JPH0785083B2 - 全血から血漿を分離するための器具およびその使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、赤血球を凝集させる物
質を含む繊維を含有している層を有する、全血から血漿
を分離するための器具およびその使用に関する。さら
に、本発明は、赤血球を凝集させる物質と全血を接触さ
せて、繊維を含有している層によって赤血球を引き止め
ることを特徴とする全血から血漿を分離する方法に関す
る。また、本発明は、血漿を単離する帯域および試験域
を含む血液成分の測定用試験担体に関する。最後に、本
発明は、ポリビニルアルコールまたはポリビニルアルコ
ール／ポリ酢酸ビニルで被覆されたガラス繊維の使用に
関する。

【０００２】

【従来の技術】赤血球は、しばしば、それ自体の色のた
めに全血の臨床学的−化学的試験、特に比色試験を妨害
する。全血から得られる血漿および血清は、溶解した血
液成分の分析に関する最も重要な試料物質である。一般
に、全血から血清または血漿を分離するのに遠心分離が
使用される。しかしながら、これは、特に少量の試料を
使用する場合に問題があり、さらに遠心分離によって沈
降するいわゆる血餅から上澄み液を分離するのは常に容
易であるとは限らない。

【０００３】全血の使用は、迅速診断装置において特に
困難である。迅速診断装置は、試薬を含有している吸収
性物質または膨潤可能物質からなり、そのまま、例えば
試薬を含浸させたかまたは固体担体上に存在する紙と試
験しようとする物質とを接触させて、通常の非常に短い
反応によって、初期の迅速診断装置の測定可能な変化、
例えば、好ましくは可視的に評価されるかまたは反射光
測定法によって測定し得る色の変化が起こる。血液のよ
うな不透明なまたは有色の溶液は測定を有意に妨害す
る。したがって、特に迅速診断装置に関して全血から血
漿を分離するのに使用することができる装置を提供する
ためおよび方法を改良するために多くの試みが為された
きた。

【０００４】全血の分析用の多くの装置のうち１つが欧
州特許出願公告ＥＰ-Ｂ-0057110に開示されている。こ
の方法において、実質的に非湿潤性物質上に固定されて
いる赤血球を凝集させる試薬を使用する。担体としてビ
ーズを使用するのが好ましい。ポリアクリルアミドは、
これに関する好ましい物質である。

【０００５】米国特許ＵＳ-Ａ-3,146,163およびドイツ
特許出願公開ＤＥ-Ａ-1498577においては、血漿の分離
のために、全血を、植物性赤血球凝集素のような赤血球
凝集素で被覆された物質に適用する。可能な担体物質と
してプラスチックおよび厚紙のような繊維性物質が挙げ
られている。

【０００６】ドイツ特許出願公開ＤＥ-Ａ-3441149に
は、レクチンを含浸させたマトリックスに全血を適用
し、血漿または血清を単離することからなる全血の分離
方法が開示されている。マトリックスは、４０％までの
流体流に対する相対抵抗性を有する吸収性物質からな
る。繊維性構造または繊維構造およびできる限り小さい
流体流に対する抵抗性を有するマトリックスが挙げられ
る。好ましい物質として、綿およびビスコース繊維およ
びセルロース物質が挙げられる。しかしながら、この方
法の明らかな欠点は、分離した血漿または血清を希釈剤
でマトリックスから洗浄しなければならないことであ
る。

【０００７】欧州特許出願公開ＥＰ-Ａ-0295526には、
全血から血漿または血清を分離する別の装置が開示され
ている。該装置は、血球を凝集させる試薬で処理されて
いる吸収性マトリックスを含んでいる。血球を凝集させ
る試薬として、トロンビンまたはレクチンが挙げられ
る。吸収性マトリックスとしては、疎水性粉末、スポン
ジ様およびクレイ様物質、繊維およびポリマーが推奨さ
れている。繊維含有紙は、ポリマーとしても認識され
る。濾紙は、好ましいマトリックスである。

【０００８】欧州特許出願ＥＰ-Ａ-0194502の物質は、
レクチンを含浸させた吸収性マトリックスを分離層とし
て使用する全血から血漿または血清を分離するための試
薬である。

【０００９】欧州特許出願公開ＥＰ-Ａ-0325413には、
全血と接触させると赤血球が結合するカチオン性表面を
形成するようにポリカチオンを吸収性固体物質上に固定
することが開示されている。好ましい担体物質は紙であ
る。

【００１０】欧州特許出願公開ＥＰ-Ａ-0133895には、
いくつかの極性基を有する物質を含浸させた吸収性多孔
質物質を使用して、全血から血漿を分離することが開示
されている。例えば、とりわけ、紙、パッドおよび繊維
が一般的に挙げられている。

【００１１】欧州特許出願公開ＥＰ-Ａ-0305803には、
赤血球凝集化抗体および所望によりレクチンを含んでい
る繊維含有濾過層、またはガラス繊維の濾過層およびレ
クチンからなる赤血球含有体液から血球を分離するため
の装置が開示されている。

【００１２】欧州特許出願公開ＥＰ-Ａ-0269240は、赤
血球凝集剤を担持することができるガラス繊維からなる
フィルターと全血を接触させる、赤血球から血漿を分離
するための装置に関するものである。

