JPH07503255A - ヘリコバクター感染に対するウレアーゼを基礎とするワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 へりコバフタ−感染に対するウレアーゼを基礎とするワクチン本発明はヒトを含 む哺乳類の胃内感染の予防ならびに治療に関する。さらに詳しくは、本発明はヒ トを含む哺乳類のへりコバフタ−感染の予防ならびに治療のための使用に適した ワクチン、及び胃疾患、その帰結である例えば慢性胃炎あるいは消化性潰瘍に苦 しむ人の治療、及び胃癌の予防方法に関する。

茸！ ヒトの胃壁（ｇａｓｔｒｉｃ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）へのへりコバフタ−感染 は胃炎を引き起こすが、これは消化性潰瘍と胃リンパ腫（ｇａｓｔｒｉｃ　ｌｙ ｍｐｈｏｍａ）の主要な展開要因である。またこれは、胃癌展開のリスクファク ターともなり得る［１−３］。最も多い感染要因（ａｇｅｎｔ）はへりコバフタ −・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）であり、ずっと下がる が次に多いのはヘリコバフタ−・ヘリマニイ０１ｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｈｅｉ １ｍａｎｉｉ）である。Ｈ，ピロリはスレンジー（ｓｌｅｎｄｅｒ）　Ｓ型のグ ラム陰性微生物であるが、それは通常、成人および子供の胃生検に際して胃炎も しくは消化性潰瘍の組織証拠と共に回収される。Ｈ，ピロリと胃十二指腸疾患と の因果関係を示す証拠は、ヒトのボランティア、潰瘍ならびに胃癌患者、ノトバ イオテインク・ビッグ類（ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃ　ｐｉｇｓ）　、及び無菌薩 歯Ｑ　（ｇｅｒｍ　ｆｒｅｅ　ｒｏｄｅｎｔｓ）の研究から（るものである。病 理学については、コツホの仮説が、以前に感染度のない個体に組織学的に確認さ れた胃炎を作出すること、および続く生育微生物の消費［４−１１］、及び胃炎 の消散によりＨ，ピロリを根絶やしにする処置によって、また消化性潰瘍疾患で は再発率の減少［１２］によって満足された。

多くの抗菌剤に対してイン・ビトロでは感受性があるにも拘わらず、イン・ビト ロで抗菌剤によって、定着したＨ、ピロリ感染を根絶するのはしばしば達成困難 である［１３］。この微生物は胃壁上や胃内のくぼみ中に粘膜質の被覆に覆われ て存在していることが見いだされた。これらは、たとえ抗菌剤を高用量で経口投 与しても適切な抗菌性レベルに達するに至れない場所である。現在では、多くの 権威者が“トリプル・セラビー”、即ちビスマス塩剤をテトラサイクリンおよび メトロニダゾールのような薬剤と組み合わせて２−４週間投与することを推奨し ている。しかしながら、この化学療法、或いは他の化学療法の効果は最適以下（ Ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）に留まる。さらに、この処置は深刻な逆の薬剤反応を誘 発することがある。

現時点では、胃内の粘膜系免疫システムの役割については、少ししか知られてい ない。正常な胃内空洞中における免疫グロブリン（Ｔｇ）産生細胞の分布は、Ｉ ｇＡプラズマ細胞が全プラズマ細胞数の８０％を占めていることを示唆している 。加えて、胃内空洞中に存在するプラズマＩｇＡ細胞の数は他の粘膜類に匹敵す る［１４．１５］。ヒト［１６］及び動物モデル［８，１０１についての多数の 研究は、特殊なＩｇＧやＩｇＡが血清中や胃分泌液中でへりコバフタ−感染に対 して反応することを示している。しかしながら、局所性或いは組織的な免疫応答 を引き起こすにも拘わらず、Ｈ，ピロリ感染症が長年にわたる慢性的感染による ものと思い込んだ見解は、免疫性戦略の発展を勇気づけるものではなかった。

リー等は、Ｈ，ピロリにご（近縁のバクテリアである、ヘリコバフタ−・フエリ ス（［１ｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｆｅｌｔｓ）による無菌謡歯頚動物の感染能 力、および再現性のあるドキュメント（ｄｏｃｕｍｅｎｔ）組織学的胃炎につい て報告した［９．１０］。それ以来、このバクテリア−宿主の組み合わせは、へ りコバフタ−媒介胃炎及びその発症因子研究の良いモデルとして受け入れられて きた［１７］。ツイン等は、Ｈ。

ピロリにコレラ毒素アジュバントをプラスした粗製の細胞溶解質による個々の経 口免疫処置（ｉ關ｕｎｉｚａｔｉｏｎ）は、マウス及びケナガイタチに激しい胃 腸内１ｇＡ抗−圧ビロリ反応を引き起こすことを示した［１３］。さらに、チェ ン等およびツイン等は、最近、Ｈ，フェリスの粗製細胞溶解＠　（ｌｙｓａｔｅ ）による経口免疫処置はマウスのＨ，フエリス感染を防御することを報告した［ ２１．２２］。しかしながら、この防御を引き起こす原因となる抗原の正確な性 質は、まだ確定するに至っていないし、いかなる情報も、この病原体に対する防 御（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）をもたらすＨ，フエリスの防御性抗原（群）が、他 のヘリコバフタ一種にまで拡がる交差反応性防御をももたらすものかどうかを示 唆していない。

我々は、初めてＨ，ピロリおよびＨフエリス超音波処理物（ｓｏｎｉｃａｔｅｓ ）とこれらのＨ，ピロリに対する抗体の幾つかが、Ｈ，フエリスに対して交差反 応を示すこと、及びその逆もあることを実証した［２４，２５１゜これらの交差 反応性の根拠は知られていなかった。

既知の異なるウレアーゼアミノ酸配列間に存在する相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ） に基づき、ウレアーゼがＨ，ピロリに対するワクチンとして使い得るのではない かということが提案された［２６］。にもかかわらず、交差反応性は常に起こる とは限らなかった。グオおよびリウは数年前、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏ ｔｅｕｓ量１ｒａｂｉｌｉｓ）　、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　 ｖｕｌｇａｒｉｓ）　、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　 ｒｅｔｔｇｅｒｉ）のウレアーゼが、お互いに交差反応性を示すが、ナタマメ（ ｊａｃｋ　ｂｅａｎ）とモルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ　ｍｏ ｒｇａｎｉｉ）のウレアーゼは、他の上記三種のウレアーゼとは免疫学的に異な ることを示した［２３］。たとえ、Ｈ，ピロリウレアーゼとヘリコバフタ−ウレ アーゼ類との成る種の抗原性交差反応性が合理的な仮説であったとしても、我々 が、幾つかのＨ。

フエリスモノクローナル抗体が、Ｈ，ピロリ　ウレアーゼと交差反応したことを 示すまでは、これが真実であったことを実証するデータは何も存在しなかった［ ２５］。Ｊ、パッポはさらに、Ｈ，フェリスに感染させたマウス力用、ピロリウ レアーゼと交差反応するが、ナタマメウレアーゼとは反応しない抗体を産生ずる ことを実証した（Ｊ、パッポ、未発表データ、１９９３年）。

Ｈ，ピロリ感染に対するワクチンとしてのＨ，ピロリ　ウレアーゼ、もしくは近 縁のウレアーゼの使用が、Ａ、ラバインにより、以前ＥＰＯ３６７，６４４で提 案されている［２８］。しかしながら、その出願はウレアーゼを用いるいかなる へりコバフタ−感染に対するいかなる哺乳類のワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔ ｉｏｎ）の証拠も含んでいない。

さらに、他のバクテリアのウレアーゼとの配列相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、 Ｈ，ピロリ感染に対するワクチン候補としてのウレアーゼの使用を支持したかも しれないが、ヒトのＨ，ピロリ感染に関する現知見は確実に否定的であろう。第 一に、感染個体は、しばしばウレアーゼに対し強力な抗体反応を上昇させるとい う事実にもかかわらず、抗ウレアーゼ免疫応答は感染のクリアランス（ｃｌｅａ ｒａｎｃｅ）または制御（ｃｏｎｔｒｏｌ）をもたらさない。第二に、圧ピロリ は細胞外にウレアーゼを搬出し、その表面からそれを脱落させ得る［１９．２０ １゜このように、ウレアーゼは防御的粘膜系免疫応答（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　 ｍｕｃｏｓａｌ　ｉａ＋＋ｅｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の進展に対する適切な ターゲットを表すものではない。事実、粘膜系免疫防御は、主として分泌（ｓｅ ｃｒｅｔｏｒｙ）　Ｉ　ｇＡによって媒介されるものと思われ、その凝固活性は 認識された抗原がターゲット病原体により脱落させられ、そのため防御性抗体に 対し餌として作用するとき減損させられるだろう。第三に、ウレアーゼは組織中 の壁細胞に対し毒性があるように思われ、粘液質の減成（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏ ｎ）及びイン・ビポの消化性潰瘍化においである働きをしているのではないかと 疑われてきた。このように、抗原としてのその使用は毒性的であり得る。

にもかかわらず、我々はこの抗原が、もし以下の前提があれば、効果的なワクチ ンになり得る可能性のあることを論証した。即ち：第一に、それを経口的に十分 に高用量で投与し自然に起こるよりもずっと強い免疫応答を誘起させた場合、 第二に、産生された抗原の量が、脱落するものも脱落しないものも含めたすべて のウレアーゼを結合するのに十分なほど大である場合、第三に、ウレアーゼの無 毒性であったサブユニットもしくは成る分子種（ａ　５Ｏ１ｅｃｕｌａｒ　５ｐ ｅｃｉｅｓ）を用いた場合。

要するに、Ｈピロリで誘発されるヒトの胃感染に対する効果的な治療及び防御は 依然として必要とされている。最近のデータはこの感染に対抗するワクチンを産 み出す可能性を示唆しているが、安全で効果的なワクチンに取り込まれる、■１ 　ピロリの全ての菌株に共通する、確認された抗原（群）を明瞭に同定するまで には至っていない。

