JPH07503363A

JPH07503363A - バシラス・リヘニフォルミス中で遺伝子を発現させる方法

Info

Publication number: JPH07503363A
Application number: JP5508898A
Authority: JP
Inventors: ヨールゲンセン，ステーン　トロエルス; ヨールゲンセン，ペル　リノー
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1991-11-14
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 1995-04-13
Also published as: FI942227A0; WO1993010248A1; FI942227A; EP0672154A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の技術分野本発明は、バシラ７．・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）内で嫌気性および／または好熱性の微生物類由来の遺伝子を発現させる方法、ならびにバシラス・リヘニフォルミス中でシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼを産生させる方法に関する。

発明の背景シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ類（１，４−α−Ｄ−グルカン４−α−Ｄ−（１，４−α−Ｄ−グルカノ）トランスフェラーゼ、ＥＣ２，４，１，１９）（以後ＣＧＴアーゼ類と呼ぶ）はすでにデンプンまたはデンプン加水分解物の液化および環化反応によるシクロデキストリン類の製造に利用されている。この目的のためにこれまで用いられているＣＧＴアーゼ類は、バシラス・マセランス好アルカリ性バシラス属の種の細菌、ミクロコツカス・ルテウスＣＧＴアーゼ類には、微生物の汚染を回避するため充分高い温度でシクロデキストリン類を産生ずるのに有用なほどに、６０″Ｃを越える温度では充分に安定でないという欠点がある。さらに最近では、国際特許願公開第ＷＯ３９１０３４２１号に記載されているように、テルモアネロこれらのＣＧＴアーゼ類は１））１５．０における最適温度が約９５℃である。

ＣＧＳＴアーゼを大量に製造するには組換えＤＮＡ法で製造するのが有利である。Ｂ・マセランスまたはＢ・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴアーゼをコードする遺伝子のクローン化は西独特許第２１６９９０２号に記載されている。テルモアネロバクタ−属の種の細菌のＣＧＴアーゼをコードする遺伝子の大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）内でのクローン化は国際特許願公開第ＷＯ３９１０３４２１号に記載されている。

発明の要約本発明は、嫌気性および／または好熱性の微生物由来の遺伝子をバシラス・リヘニフォルミスにおいて発現させる方法に関し、この方法では、嫌気性および／または好熱性の微生物由来の遺伝子を含有し、かつその遺伝子の転写を実施できるプロモーター配列が先行しているＤＮＡ配列によって形質転換されたＢ・リヘニフオルミスの適切な菌株が適切な条件下で培養され、遺伝子が発現される。

別の態様では、本発明は、Ｂ・リヘニフオルミスにおいてシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）を産生させる方法に関し、この方法では、ＣＧＴアーゼをコードする遺伝子を含有し、かつその遺伝子の転写を行うことができるプロモーター配列が先行しているＤＮＡ配列で形質転換されたＢ・リヘニフォルミスの適切な菌株がＣＧＴアーゼを産生するのに適切な条件下で培養され、次いでＣＧＴアーゼが培養物から回収される。

由来の技切り酵素をコードする遺伝子をＢ・サチリス（Ｂ・５ｕｂｔｉｌｉｓ）中にクローン化すること（Ｒ，Ｄ、　Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６９（９）巻、４３０２〜４３０７頁、１９８７年参照）およびテルモアネロバクタ−属の種の細菌由来のＣＧＴアーゼ遺伝子をＢ・サチリス中にクローン化すること（国際特許願公開第Ｗ０９１１０９１２９号参照）はすでに示唆されているが、テルモアネロバクタ−属の種の細菌のＣＧＴアーゼ遺伝子または嫌気性もしくは好熱性の微生物由来の他の遺伝子を、バシラス・リヘニフォルミスにおいてクローン化することは新規なことのようである。

Ｂ・リヘニフォルミスのほとんどの菌株は少なくとも現在は、コンピテント状態にすることによって形質転換することは不可能なので例えば原形質体形成法（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ）て形質転換しなければならずその結果形質転換頻度が低くなるので、非相同の遺伝子をＢ・リヘニフオルミス中にクローン化することは、一般に、例えばＢ・サチリスにクローン化するよりも複雑である。しかし、Ｂ・リヘニフォルミスは、その少なくともいくつかの菌株が大量の酵素タンパク質を産生ずるので、組換え酵素類の製造に用いるのに有利な微生物である。それ故に、ＣＧＴアーゼおよび嫌気性微生物由来の他の酵素を、Ｂ・リヘニフォルミスにおいて、例えばＢ・サチリスにおいてよりも高い収率で得ることができる。

発明の詳細な開示本発明によれば、嫌気性および／または好熱性の遺伝子を含有するＤＮＡ配列が、適切なプロモーター配列に作動可能に接続されていなければならない。そのプロモーターは、Ｂ・リヘニフォルミス中で転写活性を示すいずれのＤＮＡ配列でもよくおよびＢ・リヘニフオルミスに対し同種性もしくは異種性のタンパク質をコードする遺伝子由来のＤＮＡ配列でもよい。適切なプロモーターの例としては、Ｂ・ステアロサーモフィラスのマルトゲニック（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）アミラーゼ（ａｍｙＭ）　、Ｂ・リヘニフ中ルミスのα−アミラーゼ（ａｍｙＬ）、Ｂ・アミロリフファシェンス（Ｂ、　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の α−アミラーゼ（ａｍｙＱ）もしくはＢ・サチリスのアルカリ性プロテアーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、またはＢ・ピュミルス（Ｂ、　ｐｕｍｉｌｕｓ）キシロシダーゼのプロモーターもしくはハイブリッド５ＰＯＩ／ｌａｃプロモーター（Ｄ、Ｇ、　Ｙａｎｓｕｒａおよびり、Ｊ、　Ｈｅｎｎｅｒ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１巻、４３９〜４４３頁、１９８４年）がある。

本発明の方法に用いるのに特に好ましいプロモーターは、下記のＤＮＡ配列に含有されているＢ・リヘニフォルミスα−アミラーゼプロモーターの変異体またはその機能的誘導体である。

ＡＡＡＡＴＣＧＴＣＴ　ＴＡＡＴＧＣＡＣＧＡ　ＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡ　ＡＣＧＴＴＣＧＣＡＧ　ＡＴＧＣＴＧＣＴＧ八ＡＡＡＧＧＧＧへＧＧ’ＡＧＡＡＴＣ（配列番号：ｌ）好熱性の供与微生物は、アーケバクテリウム（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌株でもよく、それ故、より具体的に述べると、この好熱性微生物由来の遺伝子はピロコツカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の種の細菌のプルラナーゼもしくはα−アミラーゼをコードする遺伝子が適切である。このピロコツカス属の種の細菌のプルラナーゼおよびα−アミラーゼは例えばそれぞれ国際特許願第ＰＣＴ／ＤＫ９１１００２１９および国際特許願公開第ＷＯ９０／１１３５２号に記載されているものでもよい。嫌気性供与微生物は好熱性でもある微生物でもよく、それ故に、その好熱性でかつ嫌気性の微生物由来の遺伝子としては、テルモアネロバクタ−属もしくはテルモアネロバクタ属の種の細菌のシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ、テルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属の種の細菌のグルコースイソメラーゼをコードする遺伝子が適切である。