【００１３】従来技術によって公知である全血分離方法
のうち、特に、全血を赤血球凝集化物質と接触させ、赤
血球を繊維含有層によって保持させる装置が実践的に重
要であることが分かった。しかしながら、このような赤
血球分離層の共通の欠点は、希釈した試料を使用する場
合に赤血球が充分に分離されるだけであること、および
／または分離しようとする赤血球を分離層と接触させる
と溶血が生じることである。全血試料中の赤血球を分離
の前にまず希釈しなければならない場合、これは、冗長
な付加工程であり、行われた測定の結果を誤らせ得る。
故に、希釈工程は、実際には望ましくない。

【００１４】溶血は、赤血球からヘモグロビンを放出さ
せ、したがって、血漿または血清を変色させる。このよ
うな変色は、比色試験を相当に妨害し得る。さらに、溶
血の際に、他の赤血球成分が血漿中に放出される。ヘモ
グロビンによる変色が比色試験を妨害しない場合であっ
ても、特定のパラメーターの測定は、僅かな溶血によっ
てさえ相当に不正確になる。例えば、カリウムイオン
は、溶血の際に赤血球から放出され、その結果、血漿中
のカリウムの測定は、完全に不正確になり得る。例え
ば、欧州特許出願公開ＥＰ-Ａ-0045476から、未希釈の
全血から赤血球を良好に分離するために使用し得るガラ
ス繊維によって全血から血漿または血清を分離するため
の試薬および方法が知られている。しかしながら、ガラ
スによって生じる赤血球の僅かな溶血は、全血からのカ
リウムの測定を不正確にするのに充分である。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血漿
から未希釈の血液の細胞成分、特に赤血球を分離するこ
とができる可能性を見いだすこと、そしてこの分離の際
に溶血を生じさせないことである。分離は、特に、迅速
診断装置においても可能であるべきである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】この目的は、特許請求の
範囲において特徴付けられる発明によって達成される。

【００１７】本発明は、赤血球凝集化物質を含む繊維含
有層を含み、該繊維含有層のガラス繊維がポリビニルア
ルコールまたはポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニル
で被覆されていることを特徴とする溶血を抑制した全血
から血漿を分離するための器具を提供する。

【００１８】本発明は、また、全血を赤血球凝集物質と
接触させ、赤血球がガラス繊維含有層を通過する間に保
持され、該ガラス繊維含有層のガラス繊維がポリビニル
アルコールまたはポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニ
ルで被覆されていることを特徴とする溶血を抑制した全
血から血漿を分離するための方法を提供する。

【００１９】さらに、本発明は、溶血を抑制して血漿を
単離する帯域および試験域を含み、該血漿単離域が赤血
球凝集物質を担持しているガラス繊維含有層からなる器
具を含んでおり、この層のガラス繊維がポリビニルアル
コールまたはポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニルで
被覆されていることを特徴とする血液成分測定用試験担
体を提供する。

【００２０】さらにまた、本発明は、全血からの血漿の
分離のための、赤血球を凝集させる物質を担持している
ポリビニルアルコールまたはポリビニルアルコール／ポ
リ酢酸ビニルで被覆されているガラス繊維の使用であ
る。

【００２１】驚くことに、本発明によって、ガラス繊維
がポリビニルアルコールまたはポリビニルアルコール／
ポリ酢酸ビニルで被覆されており、かつ赤血球を凝集さ
せる物質を担持しているガラス繊維層が、この方法で実
質的に溶血を生じずに、血漿から未希釈全血の細胞成分
を非常に良好に分離するのに適していることが分かっ
た。

【００２２】ポリビニルアルコールまたはポリビニルア
ルコール／ポリ酢酸ビニルで塗布されているガラス繊維
およびこのような繊維を含有している層は欧州特許出願
公開ＥＰ-Ａ-0239002から公知であるが、該特許出願に
おいて、この被覆は、単に、該繊維を凝固に対してニュ
ートラルにさせるだけである。該公開明細書は、ポリビ
ニルアルコール／ポリ酢酸ビニルの被覆が溶血を抑制す
る効果を有し得るということを示していない。さらに、
赤血球凝集物質が全く開示されていない。

【００２３】欧州特許出願公開ＥＰ-Ａ-0353570には、
ポリビニルアルコールで被覆されているガラスからな
る、試薬によって分離できる含浸担体マトリックスが開
示されている。該担体マトリックスは、血液から血漿を
分離するためには使用されない。被覆されたガラスが赤
血球凝集物質を担持することができるという事実は、こ
の公開明細書には教示されていない。溶血については、
考慮されていない。

【００２４】本発明に関して、様々な直径のガラス繊維
を使用することができる。該ガラス物質は、アルカリ含
有またはアルカリ不含硼珪酸ガラスまたは純粋な石英ガ
ラスからなり得る。他の技術的なガラス繊維物質、例え
ば、硼素不含アルカリガラス、結晶ガラス、鉛ガラスな
どは、必要な繊維サイズが市販品として入手可能ではな
く、したがって、試験できなかった。しかしながら、そ
れらは適していると推測される。ガラス繊維の平均直径
は、０.５μm〜２.５μm、特に０.５μm〜１.５μmであ
り得る。繊維直径は、それらの製造法によって広範に変
化することができるが、例外の場合、それらは、１０μ
mの上限を越えるべきである。それらの長さは、積み重
ねのタイプによって限定されるだけであり、他に影響は
ない。積み重ねのタイプに依存して、０.１〜０.５、通
常、０.２〜０.４g／cm³の密度が好都合であることが分
かった。ガラス繊維は、ゆるく積み重ねた形態ならびに
紙、パッドまたはフェルトの形態および外部鋳型によっ
て保持されることによる所望の形状で使用することがで
きる。