本発明では、我々はワクチン候補として、Ｈ，ピロリのウレアーゼ抗原を同定し 、動物モデルでその有効性を実証した。これらの結果は、自然界におけるへりコ バフタ−感染の歴史に照らして予想外のものであった発明の要約 我々は、へりコバフタ−菌体表面上もしくはその近辺に現出（ｄｉｓｐｌａｙ） 　しているウレアーゼ・エピトープ（ｕｒｅａｓｅ　ｅｐｉｔｏｐｅ）を利用し 、またそれらをワクチンのターゲットとして用いることにより、胃腸管における へりコバフタ−感染に感受性のある哺乳類に免疫性（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を誘起 できることを見い出した。この免疫性は、天然のウレアーゼによる免疫処置によ り誘起できるが、酵素的に非活性で、従って無毒型のものとして得られた、組換 ウレアーゼ・サブユニット（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｕｒｅａｓｅ　５ｕｂｕ ｎｉｔ）でも誘起できる。本発明は、哺乳類の粘膜表面にポリアミノ酸製剤、即 ち、ペプチド類および／またはタンパク質類と適当なアジュバントとの混合物を 投与することにより、へりコバフタ−感染に対する免疫性を誘起させる方法を提 供するものである。このポリアミノ酸製剤は感染するヘリコバフタ−菌体に内生 ずるウレアーゼ酵素に特徴的な、かつウレアーゼによって現される複数のエピト ープを与える（ｐｒ６ｓｅｎｔｓ）ものである。ポリアミノ酸製剤の投与は経口 ルートで行うことができる。

この製剤の活性成分は天然のもしくは生化学的に合成したエピトープ類を含み得 るし、また各種の形態を取り得る。可能性のある製剤の非限定的リストは、純化 された、天然物由来のもしくは組換法で製造した、細菌或いは他の起源のウレア ーゼ製剤、ウレアアーゼ消化物、ウレアーゼ・エピトープ類を含む融合蛋白、ウ レアーゼ酵素の先端切除型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆｏｒｍｓ）　、あるいはウ レアーゼのアミノ酸配列と相同性のある（ｈｏ■ｏｌｏｇｏｕｓ）ペプチド類を 含む。免疫性の発生が、感染しようとしているヘリコバフタ−菌体に結合してい る体液性および／または細胞性免疫応答の感応（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）に依存す ることから、好適な製剤は、感染する菌体に内生のウレアーゼのエピトープに最 も良く似せて複写したものである。

例えば、Ｈ，ピロリのウレアーゼのエピトープを現出する製剤が、Ｈ，ピロリに 感受性のあるヒトに投与するのに適している。しかしながら、本発明の重要な態 様によれば、他種ウレアーゼが使用出来ることを見い出した。例えば、我々はマ ウスのＨフエリス感染がｈ、ピロリ由来のウレアーゼの投与によって防御出来る ことを示した。

本発明の一態様によれば、哺乳動物宿主中に、ヘリコバフタ−感染に対する防御 免疫応答を誘起する方法が提供され、該方法によれば、そのような防御免疫応答 を誘起し得る、免疫学的に有効量のウレアーゼ抗原、好ましくはＨ，ピロリ　ウ レアーゼもしくはＨ，ピロリウレア−ゼロサブユニットが、宿主の粘膜表面に投 与される。

本発明の他の態様によれば、宿主中にへりコバフタ−感染に対する防御免疫応答 を誘起し得るウレアーゼ抗原、好ましくはＨ，ピロリウレアーゼもしくはＨ。

ピロリウレア−ゼロサブユニットの有効量を、薬学的に許容できる担体もしくは 希釈剤と共に含んで成る、ヘリコバフタ−感染の防御に適したワクチン組成物が 提供される。

本発明の別の態様によれば、へりコバフタ−感染に対する防御免疫応答を誘起し 得るウレアーゼ、好ましくはＨピロリウレアーゼあるいはＨ，ピロリウレア−ゼ ロサブユニットで免疫処置した宿主中に産生ずる、ウレアーゼ特異的抗体を、宿 主の粘膜表面に、免疫学的に有効量投与することを含んで成る、哺乳類宿主にへ りコバフタ−感染に対する受動的防御能を付与する方法が提供される。

図面の簡単な説明 本発明は添付図面、そのうち図１から図６は、表１から表６に記載した結果を図 示したものである、に基づいてさらに説明される。

発明の詳細な説明 マウスは、へりコバフタ−感染に対する免疫応答の研究用に評価が一般的に受け 入れられている動物モデルであるが、本発明者らは、Ｈ，ピロリウレアーゼのエ ピトープを表出するポリアミノ酸製剤を、マウスに経口投与すると、マウス中の Ｈ，フエリスに対する防御免疫学的応答を上昇させることを見い出した［９］。

この防御免疫応答の効果は、病原体によって攻撃されたとき、免疫処置した動物 が受ける感染の影響が、非免疫処置動物と比べて大きく減少することである。さ らに、本発明者らは、酵素的に非活性な組換タンパク質として産生されたＨ、ピ ロリウレア−ゼロサブユニットを用いてマウスを経口免疫処置すると、マウス中 のＨ，フエリスに対する防御免疫学的応答を上昇させることを見い出した。この 防御免疫応答の効果は、免疫処置した動物が病原体の攻撃を受けたとき、感染の 影響が、同じく感染させられた非免疫処置動物と比べて大きく減少することでも ある。

このように、第一の態様では、本発明は、哺乳動物宿主にヘリコパクター感染に 対する防御免疫応答を付与する方法を提供するものである。この方法は、ヒトを 含む哺乳類の粘膜表面に、そのような防御免疫応答を付与し得る有効量のウレア ーゼ抗原、好ましくはＨ，ピロリウレアーゼを投与する段階を含んで成るもので ある。

第二の態様では、本発明は、哺乳類宿主にへりコバフタ−感染に対する防御免疫 応答を付与する方法を提供するものである。この方法は、ヒトを含む動物の粘膜 表面に、そのような防御免疫応答を付与し得る酵素的に非活性な組換ウレア−ゼ ロサブユニット抗原、好ましくは組換Ｈ，ピロリウレアーゼＢサブユニットを、 免疫学的に有効量投与する段階を含んで成るものである。

本発明はまた、その範囲中に、ヒトを含む哺乳類のへりコバフタ−感染に対する 処置あるいは予防をも含むものであって、ヘリコバフタ−感染に対し防御免疫応 答を付与し得るウレアーゼ、もしくはそのサブユニットの免疫学的有効量が、患 者の粘膜表面に投与される場合を含む。好ましくは、ウレアーゼはＨ，ピロリウ レアーゼもしくはＨ，ピロリウレア−ゼロサブユニットであり、このウレアーゼ は単独であるいはヒドロキシル化すン酸カルシウム、例えばヒドロキシアパタイ トと連結して投与できる。さらに、Ｈ，ピロリウレアーゼを粘液性アジュバント 、コレラ毒素のＢサブユニット、ムラミルジペプチド、あるいは他の同様のアジ ュバント類と一緒に投与するのが好ましい。いかなる理論にも基づくわけではな いが、本発明者らは、ウレアーゼ抗原、あるいはそのＢサブユニットを粘膜表面 に投与することが、共通の粘膜免疫系、およびおそらくは、胃粘膜中の免疫応答 を含み、胃分泌液中にヘリコバフタ−感染を防ぐＨ，ピロリに特異的なＩｇＡ抗 体が出現することを含む局所部位を刺激するものと信じている。動物モデル中で ヒト用のワクチン候補について前臨床試験を進めることは通常のやり方であるこ とから、本発明の方法論は、ヒトの、特に消化性潰瘍、胃炎、悪性胃疾患及びＨ 。

ピロリおよび／またはＨ，ハイルマニイの存在によって発生する他の症状の予防 及び治療に有効であると信じられる。

八−細菌培養物およびウレアーゼ精製 研究用に用いたＨ、ピロリの菌株は十二指腸潰瘍患者由来のものであり、ＢＨｌ 　（Ｂｒａｉｎ−４１ｅａｒｔ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）寒天プレート上で同質に継 代培養されて来たものである。Ｈピロリは適当な培地、典型的には０．２５％の 酵母エキスと、１０％のウシ胎児血清を含み、さらに０４％カンピロバクタ−（ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）に選択性補体（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｌ ｅｍｅｎｔ）　（スキロー・サブルメント、オキソイド６９）を補ったＢＨＩ培 地中で培養した。この細菌は微好気性条件下にビン中３７℃で一夜インキユベー トした。このビンを次いで密閉し、３７℃で２乃至３日間振盪して液体培養物を 得た。培養物はＢＨＩと０．２５％の酵母エキスおよび５％の羊血よりなる寒天 プレート中、３７℃３日間微好気性条件下でも調製できる。細菌の量は、６６０ ｎｍでのＢＨＩ溶液の光学密度により測定したが、１光学書度単位（ｏｎｅ　ｏ ｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｕｎｉｔ）は１０８個のバクテリアに相当した 。寒天プレート上の培養物はまず１５４ｍｍＮａＣ１中に分散させた。

ウレアーゼ・エピトープ類を表すポリアミノ酸の好適な最近の入手源は、精製し たウレアーゼ、例えば下記のように改変した、ダン等、ジャーナル・オブ・バイ オロジカル・ケミストリー、２６５巻、９４６４−９４６９頁、の−膜性に従っ て得られたＨ、ピロリ　ウレアーゼである。培養にひきつづき、このＨ，ピロリ を水中に集め、渦巻き状に旋回させ、さらに再び旋回させて上清を産生じた。Ｈ 。

ピロリのウレアーゼ活性（下記迅速ウレアーゼテストで測定）を含有する溶液は 、次いでＣＬ−６Ｂサインングカラム上でクロマトグラフかけ、強いウレアーゼ 活性を現す分画を集め、−夜透析し、再びアニオン交換ゲル上でクロマトグラフ にかけた。各分画は、ＮａＣ１が増加する緩衝液で溶出し、集めた強いウレアー ゼ活性をもつ分画群を個別にＳＤＳゲルに供給したのちクーマッノイ（Ｃｏｏｃ ａａｓｓｉ）染色を行った。分子量約６３と約２９ｋＤａ（キロダルトン）に相 当する二つの明白なバンドがウレアーゼと同定された。ウレアーゼを含む分画は 集めて、純度９５％乃至９９％の範囲の精製したＨ、ピロリ　ウレアーゼを得る 。