本発明によれば、嫌気性および／または好熱性の微生物由来の遺伝子を含有するＤＮＡ配列は自己複製発現ベクター上に存在している。

このベクターはさらに、ベクターを宿主細胞中で複製可能にするＤＮＡ配列を含有している。このような配列の例は、プラスミドの、ｐＵＣ１９（Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ、　３３巻、　１０３〜１１９頁、１９８５年）１）ＡＣＹＣ１７７（Ａ、Ｃ，Ｙ、　ＣｈａｎｇおよびＳ、Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１３４巻、１１４１−１１５６頁、１９７８年）　、ｐＵＢｌｌｏ（Ｇｒｙｃｚａｎらの１９７８年の文献）またはｐｌＪ７０２（Ｅ、　ＫａｔｚらＪ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１２９巻、２７０３〜２７１４頁、１９８３年）の複製開始点である。またこのベクターは、選択可能なマーカー例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンもしくはテトラサイリンに対する耐性のような抗生物質耐性を与える産物を産生ずる遺伝子、またはＢ・サチリスもしくはＢ・リヘニフォルミス由来のｄａｌ遺伝子（Ｂ、　Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎの１９８６年の文献）を含有していてもよい。嫌気性および／または好熱性の微生物由来の遺伝子をコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよび複製開始点を連続するのに用いる方法は当該技術分野の当業者にはよく知られている（例えば５ａｎｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、米国、−ニーヨーク州、１９８９年参照）。

あるいは、嫌気性および／または好熱性の微生物由来の遺伝子を含有するＤＮＡ配列はＢ・リヘニフｔルミスの宿主細胞の染色体上に存在していてもよい。このことは、そのＤＮＡ配列は該宿主細胞内に安定に保持されているようなので有利である。該ＤＮＡ配列の宿主染色体への組込みは、通常の方法、例えば相同的組換え法によって実施することができる。一つの実施態様において、前記ＤＮＡ配列は、Ｂ・リヘニフォルミスの宿主細胞の染色体上に二つ以上のコピーとして存在してもよい。

本発明の方法の現在好ましい実施態様では、前記ＤＮＡ配列は、Ｂ・リヘニフォルミスの宿主細胞の染色体上のＢ・リヘニフォルミスα−アミラーゼ遺伝子の部位に存在し、ａｍｙＬプロモーター特に上記のａｍｙＬプロモーター変異体およびそのアミラーゼシグナルペプチドを含有する、Ｂ・リヘニフォルミスα−アミラーゼの発現シグナルによって発現される。

Ｂ・リヘニフォルミスの宿主細胞はプロテアーゼおよび／またはアミラーゼ欠乏性の細胞の方が好ましい。なぜなら、一般的に、培地中に存在するタンパク質はできるだけ少なくて注目のタンパク質の精製が容易になるのが有利だからである。また発現されたプロテアーゼは注目の遺伝子産物の少なくとも一部を分解することもあり、そして発現されたアミラーゼは（注目の遺伝子産物がＣＧＴアーゼのようなデンプン分解酵素である限り）最終産物に耐性がないかもしれず、かつ続いて行う生成物の精製を困難にすることがあり、いずれの場合も注目の生成物の収率が低下することになる。プロテアーゼおよび／またはアミラーゼ欠乏は、例えばプロテアーゼまたはアミラーゼをコードする遺伝子の欠失または該遺伝子中への挿入によって得られ、例えばＣＧＴアーゼをコードするＤＮＡ配列を、上記のように、宿主の染色体のα−アミラーゼ遺伝子の部位に導入することによって行う。

本発明の方法では、発現遺伝子の生成物は好ましくは培養物から回収される。生成物の回収は従来の方法で行われるが、この方法は、遠心分離もしくは濾過によって細胞を培地から分離し、得られた上澄み液もしくは濾液のタンパク質成分を硫酸アンモニウムのような塩によって沈澱させ、次に必要に応じて各種のクロマトグラフィーの方法、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーなどに付すことからなる方法である。

図面の簡単な説明本発明は、さらに添付した図面を参照して以下の実施例で説明する。なお図面には以下の略語を使用している。

“ｐＢＲ３２２”はｐＢＲ３２２由来のＤＮＡを意味する：“十ｏｒｉ　ｐＵＢｌｌｏ”はｐＵＢｌｌｏのプラス複製開始点を意味する；”　ｒｅｐ”はｐＵＢｌ　１０のｒｅｐ遺伝子を意味する：“ｃａｔ”はｐｃ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子を意味する二“ＣｇｔＡ”はテルモアネロバクタ−のＣＧＴアーゼ遺伝子を意味する：“ＰａｍｙＭ”はＢ・ステアロサーモフィラスのマルトゲニックアミラーゼ遺伝子のプロモーターを意味する（ＤｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎおよびＣｈｒ　ｉ　ｓ　ｔ　１ａｎｓｅｎの１９８８年の文献）；”ｂｌａ”はｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子を意味する；“ｐＫＫ２３３−２”はｐＫＫ２３３−２由来のＤＮＡを意味する：“ＰａｍｙＬ″はＢ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼ遺伝子のプロモーターを意味する； “ＰａｍｙＱ”はＢ・アミロリフファシェンスのα−アミラーゼ遺伝子のプロモーターを意味する； “ａｍｙｔ、　−ＣｇｔＡ”は、Ｂ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼ遺伝のシグナルペプチドをコードする部分および成熟酵素をコードするテルモアネロバクタ−ＣＧＴアーゼ遺伝子の部分からなる融合遺伝子を意味する； “ｅｒｍ”はｐＨ＋９４のエリスロマイシン耐性遺伝子を意味する；“ｏｒｉ　ｐＨ１９４”は、プラス複製開始点とｒｅｐ遺伝子を含有する、ｐＨ１９４の領域を意味する； “ａｍｙＬ”はＢ・リヘニフオルミスのα−アミラーゼ遺伝子の３′末端にまたがっているＤＮＡフラグメントを意味する；“ｄａｌ“はＢ・ズブチリスのり、Ｌ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を意味する；ならびに “ｄｆｓ”はｄａｌ遺伝子のすぐ３′側の配列を意味する。