【００２５】ポリビニルアルコールは、通常、生成物の
所望の性質に依存して完全または部分的なケン化が行わ
れるケン化によって、ポリ酢酸ビニルから製造される。
本発明の目的のために、完全または部分的にケン化され
た生成物が使用され得る。多量に商業的に入手可能であ
るポリビニルアルコールは、特に、通常１００００〜１
０００００であり、いくつかの特別な場合、非常に高い
値を達し得るそれらの平均分子量において、ならびにア
セチル基の残存含有量において異なる。アセチル基約５
〜１５％、特に約１０％を含有している低分子量化合物
は、水に最も容易に溶解し、これに反して、高分子量お
よび／またはより多くアセチルを含有する生成物は、水
にあまり溶解しない。さらに、ポリビニルアルコール鎖
の間の相互作用は、溶解性への影響を有する。個々の領
域において該ポリマー鎖が平行に配置される結果、“結
晶”帯域が形成され、これによって、配向の傾向が大き
いほど鎖の構造が不均一になり、大部分が配向を妨害す
るアセチル基の割合が小さくなる。結果として、“結晶
化度”は、９７〜１００モル％のケン化度で、すなわ
ち、３〜０モル％のアセチル化度で特に実質的に増大
し、これによって、反対に、冷水中の溶解性が非常に減
少する。

【００２６】さらに、水溶性は、アルコールの基のアル
デヒドによる後処理(アセタール化)によって、または他
の化学的転換によって減少し得る。特に冷水中で非常に
僅かな溶解性を有するこれらポリビニルアルコールは、
本発明で使用し得る。該生成物は、水にゆっくりと溶解
するかまたは２０℃で全く溶解しない。しかしながら、
５０〜１００℃の温度で、特に、６０℃以上の温度で、
水への溶解性は、不都合ではない。

【００２７】本発明において、ガラスの全表面を覆うよ
うな方法で、全血から血漿を分離するために使用される
ガラス繊維をポリビニルアルコールまたはポリビニルア
ルコール／ポリ酢酸ビニル層で被覆する。これに関し
て、ガラス繊維に対して比較的少量、特に約０.５〜２
０重量％、好ましくは１〜１０重量％のポリビニルアル
コールまたはポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニルで
充分である。

【００２８】有意に溶血せずかつ血液型に依存しない濃
度で、繊維層によって血液から分離され得るような方法
で、赤血球を大きい凝塊に凝集させることができる全て
の物質が、赤血球凝集化物質を有する本発明のポリビニ
ルアルコールまたはポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビ
ニル被覆ガラス繊維を被覆するのに基本的に適してい
る。これに関して、カチオンポリマー、レクチン、赤血
球に対する抗体または個々の物質もしくはこれら物質の
全ての混合物が使用されるのが好ましい。

【００２９】カチオンポリマーとして、分子当たり１０
以上、好ましくは２０以上の陽電荷を有する全ての有機
または無機ポリマーが大体において適している。Ｎ,Ｎ,
Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−１,６−ヘキサンジアミンおよ
び１,３−ジブロモプロパン（ポリブレン(Ｐolybre
n^R)）、ポリエチレンイミン（ポリミン(Ｐolymin^R)）お
よびポリピペリジン塩、例えば、ポリ塩化ジメチルピペ
リジンが特に好ましいことが分かった。特に好ましく
は、ポリブレン(Ｐolybren^R)であり、特に６０００以下
の分子量を有するものである。

【００３０】使用し得るレクチンは、とりわけ、全ての
ヒト赤血球と結合することができ、したがって、それら
を凝集させるものであり、すなわち、血液型特異性では
ない。ジャガイモ(Ｓolanum tuberosum)、トマト(Ｌyco
pesicon esculantum)、リシナス・コミュニス(Ｒicinus
communis)またはアメリカヤマゴボウ(Ｐhytolaccaamer
icana)(ケルメス・ベリー(kermes berry))のレクチン
を、個々に、または上記のいくつかもしくは全てを組み
合わせて使用するのが好ましい。

【００３１】本発明で使用され得る抗体は、赤血球の表
面構造に結合する。該抗体は、好ましくは血液型非特異
性であるべきであり、さもなければ、抗体を存在する血
液試料に適合させなければならない。モノクローナルま
たはポリクローナル抗体を使用することができ、それに
よって、製造がより“簡単”であるポリクローナル抗体
の使用が適切である。

【００３２】本発明において、ガラス繊維パッドは、全
血から血漿を分離するための器具として特に好都合であ
ることが分かった。本発明のガラス繊維パッドの製造
は、水中でポリビニルアルコールによって、または適切
な有機溶媒によって、適切なガラス繊維パッドをさらに
処理し、好ましくは６０℃以上、特に９０〜１４０℃の
温度でそれを乾燥させるか、あるいは、ガラス繊維パッ
ドの製造の間にポリビニルアルコールまたはポリビニル
アルコール／ポリ酢酸ビニルを添加することによって行
うことができる。ガラス繊維パッドは、平均直径０.５
〜２.５μm、特に０.５および１.５μmの乾燥し縺れた
ガラス繊維を非常に過剰量の水に懸濁し、この方法で分
離し、この“バット”を通常の紙製造と同様の方法でこ
れに関する通常の機械によって薄層中に形成し、乾燥さ
せるような方法で製造される。該バットに添加したポリ
ビニルアルコール粉末または繊維は、ガラス繊維を懸濁
させた後に混合物中に不均一に分散され、該パッドの製
造において、それらを、その後のパッドの乾燥の間にガ
ラス繊維上に不均一な塗膜を形成するような程度に、溶
解または溶融させる。