Ｂ−Ｈ，ピロリ由来の精製ウレアーゼによる経口免疫処置抗原性素材（ａｎｔｉ ｇｅｎｉｃ　ｍａｔｅｒｉａｌ）として、記述されているようにして得た精製Ｈ ピロリ　ウレアーゼを用いるのが好ましいのであるが、抗原性素材として、天然 に存在するかまたは組換ＤＮＡ技術により得られるいずれのウレアーゼやウレア ーゼのサブユニットを用いることも可能であること、また消化したそれらの断片 、断片や全ウレアーゼを含んで成る融合タンパク質類、短縮したウレアーゼ構成 物、あるいはへりコバフタ−感染に対する防御免疫応答を付与し得るウレアーゼ ・エピトープを表す他のペプチドもしくはタンパク質製剤（下記参照）も同様に 用い得ることが理解されよう。このように、Ｈピロリ　ウレアーゼに関して実質 的な相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）をもち、へりコバフタ−に対する交差防御免疫 応答を高める効果のあるウレアーゼを使用することが可能である。そのようなウ レアーゼの例は、Ｈピロリウレアーゼと約７０％の相同性をもつナタマメ　ウレ アーゼである。本発明は、それ故に、完全なウレアーゼの使用に限定されるもの ではなく、ウレアーゼ・エピトープを現出し、へりコバフタ−感染に対する宿主 中の防御免疫応答を誘起するのに有効ないかなるポリアミノ酸製剤の使用もその 範囲に入る。典型的には、Ｈ，ピロリウレアーゼに関して７０−９５％の相同性 、例えば８０−９０％の相同性を有するウレアーゼが、本発明においてウレアー ゼ抗原として使用できる。

有用可能性のあるウレアーゼ製剤源の非制限的リストには、異なるへりコバフタ 一種の内生ウレアーゼ酵素類、クレブシェラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ ｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）やプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍ ａｉｒａｂｉｌｉｓ）のような他の細菌由来のウレアーゼ、および同様にこれら のウレアーゼ類がＨ，ピロリ　ウレアーゼと交差反応性エピトープを共有する条 件下ではいかなる他のウレアーゼもが含まれる。上記した全菌体のウレアーゼ遺 伝子は全タンパク質として、あるいはそれらの部分として、組換ウレアーゼ遺伝 子を発現するための有用可能性のある手段を代表する。

有用可能性のあるウレアーゼ製剤の非限定的リストには、精製ウレアーゼ（入手 源は前述のとおり）から生じたペプチド類が含まれる。それらは物理的および／ または化学的開裂操作（即ちＣｎＢｒ）および／またはタンパク質分解開裂（プ ロテアーゼ、即ちＶ８−プロテアーゼ、トリプシンまたは他のものを用いて）、 もしくは化学的に合成したウレアーゼと連続するエピトープ群を共有するペプチ ド類も含む。

他の可能性のある有用なエピトープ源は、抗ウレアーゼ抗体類によるスクリーニ ングの結果として、ウレアーゼとの交差反応性により同定されたエピトープ類を 含む。これらのペプチド類は、天然に存在するペプチド類であっても、化学合成 により得られたペプチド類であっても良い。更に、そのようなペプチド類は組換 ランダム・オリゴヌクレオチド（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｒａｎｄｏｍ　ｏｌ ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の発現によるものであってもよい。

他の可能性なる有用なエピトープ源はウレアーゼに対する抗−イディオタイプ抗 体類の発生によるものとしてのウレアーゼに類似のエピトープ類を含んでいる。

そのような、抗−イディオタイプ抗体類は、いかなる免疫能のある宿主中に発生 したものでも、ウレアーゼと構造的な相同性を共有する抗ウレアーゼ抗体に対抗 する抗体発生を目的として、この宿主の抗ウレアーゼ抗体類での免疫処置により 得られた。

本文中で焦点となる議論は、Ｈ，ピロリ（セクションＢ）により天然に生成する ウレアーゼの使用についてである。しかしながら、所望の防御免疫応答を付与し 得る上記したウレアーゼもしくはサブユニットあるいはそれらの構成物が、当業 者に良く知られている組換ＤＮＡ技術によっても製造できることが評価されるだ ろう。個々の製剤の有効性は動物モデルを用いる通常の投与、候補ワクチンの経 口投与、ならびに下記手順と実質的に同一のあるいは類似のプロトコールを用い る病原体による攻撃により決められるだろう。

下記表１および表２ならびに図１−図５は、マウスを経口的に、精製したＨピロ リ　ウレアーゼで免疫処置した場合の結果を記載したものである。この第１実験 では、Ｈ，ピロリ抗原の投与はセクションＡて記載したようにして精製したＨ、 ピロリウレアーゼをマウスにヒドロキシアパタイト結晶と併せて、Ｍ細胞の結合 ならびに吸収を高めるキャリヤーとして経口的に投与して行った。コレラ毒素（ ／グマ）を粘膜性アジュバントとして与えた。この実験では、雌ＳＰＦ　ＢＡＬ Ｂ／ｃ６週齢マウス群を０，７．１４および２１日目にＩＩＩｇのコレラ毒素ア ジュバントと組み合わせて、３０ｕｇの精製Ｈ，ピロリ　ウレアーゼで経口的に 免疫処置した。マウスは次いで２８および３０日目に２回１０”Ｈ，フェリスで 攻撃した。比較の目的で、同様の雌ＳＰＦ　ＢＡＬＢ／ｃ６週齢マウス群を０， ７．１４および２１日目に経口的に全ピロリ溶解質（超音波処理物）および１０ ｔ＋ｇコレラ毒素と組み合わせて免疫処置した。マウスは２８および３０日目に Ｈ，フェリスで攻撃した。Ｈ，ピロリ超音波処理物は、Ｈ，ピロリを細胞培養液 から収集し、遠心分離によるベレット化、およびペレットの１９％塩化ナトリウ ム中への再懸濁、続く超音波処理により調製した。

対照として、雌ＳＰＦ　ＢＡＬＢ／ｃ６週齢マウスを、０，７．１４及び２１日 目にコレラ毒素１０ｕｇおよび１ｍｇのヒドロキシアパタイトで経口的に疑似免 疫処置した。全てのマウスは、囲い込み、免疫処置し、次いで並行して攻撃した 研究に供した全マウスは３５日目に層殺した。

Ｃ−Ｈ，ピロリの組換ウレアーゼサブユニットによる経口免疫処置Ｈ，ピロリ　 ウレアーゼの構造ＡおよびＢサブユニットをコードする遺伝子を、標準操作に従 って、以前に発表された配列に基づいて、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ ）クローニングにより得た［２９］。これらの遺伝子は、Ｅ、コリー　（Ｅ、Ｃ ｏ　Ｉ　ｉ）中の外来遺伝子の高度発現と容易な精製のためにデザインされたベ クター（名称ｐＥＶ４０）中に挿入されたものであり、この外来遺伝子は熱−抑 圧性のプロモーターの下流で、ヒスチジン６個の繰り返しをコードする配列の枠 内に挿入される。ａｍｐＲ遺伝子は形質転換体の選択のためにこのベクター中に 存在する。適当な温度条件の下で、得られた組換タンパク質は、Ｎ−末端に６個 のヒスチジンが付いており、ニッケルカラム上の一段階アフィニティ精製を可能 とする。Ｈ，ピロリ組換ウレアーゼＡおよびＢサブユニットは両方とも、Ｅ、コ リー中でそれぞれ別々に発現され、そしてニッケルカラム上で純度９５％まで精 製された。抗原性素材として、上述したようにして得た組換Ｈピロリウレアーゼ を使用することが好ましいが、抗原性素材としては、組換技術により得た、ヘリ コバフタ−感染に対する防御免疫応答を誘起し得るウレアーゼの抗原性部位を発 現する、いかなるウレアーゼやウレアーゼのサブユニット（例えば融合タンパク 質）を使用することも可能であることが理解されよう。このように、構成中にＨ ，ピロリ　ウレアーゼに関して実質的な相同性を有し、へりコバフタ−に対して 交差防御免疫応答を高める効果のあるウレアーゼ遺伝子を使用することが可能で ある。そのようなウレアーゼの例は、Ｈ，ピロリ　ウレアーゼと約７０％の相同 性を有するナタマメ　ウレアーゼ、あるいは、Ｈ，ピロリ　ウレアーゼと約８８ ％の相同性を有するウレアーゼである。本発明はそれ故、Ｈ，ピロリ　ウレアー ゼ遺伝子や、遺伝子生産物の使用に限定されるものではなく、また宿主中でへり コバフタ−感染に対する防御免疫応答を誘起する効果のある、いがなる組換ウレ アーゼ、そのサブユニットの使用をも範囲内とするものである。典型的には、７ ０−９５％の相同性、例えばＨ，ピロリウレアーゼに関して８０−９０％の相同 性を有する組換ウレアーゼが本発明における組換ウレアーゼ抗原として使用でき る。

本文において議論は、Ｅコリー（セクションＣ）により製造された組換Ｈピロリ ウレアーゼＡおよびＢサブユニットの使用に焦点がおかれる。しカルながら、所 望の防御的免疫応答を付与し得る上記組換ウレアーゼやサブユニット、あるいは それらの構成成分は、当業者によ（知られた他の組換ＤＮＡ技術および他の真核 もしくは原核発現ベクターを用いても製造できることが認められるべきである。

