JPH07502658A

JPH07502658A - 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｈａｖプローブ

Info

Publication number: JPH07502658A
Application number: JP5511960A
Authority: JP
Inventors: コルバーグ，ジャニス　エイ．; アーデア，マイケル　エス．
Original assignee: バイエル　コーポレイション
Priority date: 1991-12-23
Filing date: 1992-12-21
Publication date: 1995-03-23
Also published as: CA2125269A1; EP0672175A1; AU3427993A; EP0672175A4; US5702891A; WO1993013226A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】サンドイッチバイブＩ　イゼーンヨンア１．セイにいるためのＨＡＹプローブ皮盃五厨本発明は、核酸ハイブリダイゼーシ讐ンアッセイの分野に属する。より詳細には、本発明は、Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＹ）を検出するための新規な核酸プローブに関する。

１１狡歪Ａ型肝炎ウィルスは、ピコウィルス科に属するＲＮＡウィルスであり、そして肝炎の報告されたケースの全てのうち少なくとも３８％の原因とされている。Ｃｏｈｅｎら、０．Ｖｉｒｏｌ、　６１：　５０−５９．１９８７）は、野生型Ａ型肝炎ウィルスの完全なヌクレオチド配列について記載し、そしてその配列と、実験室用に適合させたＨＡＶ株および他のピコウィルスとを比較し、はとんどのアミノ酸の差がカプシド領域で生じるのに対し、はとんどのヌクレオチドの差がゲノム全体にわたり不規則に生じることを見い出した。

同一人に譲渡された米国特許第４．８６８．１０５号には、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイが開示されている。このアッセイでは、分析される核酸は、まず第一の容器中で、溶液中で、標識化プローブの七ノドとノーイブリダイズされ、そして捕獲プローブのセクトとハイブリダイズされる。次いで、ブローブー分析物複合体は、捕獲プローブのセグメントに相補的である固相固定化プローブを含む第二の容器に移される。このセグメントは固定化プローブにハイブリダイズするので、溶液から複合体は除去される。固定化複合体の形態で分析物を有することにより、アッセイにおける続く分離工程が容易になる。

最終的に、標識化プローブのセクトの一重鎖セグメントは標識プローブにハイブリダイズされるので、分析物含有複合体は、標識から直接または間接的に生じたシグナルによって検出され得る。

同一人に譲渡された欧州特許出願（ＥＰＡ）第８８３０９６９７６号には、米国特許第４．８６８．１０５号に記載のアッセイの変形が開示されており、ここでは、標識プローブにより生じるシグナルが増幅される。この増幅は、核酸マルチマーの使用を包含する。これらのマルチマーは、分枝ポリヌクレオチドであって、分析される核酸にまたは分析物に結合した以下のような核酸（分枝または直鎖状）に特異的にハイブリダイズするセグメント、ならびに標識プローブに特異的にハイブリダイズする第二のセグメントの反復を有するように構築されている。

マルチマーを用いるアツセイでは、分析物を、標識または増幅プローブのセットおよび捕獲プローブの七ノドと、第一の容器内でハイブリダイズし、そして複合体を、捕獲プローブのセグメントとノ・イブリダイズする固定化核酸を含む他の容器に移すという開始工程が行われる。次いで、マルチマーは固定化複合体にハイブリダイズされ、標識プローブはマルチマーの第二のセグメント反復に順にハイブリダイズされる。マルチマーは、標識プローブが付着する多数の部位を提供するので、シグナルが増幅される。増幅および捕獲プローブ配列は、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＳＮ、ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのペニシリンおよびテトラサイクリン耐性、および劫ユｖは虚り−ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓについて開示されている。

１９９０年７月２７日に出願された同一人に譲渡された同時係属出願第５５８．８９７号には、上記溶液相アッセイに用いられる、大きなコーム型分枝ポリヌクレオチドマルチマーの調製が記載されている。このコームは、より小さいマルチマーよりもより強いシグナル増強を提供する。

λ匪二皿丞本発明の１つの局面は、ＨＡＹ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；およびオリゴヌクレオチド酸マルチマーに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、ＨＡＹに対するサントイ・ツチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドである。