【００３３】赤血球凝集化物質をガラス繊維含有層に適
用するために、後者に適当な物質の溶液を含浸させるの
が好ましい。例えば、含浸溶液をガラス繊維層に適用す
るかまたはこれを含浸溶液中に浸漬させる。

【００３４】ガラス繊維がポリビニルアルコールまたは
ポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニルで被覆されてい
るガラス繊維パッドは、未処理ガラス繊維パッドと比較
して湿潤強度が増大する。特に技術的な大規模の製造に
必要な量およびサイズの未処理ガラス繊維パッドは、含
浸溶液中に浸漬することができず、それらの湿潤強度が
低いために引き裂かれずに試薬を含浸することができな
いが、これは、ポリビニルアルコールまたはポリビニル
アルコール／ポリ酢酸ビニル被覆ガラス繊維パッドを用
いて容易に行うことができる。できる限りホモジニアス
であるポリビニルアルコールまたはポリビニルアルコー
ル／ポリ酢酸ビニル被覆ガラス繊維パッドへの赤血球凝
集化物質の含浸を達成するために、このように前処理さ
れたガラス繊維パッドは、適用しようとする物質の溶液
中に浸漬することによって好都合に含浸させることがで
きる。

【００３５】適度に赤血球を凝集する物質を溶解する溶
媒として、この物質の性質への陰性の影響を有さず、ポ
リビニルアルコールまたはポリビニルアルコール／ポリ
酢酸ビニルによって被覆されたガラス繊維パッドに赤血
球凝集化物質を含浸させた後、この方法で製造されたフ
ィルター物質の血漿分離特性を損なわないような方法で
再度除去し得る如何なる液体をも選択することができ
る。大部分の場合、選択される溶媒は、水または水性緩
衝溶液である。

【００３６】赤血球凝集化物質に関する溶媒を分離除去
しなければならない場合に、含浸工程の次に乾燥工程を
続ける。これは、水が溶媒として使用される場合に慣例
的である。この場合、乾燥工程が行われる温度および赤
血球凝集化物質に依存する時間の長さを決定しなければ
ならない。一般に、温度が４０〜９０℃の間であり、乾
燥時間は、１〜１０分間である。

【００３７】本発明への適用に関して、ポリビニルアル
コールまたはポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニルで
処理されたガラス繊維層の表面上の赤血球凝集化物質の
濃度は、凝集効果を有する個々の物質のタイプおよび血
漿を単離しようとする血液の量に依存する。しかしなが
ら、如何なる場合も血漿の完全な分離を可能にするため
に充分に高くなければならないが、妨害溶血が生じるほ
ど高くてはいけない。これは、血液を、様々な濃度の赤
血球凝集化物質を含浸させたガラス繊維層に適用し、重
力および／または毛管力によってこの層を通過する血漿
が赤血球またはヘモグロビンを含有しているかを吟味す
る簡単な実験によって測定され得る。このような実験
は、実施例２と同様に行うことができる。被覆したガラ
ス繊維層１グラム当たりの陽電荷の数は、使用するカチ
オンポリマーの濃度を特徴付けるのに使用されることが
分かった。本発明における量は、１グラム当たり１０¹⁸
〜１０²¹電荷、好ましくは１グラム当たり５×１０¹⁹〜
１０²¹電荷である。

【００３８】全血から血漿を分離するための本発明の器
具は、ポリビニルアルコールまたはポリビニルアルコー
ル／ポリ酢酸ビニルで被覆されておりかつカチオンポリ
マーを担持しており、ゆるく積み重ねたか、または紙、
パッドもしくはフェルトの形態であるガラス繊維からな
り得る。しかしながら、それらは、外部構造によって保
持されることによって所望の形態で使用されてもよい。
例えば、遠心分離せずに簡単な通過によって血液から血
漿を単離するために、これに関して適当に処理したガラ
ス繊維を充填したカラム、ヌッツェフィルターまたは他
の適切な容器を使用することができる。

【００３９】血漿単離および試験域を有する血液成分測
定用試験担体における血漿単離の技術分野において、特
に本発明の器具、とりわけ、ガラス繊維がポリビニルア
ルコールまたはポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニル
で被覆されており、赤血球凝集化物質を担持しているガ
ラス繊維パッドを使用することができる。このような試
験担体の可能な配置の例は、例えば欧州特許出願公開Ｅ
Ｐ-Ａ-0045476、ＥＰ-Ａ-0239002またはＥＰ-Ａ-013389
5に開示されている試薬と同様に可能であり、本明細書
に引用している。

【００４０】図１において、本発明の血漿分離層を含ん
でいる試験担体のタイプを例として示す。

【００４１】図２および図３は、試料液体として血液お
よび血漿に関する様々な分離層を有する図１の試験担体
を使用する反射率[％]および分析物濃度[ミリモル／リ
ットル]の相互関係に関する関数曲線を示す。