下記第３．４および５表および第５図は、マウスをＥ、コリー中で製造した組換 Ｈ，ピロリ　ウレアーゼサブユニットで経口的に免疫処置して得た結果を記載す るものである。この実験では、Ｈ。ピロリ抗原の投与は、マウスにＥ、コリー中 では製造した組換Ｈピロリ　ウレアーゼＡおよびＢサブユニットを、上述の如く して精製し、モしてＮ１細胞の結合と吸収を高めるキャリヤーとして用いたヒド ロキシアパタイト結晶と組み合わせて、経口投与することにより行った。コレラ 毒素（Ｓｉｇｍａ）を粘膜性アジュバントとして与えた。この実験では、雌５Ｐ ＦＢＡＬＢ／ｃ６週齢マウス群を各３０ｕｇの組換Ｈ，ピロリウレアーゼＡおよ びＢサブユニットで、０．８．１４および２１日目に、］）Ｈのヒドロキシアパ タイトプラスコレラ毒素アジュバント１０ｕｇと併せて経口的に免疫処置した。

マウスを次いで３２．３４および３６日目に、１０’のＨフェリスで２回攻撃し た。比較の目的で、同様の雌ＳＰＦ　ＢＡＬＢ／ｃ　６適齢マウス群をヒドロキ シアパタイトプラス１０ｕｇのコレラ毒素３Ｑｕｇの組換Ｈ，ピロリ　ウレアー ゼＢサブユニットで、０．８．１４および２１日目に経口的に免疫処置した。マ ウスは、Ｈ，フェリスで３回、３２．３４および３６日目に攻撃した。対照とし て、雌ＳＰＦ　ＢＡＬＢ／ｃ６週齢マウス群をそれぞれ、１０ｕｇのコレラ毒素 とｌｅＨのヒドロキシアパタイトで、０．８．１４および２１日目に疑似免疫処 置した。マウスは次いでＨ。

フェリスで３２．３４および３６日目に攻撃した。被験マウスは全て並行して免 疫処置し攻撃した。動物群は４６日目（攻撃後１２日）または１０週後に層殺し た。

Ｄ−胃生検、血液および腸管分泌物の分析生検体（ｂｉｏｐｓｉｅｓ）を胃及び 心臓から得た血液から採取した。腸管は摘出してＰＢＳ緩衝液中、１ｍＭ　ＰＭ ＳＦ　（ベーリンガー）で洗い、ＥＬＩＳＡ分析用に腸管分泌物を採取した。

■フエリスのコロニー化（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）に対する防御力を評価す るため、各動物からの胃生検体は、提供者の指示に従ってジャトロプラス０ａｔ ｒｏｘ）ＨＰテスト（ローム、ファルマ製）による迅速ウレアーゼ活性測定によ り、Ｈ，フエリスの存在についてスクリーニングした。要約すると、胃生検体は ０．５−ｍｌの提供者ウレアーゼ混液、およびｐＨ指示薬フェノールレッド中に 浸した。ウレアーゼ活性はウレアーゼからアンモニアおよび重炭酸塩を発生させ 、次いで５５０ｎ−における、より高吸光度に向かう溶液の色温度変化（ｃｏｌ ｏｒｍｅｔｒｉｃ　ｃｈａｎｇｅ）があった。

ウレアーゼ活性は分光分析（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　ａｎａｌ ｙｓｉｓ）により定量した。

セクションＢで述べた実験に含められた各動物の胃生検体は、上記の如く成分を 補ったＢＨＩ寒天プレート上でＨフェリスの検出のために培養した。微好気性条 件下に３乃至１０日間のインキュベーンジン後、Ｈ，フェリスの存在はダラム染 色とウレアーゼ活性測定により確認した。実験群の最初のセット（表３参照）中 で圧フエリス培養物の検出のために、極めて重要な相関関係が得られたので、胃 生検体ウレアーゼテストのみが、セクションＣで記述した実験中に記載した実験 中てＨ，フェリスの検出のために行われた。Ｈ，フェリスの検出は、２つの異な る染料（アクリジン・オレンジ、およびクレシル・バイオレット）を用いて二人 の独立した実験者による顕微鏡的検査で確認された。

血液試料は３時間ＲＴで凝血させ、血清を集め、−２０℃で分析まで凍結させた 。腸管分泌物は４℃で５分間、残渣を除くため旋回させ、−２０℃で凍結保存し た。各動物の血清および腸管検体は標準操作に従って、抗ヘリコバクター活性の 評価のためＥＬＩＳＡにより分析した。要約すれば、９６ウエルのプレートを、 Ｈ，ピロリの超音波処理物で被覆し、次いで５％脱脂ミルクで飽和した。試料は １．１から１　＋　１０００迄段階的に希釈し、モしてＥＬＩＳＡプレート上で 一夜４℃でインキュベートした。ビオチニル化（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）　 シた抗〜マウスＩｇＧ（血清）および抗−マウスＩｇＡ、次いでストレプトアビ ディン−西洋ワサビベルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ）を抗体レベルの測定に用いた。

精製したＨピロリウレアーゼによる免疫処置につづ＜Ｉ（、フエリス攻撃の結果 は、表１−３および図１−４に記載してあり、また組換ＨピロリウレアーゼＡお よびＢサブユニットによる免疫処置につづ＜Ｈ，フェリス攻撃の結果は表４−６ および図５および６に記載しである。

表１ 表１では、セクションＢで記載した実験を参照にして、”ｈ”は時間を意味し、 Ｔｇ”は免疫グロブリンを意味し、“ＮＤ”は“測定されない（ｎｏｔ　ｄｅｔ ｅｒｍｉｎｅｄ）”を意味し、″ウレアーゼ十ＨＦ”は、マウスをウレアーゼ（ コレラ毒素でヒドロキシアパタイトと結合させたちの）で免疫処置し、次いでＨ ，フェリスで攻撃したことを意味し、゛ウレアーゼは、マウスをウレアーゼ（コ レラ毒素でヒドロキシアパタイトと結合させたもの）で免疫処置し、攻撃してい ないことを意味し、“ＣＴ十ＨＦ”は、マウスをコレラ毒素で疑似免疫処置し、 Ｈ，フエリスで攻撃したことを意味し、“ＨＰ超音波処理物＋ＨＦ″は、マウス をコレラ毒素と共に超音波処理したＨピロリで免疫処置し、Ｈ，フエリスで攻撃 したことを意味し、“ＨＰ超音波処理物”は、マウスをコレラ毒素と共に超音波 処理したＨ、ピロリで免疫処置し、攻撃しなかったことを意味する。表１では、 抗体結果部分の数字は、５９５止での吸光度に１０００を掛けた測定値として与 えられる。抗体を無しにして測定するバックグラウンドは控除した。

両生検ウレアーゼ試験およびＨ，フェリス培養物のダラム染色に基づき、セクシ ョンＢで記載した薫験の結果は、表２に示す。感染は、ウレアーゼ試験または培 養物のダラム染色を含む、Ｈ４フェリスによってコロニーを作る１つまたはそれ 以上のマーカーを持つマウスにより定義された。

表２ 本　ＣＴ対象と比較してｐ＝０．０１９８　（トウ・ティルト・フィッシャー・ イグザクト試験（ｔｗｏ　ｔａｉｌｅｄ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｅｘａｃｔ　ｔｅｓｔ ））林ＣＴ対象と比較してｐ＝０．３０３　（トウ・ティルト・フィッンヤー・ イグザクト試験（ｔｖｏ　ｔａｉｌｅｄ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｅｘａｃｔ　ｔｅｓｔ ）　）表１および２に示した結果から、Ｈピロリ超音波処理物またはコレラ毒素 のいずれかを用いて得られた値と比較して、Ｈ，ピロリを用いる経口免疫処置で 統計的に有意なＨ，フエリス攻撃に対する防御が得られることが分かるであろう 。

表２を参照にすると、免疫処置した１０匹の動物の内、Ｈ，ピロリ超音波処理物 で免疫処置した動物の６匹とコレラ毒素で免疫処置した動物の９匹と比較すると 、たった３匹だけが感染したことが分かるであろう。表２は、Ｈ，ピロリ超音波 処理物で免疫処置した動物の３３％とコレラ毒素で免疫処置し、次いでＨ，フェ リス攻撃に付した動物の１０％と比較して、７０％の動物がＨ，フエリスによる 攻撃から防御されたことを示している。言い換えると、Ｈ，フェリスにさらした 対照マウスの９０％が病原体に感染しており、一方、反対に、Ｈフエリスにさら す２８日前にＨ，ピロリウレアーゼで免疫処置したマウスでは、感染率は、たっ たの３０％であった。このことは、感染を有意に減少することを表している（対 照マウスと比較して、フィッシャー・イグザクト試験においてｐ＝０．０１９８ ）。

マウスをＨピロリ超音波処理物で経口的に免疫処置すると、感染率は６７％であ った（対照に対して有意な値ではない）。Ｈ，ピロリウレアーゼを用いて得られ た防御は、予想外のものであり、Ｈピロリ超音波処理物を用いて観察された結果 に基づき、想到されるものではない。

図１−４を参照すると、図１は、ウレアーゼでの免疫処置後防御されていないマ ウスにおける血清中の抗体（ＩｇＧ）および腸管分泌抗体（ＩｇＡ）に対する試 験の結果をグラフに表したものである。これらは、表１で示すマウス番号１．４ および６であり、グループＡを成す。図２は、ウレアーゼでの免疫処置後防御さ れたマウス（グループＢ）の抗体応答を示しており、即ち、マウス番号２．３． ５および７−１０である。

図３および４は、マウス番号３１−３９で得られた結果に関するものである。

図３（グループＣ）は、Ｈ，ピロリ超音波処理物での免疫処置後防御されていな いマウス（マウス番号３１．３２．３３．３５．３６および３８）の抗体応答を 示しており、図４（グループＤ）は、Ｈ，ピロリ超音波処理物での免疫処！Ｉｌ ＆防御されたマウス（マウス番号３４．３７および３９）の抗体応答を示してい る。

図３および図４に関しては、ＩｇＡ抗体応答（ＩｇＧでない）は、防御されてい ないマウスよりも防御を示しているマウスにおける方が高いことを表しており、 防御とＩｇＡ応答との相関関係を暗示していることは、興味深い。血清１ｇＧ応 答は、相関関係を表さなかった。血清ＩｇＧ抗体ではな（粘膜１ｇＡは、消化管 の細菌感染を防御する役割を果たすことが知られている。