図１はプラスミドｐＮＶ６０１の制限酵素地図である；図２はプラスミドｐＰＬ１８７８の制限酵素地図である：図３はプラスミド１）ＰＬ１４１９の制限酵素地図である；図４はプラスミドｐＰＬ１４８９の制限酵素地図である：図５はプラスミドｐＰＬ１５４０の制限酵素地図である：図６はプラスミドｐＤＮ３０００の制限酵素地図である：図７はプラスミドｐＰＬ１７５９の制限酵素地図である；図８はプラスミドｐＰＬ１８９２の制限酵素地図である；図９はプラスミドｐＰＬ１７９６の制限酵素地図である；図１０はプラスミドｐＢＢ３７の制限酵素地図である；図１１はプラスミドｐＰＬ１３８５の制限酵素地図である；図１２はプラスミドｐＰＬ１８９３の制限酵素地図である；図１３はプラスミドｐｓＪ１１１１の制限酵素地図である；図１４はプラスミドｐＤＮ３０６０の制限酵素地図である；図１５はプラスミドｐＳＪ　１２７７の制限酵素地図である；図１６はプラスミドｐＳＪ９９４の制限酵素地図である；図１７はプラスミドｐｓＪ１２８３の制限酵素地図である；図１８はプラスミドｐＳＪ　１３４２の制限酵素地図である；図１９はプラスミドｐｓＪＩ３５９の制限酵素地図である。

図２０はプラスミドｐＰＬＩ４８３の制限酵素地図である：図２１はプラスミドｐＰＬ１４８７の制限酵素地図である：図２２はプラスミドｐＳＪ９３２の制限酵素地図である：図２３はプラスミドｐＳＪ９４ｇの制限酵素地図である。

図２４はプラスミドｐＳＪ９８０の制限酵素地図である；図２５はプラスミドｐｓＪ１３９１の制限酵素地図である。

図２６は、染色体のα−アミラーゼ遺伝子およびプラスミドｐｓＪＩ３９１が保有しているａｍｙＬ　−ｃｇｔＡ融合遺伝子間の、相同的組換えによる交換を示す概略図である；図２７は、ＣｇｔＡの成熟部分の５′末端間の生体内組換えを示す概略図である。

図２８はプラスミドｐＤＮ＋３１６の制限酵素地図である：図２９はプラスミドｐＤＮ３０２０の制限酵素地図である；図３０はプラスミドｐｓＪＩ４４６の制限酵素地図である：ならびに、図３１はプラスミド１）ＳＪ１４４８の制限酵素地図である。

本発明を以下の実施例でさらに説明するが、本発明の適用範囲はこれらの実施例で限定されるものではなく特許請求の範囲によって限定される。

実施例一般的な方法プラスミド類を構築するのに使用される実験方法は、組換ＤＮＡ法の技術分野に含まれる標準の方法である（Ｔ、　ＭａｎｉａｔｉｓらＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　、米国、ニューヨーク州、１９８２年参照）。

制限エンドヌクレアーゼ類はＮｅｗ　Ｂｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社から購入し、メーカーが推奨するとおりにして使用した。Ｔ　４　ＤＮＡ　リガーゼはＮｅｗ　Ｂｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社から購入しメーカーが推奨するとおりにして使用した。

すべての菌株からのベクターＤＮＡの調製はに１ｅｓｅｒの１９８４年の文献に記載されている方法で実施した。

大腸菌の形質転換；大腸菌の細胞をコンピテント状態にしてＭａｎｄｅｌおよびＨｉｇａの１９７０年の文献に記載されているようにして形質転換した。

Ｂ・ズブチリスの形質転換：コンビテント細胞を調製し、Ｙａｓｂｉｎらの１９７５年の文献に記載されているようにして形質転換した。

Ｂ・リヘニフオルミスの形質転換：ＡｋａｍａｔＳｕの１９８４年の文献に記載されているポリエチレングリコールによる原形質体形質転換法によって、プラスミドをＢ・リヘニフォルミスに導入した。

１％の可溶性デンプンを補充したＬＢ寒天プレート上に形質転換体をプレートすることによって、大腸菌、Ｂ・ズブチリスまたはＢ・リヘニフォルミスのＣＧＴアーゼ産生コロニーを同定した。３７°（Ｊたは３０゛Ｃで一夜インキユベートした後、プレートをヨウ素の蒸気で染色して、ＣＧＴアーゼの作用によってデンプン上に生成した加水分解領域を示した。

培地ＢＰＸ　：　ジャガイモデンプン１００ｇ／ｆ大麦粉　５０ｇ／ＩＢＡＮ５０００ＳＫＢ　Ｏ，Ｉ　ｇ　／　Ｉ！カゼイン酸ナトリウム　ｌＯｇ／ｌ大豆かす　２０ｇ／ｌＮａ２ＨＰＯ４１２Ｈ２０９ｇ／Ｉ！Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　０．１　ｇ　／　ＩＬＢ寒天：　Ｂａｃｔｏ−トリプトン　ｌＯｇ／ＩＢａｃｔｏ酵母エギス　５ｇ／ｐＮａＣ１１０ｇ／ＩＢａｃｔｏ寒天　１５ｇ／Ａ’ ＮａＯＨでｐｌ＋を７．５に調節した。

テルモアネロバクタ−属の種の細菌ＡＴＣＣ５３６２７のＣＧＴアーゼ遺伝子（以後ｃｇｔＡと呼ぶ）を保持する大腸菌プラスミドｐＮＶ６０１　（図１）の構築は国際特許出願公開第ＷＯ３９１０３４２１号に開示されている。このＣｇｔＡ遺伝子を含有するＢ・ズブチリスのプラスミドｐＰＬ１８７８（図２）は国際特許出願公開前９１１０９１２９号に開示されている。このプラスミドは次のようにして構築した。

ｐＮＶ６０１を５ａｕ３Ａで部分的に消化し、次いで再連結し、これを用いて大腸菌５Ｃ３Ｉ　（Ｓｔｒａ、ｔａｇｅｎｅ社、米国、カリフォルニア州、Ｊａ　ｊｏｌｌａから購入した凍結コンピテント細胞）を形質転換し、アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。一つのＣＧＴアーゼ陽性コロニーはｐＰＬ１４１９（図３）を含有するＰＬ１４１９であった。プラスミドｐＰＬ１４１９を５ａｕ３Ａで部分的に消化し、フラグメントを、ＢｇｌＩ［で消化した。ｐＰＬＩ４８９（図４）に連結した。一つのＣＧＴアーゼ陽性でアンピシリン耐性（２００μｇ／ｍり　（Ｄ大腸菌５ＣＳＩ形質転換体がｐＰＬ＋５４０（図５）を含有していた。プラスミｔ”ｐＫＫ２３３−２　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）のＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩの部位の間に合成のＤＮＡリンカ−を挿入することによって、ｐＰＬ１４８９を該プラスミドがら誘導した。このリンカ−はＩ）ＤＮ３０００（図６−国際特許出願公開第ＷＯ０９１１０９１２号、Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎらの１９９０年の文献）由来のＰｓｔＩ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩフラグメントであった。ｐＰＬ１５４０をＦ（ａｅＩＩとＳｐｈ　Ｉで消化し、ｃｇｔＡ遺伝子を含有する２、　４ｋｂのフラグメントをＨａｅｌＩ＋　５ｐｈＩで消化し、たプラスミドｐＤＮ１３８０　（ＤｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎおよびＣｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎの１９８８年の文献）に挿入した。ＣＧＴアーゼ陽性でクロラムフェニコール耐性（６ｕ　ｇ／ｍｌ）の、Ｂ・ズブチリスＤＮ１８８５（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎらの１９９０年の文献）の形質転換体はｐＰＬ１８７８を含有していた。