【００４２】図２に関して、分離層として、欧州特許出
願公開ＥＰ-Ａ-0239002の２％ポリビニルアルコールと
一緒にガラス繊維を用いた。

【００４３】図３に関して、２％ポリビニルアルコール
および赤血球に対する抗体を有する本発明のガラス繊維
パッドを使用した。

【００４４】図１：試料適用域および血漿単離域(７)か
ら試験域(８)中に試料液を移動させる移動層(２)は、不
活性担体ホイル(５)、例えばプラスチックホイルに固定
される。大体において、移動層(２)としては、試験しよ
うとする液体を試料適用域(７)から試験域(８)中に移動
させることができ、この工程において、分析を害するよ
うな方法でそれを変えない全ての物質が適している。移
動層(２)としてガラス繊維パッドを使用するのが特に好
ましい。本発明の血漿分離層(３)は、移動層(２)を部分
的に覆っている。保護層(４)は、分離層(３)の上に設置
されており、例えばピペットで、試料適用の間に分離層
(３)の損傷を防止しようとする。不活性物質、例えばプ
ラスチックのネットがこのために価値があることが分か
った。保護層(４)および分離層(３)は、不活性担体ホイ
ル(５)に固定されている。これは、例えば、熱間硬化型
接着剤のストリップ(６)によって行われ得る。測定を行
うのに必要な試薬を含むフィルム層を有する透明なプラ
スチックからなる担体ホイル(１)は、移動層(２)の片側
に接着されている。これは、好ましくは、接着部(９)、
例えば熱間硬化型接着剤のストリップによって行われ
る。フィルム層(１)は、不活性担体ホイル(５)に向かっ
て透明担体ホイルを押すことによって液体移動を可能に
するような方法で移動層(２)と接触させることができる
ように位置決定する。

【００４５】血液中の分析物の測定を行うために、試料
を保護層(４)に適用する。血液が分離層(３)中に浸透
し、赤血球を凝固し保持する。血球が血漿または血清か
ら分離される。この方法で得られた血漿は、毛管力によ
って試験域(８)中に吸収される。移動層(２)における血
漿は、試薬層(１)を有する担体ホイル上の圧力によって
試薬層と接触させられ、液体は試薬層中に浸透し、測定
反応を起こす。比色測定反応の場合、該反応は、例え
ば、フィルム層(１)の担体ホイルを介して肉眼で観察さ
れるか、または試薬層中で形成された色素に基づく反射
光測定法によって測定される。

【００４６】本発明によって達成される長所は、実質的
には、細胞成分が、予め希釈されずに、かつ妨害溶血を
伴わずに全血から取り出され得ることである。赤血球に
加えて、実質的に、白血球および血小板のような血液の
全ての他の血球成分を分離することもできる。

【００４７】本発明の血漿分離層は非常に効果的である
ので、少量の血液試料からでさえ血漿を迅速に単離する
ことができる。

【００４８】血漿分離層は、接触させる血液試料への妨
害影響を有しないので、血液／血漿差異がその後の血漿
成分の測定において確立されない、すなわち血液と血漿
から得られる一致した値が得られるであろう。

【００４９】以下の実施例において、本発明をさらに詳
細に説明する。

【００５０】

【実施例１】 ａ）ガラス繊維パッドの製造 脱イオン水 １０００リットル ガラス繊維タイプ１０８Ａ(ジョン・マンビィル (Ｊohn Ｍanville)、アメリカ合衆国) ２kg 出発物質としてポリビニルアルコール、 タイプ クラロン(Ｋuralon)ＶＰＢ １０５−２ (ローテックス・テキスタイル・ゲゼルシャフト・ ミット・ベシュレンクテル・ハフツング(Ｒohtex Ｔextil ＧmbＨ)、ドイツ連邦共和国) ０.０４kg。

【００５１】抄紙機として、傾斜スクリーン機(ホイス
(Ｖoith)、ドイツ連邦共和国ハイデンハイム)を使用す
る。水に懸濁させた繊維を傾斜スクリーン上にポンプで
押し出す。液体を流出させるかまたは真空によって吸引
しながら、該繊維をスクリーン表面でそれ自体を配向さ
せ、乾燥シリンダー上でパッドとして乾燥させる。乾燥
は、最終湿度が０.５〜１.５重量％に達するまで１２５
℃で行う。面積重量６０g／m²および厚さ０.４５mmを有
する物質が形成されるように、吸引および製造速度とし
て２m／分を選択する。

【００５２】ｂ）カチオンポリマーによるガラス繊維パ
ッドの含浸：ガラス繊維パッドにポリブレン(Ｐolybren
^R)(ビーエイエスエフ(ＢＡＳＦ)、ドイツ連邦共和国ル
ドヴィクシャフェン)の０.７％溶液を含浸させる。比含
浸物吸収量は約３７０ml／ｍ^２である。ガラス繊維パッ
ドは、１ｍ／分の速度で８０℃で生成物移動式乾燥器中
で乾燥させる。

【００５３】ｃ）抗体によるガラス繊維パッドの含浸：
実施例１ｂ）と同様に(含浸物吸収量３７０ml／m²)、生
理食塩水(濃度４mg／ml)に抗赤血球抗体(ダコパッツ(Ｄ
akopatts))を入れた溶液を、ガラス繊維パッドに含浸さ
せる。１分の速度で生成物移動式乾燥器中で６０℃で乾
燥させる。

【００５４】ｄ）レクチンによるガラス繊維パッドの含
浸 リン酸塩緩衝化(１.２５ミリモル／リットル)生理食塩
水(濃度１mg／ml)にリシヌス・コミュニス(Ｒicinus co
mmunis)(ＲＣＡ １２０、ベーリンガー・マンハイム・
ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツン
グ(ＢoehringerＭannheim ＧmbＨ)、ドイツ連邦共和国
マンハイム)由来のレクチンを入れた溶液を、ガラス繊
維パッドに含浸させ、実施例１ｃ）と同様に乾燥させ
る。