ウレアーゼ試験による両生検体におけるＨ、フエリスの検出と培養によるものと の相関関係の結果を表３に表す。

表３ トウ・ティルト・フィソシャーズ・イグザクト試験：ｐ＜０．０００１表３は、 胃生検を行ったウレアーゼ試験の結果とＨフエリス感染の同定の間には、ウレア ーゼ試験よりも非常に有意な相関関係が存在し、ウレアーゼ試験は、そのより良 い感度のために、次の実験ではマウスでのＨ，フエリス感染の診断に優れていた ことを示している。この研究では、各マウスの胃のより大きい切片を用いて２度 ウレアーゼ試験を行い、更にウレアーゼ試験の感度を高めた。更に、最高感度の 方法を使用することは、試験されるべきワクチン製剤により得られた防御の過大 評価を妨げるものである。陽性培養を感染に対する標準として用いる場合、セク ションＢで示した実験中、ウレアーゼ免疫処置後に引き起こされる防御は、ウレ アーゼ試験と培養を組み合わせて用いた場合と同じく有意である（ｐ＝０．０２ １対ｐ＝０．０１９）。

セク／ヨンＣ（組換ウレアーゼサブユニット）に記載した実験の結果は、両生検 体ウレアーゼ試験に基づいて得られたものであり、表４．５、および６に表し、 また図６に示した。

表４ 表４では、　“ＣＴ”はコレラ毒素を意味し、　”ウレＡ”は、組換Ｈ，ピロリ 　ウレア−ゼムサブユニットを意味し、“ウレＢ”は組換Ｈピロリ　ウレアーゼ Ｂサブユニットを意味し：および“ＨＡＰ”は、ヒドロキシアパタイト結晶を意 味する。マウス番号２０から５４は攻撃後１２日で、マウス番号６８から８２は 攻撃後１０週（１０６日）で屠殺した。各動物の両生検体から行ったウレアーゼ 試験の結果は、５５０止でのＯＤ値で表される。陽性および陰性のサインは、Ｈ ，フエリスを検出するためのウレアーゼ試験の陽性または陰性に従い、各動物の 感染の最終状態を示している。陽性：０Ｄ５５０値〉０２零　ＣＴ対照と比較し てｐ＝ｏ、ｏ０３１（トウ・ティルト・フィッシャー・イグザクト試験） 宰　ＣＴ対照と比較してｐ＝０．００３（トウ・ティルト・フィッシャー・イグ ザクト試験） ＊＊ＣＴ対照と比較してｐ＝０．０１（）つ・ティルト・フィッシャー・イグザ クト試験） 表４．５および６から、組換Ｈピロリ　ウレア−ゼロサブユニットを用いる経口 免疫処置により、組換Ｈ，ピロリウレアーゼＡサブユニットまたはコレラ毒素の いずれかを用いて得られた値と比較して、Ｈ，フエリス攻撃に対する統計学的に 有意な防御が得られることが分かるであろう。表４を参照すると、攻撃後１２日 で、ウレア−ゼロサブユニットグループにおいて、免疫処置した動物全１０匹の 内、感染したのは、ウレアーゼのＨ，ピロリＡサブユニットで免疫処置した動物 では１０匹金工、およびコレラ毒素で免疫処置した動物では１０匹中１０匹であ るのに比較して、たったの３匹だけであることが分かるであろう。表４は、Ｈ。

ピロリ　ウレアーゼサブユニット類験中処置した動物では０％、およびコレラ毒 素で免疫処置し、次いでＩ］フエリス攻撃に付した動物では０％であるのに比較 して、動物の７０％がＨフエリスによる攻撃から防御されたことを示している。

言い換えると、Ｈフェリスで攻撃した対照マウスの１００％が感染したのに対し 、反対に、組換ＨピロリウレアーゼＢサブユニットで免疫処置したマウスでは、 感染率はたったの３０％であった。このことは、対照マウスと比較して、感染を 有意に減少する（ｐ＝０．００３１、フィッシャー・イグザクト試験）ことを表 している。

Ｈ，ピロリウレアーゼの場合に観察された防御は、完全にウレアーゼのＢサブユ ニットでの免疫処置により与えられるものであり、Ａサブユニットは、そのよう な効果をもたないと官う事実は、精製ウレアーゼでの実験に基づき予想されるも のでは無かった。従って、このような防御免疫応答の発生におけるウレアーゼの ２種の構造サブユニットの役割の定義は、新規である。組換ウレアーゼサブユニ ット類トいて得られた防御は、酵素的に不活性であり、またウレアーゼの非毒性 型はヘリコバフタ−感染に対する経口ワクチンとして用いられ得ることを教示す るものである。更に、これらの結果は、不活性ウレアーゼサブユニット類ツトウ レアーゼの触媒部位を認識および阻害する抗体を殆ど誘導しないようであること から、活性部位の認識が防御には要求されないことを強く暗示している。

表６を参照すると、マウスを感染後１０週で屠殺する場合、ウレア−ゼロサブユ ニットで免疫処置した動物の６０％（マウス１０匹中６匹）およびＨ，ピロリウ レアーゼＢサブユニットで免疫処置した動物の８０％（マウス５匹中４匹）がＨ ，フエリス感染に対して防御されたことが分かるであろう。ウレア−ゼロサブユ ニットでの免疫処置中に得られた防御は、期間中続き、ウレアーゼＡでの免疫処 置が、ウレアーゼＢにより引き起こされた防御と比べて、それに取って代わる防 御を引き起こすと言う事実は、精製ウレアーゼでの実験または初期に行われた他 の実験からは予想出来るものではなかった。ウレアーゼＢサブユニット免疫処置 が防御を与えると言う事実は、活性部位の認識が、防御には必要でないことを明 確に証明している。図６は、組換ウレアーゼＡおよびＢサブユニットでの経口免 疫処置後に得られた結果を要約している（表５および６に記載）。

本発明は、へりツバフタ−感染の予防に適切なワクチン組成物を与えるものでも ある。当該組成物は、宿主において、ヘリコバフタ−感染に対する防御免疫応答 を誘起する能力を持つウレアーゼ抗原、好ましくはＨ，ピロリ　ウレアーゼまた は組換Ｈ，ピロリ　ウレアーゼサブユニット類の有効量を、医薬的に許容出来る キャリアーまたは希釈剤と共に含んで成る。

本発明のワクチンは、当業者には容易に判断できる量で投与される。従って、成 人に適切な投薬量は、１０ｔ＋ｇから１００ミリグラムの範囲であり、例えば、 ５Ｑｕｇから５０ｍｇであろう。同様の投薬量範囲で子供に適用可能であろう。

ヒトでのキャリアー系は、胃の酸性環境から抗原を保護する腸溶放出カプセルを 含み、また融合タンパク質として不溶性型ウレアーゼ抗原を含み得る。このワク チンは、成人または子供における一次予防剤として、感染宿主におけるＨ、ピロ リの根絶に成功した後には、二次予防として、または、宿主においてＨピロリの 根絶に寄与することが可能な免疫応答を誘導する目的で治療剤として投与され得 る。

上記のように、適切な粘膜アジュバント（＋＋ｕｃｏｓａｌ　ａｄｊｕｖａｎｔ ）は、コレラ毒素である。他には、ムラミルノペプチドまたはその誘導体、コレ ラ毒素の非毒性誘導体でそのＢサブセットを含むもの、および／またはコンジュ ゲートまたはウレアーゼ抗原とコレラ毒素またはそのＢサブセットを遺伝子技術 的に融合したものなどが用いられ得る。他の適切な運搬方法は、生物分解性マイ クロカプセル類または免疫刺激複合体類（ｉｍｍｕｎｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎ ｇ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓＸ　Ｉ　Ｓ　ＣＯＭ’　Ｓ　）またはリポソーム類、ウ ィルスまたは細菌のように遺伝子技術的に減弱された、生きたままのベクター類 、および組換（キメラの）ウィルス様粒子、例えばブルータング（ｂｌｕｅｔｏ ｎｇｕｅ）を含む。採用した粘膜アジュバント量は、使用した粘膜アジュバント の種類に依存している。例えば、粘膜アジュバントがコレラ毒素である場合、５ ％ｇから５０％ｇ、例えばｉｏｕｇから３５％ｇの量で用いるのが適切である。

マイクロカプセル類の形で用いる場合、使用量は、マイクロカプセル類のマトリ ックスにおいて所望の投薬量に到達するために費やされる量に依存するであろう 。

この量の決定は、当業者の技術範囲内である。本発明のワクチンに適切なキャリ アーは、腸溶性被覆化カプセル類およびポリアクチドーグリコリドミクロスフエ ア類である。適切な希釈剤は、０．２Ｎ　ＮａＨＣＯｓおよび／または生理食塩 水である。

粒状ヒドロキシル化リン酸カル７ウム（ＨＣＰ）は、粘膜表面に適用されるべき Ｉ（ピロルウレアーゼ用キャリアーとして特に有用である。Ｈビロルウレアーゼ ーヒドロキシル化すン酸カル／ウムコンジュゲートは、ポリ１ｇ免疫応答を高め る場所である上皮を横切って輸送されると信じられている。好ましくは、ヒドロ キシル化リン酸カル７ウムは、特にこの目的のために特殊化された細胞（〜１細 胞）により、上皮を横切って輸送されるに適切な微粒子形である。ヒドロキシル 化リン酸カル７ウムの好ましい形は、ヒドロキシアパタイト、商業的に入手可能 な結晶状ヒドロキシル化すン酸カルシウムＣａ＋ｏ（ＰＯ４）ｓ（ＯＨ）ｚであ る。