２　α−アミラーゼ／ＣＧＴアーゼ融合遺伝子の構築バシラス・リヘニフォルミスα−アミラーゼ遺伝子：　ａｍｙＬをクローン化してプラスミドｐＤＮ１９８１が得られることはＪｏｒｇｅｎｓｅｎらの１９９０年の文献に記載されている。

プラスミドｐＰＬ１７５９（図７）において、ｐＤＮ１９８１のＰｓｔ　Ｉ　− ｔ（ｉｎｄｌＩＩフラグメントをｐＤＮ３０００（図６）由来のＰｓｔ　ｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩマルチリンカ−フラグメントで置換した。生成したプラスミドは、ａｍｙＬプロモーターと、シグナルペプチドをコードする配列の大部分を保持していた。

２．４ｋｂのＳａｌ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉフラグメント上にある、ｐＰＬ１８７８から切取ったＣｇｔＡ遺伝子を、Ｓａｔ　ｒ　＋　Ｎｏｔ　Ｉで消化したｐＰＬＩ７５９中に挿入し、次いてこのプラスミドでＤＮ１８８５を形質転換してカナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｇ）で選択することによってプラスミドｐＰＬ１８９２（図８）を構築した。

ｐＢＢ３７（図ｔｏ　；　Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、　Ｐ、らの１９９１年の文献）由来の０．５ｋｂＳ４（Ｉ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、Ｓａｃ　Ｉ　＋Ｓｍａ　Ｉで消化したｐＰＬ１３８５（図１１　；　Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎらの１９９０年の文献）中に挿入し、得られたプラスミドでＤＮＩ８８５を形質転換してクロラムフェニコール耐性（６μｇ／ｍｌ）で選択することによってプラスミド１）ＰＬ１７９６（図９）を構築した。

２．４ｋｂのＢａｍ）（Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉフラグメント上にある、ｐＰＬ１８７８から切取ったＣＧＴアーゼ遺伝子をＢａｍ）ｌ　Ｉ　＋　Ｎｏｔ　Ｉで消化したＩ）ＰＬ１７９６に挿入し、得られたプラスミドでＤＮ１８８５を形質転換してクロラムフェニコール耐性（６μｇ／ｍｌ）によって選択してプラスミドｐＰＬ１８９３（図１２）を構築した。

同じプラスミド上に含有されかつ相同領域を共有する二つのＤＮＡ配列を、相同領域間の組換えを生体内で行うことによってともに融合することができる生体内での遺伝子工学の方法（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎらの１９９０年の文献）（図２９参照）を用いて、ａｍｙＬとｃｇｔＡの遺伝子の融合体を構築したが、ｃｇｔＡシグナルペプチドをコードする配列はａｍｙＬ遺伝子のシグナルペプチドをコードする配列で正確に置換されていた。

この目的のために、下記のオリゴヌクレオチドリンカーを合成し、５ａｌＩで消化したｐＵｃ１９　（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎらの１９８５年の文献）に連結してｐＳＪＩＩＩＩ（図１３）を得て、このプラスミドで大腸菌ＳＪ２　（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎらの１９９０年の文献）を形質転換し、アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）によって選択した。

ａｍｙＬシグナルペプチドをコードする領域の３′末端５ａｌＩ　ＢｃｌＩ　Ｐｓｔ１５’　−ＴＣＧＡＣＴＧＡＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧ　−３’−ＧＡＣＴＡＧＴＧＡＡＣＧＡＣＧＧＡＧＴＡＡＧＡＣＧＴＣＧＴＣＧＣＣＧＣ−ＣｇｔＡ成熟タ成熟タンパク−ドする領域の５′末端ＧＣＡＣＣＧＧＡＴＡＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧ　−３’ＣＧＴＧＧＣＣＴＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴ　−５’　（配列番号：３）ｐｃ１９４（ＨｏｒｉｎｏｕｃｈｉおよびＷｅｉｓｂｌｕｍの１９８２年の文献）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔを、ｐＤＮ３０６０（図１４、国際特許出願公開第Ｗ０９１１０９１２９号）から１．ｌｋｂのＢａｍＨＩ　−ＢｇｌＩ［フラグメントとして切取って、Ｂｃｌ　Ｉで消化したｐｓＪ１１１１中に挿入し、得られたプラスミドで大腸菌ＳＪ６　（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎらの１９９０年の文献）を形質転換し次いでアンピシリン（２００μｇ／ａ＋１）およびクロラムフェニコール（６ｔｔ　ｇ／ｍｌ）　（７）耐性ニツイテ選択しテｐｓＪ１２７７（図１５）を得た。

ｐＰＬｌ　８９３由来の０．６ｋｂ　ＮｏｔＩ　−ＮｃｏＩフラグメントをｐＰＬ１８９２由来の５．４ｋｂ　Ｎｏｔ　Ｉ　−Ｎｃｏ　Ｉフラグメントに連結し、得られたプラスミドでＢ・ズブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、カナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）について選択することによって、ｐＳＪ９９４　（図１６）を構築した。

ｐｓＪ１２７７由来の１．　ｌｋｂのＳａｌ　Ｉフラグメントを５ａｌＩで消化したｐＳＪ９９４に連結し、得られたプラスミドでＤＮ１８８５を形質転換しカナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール耐性（６μｇ／ｍｌ）について選択してｐｓＪ１２８３（図１７）を構築した。

１．１ｋｂのＰｓｔＩフラグメントをｐｓＪ］２８３から欠失させ、得られたプラスミドでＤＮ１８８５を形質転換させ、カナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）について選択することによって、ｐｓＪ１３４２（図１８）を構築した。

ｐｓＪ１３４２からの実際の生体内組換えによってｐｓＪ１３５９（図１９）を構築した。ＣＧＴアーゼ遺伝子の成熟部分のスタート部分と、ｐｓＪ１３４２上のＰｓｉ　Ｉと５ａｌＩの間に延びる合成オリゴヌクレオチドの部分との間に相同性がある。そのプラスミドを、これらの二つの相同領域間で組換えを行うとＸｂｂｌ、５ａｌＩおよびＢａｍＨＩのユニーク部位が欠失する。