【００５５】ｅ）抗体およびカチオンポリマーによるガ
ラス繊維パッドの含浸 実施例１ｃ）と同様に、１０mＭヘペス(Ｈepes)緩衝液
(pＨ７.２)に０.７％ポリブレン(Ｐplybren^R)および１m
g／ml抗−赤血球抗体(ダコパッツ(Ｄakopatts))を入れ
た溶液をガラス繊維パッドに含浸させ、乾燥させる。

【００５６】

【実施例２】 血漿分離特性：実施例１で製造した本発明のガラス繊維
パッドの分離能は、６×６mmの分離パッドの表面全体
を、面積重量２５g／m²を有する２０×６mmの、血漿を
移動させるガラス繊維パッド(ビンザー(Ｂinzer)、ドイ
ツ連邦共和国)の一端におくような器具で測定される。

【００５７】４８％のヘマトクリットを有する血液３２
μlを分離パッド上にピペットによって移し、移動パッ
ド上で２分後に赤血球フロント(erythrocyte front)を
測定する。

【００５８】さらに、血液１dlを有する分離パッド２.
２mgによって生じる溶血を測定する。

【００５９】本発明のガラス繊維含有層を従来技術の血
漿分離層と比較する。結果を表１に示す。本発明の血漿
分離層だけが、顕著な溶血を伴わずに非常によく赤血球
を分離する。

【００６０】

【表１】 血漿分離層 赤血球フロント 溶血 (mm) (g Hb／dl) ポリビニルアルコール不含およびカチオン ポリマー不含ガラス繊維 １〜２ ０.４５ ２％ポリビニルアルコール含有ガラス繊維 ２.８ ０.０５ ポリブレン(Ｐolybren^R)含有ガラス繊維 ＜０.２ ０.３ ２％ポリビニルアルコールおよびポリミン (Ｐolymin)Ｐ含有ガラス繊維 ＜０.２ ０.１ ２％ポリビニルアルコールおよびポリブレン (Ｐolybren^R)含有ガラス繊維 ＜０.２ ０.０１ ポリブレン(Ｐolybren^R)含有紙(ワットマン (Ｗhatman) ３１ ＥＴ クロム(Ｃhrom))(欧 州特許出願公開ＥＰ-Ａ-0325413による) 血漿分離されない ２％ポリビニルアルコールおよびレクチン 含有ガラス繊維 ＜０.２ ０.０１ ２％ポリビニルアルコールおよび抗体含有 ガラス繊維 ＜０.２ ０.０１ ２％ポリビニルアルコール、抗体およびポリ 測定可能な ブレン(Ｐolybren^R)含有ガラス繊維 ＜０.２ 溶血なし

【００６１】

【実施例３】血液および血漿中のカリウムを検出するた
めに試験担体を使用する場合の血液／血漿差異３つの血
漿分離層を製造し、各々、図１の試験担体上の層(３)と
して使用する。

【００６２】血漿分離層： ａ）実施例１ａ）に従って製造した２％ポリビニルアル
コール含有ガラス繊維(欧州特許出願ＥＰ-Ａ-0239002に
よる)。

【００６３】ｂ）２％ポリビニルアルコールおよびカチ
オンポリマー含有ガラス繊維(実施例１ｂ）に従って製
造した)。

【００６４】６×６mmのパッドの形態の各血漿分離層
を、６×６mmポリアミド保護ネットの下でかつ実施例２
に記載した２０×６mmガラス繊維パッド(２５g／m²、ビ
ンザー(Ｂinzer)、ドイツ連邦共和国)の上で、熱間硬化
型接着ストリップを介して、担体ホイルとしての長さ１
５０mmおよび幅６mmの白色ポリエステルホイルに接着す
る。

【００６５】カリウム試験用試薬層として、分析物測定
に必要な試薬で被覆した長さ１５mmおよび幅６mmの透明
ポリエステルホイル(厚さ２００μm)を、熱間硬化型接
着ストリップを介して白色ポリエステルホイルに接着す
る。

【００６６】試薬層の製造に関して、下記組成からなる
混合物を湿厚３００μmで透明ポリエステルホイルに塗
布し、乾燥させる。

【００６７】 ビニルアセテート−マレイン酸ジブチルエステル−コポリマー (モウィリス(Ｍowilith^R) ３５／７３、ヘキスト・アクチエン・ ゲゼルシャフト(Ｈoechst ＡＧ)、ドイツ連邦共和国フランクフルト) 14.7g ２,２−ジフェニル−１−シアノ−アクリル酸−エチルヘキシル エステル(ユビヌル(Ｕvinul^R)Ｎ５３９、ビーエイエスエフ(ＢＡＳＦ)、 ドイツ連邦共和国ルドヴィークシャフェン) 18.4g ４−(２,６−ジブロモ−４−ニトロ−フェニルアゾ−)−２−オクタ デシルオキシ−ナフトール−１(実施例３ｃに従って製造した) 0.130g バリノマイシン 0.600g 珪藻土(セラトム(Ｃelatom^R) ＭＷ ２５、イーグル-ピッチャー (Ｅagle-Ｐicher)、アメリカ合衆国シンシナティ) 28.2g 酢酸ブチル 50.7g

