT ACT GGT ACG GGA GTT CGG GTA GCG GTA CTT GAT 96 ACA GGG ATT TCT ACA CAT CCT GAT TTA AAT ATT CGA GGT GGA GTA AGT 144 TTT GTT CCT GGT GAA CCA TCC TAT CAA GAT GGA AAT GGT CAT GGA ACA 192 CAT GTG GCA GGT ACA ATT GCT GCT TTA AAT AAT TCG ATT GGT GTT GTT 240 GGT GTA GCT CCA AAT GCG GAG CTC TAT GCC GTG AAA GTA CTA GGG GCA 288 AAT GGT TCA GGC TCT GTT AGT TCA ATT GCT GAT GGA TTA CAA TGG ACA 336 GCC CAA AAT AAT ATT CAT GTT GCT AAT TTA AGT TTA GGT AGT CCA GTA 384 GGA AGT CAA ACA CTA GAG TTA GCT GTT AAT CAA GCT ACA AAT GCA GGT 432 GTT TTA GTG GTA GCA GCA AACT GGT AAT GGT TCT GGT ACA GTT TCT 480 TAT CCC GCT CGT TAT GCG AAT GCT TTA GCG GTA GGT GCA ACA GAT CAA 528 AAT AAT AAT CGT GCT AGC TTT TCA CAA TAT GGG ACA GGT TTA AAT ATC 576 GTA GCT CCA GGA GTC GGA ATT CAG AGT ACG TAT CCT GGT AAC AGA TAT 624 GCA AGT TTA AGT GGA ACA TCA ATG GCT ACT CCT CAT GTT GCT GGG GTC 672 GCT GCA CTC GTT AAG CAG AAG AAC CCA AGC TGG TCT AAT ACA CAA CAATT 720 AGA CAT CTT ACG TCT ACG GCC ACT TCA CTT GGG AAT TCA AAC CAG 768 TTT GGC AGT GGA CTT GTG AAT GCA GAA GCT GCA ACA AGG TAA 810
【0045】配列番号:4 配列の長さ:30 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 16 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala 30SEQ ID NO: 4 Sequence length: 30 Sequence type: Amino acid Number of chains: Single chain Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 16 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala 30
【図1】本発明の酵素のpH安定性を示すグラフであ
る。FIG. 1 is a graph showing the pH stability of the enzyme of the present invention.
【図2】本発明の酵素の至適pH範囲を示すグラフであ
る。FIG. 2 is a graph showing the optimum pH range of the enzyme of the present invention.
【図3】本発明の酵素の熱安定性を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the thermostability of the enzyme of the present invention.
【図4】本発明の酵素の至適温度範囲を示すグラフであ
る。FIG. 4 is a graph showing the optimum temperature range of the enzyme of the present invention.
【図5】過ギ酸酸化インシュリンB鎖を基質として本発
明および既知のセリンプロテアーゼ8種を用い反応させ
たときに加水分解されるペプチド結合部位を示す。FIG. 5 shows peptide binding sites that are hydrolyzed when the present invention and eight known serine proteases are used as a substrate with a formate-insulated insulin B chain as a substrate.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:07) (C12N 15/09 C12R 1:07) C12R 1:07) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Office reference number FI technical display location C12R 1:07) (C12N 15/09 C12R 1:07) C12R 1:07)
Claims (3)
配列を有し、等電点が11以上のアルカリプロテアー
ゼ。1. An alkaline protease having an amino acid sequence substantially represented by SEQ ID NO: 2 and an isoelectric point of 11 or more.
するアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。2. A gene encoding an alkaline protease having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
するアルカリプロテアーゼをコードする配列番号3で示
される遺伝子。3. A gene represented by SEQ ID NO: 3 which encodes an alkaline protease having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26313993A JPH0795882A (en) | 1993-09-28 | 1993-09-28 | Alkaline protease and gene coding for the same |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26313993A JPH0795882A (en) | 1993-09-28 | 1993-09-28 | Alkaline protease and gene coding for the same |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0795882A true JPH0795882A (en) | 1995-04-11 |
Family
ID=17385358
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP26313993A Pending JPH0795882A (en) | 1993-09-28 | 1993-09-28 | Alkaline protease and gene coding for the same |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0795882A (en) |
-
1993
- 1993-09-28 JP JP26313993A patent/JPH0795882A/en active Pending
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