宿主菌株ＤＮ１８８５から調製したｌバッチのｐｓＪ１３４２をＢａｍＨＩ　、Ｘｂａ　Ｉおよび５ａｌＩで徹底的に消化し、次にこの消化したプラスミドで直接（すなわち連結せずに）　ＤＮ１８８５のコンピテント細胞を形質転換し、カナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）について選択した。この方法によって組換えプラスミドが強く消化される。というのは線形化されたプラスミドモノマーはＢ・ズブチリスのコンピテント細胞を形質転換できないからである（Ｍｏｔｔｅｓらの１９７９年の文献）。組換えられたプラスミドは制限酵素によって開裂されることなく、したがってＢ・ズブチリスのコンピテント細胞を充分に形質転換することができるモノマーまたはオリゴマー形態の混合物として存在する。このようにして得られた一つの形質転換体はｐｓＪ１３５９含有していた。このプラスミドは、Ｉ）ＵＢｌ　１０（Ｌａｃｅｙと（：ｈｏｐｒａの１９７４年の文献、Ｇｒｙｃｚａｎらの１９７８年の文献、Ｍｃｋｅｎｚｉｅらの１９８６年の文献）の複製開始点、ｐＵＢＩＩｏのｒｅｐタンパク質の遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ならびにテルモアネロバクタ−属の種の菌株ＡＴＣＣ５３６２７由来のＣＧＴアーゼの成熟部分をコードするＤＮＡに完全に融合された、Ｂ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼ（ａｍｙＬ）プロモーターおよびシグナルペプチドのコーディング領域を含有している。

３、染色体組込みベクターの構築ｐＵＢＩＩｏのカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）を含有する１、　４ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントをプラスミドｐＤＮ２９０４（国際特許願公開第ＷＯ９１１０９１２９号）から切取り、ＢｇＩＩＩで消化したｐＤＮ３０００（図６）に連結し、得られたプラスミドで大腸菌５ＣＳＩを形質転換してアンピシリン耐性（１００μｇ／ｍｌ）で選択して、かような形質転換体から１）ＰＬ１４８３（図２０）を回収した。

次にこのプラスミドを、複製に対して温度感受性のバシラス属細菌のベクターであるプラスミドｐＥ１９４（ＨｏｒｉｎｏｕｃｈｉおよびＷｅｉｓｂｌｕｍの１９８２年の文献ｂ）と結合させた。ｐＰＬ１４８３をＡｃｃ　Ｉで消化し、ｐＨ１９４をＣ１ａ　Ｉで消化し、得られた二つの線状化プラスミドを混合して連結し、生成したプラスミドでＢ・ズブチリスＤＮ１８８５を形質転換し３゜°Ｃにてカナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）で選択した。得られた形質転換体の一つは９ＰＬＩ４８７（図２１）を含有していた。

ａｍｙｌ遺伝子の３′末端のフラグメントをプラスミドｐＤＮ１５２８（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、　Ｓ、らの１９９１年の文献）から、０．７ｋｂのＳａｌ　Ｉ　 −Ｈｌｎｄｌ［Ｉフラグメントとして切取り、Ｓａｌ　Ｉ　＋ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵｃ１９に連結し、生成したプラスミドで大腸菌ＳＪ２を形質転換し、アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）で選択した。このようにして得た形質転換体の一つはｐＳＪ９３２　（図２２）を含有していた。

ＢｇＩＩ［リンカ−を）ｌｉｎｄＩ［で消化したｐＳＪ９３２に挿入し、得られたプラスミドでＳＪ２を形質転換しもう一度アンビシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）で選択することによってプラスミドｐＳＪ９４８　（図２３）を得た。

１）ＰＬ１４８７の５．　ｌｋｂの旧ｎｄＩ［［フラグメントを、Ｈｉｎｄｌ［Ｉで消化したｐＳＪ９４８に連結し、得られたプラスミドでＢ・ズブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、３０℃にてカナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）で選択することによって、ｐｓＪ９８０　（図２４）を構築した。

最後ニ、ｐＳＪ１３５９　（７）　４．０ｋｂ（７）　ＢｇＩＩＩ７−ｙグメントを、ｐｓＪ９８０（７）５、６ｋｂのＢｇｌＩＩフラグメントに連結し、得られたプラスミドでＤＮ１８８５を形質転換し、３０”Ｃテカナマイシン耐性（１０ｕｇ／ｍｌ）　テ選択することによって、ｐｓＪ１３９１（図２５）を構築した。このプラスミドは、複製に対して温度感受性でカナマイシンとエリスロマイシンに対する耐性を与えるベクター上に、Ｂ・リヘニフォルミスα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）由来のプロモーターと上流領域（約０．４ｋｂ）、α−アミラーゼ／　ＣＧＴアーゼ融合遺伝子（ａｍｙＬ−ｃｇｔＡ）　、およびα−アミラーゼ遺伝子の３′領域（’　ａｍｙＬ）由来の約０．７ｋｂを含有している。

４、融合遺伝子のＢ・リヘニフォルミスへの転移と染色体への組込Ｂ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼ産生菌株を、原形質体形質転換法（Ａｋａｍａｔｓｕの１９８４年の文献）によッテ、ｐＳＪ１３９１　テ形質転換した。−回再生させたどころカナマイシン耐性のコロニーが単離し、α−アミラーゼとＣＧＴアーゼの両方を産生ずることが見出された。これら二つの酵素が産生じていることは次のようにして容易に認めることができる。すなわち振盪フラスコ中のＢＰＸ培地（国際特許出願公開第Ｗ０９１１０９１２９号）による培養物から得た培養上清液中のタンパク質を等電点電気泳動ゲル法（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ　ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍを用いる）で分離し、次いで１％の可溶性デンプンを含有するアガロースゲルを上にのせてヨウ素蒸気で染色することによって認めることができる。ＣＧＴアーゼの活性はＰＩ４．５によって検出し、α−アミラーゼの活性はＰＩ　８において検出した。

この形質転換体をそのプラスミドの内容について分析したところ、入ってくるプラスミドと染色体との間の組換えが起こったことが分かった。二重組換えによって、染色体のα−アミラーゼ（ａｍｙＬ）遺伝子とプラスミドがもっているａｍｙＬ　−ｃｇｔＡ融合遺伝子との交換がなされた結果、単離されたプラスミドはａｍｙＬ遺伝子を保有しくこのプラスミドで形質転換されたＢ・ズブチリスＤＮ１８８５はα−アミラーゼを産生した）、一方ａｍｙＬ　−ｃｇｔＡ融合遺伝子は染色体上に存在していた（図２６）。

ＴＹ培地（国際特許出願公開第Ｗ０９１１０９１２９号）中カナマイシンなしで菌株を増殖させることによって、自発的にそのプラスミドを失った菌株を単離した（ＳＪ１５９９．５Ｊ１６０３〜１６０７）。

Ｂ・リヘニフォルミスの元の形質転換体について、組換えを促進するため、染色体への組込みと続いてプラスミドの切取りを確実に行う実験を行った。元の形質転換体を、１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天（国際特許出願公開第Ｗ０９１１０９１２９号）上に５０″Ｃでプレートし、個々のコロニーを５０″Ｃで数回、再画線を行い、次いで各々をカナマイシンなしで３０″Ｃにて一夜連続してＴＹ培養物中で増殖させて、プラスミドを除去させた。元の５０°Ｃでの各コロニー由来のＫａｎａ”単離物をＢＰＸ振盪フラスコ中でインキュベートし、次いでα−アミラーぜまたはＣＧＴアーゼの産生を上記の等電点電気泳動ゲル法で分析して測定した。分析されたこれらのプラスミドなしの菌株はすべてＣＧＴアーゼまたはα−アミラーゼを産生じた。ＣＧＴアーゼを産生する単離物は例えば５Ｊ１５６１−１５６２．１５８０〜１５８３．１５８６〜１５９１および１５９５である。