【００６８】この層に、湿フィルム厚さ１５０μmを有
する下記組成の第２の層を塗布し、乾燥する。

【００６９】 ヒドロキシセルロース(ナトロゾル(Ｎatrosol^R) ２５０Ｇ、 ハーキュリーズ・インコーポレイテッド(Ｈercules Ｉnc.)、 アメリカ合衆国デラウエア州ウィルミントン) 41.5g Ｎ,Ｎ−ビス−(ヒドロキシエチル)−アミノエタンスルホン酸 8.5g エタノール 64 ml ＬiＯＨでpＨ７.８に調節。

【００７０】この試薬層を、１５×６mmの小片に分割し
た後、上記試験担体と合わせる。

【００７１】ｃ）４−[２,６−ジブロモ−４−ニトロフ
ェニル)アゾ]−２−オクタデシルオキシ−１−ナフトー
ル

【００７２】ｃａ）２−オクタデシルオキシナフタレン 撹拌器、冷却器および温度計を装着した４リットルの３
つ口フラスコ中、エタノール１リットルに水酸化ナトリ
ウム(９９％)４８g(１.２モル)を入れた溶液に、２−ナ
フトール(９８％)１７２.８g(１.２モル)を添加し、溶
解した後、臭化n−オクタデシル４１７g(１.２５モル)
を添加し、反応混合物を還流下で１４時間加熱する。さ
らにエタノール１リットルを添加した後、該熱溶液をサ
イツ(Ｓeitz)フィルター上で吸引して、無機物質を除去
し、弱いピンク色の濾液を３０分間氷浴に置くことによ
って結晶化させる。ほとんど無色の結晶を吸引した後、
濾過ケーキをエタノール約７００mlで数回に分けて洗浄
し、五酸化二リンによって乾燥させた後、無色の結晶と
して２−オクタデシルオキシナフタレン３７１.９g(理
論収率９３.７％)を得た。Ｆp ６４〜６８℃。

【００７３】ｃｂ）２−オクタデシルオキシ−１−ナフ
トール 撹拌器、クライゼン付属物、温度計および冷却器ならび
に塩化カルシウム管を装着した１０リットルの３つ口フ
ラスコ中、氷酢酸３リットルおよび無水酢酸６００mlの
混合物に、２−オクタデシルオキシナフタレン５９４g
(１.５モル)および四酢酸鉛３９７g(０.７５モル)を添
加し、５５℃に加熱する。撹拌しながら、２４時間おき
に、４日にわたって、さらに四酢酸鉛４００gを分けて
(各１００gずつ)添加する。その後、形成された黄色液
体を室温に冷却し、水１.５リットルを添加した後、再
度３０分間撹拌し、形成された結晶スラリーを吸引し、
水２リットルで数回に分けて洗浄する。湿粗生成物をト
ルオール４リットルに溶解し、水１リットルを分けて３
回、飽和炭酸水素ナトリウム溶液１リットルを分けて３
回、そして再度水１リットルを分けて３回、一緒に振盪
する。硫酸ナトリウムによってトルオール相を乾燥さ
せ、吸引および蒸発による濃縮の後、茶色の粗生成物６
３５gを得、これを以下のとおりクロマトグラフィーで
精製する：得られた結晶をトルオール／イソヘキサン
(５：２)１.３リットルの混合物に溶解し、該溶液を、
内径１１.５cm、充填高さ１.２mのシリカゲル６０(メル
ク(Ｍerck))カラムに入れる。移動溶媒としてトルオー
ル／イソヘキサン(５：２)を使用し、画分約３００mlを
得る。画分９〜５２を合わせて、重量が一定になるまで
蒸発によって濃縮する。２−オクタデシルオキシ−１−
ナフトールアセテート３２４.２gを得る。Ｆp ６７〜６
８℃。さらに精製せずに、加熱しながら、これをメタノ
ール１.８リットルに溶解し、２０℃に冷却する。形成
された懸濁液に、冷却せずに撹拌しながら、濃硫酸９３
mlを１５分以内で滴下する。これによって温度が３５℃
に上昇する。次いで、還流下で２時間加熱し、次いで、
氷浴で冷却し、氷飢えで冷却しながらさらに３０分間撹
拌する。形成された結晶を吸引し、氷冷メタノール１５
０mlで洗浄し、五酸化二リンによって乾燥棚中で３５℃
で乾燥させる。無色結晶の２−オクタデシルオキシ−１
−ナフトール２９４.４g(理論収率４７.５％)を得る。
Ｆp ５８〜５９℃。