商業的に入手可能なヒドロキシアパタイトは、一般に正常骨組織における無機ヒ ドロキシアパタイトと化学的かつ理学的に類似である平板状結晶から成る。それ 故に、ヒドロキシアパタイトの摂取は、グラウンド・ポーン（ｇｒｏｕｎｄ　ｂ ｏｎｅ）に由来する栄養的カルシウム／リン補足の存在により立証されるように 、安全であり、摂取されるようにデザインされている。市販の高分解ヒドロキシ アパタイト（カルバイオケム（ＣａｌＢｉｏＣｈｅｃｍ）由来）は、大きさが広 範に変化する結晶から成る。長さｌｕｍ以上の結晶は、Ｍ細胞に取り込まれない ようである。従って、本発明で使用するには、市販のヒドロキシアパタイト結晶 を超音波処理等により小さく壊し、相対的に単一形の結晶状断片にする。好まし くは、ヒドロキシアパタイトの実質割合は、約０．０１−０．０ｎ１１の断片と して存在する。断片化は、電子顕微鏡または光散乱のいずれかにより、標準技術 を用いて測定され得る。

Ｈピロリウレアーゼ抗原の好ましい投与様式は、経口投与、鼻腔内投与、直腸投 与、または眼科的投与である。経口投与は、腸粘膜を含む他のＧ、Ｔ、粘膜への 運搬を提供することが出来る。

本発明のワクチンはエアロゾル、！濁液、カプセルおよび／または生薬の形で粘 膜表面に投与し得る。その投与方法は、当業者には容易に明らかであろう。

更に本発明は、ヒトを含む動物のへりコバフタ−感染に対する受動免疫処置を含 むものである。このことは、患者の粘膜表面にウレアーゼ特異的抗体の有効量を 投与することにより達成される。好ましくは、Ｈ，ピロリウレアーゼ特異的１ｇ Ａモシクローナル抗体の有効量である。

Ｈピロリのウレアーゼは、防御免疫の誘導に関する抗原に相当することが示され ているので、本発明の更なる態様は、ウレアーゼに基づくワクチンを受けた個人 の免疫応答を測定するための、または個人が免疫性であるのか感受性である（従 ってワクチン接種が必要である）のかを決定するための診断剤としてのＨ。

ピロリウレアーゼの使用である。本発明は、ウレアーゼおよびウレアーゼ特異的 抗体類の使用も含んでおり、アッセイおよびへりコパクター免疫の診断用、へリ コバクター感受性の評価用、およびワクチンに対する免疫応答の定義用キットを 構築するものである。

大奥撚 ここで本発明を、以下の非限定的な実施例を参考にして更に説明する。

ａ）細菌株 Ｈ，フエリスは、Ｊ、フォー（アメリカ合衆国、ボストン、マサチューセッツ・ インスティテユート・オブ・テクノロジー、コーポレイティブ・メディノン部） により与えられた。Ｈ，ピロリは、肩痛疾患の患者から分離した（スイス、ロウ サン、ＣＨＵＶ）。

択補体（オキソイド）０４％を添加したウノ胎児血清（イノチック）１０％を含 有するＢＨＩ（プレイン−ヒート・インフユーンヨン、バイオメリオイシラス） 液体培地で培養した。細菌を３７℃で親機性（ｍｉｃｒｏｐｈｉｌｉｃ）条件で 一晩インキユベートし、次いで３７℃で２から３日振盪させた。

寒天プレートでの培養−細菌を領２５％酵母エキスおよび羊血液５％を含むＢＨ Ｉから成る寒天プレート上、３７℃で３日間、親機性条件で培養した。

定量−細菌量を６６０ｎｍでのＢＨＩ溶液の光学密度により測定した（１光学書 度単位は、細菌１０８に相当する）。

Ｃ）超音波処理準備 Ｈ，ピロリを０．１５Ｍ　ＮａＣ１中３１血液寒天プレートから集め、４℃、１ ４００ｇで５分間遠心分離した。ペレットを３ｍｌのＮａＣ１に再懸濁し、４分 間超音波処理した。タンパク質量は、ブラットフォード・アッセイ（バイオラド ・キット、供給元の使用案内書に従う）により評価した。

ｄ）ヒドロキシアパタイトと免疫原との結合免疫原（ウレアーゼまたはそれらの サブユニット）をヒドロキシアパタイトと共に４℃で１時間インキュベートした 。マウス１匹当たり３０ｕｇの免疫原に対してヒドロキシアパタイト１．０ｍｇ を用いた。インキュベーションの最後に、最終容量２００ｕｌＰＢＳでコレラ毒 素１０ｕｇを加えた。

３０血液寒天プレート由来のＨ，ピロリを氷上０．１５ＭＮａＣ１中に集めた。

溶液を４℃、１４００ｇで５分間遠心分離した。ペレットをＨＩ３２０１１１に 再懸濁し、４５秒間（最大スピード）渦を巻かせた。次いで、抽出物を４℃、６ ７００ｇで２０分間遠心分離した。上清を回収し、タンパク質量を評価しく上記 “定量”参照）、７０％の硫酸アンモニウムで沈澱させた。

ｂ）ウレアーゼの精製 溶液を移動相としてＰＢＳ　（リン酸緩衝化生理食塩水）を用い、セファロース ＣＬ−６Ｂカラム（ファルマノア）でクロマトグラフにかけた。強いウレアーゼ 活性を表した２２の収集画分を集め、４℃で一晩、３リツトルのＦＥＢ　（２０ １Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７）に対して透析し、次いで、移動相としてＦＥＢを用 い、Ｑセファ０−ス・ファスト・フロラ（Ｑ　５ｅｈｐａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　 ｆｌｏｗ）　（ファルマシア）でクロマトグラフにかけた。画分は、０から５０ ０ｎＭ　ＮａＣ１勾配により溶出された。集めた画分の内、強いウレアーゼ活性 を持つ１０の画分をそれぞれＳＤＡゲルにかけ、次いでクーマン−（Ｃｏｏｍａ ｓｓｉｅ）染色した。分子量６３および２８ｋＤａに対応する２つの別々のバン ドを表す６つ画分を集め、これを精製ウレアーゼと見なした。

実施例２（セクションＢも参照） 免疫処置研究に用いたマウスを、胃内免疫処置の前に、エーテルで軽く麻酔した 。そして、次に、超音波処理準備するかまたは精製したウレアーゼ、ヒドロキシ アパタイトおよびコレラ毒素をＰＢＳに墾濁し、２００ｕｌを皮下注射器の付い たポリエチレンチューブを用いて、それぞれのマウスの胃まで運搬した。この手 順は、経口投与として参照されるであろう。

３つの経口免疫処置プロトコールを評価した。これらは以下に記載している。

プロトコールＢ１−精製ウレアーゼを用いるワクチン接種雌ＢＡＬＢ／ｃ６週齢 マウス（２０）を精製Ｈピロルウレアーゼ３０ｔ＋ｇとヒドロキシアパタイト１ ｍｇおよびコレラ毒素１０ｕｇで０日、７日、１４日および２１日に経口的に免 疫処置した。１０匹のマウスを２８日と３０日に、液体培養由来のＨ，フエリス ５Ｘ１０’と１０８で攻撃した。

プロトコールＢ２−ヘリコバフタ−超音波処理物を用いるワクチン接種雌ＢＡＬ Ｂ／ｃ６週齢マウス（２０）をＩ］ピロル超音波処理物溶液２ｍｇで０日、７日 、１４日および２１日に経口的に免疫処置した。１０匹のマウスを２８日と３０ 日に、Ｈ，フエリス５Ｘ１０７と１０１′で攻撃した。

プロトコールＢ３一対照 雌ＢＡＬＢ／ｃ６週齢マウス（２０）を１ヒドロキシアパタイトとコレラ毒素１ ０ｕｇで０日、７日、１４日および２１日に経口的に免疫処置した。マウスを２ ８日と３０日に、Ｈ，フェリス５Ｘ１０’と１０８で攻撃した。

３５日で全マウスを層殺し、胃からの生検体を腸管分泌物および血液の場合と同 じく取った。

防御および評価 防御を評価するために、ジェトロプラス（Ｊｅｔｒｏｘ）　Ｉ−ＩＰ試験（ロー ム・ファルマ）により、供給元の使用案内書に従い、生検体のウレアーゼ活性を スクリーニングした。ウレアーゼを５５０ｎｍでの分光光度測定により定量した 。生検体もまたＨフェリスの存在下で培養し、ダラム染色により評価した。胃前 庭部生検体を均質化し、０．１５Ｍ　ＮａＣ］で希釈（１１０と１：１００）Ｌ 、血液寒天プレートにプレートし、３７℃で４から１０日間、親機性条件でイン キュベートし腸管分泌物と血液は、抗体タイター評価のため、ＥＬＩＳＡで分析 した。ＥＬＩＳＡは以下のように行った。ポリスチレン・プレート（９６ウエル ）を３７℃で２時間、精製ウレアーゼ１　ｕｇ／ウェルで被覆した。非特異的結 合部位を３７℃で３０分間、ＰＢＳ０．１％ツイーン中５％粉末ミルクで保護し た。プレートをＰＢＳ０．１％ツイーンで１度洗浄した。血液試料は１：１００ 希釈で試験し、腸管分泌物は１．１で試験した。各試料ＩＱＱｕｌを抗原被覆化 プレートに加えた。

２時間インキュベーションした後、プレートを３回ＰＢ３０．１％ツイーンで洗 浄した。抗マウスビオチニル化したヤギ由来の全抗体とビオチニル化した抗マウ スＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭ（アメルノヤム）をＩｇＡ　（１：　２５０）以 外は１：５００希釈で（１００ｕｌ）加え、３７℃で１時間インキュベートした 。プレートをＰＢＳ０．１％ツイーンで３回洗浄し、ＰＢＳ０．１％ツイーン中 、ストロブタビジン（ｓｔｒｏｐｔａｖｉｄｉｎ）西洋ワサビペルオキソダーゼ の１　：　１０００希釈の１００ｕｌを加え、３７℃で３０分間インキュベート した。プレートを３回洗浄し、３０％Ｈ３Ｏ２を含むｌｕｌ／ｍｌクエン酸緩衝 液ｐＨ５，０中０−フェニル−ジアミンの１．５０希釈の５Ｑｕｌを加え、室温 で２０分間インキュベートした。４９５ｎ園での吸光度を各ウェルで測定した。