５Ｊ１６０８と命名した一つの菌株は他の菌株よりも大量のＣＧＴアーゼを産生ずるようであった。

菌株５Ｊ１５６１．１５６２．１５９９．１６０６および１６０８をサザンプロット分析に付して、これらの菌株は染色体のａｍｙＬ遺伝子がａｍｙＬ　−ｃｇｔＡ遺伝子で置換されていることを確認した。

以下の試験結果は、ＢＰＸ入り振盪フラスコ中で６日間３７℃でインキュベートして生成したＣＧＴアーゼの活性を定量することによって得た（いくつもの実験で得た結果である。菌株の各グループ内の変動の主な原因は異なるバッチの振盪フラスコを使用したことである）。

菌株“　ＣＧＴアーゼの活性、任意単位５Ｊ１５６１〜１５６２．１５８０〜１５８３゜１５８６〜１５９＋、　１５９５．１５９９．１６０３〜１６０７　１〜７．５ＳＪ１６０８　２００〜２７５５、プロモーターの分析我々は、ａｍｙＬ−ｃｇｔＡ遺伝子をいずれも含有する菌株５Ｊ１６０８どその他の菌株のＣＧＴアーゼの産生量の大きな差が、ＣＧＴアーゼの発現に関与しているａｍｙＬプロモーターの差が原因であるの゛麻否かを試験した。

Ｂ・リヘニフォルミスの宿主菌株のａｍｙＬプロモーターの配列を配列番号、２に示す。

ＣＧＴアーゼを産生する多数のＢ・リヘニフオルミス菌株由来のプロモーター領域をＰＣＲ法（Ｓａｉｋｉらの１９８８年の文献）によって染色体ＤＮＡから増幅した。この場合、２０４〜２３３位の読取り下流（ｒｅａｄｉｎｇｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）からａｍｙＬプロモータまでに相当する一つのオリゴヌクレオチドおよび成熟ＣＧＴアーゼをコードするＤＮＡの５′未満と読取り上流（ｒｅａｄｉｎｇ　ｕｐｓｔｒｅａｍ）に相当するもう一つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。この第二のオリゴヌクレオチドの配列は５　’　−ＣＣＴＧＴＴＧＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧ−３’　（配列番号　４）であった。

各菌株由来の増幅ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切取り、次いてジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒらの１９７７年の文献）の配列決定プライマーとして、ＰＣＲ増幅に使ったのと同しオリゴヌクレオチドを用いて配列を直接決定した。

配列分析の結果から、プロモーター領域内の二つの点変異の一方もしくは両方が、観察されたＣＧＴアーゼの産生ｌの大きな差の原因であることが分かった。

菌株５Ｊ１５９９と１６０３〜１６０６はすべて低収量であるが配列番号：２に示すプロモーター配列をもっている。しかし高収量菌株の５Ｊ１６０８はＳＥＱ　ＩＤ＃ｌに示すプロモーター配列を含有している。

上記の差は、５５３位においてＳＪ］６０８がＴの代わりにＣを含有している場合、および５９３位において５ＪＩ６０８がＴの代わりにＡを含有している場合に起こる。

１）ＳＪＩ３５’９とｐｓＪ１３９１上に存在するａｍｙ　Ｌプロモーターの配列は、上記のＰＣＲ増幅法と配列決定法を用いて決定した。その結果、両方のプラスミドが配列番号＝１に示すプロモーター配列すなｉち５Ｊ１６０８のプロモーター配列と同一の配列を含有していることが分かった。

６　Ｂ・ズブチリスの染色体へのａｍｙＬ−ｃｇｔＡ融合遺伝子の組込みＢ・ズブチリスの染色体のｄａｌ領域に１コピーのａｍｙＬ　−ｃｇｔＡ融合遺伝子を含有する菌株を、Ｂ、　Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎの１９８６年の文献に記載されているのとほとんど同様にして構築した。１ｌＤＮ１３１６（図２８）は、マルチリンガ−の配向を除いてｐＤＮＩ３１３　（Ｂ、Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎの１９８６年の文献）と同一である。

ｐＤＮ３０２０（図２９）はｐＤＮ１３１６の誘導体であるが、次のようにして構築した。まず合成のｓｐｈ　１部位を含有するオリゴヌクレオチドリンカーをプラスミドｐＤＮ１３８０　（ＤｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎとＣｈｒｉＳｔｉａｎＳｅｎの１９８８年の文献のＥｃｏＲＩ部位に挿入してプラスミドｐＤＮ１６２０を得た。ｐＤＮＩ　６２０上に存在するＢ・ステアロサーモフィラス由来のマルトゲニックアミラーゼのプロモーター領域（ＰａｍｙＭ）　（約２００ｂｐのＢａｍＨＩ　−Ｓｐｈ　Ｉフラグメント上にある）を、Ｓｐｈ　Ｉ　−ＢａｍＨＩで消化したｐＵｃ１９に転移させてプラスミドｐＤＮ２９７７を得た。約２００ｂｐのＢｇｌｌ［−５ａｃＩフラグメント上のプロモーター領域をｐＤＮ２９７７から切取り、これをｐＤＮＩ３１６のポリリンカー領域中に挿入してプラスミドｐＤＮ３０２０を得た。

菌株ＤＮ１６８６は、ｄａｌ遺伝子（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎの１９８６年の文献）中に染色体欠失があるＤＮ１２８０の５ｐｏ−誘導体である。ＤＮ１６８６は伝統的な突然変異誘発法によってＤＮ１２８０から誘導し、以下の実験で宿主として使用した。

ａｍｙＬ　−ｃｇｔＡ融合遺伝子を、ｐｓＪ１３６０（図１９に示すｐｓＪ１３５９と同一）から４ｋｂのＢｇｌＩＩフラグメントとして切取り、ＢａｍＨＩで消化したｐＤＮ３０２０に連結し、得られたプラスミドでＤＮ１６８６を形質転換させクロラムフェニコール耐性（６ｔｔ　ｇ／ｍｌ）で選択してｐＳＪ１４４６（図３０）およびｐｓＪ１４４８（図３１）を得た。

次に、組込み菌株５Ｊ１４５４およびＳＪ！４５５はそれぞれ、ＤＮ１６８６をｐｓＪ１４４６およびｐｓＪ１４４８で形質転換し形質転換体を単離することによって得た。これらの形質転換体はＣＧＴアーゼを産生したがクロラムフェニコールに対して感受性であった。これらの菌株をＢＰＸの振盪フラスコ中３７°Ｃで６日間インキュベートしてそのＣＧＴアーゼ活性を測定した（実施例４と同様の任意単位）。