【００７４】ｃｃ）４−[(２,６−ジブロモ−４−ニト
ロフェニル)アゾ]−２−オクタデシルオキシ−１−ナフ
トール 撹拌器、クライゼン付属物および温度計を装着した２リ
ットルの３つ口フラスコ中、撹拌しながら、１０〜１５
分間、濃硫酸３００mlに亜硝酸ナトリウム２２.７g(０.
３３モル)を入れる。これによって反応溶液の温度が３
５℃に上昇する。次いで、２０℃に冷却し、氷で冷却し
つつ温度を２０〜２５℃に維持するような方法で約１５
分で氷酢酸２３０mlを滴下する。その後、場合によって
冷却しながら、１０分間、２,６−ジブロモ−４−ニト
ロアニリン(リーデル・デ・ヘーン(Ｒiedel de Ｈaen)
[９９％ＧＣ])９７.６ml(０.３３モル)を数回に分けて
添加する。これによって温度が１９〜２１℃に維持され
る。さらに３時間、再度、撹拌する。その後、氷水３.
５リットル上に注ぎ、形成されたジアゾニウム塩溶液
を、氷酢酸３リットルおよびクロロホルム３００mlに酢
酸ナトリウム・三水和物１８０g(１.３３モル)を添加し
た混合物に２−オクタデシルオキシ−１−ナフトール１
２４g(０.３モル)を入れた溶液に迅速に添加する。(ナ
フトールエーテルの溶液の製造において、酢酸ナトリウ
ムを添加して氷酢酸−クロロホルム中に加えた後、温度
が約４５℃に上昇した後、２０℃に再度冷却することに
注意しなければならない。）氷浴中で３時間撹拌した
後、形成した結晶を吸引し、残渣を毎回水５００mlで３
回洗浄し、４０℃で乾燥棚中で乾燥させる。粗生成物
− 淡茶色結晶２９５.５g − をクロマトグラフィーに
よって精製する。アゾ化合物をトルオール／塩化メチレ
ン(２：５)１リットルに溶解し、内径１１.５cm、充填
高さ１.２mのシリカゲル６０(メルク(Ｍerck))に充填
し、トルオール／塩化メチレン(２：５)で溶離する。画
分約７０mlが得られる。画分５７〜１７３を合わせて、
蒸発によって濃縮する。茶色の結晶１３４.２ｇを得
る。これを８０℃でトルオール４８０mlに溶解し、６５
℃に冷却し、強く撹拌しながらイソヘキサン８００mlを
添加する。強く撹拌しながら２０℃に冷却し、冷蔵庫中
に一晩放置し、形成された結晶を吸引し、濾過ケーキを
氷冷トルオール／イソヘキサン(１：１.３)３００mlで
２回洗浄し、次いで、イソヘキサン３００mlで洗浄す
る。その後、重量が一定なるまで五酸化二リンによって
４０℃で乾燥棚中で乾燥させる。淡茶色結晶のアゾ化合
物１１９.９g(理論収率５５.５％)を得る。Ｆp １０２
〜１０３℃。ＴＬＣ、シリカゲル６０(メルク(Ｍerc
k))、移動溶媒：トルオール／塩化メチレン(２：５)、
Ｒf＝０.３８。o−ニトロフェニルオクチルエーテル
中、酸性またはアルカリ性pＨでの透過分析によって、
４５４または６７２nmのλ_max値が得られる。

【００７５】血液／血漿差異を評価するために、同一の
試験担体を用いて、全血および通常のように遠心分離に
よって血液から得た血漿を研究する。試料３０μlを保
護層(４)にピペットで移し、次いで、各試験担体を市販
の反射光光度計レフロトロン(Ｒeflotron^R)(ベーリンガ
ー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレン
クテル・ハフツング(Ｂoehringer Ｍannheim ＧmbＨ)、
ドイツ連邦共和国マンハイム)中に挿入する。反射光光
度計において、フラップの上の試薬層を移動層中の液体
と接触させ、生じた反応を反射光光度計によって測定す
る。

【００７６】結果を図２および図３に示す。従来技術の
ガラス繊維パッドを使用すると、顕著な血液／血漿差異
が観察され、本発明の血漿分離層を使用する試験担体
は、血液からおよび血漿からの分析物の測定に適してい
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の血漿分離層を含んでいる試験担体の
斜視図である。

【図２】 血液および血漿に関して、分離層として従来
技術のガラス繊維を用いた試験担体で測定される反射率
と分析物濃度の間の関係を表す曲線である。

【図３】 血液および血漿に関して、本発明の分離層を
有する試験担体で測定される反射率と文節物濃度の間の
関係を表す曲線である。

【符号の説明】

１・・・フィルム層 ２・・・移動層 ３・・・分離層 ４・・・保護層 ５・・・不活性担体ホイル ６・・・熱間硬化型接着剤のストリップ ７・・・試料適用域 ８・・・試験域 ９・・・接着部

フロントページの続き (72)発明者 ペーター・フォーゲル ドイツ連邦共和国デー−6944ヘムスバッ ハ、シューベルトヴェーク５番 (72)発明者 ロルフ・レルヒ ドイツ連邦共和国デー−6804イルベシャイ ム、カンツェルバッハシュトラーセ22番 (72)発明者 エリッヒ・シュナイダー ドイツ連邦共和国デー−6800マンハイム 31、メルカー・クヴェーアシュラーク６番 (72)発明者 アンドレアス・マーシャル ドイツ連邦共和国デー−6800マンハイム 31、レフコーイェンヴェーク18番 (56)参考文献 特開 昭62−249064（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−78935（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−72065（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 赤血球凝集化物質を含む繊維含有層を有
   し、繊維含有層がポリビニルアルコールまたはポリビニ
   ルアルコール／ポリ酢酸ビニルで被覆されたガラス繊維
   を含むことを特徴とする溶血を抑制した全血から血漿を
   分離するための器具。
2. 【請求項２】 全血を赤血球凝集化層と接触させ、赤血
   球を繊維含有層によって保持させる、溶血を抑制して全
   血から血漿を分離するための方法であって、繊維含有層
   としてガラス繊維を含有している層を使用し、ガラス繊
   維がポリビニルアルコールまたはポリビニルアルコール
   ／ポリ酢酸ビニルによって被覆されていることを特徴と
   する分離方法。
3. 【請求項３】 溶血を抑制した血漿単離域および試験域
   を含み、該血漿単離域が請求項１記載の器具を含むこと
   を特徴とする血液成分の測定用試験担体。