実施例３（セク／ヨンＣも参照） 免疫処置研究に用いられたマウスに胃内免疫処置の前に、エーテルで僅かに麻酔 した。次いで、ヒドロキシアパタイトと結合し、コレラ毒素を添加した、ピロリ において生産された組換ＨピロリウレアーゼＡおよびＢサブユニットをＰＢＳに 懸濁し、皮下注射器の付いたポリエチレンチューブを用いて、それぞれのマウス の胃まで運搬した。この手順は、経口免疫処置として参照されるであろう。

３つの経口免疫処置プロトコールを評価した。これらは以下に記載している。

プロトコールＣ１−組換ウレア−ゼムサブユニットでのワクチン接種雌ＢＡＬＢ ／ｃ６週齢マウス（１０）を精製組換Ｈ，ピロルウレアーゼＡサブユニット３０ ｕｇとヒドロキシアパタイト１ｍｇおよびコレラ毒素１０ｕｇで０日、８日、１ ４日および２１日に経口的に免疫処置した。１０匹のマウスを３２日、３４日お よび３６日に、液体培養由来のＨ，フェリス１０’で攻撃した。

プロトコールＣ２−組換ウレアーゼＢサブユニットでのワクチン接種雌ＢＡＬＢ ／Ｃ６週齢マウス（１０）を組換Ｈ，ピロルウレアーゼＢサブユニット３０ｕｇ とヒドロキシアパタイト１■ｇおよびコレラ毒素１０ｕｇで０日、８日、１４日 および２１日に経口的に免疫処置した。１０匹のマウスを３２日、３４日および ３６日に、液体培養由来のＨ，フェリス１０’で攻撃した。

雌ＢＡＬＢ／ｃ６週齢マウス（１０）をヒドロキシアパタイトｌａｇおよびコレ ラ毒素１０ｕｇで０日、８日、１４日および２１日に経口的に免疫処置した。１ ０匹のマウスを３２日、３４日および３６日に、液体培養由来のＨ，フェリス１ ０８で攻撃した。

４２日または１０６日で、マウスを殺し、胃からの多数生検体を取った。

防御および評価 防御を評価するために、ジェトロプラス（Ｕｅｔｒｏｘ）　ＨＰ試験（ローム・ ファルマ）により、供給元の使用案内書に従い、胃の本体（ｃｏｒｐｕｓ）およ び洞（ａｎｔｒｕｍ）の生検体のウレアーゼ活性をスクリーニングした。ウレア ーゼを５５０止での分光光度測定により定量した。本体および洞のＯＤ値の合計 を加えて、各マウスに対する最終ＯＤ値を得た。

引用文献 １、ブラサー、Ｍ、Ｊ、、“ガストリック・カンピロバクター−ライク・オーガ ニズムス、ガトリティス・アンプ・ベブチック・アルカ−・ディシーズ、ガスト ロエンテロロンー、１９８７年、９３巻、３７１−３８３頁。

２　グラハム、Ｄ、Ｙ、、　“カンピロバククー・ピロリ・アンド・ベブチック ・アルカ−・ディノーズ、ガストロエンテロロン−１１９８９年、１９６巻、６ １５−６２５頁。

３、ハルツネット　Ｊ　等、　“ヘリコバフタ−・ピロリ・インフエクンヨン・ イン・インテステイナル・アンド・ディフユーズ−タイプ・ガストリック・アデ ノカルシノマース”、ジャーナル・オブ・す／ヨナル・キャンサー・インテステ イナル、１９９１年、９３巻、６４０−６４３頁。

４　マーンヤル、Ｂ、Ｊ、等、“アテンブト・トウ・フルフィル・コツホス・ボ ステユレート・フォア・ピロリツク・カンピロバクタ−、メディカル・ジャーナ ル・オブ・オーストラリア、１９８５年、１４２巻、４３６−４３９頁。

５、モリス、Ａ９等、　゛インゲスンヨン・オブ・カンピロバクタ−・ピロリデ ィス・コージイズ・ガストリティス・アンド・レイズド・ファスティング・ガス トリック・ｐＨ”、アメリカン・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロンー、 １９８７年、８２巻、１９２−１９９頁。

６、インゲストランド、Ｌ３等、“イノキュレーノジン・オブ・バリアー−ボー ン・ピッゲス・ウィズ・ヘリコバフタ−・ピロリニア・ユースフル・アニマル・ モデル・フォア・ガストリティス・タイプ・Ｂ”、イ／フエクンヨン・アンド・ イミユニティ−１１９９０年、５３巻、１７６３−１７６８頁。

７　フォックス、Ｊ、Ｇ、等、“ガストリック・コロニゼー／ヨン・パイ・カン ピロバクタ−・ピロリ・サブスピー／イーズ・マステラエ・イン・フェレッッ２ 、インフェクンジン・アンド・イミユニティ−１１９８８年、５６巻、２９９４ −２９９６頁。

８、フォックス、Ｊ、Ｇ、等、“ヘリコバフタ−・マステラエーアソノエイテッ ド・ガストリティス・イン・フエレッッ：アン・アニマル・モデル・オブ・ヘリ コバフタ−・ピロリ・ガストリティス・イン・ヒューマンズ”、カストロエンテ ロロノー、１９９０年、９９巻、３５２−３６１頁。

９　リー、Ａ等、”ア・スモール・アニマル・モデル・オブ・ヒユーマン・ヘリ コバフタ−・ピロリ・アクティブ・クロニック・ガストリティス′、ガストロエ ンテロロンー、１９９０年９９巻、１３１５−１３２３頁。

１０　フォックス、Ｊ、Ｇ、等、　”へりコバフタ−・フェリス・ガストリティ ス・イン・ノートバイオティック・ラソツ・アン・アニマル・モデル・オブ・ヘ リコバフタ−・ピロリ・ガストリティス２、インフェクノヨン・アンド・イミユ ニティ−１１９９１年、５９巻、７８５−７９１頁。

１１、イートン、ＫＡ等、“カンピロバクタ−・ピロリ・ビルレンス・ファクタ ーズ・イン・ノートハイエティック・ヒ゛グレッツ′、インフェク／ヨン・アン ド・イミユニティ−１１９８９年、５７巻、１１１９−１１２５頁。

１２　ビーターマン、Ｗ、Ｌ、、°ヘリコハクター・ピロリ・アンド・ペプチッ ク・アルカ−・ディノーズ、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディ ノン、１９９１年、３２４巻、１０４３−１０４８頁。

１３、ツイン、Ｓ　Ｊ　およびネドラソド、Ｊ、Ｇ、、“オーラル・イミュニゼ ーノヨン・アゲインスト・ヘリコバフタ−・ピロリ”、インフェクノヨン・アン ド・イミユニティ−１１９９１年、２３５９−２３６３頁１４　ブランドラアー ク、Ｐ１　“ロール・オブ・Ｈチェイン・アンド・ンクレトリー・コンボー不ン ツ・イン・レセブターーメディエイテッド・グランデュラー・アンド・ヘパティ ック・トラノスポート・オブ・イミュノグロブリンズ・イン・マン”、スカンノ ナヒアン・／ヤーナル・オブ・イミュノロンー、１９８５年、２２巻、１１１− １４６頁。

１５　ブランドラアーク、Ｐ、“プロダクンヨン・アンド・ノクリオン・オブ・ イミュノグロブリンズ・イン・ザ・ガストロインテステイナル・トラクト”、ア ナルス・オブ・アレルノー、１９８７年、５９巻、２１−３９頁。

１６、セット、Ｊ、［、、“ローカル・イミュン・レスポンス・トウ・ガストリ ックンク・カンピロバクタ−・イン・ノシーアルカー・ディスベブシア”、ツヤ −ナル・オブ・クリニカル・パソロノー、１９８６年、３９巻、８６３−８７０ 頁。

１７、リー、Ａ等、　“パソゲニシティー・オブ・へりコバフタ−・ピロリニア ・パースペクティブ、インフェクノヨン・アンド・イミユニティ−１１９９３年 、６１巻、１６０１−１６１０頁。

１８、ボーレン、Ｍ、Ｊ、およびフライトン、Ｃ，Ｌ、、“ワタチネーション・ アゲインスト・ヘリコバフタ−・ピロリ・ウレアーゼ、レター”、ランセット、 １９９０年、３３６巻、１８６頁。

１９　エバンス、Ｄ　Ｊ等、　“ウレアーゼーアソノエイテッド・ヒート・ノヨ ック・プロティン・オブ・ヘリコバフタ−・ピロリ”、インフエクション・アン ド・イミユニティ−１１９９２年、６０巻、２１２５−２１２７頁。

２０、フェレロ、Ｒ，Ｌおよびり−、Ａ１　“ザ・インポータンス・オブ・ウレ アーゼ・イン・ア／ツド・プロテクンヨン・フォア・ザ・ガストリックーコロナ イノング・バクテリア・ヘリコバフタ−・ピロリ・アンド・へりコバフタ−・フ エリス・ｓｐ、ｎｏｖ、”　、ミクロバイアル・エコロジー・イン・ヘルス・ア ンド・ディノーズ、１９９１年、４巻、１２１−１３４頁。

２１、チェノ９等、“イミュニゼーノヨン・アゲインスト・ガストリック・ヘリ コバフタ−・インフェクション・イン・ア・マウス／ヘリコバフタ−・フエリス ・モデル、レター”、ランセット、１９９２年、３３９巻、１１２０−１１２１ 頁。

２２、ツイン、Ｓ３等、“オーラル・イミュニゼーンヨン・プロテクッ・ノヤー ムーフリー・ライク・アゲインスト・インフェク／ヨン・フロム・ヘリコバフタ −・フェリス”、プロノーディンゲス・オブ・ザ・ＤＤＷ、アメリカン・ガスト ロエンテロロンカル・アソノエー／ヨン、５月１０−１３日、１９９２Ｌ１３２ １、Ａ−３３１゜ ２３、グす１Ｍおよびリウ、Ｐ、Ｖ、、“七ロロジカル・スペンフィ／ティーズ ・オブ・ウレアーゼズ・オブ・プロテウス・スベー／イーズ、ジャーナル・オブ ・／エネラル・ミクロ・バイオロジー、１９６５年、１３６巻、１９９５−２０ ００頁。