菌株　ＣＧＴアーゼ活性、任意単位５Ｊ１４５４　２１ＳＪ１４５５　１７実施例４と６で得た結果を比較すると、Ｂ・リヘニフォルミスは、ＣＧＴアーゼを製造するのに用いる宿主菌株としてビー・サチリスより存意に優れていることを示している。

引用文献Ａｋａｍａｔｚｕ、　Ｔ、、　Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ、　Ｊ、　（１９８４）、　Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｅｃｉｅｓ　ａｎｄ　ｔｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｆｕｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　４８．６５１−６５５゜Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ、Ｂ、、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、Ｌ、（１９８８）、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ　ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ　ｆｒｏｍ　ａ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ。

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Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、　Ｐ、Ｌ、、　Ｐｏｕｌｓｅｎ、　Ｇ、Ｂ、、　Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ、　Ｂ、　（１９９１）。

Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｓ、、５ｋｏｖ、Ｋ、Ｗ、、Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ、Ｂ、（１９９１）、Ｃｌｏｎｉｎｇ。

５ｅｑｕｅｎｃｅ、ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　１ｉｐａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ：　Ｌｉｐａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｈｏｓｔｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｓ　ｔｗ。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｅｎｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７３．　５５９−５６７゜Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ、　Ｓ、、　Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、　Ｂ、（１９８２ａ）、　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｍａｐ　ｏｆ　ｐｃ１９４．　ａ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｔｈａｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｅｓｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５０．　８１５−８２５゜Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ、Ｓ、、　Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、　Ｂ、（１９８２ｂ）、　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｍａｐ　ｏｆ　ｐＥ１９４．　ａ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｔｈａｔ　５ｐｅｃｉｆｉｅｓ　１ｎｄｕｃｉｂｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｍａｃｒｏｌｉｄｅ、ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ、ａｎｄ　ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ　ｔｙｐｅＢ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５０．　８０４−８１４゜Ｋｉｅｓｅｒ、Ｔ、（１９８４）、Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＣＣＤＮＡｆｒｏｍ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌ１ｖｉｄａｎｓ　ａｎｄ　［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、　ｐｌａｓｍｉｄ　１２゜１９−３６゜Ｍａｎｄｅｌ、　Ａ、、　ｌ（ｉｇａ、　Ａ、　（１９７０）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５３．１５９−１６２゜Ｍｏｔｔｅｓ、Ｍ、、Ｇｒａｎｄｉ、Ｇ、、Ｓｇａｒａｍｅｌｌａ、Ｖ、、Ｃａｎｏｓｉ、Ｕ、、Ｍｏｒｅｌｌｉ。

Ｇ、、　Ｔｒａｕｔｎｅｒ、　Ｔ、Ａ、　（１９７９）、　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆ　ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　ａｎｄ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ　ｆｏｒｍｓ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　１ｎＬａｃｅｙ、Ｒ，、Ｃｈｏｐｒａ、１．　（１９７４）、Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ａＭｃＫｅｎｚｉｅ、　Ｔ、、　Ｈｏ５ｈｉｎｏ、　Ｔ、、　Ｔａｎａｋａ、　Ｔ１．５ｕｅｏｋａ、　Ｎ、　（１９８６）、　Ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐＵＢ１１０二　Ｓｏｍｅ　５ａｌｉｅｎｔ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　１ｎｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｅｑｕｌａｔｉｏｎ、　Ｐｌａｓｍｉｄ　１５゜９３−１０３゜Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、、　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，（１９７７）、　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７４、　５４６３−５４６７．５ａｉｋｉ、　Ｒ，に、、　Ｇｅ１ｆａｎｄ、　Ｄ、Ｈ，、５ｔｏｆｆｅ１．　Ｓ、、　５ｃｈａｒｆ、　Ｓ！、。

Ｈｉｇｕｃｈｉ、　Ｒ，、Ｈｏｒｎ、　Ｇ、Ｔ、、　Ｍｕｌｌｉｓ、に、Ｂ、、　ｔｉｒｌｉｃｈ、　Ｈ，Ａ、　（１９８８）。

Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ａｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．　４８７−４９１゜Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、、Ｃｏｎｔｅｎｔｅ、Ｓ、、Ｄｕｂｎａｕ、Ｄ、（１９７８）、ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎＹａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、（１９８５）、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭ１３　ｐｈａｇｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　５ｔｒａｉｎｓ：　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍ１３　ｍｐ１８　ａｎｄ　ｐＵｃ１９　ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｇｅｎｅ　３３．　１０３ −１１９゜Ｙａｓｂｉｎ、Ｒ，Ｅ、、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｇ、Ａ、、Ｙｏｕｎｇ、Ｆ、Ｅ、（１９７５）、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１２１．　２９６−３０４゜配列表（１）一般情報（ｉ）出願人：（Ａ）名Ｂ　：　Ｎ０ＶＯＮ０ＲＤＩＳＫ　Ａ／５（Ｂ）ストリート：　Ｎｏｖａ　Ａ１１ｅ（Ｃ）市：　Ｂａｇｓｖａｅｒｄ（Ｄ）国：デンマーク（Ｅ）郵便番号（ＺＬＰ）　：　ＤＫ−２８８０（ｉｉ）発明の名称：バシラス・リヘニフォルミス中に嫌気性遺伝子を発現させる方法（ｉｉｉ）配列の数：４（ｉｖ　）通信宛先：（Ａ）受信人：　Ｎ０ＶＯＮ０ＲＤＩＳＫ　Ａ／Ｓ（Ｂ）ストリート：　Ｎｏｖｏ　Ａ１１ｅ（Ｃ）市：　Ｂａｇｓｖａｅｒｄ（Ｄ）国：デンマーク（Ｅ）　ＺＬＰ　：　２８８０（ｖ）コンピューターの読取り可能な形態。

（Ａ）媒体の形態：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔ　Ｉｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０゜Ｖｅｒｓｉｏｎ　１１．２５　（ＥＰＯ）（ｖｉ　）原出願のデータ：（Ａ）出願番号：　ＰＣＴ／ＤＫ９１１００３４４（Ｂ）出願日：　１９９１年１１月１４日（■）弁護士／弁理士の情報：（Ａ）姓名：　Ｔｈａｌｓｏ−Ｍｅｄｓｅｎ、　Ｂ：ｒｇ二ｔ（Ｂ）参照／摘要番号：　３６５３．２０４−　ＷＯ（ｖｉ　）電気通信の情ｉｉ１　：（Ａ）電話：　＋４５４４４４８８８８（Ｂ）テ１ノファックス：　＋４５４４４９３２５６（２）配列番号：１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６１６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）　ｌｌＱ数ニ一本鎖重鎖）トボロノー二線状（ｉｉ）分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）起源。

（Ａ）微生物：バシラス・リヘニフォルミス（ｘｉ）配列の表示、配列番号＝１＝（３）配列番号、２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６１６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ　）起源：（Ａ）微生物：バシラス・リヘニフォルミス（Ｂ）菌株：　５Ｊ１６０８（ｘｉ）配列の表示、配列番号：２： πλχ■請Ｇαヱ℃ロ豆臥αロπαポ頁コフＣり刀の℃肛ハ醍りＣ罠ごバエ　２４０〕Ｏ〕０（２）配列番号：３の情報。

（ｉ）配列の特徴：（Ａン長さ二６６塩基灯（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　線状（ｊｊ）分子のｆｆＩＩＡ　：　ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源。

（Ａ）微生物二合成（ｘｌ）配列の表示：配列番号・３：（２）配列番号：４の情報。

（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長さ、２０の塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖の数、−重鎖（Ｄ）トポロジー・線状（ｉｉ）分子の種類：　ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）起源（Ａ）微生物・合成（ｘｉ）配列の表示、配列番号：４゜ αコ毛ＴｎＸ論Ｔ　’ＭＹＡＣバ芙Ｃ２０Ｆｉｇ、　３Ｆｉｇ、　４舐Ｆｉｇ、　７Ｆｉｇ、　８Ｆｉｇ、１０Ｆｉｇ、１１Ｆｉｇ、１５Ｆｉｇ、１６Ｆｉｇ、１７Ｆｉｇ、１９母Ｆｉｇ、　２０Ｆｉｇ、　２１Ｆｉｇ、　２２Ｆｉｇ、　２３Ｆｉｇ、　２４Ｆｉｇ、　２５染色体染色体Ｆｉｇ、　２６Ｆｉｇ、　２ＢＦｉｇ、　３１補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年５月ｌＬ日

Claims

【特許請求の範囲】

１．嫌気性および／または好熱性の微生物由来の遺伝子を含有し、かつその遺伝子の転写を実施できるプロモーター配列が先行しているＤＮＡ配列で形質転換されたバシラス・リヘニフォルミスの適切な菌株を、適切な条件下で培養して遺伝子を発現させることからなる、嫌気性および／または好熱性の微生物由来の遺伝子をバシラス・リヘニフォルミス内で発現させる方法。
２．プロモーターが、Ｂ・ステアロサーモフィラスのマルトゲニックアミラーゼ、Ｂ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼ、Ｂ・アミロリクファシエンスのα− アミラーゼもしくはＢ・サチリスのアルカリ性プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するか、またはＢ・ブュミルスのキシロシダーゼのプロモーターもしくはハイブリッドＳＰＯＩ／ｌａｃプロモーターである請求項１に記載の方法。
３．プロモーターが、Ｂ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼのプロモーターの変異体であって、下記のＤＮＡ配列：【配列があります】（配列番号：１）またはその機能誘導体に含有されている請求項２に記載の方法。
４．好熱性微生物がアーケバクテリウム属の菌株である請求項１に記載の方法。
５．前記好熱性微生物由来の遺伝子が、ピロコッカス属の種の細菌のプルラナーゼまたはα−アミラーゼをコードする遺伝子である請求項４に記載の方法。
６．前記嫌気性微生物が好熱性である請求項１に記載の方法。
７．前記の好熱性でかつ嫌気性の微生物由来の遺伝子が、テルモアネロバクター属の種の細菌もしくはテルモアネロビウム属の種の細菌のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、またはテルモトガ属の種の細菌のグルコースイソメラーゼをコードする遺伝子である請求項６に記載の方法。
８．嫌気性および／または好熱性の微生物由来の遺伝子を含有するＤＮＡ配列が自己複製発現ベクター上に存在している請求項１に記載の方法。
９．嫌気性および／または好熱性の微生物由来の遺伝子を含有するＤＮＡ配列がＢ・リヘニフォルミスの宿主細胞の染色体上に存在している請求項１に記載の方法。
１０．前記ＤＮＡ配列が、Ｂ・リヘニフォルミスの宿主細胞の染色体上に２個以上のコピーで存在している請求項９に記載の方法。
１１．前記ＤＮＡ配列が、Ｂ・リヘニフォルミスの宿主細胞の染色体上の、Ｂ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼの遺伝子の部位に存在し、Ｂ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼの発現シグナルによって発現される請求項９かまたは１０に記載の方法。
１２．発現された遺伝子の産物が次いで培養物から回収される請求項１に記載の方法。
１３．Ｂ・リヘニフォルミスの宿主細胞がプロテアーゼおよび／またはアミラーゼ欠乏性である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．ＣＧＴアーゼをコードする遺伝子を含有しかつ前記遺伝子の転写を実施することができるプロモーター配列が先行しているＤＮＡ配列で形質転換されたＢ・リヘニフォルミスの適切な菌株を、ＣＧＴアーゼを産生するのに適切な条件下で培養し、生成したＣＧＴアーゼを培養物から回収することを含んでなる、Ｂ・リヘニフォルミス中にシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）の製造方法。
１５．プロモーターが、Ｂ・ステアロサーモフィラスのマルトゲニックアミラーゼ、Ｂ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼ、Ｂ・アミロリクファシエンスのＢＡＮアミラーゼもしくはＢ・ズブチリスのアルカリ性プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するか、またはＢ・ブュミルスのキシロシダーゼのプロモーターもしくはハイブリッドＳＰＯＩ／ｌａｃプロモーターである請求項１４に記載の方法。
１６．プロモーターが、Ｂ・リヘニフォルミスのαアミラーゼのプロモーターの変異体であって、下記のＤＮＡ配列：【配列があります】（配列番号：１）またはその機能誘導体に含有されている請求項１５に記載の方法。
１７．ＣＧＴアーゼをコードする遺伝子が、テルモアネロバクター属の種の細菌、テルモアネロビウム属の種の細菌、バシラス・マセランス・バシラス・サーキュランス、バシラス・ステアロサーモフィラス、バシラス・メガテリウム、バシラス・オーベンシス、好アルカリ性バシラス属の種の細菌、ミクロコッカス・ルテウス、ミクロコッカス・バリアンスまたはクレブシエラ・ニューモニエ由来の遺伝子である請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．ＣＧＴアーゼをコードする遺伝子が自己複製発現ベクター上に存在している請求項１４に記載の方法。
１９．ＣＧＴアーゼをコードする遺伝子がＢ・リヘニフォルミスの宿主細胞の染色体上に存在している請求項１４に記載の方法。
２０．前記遺伝子が、Ｂ・リヘニフォルミスの宿主細胞の染色体上に２個以上のコピーで存在している請求項１９に記載の方法。
２１．前記遺伝子が、Ｂ・リヘニフォルミスの宿主細胞の染色体上の、Ｂ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼの遺伝子の部位に存在し、Ｂ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼの発現シグナルによって発現される請求項１９または２０に記載の方法。
２２．Ｂ・リヘニフォルミスの宿主細胞がプロテアーゼおよび／またはアミラーゼ欠乏性である請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。