２４．ミチェツティ、Ｐ１等、“スペシフィシティー・オブ・ムコ−サル・■ｇ Ａａ・レスポンス・イン・Ｂａ１ｂ／ｃ・マイス・フォローイング・Ｈ，フエリ ス・オア・Ｈ，ピロリ・チャレンジズ、プロン−ディンゲス・オブ・ザ・ＤＤＷ 、アメリカン・ガストロエンテロロジカル・アソンエーション、５月１０−１３ 日、１９９２年、１００１、Ａ−２５１゜２５、デビン、Ｃ９等、“Ｈ，ピロリ ・ウレアーゼ・エリサイツ・プロテクション・アゲインスト・Ｈフェリス・イン フエクション・イン・マイス”、ブロン−ディンゲス・オブ・ザ・ＤＤＷ、アメ リカン・ガストロエンテロロジカル・アソンエーション、５月１６−１９日、１ ９９３年、１００１、Ａ〜３０４゜２６　ポーレン１ＭＪ　およびフライトン、 Ｃ，Ｌ、、”ワクチネーノヨン・アゲインスト・へりコバフタ−・ピロリ・ウレ アーゼ゛、ランセット、１９９０年、３３６巻、１８６−７頁 ２７、ピメンテル、Ｊ　Ｌおよびクック、Ｍ、Ｅ、、“インブルーブト・グロウ ス・イン・ザ・ブロゲニー・オブ・ヘンス・イミュナイズド・ウィズ・ジャック ビーン・ウレアーゼ”、ボウルトリー・サイエンス、１９８８年、６４巻、４３ ４−４３９頁。

２８、ラビーネ、Ａ１　“ノーケンス・オブ・ヌクレイツク・コーディング・フ ォア・ア・プロティン・ハビング・アン・ウレアーゼ・アクティビティ−”、Ｅ ＰＯ特許出願番号ＥＰ００３６７６４４Ａ１．１９８９年、国際出願番号、Ｗ０ ９０１０４０３０．１９９０年。

２９、クライトン、Ｃ，Ｌ等、“ヌクレオチド・ノーケンス・オブ・トウー・ジ ーンズ・フロム・ヘリコバフタ−・ピロリ・エンコーディング・フォア・ウレア ーゼ・サブユニット、ヌクレイツク・アノラド・リサーチ、１９９０年、１８巻 、３６２頁。

３０　マツクジ−、Ｊ、Ｒおよびキョウム　Ｈｏ、”二ニー・パースペクティブ ス・イン・ワクチン・デベロップメント：ムコーサル・イミニニティー・トウ・ インフェクションズ、イ・フエクト・エーノエンツ・ディノーズ、１９９３年、 ２巻、５５−７３頁。

図１ グループＡ；ウレアーゼでの免疫処置後防御されなかったマウスグループＢ：ウ レアーゼでの免疫処置後防御されたマウス図３ グループＣ：　Ｈ，ｐ、超音波処理物での免疫処置後防御されな力・つたマウス グループＤ　：　Ｈ，ｐ、超音波処理物での免疫処置後防御されたマウス図５ ＊トウーティルト・フィッシャー・イグザクト試験図６ マウス　１０　１０　５ 感染後時間　１２日　１０週 Ｂ、ユ　ウ９８　ウ、８ マウス　１０　１０　１０ 感染後時間　１２日　１０週 フィノヤー試験　ｐ＝０．００３　ｐ＝０．０１ＡＮ）−４ＡｈＪＣＩ　Ａ　Ｎ ｈＪＥＸ　ＡＮＮＥＸＥフロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１６／４０　８３ １８−４Ｈ１９１００８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　９／８０　Ｚ　９１５２−４８ＧＯＩＮ　３３１５６９　Ｆ　９０１ ５−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｎ　９／８０　Ｚ Ｃ１２Ｒ１：６４５） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＢＹ、ＣＡ。

ＣＺ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＫＺ、　ＬＫ、　ＬＶ、ＭＧ、 ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ （７２）発明者　ブルーム、アンドレ スイス１０１１、ローザンヌ、ペーパー１０−ツエーハーウーフアウ、ディビジ オーン・デ・ガストローエンテロロジ−（番地の表示なし） ＦＩ （７２）発明者　ダーツイン、カテリーンスイス１０１１、ローザンヌ、ペーパ ー１０−ツエーハーウーフアウ、ディビジオーン・デ・ガストローエンテロロジ −（番地の表示なし） （７２）発明者　ハース、ライネル ドイツ連邦共和国、チュービンゲン、シュペーマンシュトラーセ斜番　マックス ・ブランク・インスティテユート・フユア・ビオロジエ・アブテイルング・イン フェクチオーンスビオロジー フロントベージの続き （７２）発明者　コルテシーーテウラッ、イレーヌスイス１０１１、ローザンヌ 、ペーハー１０−ツェーハーウーファウ、ディビジオーン・デ・ガストローエン テロロジ−（番地の表示なし） （７２）発明者　クラニーエンブール、ジャン−ビニールスイス１０６６、エバ リンゲス／ローザンヌ、インスティテユート・デ・ビオケミ−・デ・イウニバー シテ・デ・ローザンヌ・エト・イーエスエリエーツェー（番地の表示なし） （７２）発明者　サラガ、エミリア スイス１０１１、ローザンヌ、ルー・デウ・ブークツ２２５番　インステイテユ ート・ウニバーシテイレ・デ・パソロジー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類宿主においてヘリコバクター感染に対する防御免疫応答を誘起する方 法であって： ヘリコバクター菌体内で生じるウレアーゼにより顕示されるエピトープの、該菌 体による感染に対する防御免疫応答を誘起するのに充分な数を与えるポリアミノ 酸製剤の免疫学的有効量を哺乳類の粘膜表面に投与する処置を含んで成る方法。 ２．該製剤が菌体から精製した無傷のウレアーゼを含んで成る、請求の範囲第１ 項記載の方法。 ３．該製剤がウレアーゼのアミノ酸配列の酵素的に不活性部分と相同性のペプチ ド類を含んで成る、請求の範囲第１項記載の方法。 ４．該製剤がウレアーゼのアミノ酸配列と非相同性であり、ウレアーゼと交差反 応するエピトープを表すペプチド類を含んで成る、請求の範囲第１項記載の方法 。 ５．該製剤がＨ．ピロリウレアーゼを含んで成る、請求の範囲第１項記載の方法 。 ６．該製剤が少なくとも、酵素活性を持つかまたは持たないウレアーゼのサブユ ニットを含んで成る、請求の範囲第１項記載の方法。 ７．該製剤がウレアーゼに対する抗イディオタイプ抗体を含んで成る、請求の範 囲第１項記載の方法。 ８．該製剤がウレアーゼと免疫学的に交差反応するペプチド類を含んで成る、請 求の範囲第１項記載の方法。 ９．該ペプチド類が化学合成によって得られるものである、請求の範囲第３項お よび第９項記載の方法。 １０．該製剤がＤＮＡ組換技術を用いて生産されるウレアーゼ抗原を含んで成る 、請求の範囲第１項記載の方法。 １１．該製剤が組換技術で生産されるウレアーゼのサブジェニック断片を含んで 成る、請求の範囲第１項記載の方法。 １２．該製剤が遺伝子的に融合したタンパク質として生産されるウレアーゼサブ ジェニック断片を含んで成る、請求の範囲第１項記載の方法。 １３該融合タンパク質がコレラ毒素サブユニットを含んで成る、請求の範囲第１ ２項記載の方法。 １４．該製剤が粘膜アジュバントと共に投与される、請求の範囲第１項記載の方 法。 １５．該粘膜アジュバントがコレラ毒素である、請求の範囲第１４項記載の方法 。 １６．該哺乳類宿主がヒトである、請求の範囲第１項記載の方法。 １７．該製剤がヒドロキシル化リン酸カルシウムと共に投与される、請求の範囲 第１項記載の方法。 １８．該ヒドロキシル化リン酸カルシウムがヒドロキシアパタイトである、請求 の範囲１７項記載の方法。 １９．該ヒドロキシアパタイトが上皮を横切って移動させるのに適した粒子の形 である、請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０．該ウレアーゼが経口的、鼻腔内、直腸経由または眼内投与される、請求の 範囲第１項記載の方法。 ２１．哺乳類でのヘリコバクター感染に対する防御免疫応答を引き起こすワクチ ンであって、ヘリコバクター菌体内で生じるウレアーゼにより顕示されるエピト ープを与え、医薬的に許容され得るキャリアーまたは希釈剤中に配されたポリア ミノ酸製剤を含んで成るワクチン。 ２２．更に粘膜アジュバントを含んで成る、請求の範囲第２１項記載のワクチン 。 ２３．ヘリコバクター感染に対する哺乳類受動防御を与える方法であって、該哺 乳類の粘膜表面に、ヘリコバクターに対する防御免疫応答を誘起する、ウレアー ゼでの免疫処置により宿主内で生産されるウレアーゼ特異的ＩｇＡ抗体の免疫学 的有効量を投与することを含んで成る方法。 ２４．該抗体がヘリコバクター・ピロリウレアーゼ特異的ＩｇＡ抗体である、請 求の範囲第２３項記載の方法。 ２５．該哺乳類がヒトである、請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６．ヘリコバクター微生物に感染した哺乳類の内生免疫応答を評価する方法で あって、哺乳類の胃腸管由来の試料において、ヘリコバクター菌体内で生じるウ レアーゼにより顕示されるエピトープと反応する抗体の存在を測定することを含 んで成る方法。 ２７．投与前にヘリコバクターワクチンを該哺乳類に投与する更なる処置を含ん で成る、請求の範囲第２６項記載の方法。