本発明の別の局面は、ＨＡＹ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、ＨＡＹに対するサントイ・ノチハイブリダイゼーンマンアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドである。

本発明の別の局面は、試料中のＨＡＹの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、このアッセイは以下の工程を包含する：（ａ）　該試料を、過剰の（１）ＭＡＹ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、増幅プローブオリゴヌクレオチド、および、（ｉ　ｉ）　ＨＡＹ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、捕獲プローブオリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｂ）　工程（ａ）の生成物を、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）　その後、固相に結合していない物質を分離する工程；（ｄ）　工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマーと、ノーイブリダイゼーシコン条件下で接触させる工程であって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程（ｅ）　非結合マルチマーを除去する工程；（ｆ）　工程（ｅ）の固相複合体生成物を、該標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｇ）　非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および（ｈ）　工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。

本発明の別の局面は、試料中のＨＡｖの検出のためのキットを含むＨＡＹの検出のためのキットであって、このキットは以下の組合せを含む：（ｉ）　増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで該増幅プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＡＹ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメントと、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントとを含む、セット；（ｉｔ）　１ｍＮプローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで該捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＡＹ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、セット；（ｉｉｉ＞　核酸マルチマーであって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、マルチマー；および（ｉｖ）　標識オリゴヌクレオチド。

日を　るための≦ Ｌ覗［溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイ」とは、同一人に譲渡された米国特許第４．８６８．１０５号およびＥＰＡ第８８３０９６９７６号に記載およびクレームされているアッセイ法を意味する。

「改変ヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドに安定して取り込まれ得て、付加的な官能基を有するヌクレオチドモノマーを意味する。好ましくは、改変ヌクレオチドは、そのＮ４位が機能的ヒドロキシ基を提供するように改変されている５゜−シチジンである。

「増幅マルチマー」とは、分析される核酸と、多数のポリヌクレオチド反復（すなわち、他のマルチマーの反復または標識プローブの反復のいずれか）とに、同時に直接または間接的にハイブリダイズし得る分枝ポリヌクレオチドを意味する。マルチマーの分枝は共有結合によりつくられ、マルチマーは、２つの型のオリゴヌクレオチド単位から構成されている。これらのオリゴヌクレオチド単位は、それぞれ、分析される核酸または分析される核酸にハイブリダイズした核酸に、および多数の標識プローブにノ・イブリダイズし得る。このようなマルチマーの組成物および調製は、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号、および１９９０年７月２７日に出願された米国特許出願箱５５８．８９７号に記載されており、その開示内容は、本明細書中に参考として援用されている。

用語「増幅プローブ」は、分析される核酸に特異的にハイブリダイズするセグメントと、増幅マルチマーに特異的にハイブリダイズする第二のセグメントの反復とを有するように構築された、分枝または直鎖状のポリヌクレオチドとして意図される。

用語「捕獲プローブ」は、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に実質的に相補的なセグメントと、固相固定化プローブのヌクレオチド配列に実質的に相補的なセグメントとを有するオリゴヌクレオチドとして意図される。

本明細書中で本発明のコーム型分岐ポリヌクレオチドを記載するのに用いられている［大きな（Ｌａｒｇｅ）　Ｊとは、少な（とも約１５個の分枝部位と、標識プローブ結合配列の少なくとも約２０個の反復とを有する分子を意味する。

本明細書中で本発明の分枝ポリヌクレオチドの構造を記載するのに用いられている「コーム型」とは、バックボーンから伸長している多数の側鎖を有する直鎖状のバックボーンを有するポリヌクレオチドを意味する。

「切断可能なリンカ−分子」とは、ポリヌクレオチド鎖に安定して取り込まれ得て、化学的処理または物理的処理（例えば、放射線照射）により破壊または切断され得る共有結合を含む分子を意味する。

本明細書中に開示された全ての核酸配列は、５′から３゛への方向に記載されている。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨されたヌクレオチド記号に従って示す。

開示された全てのヌクレオチド配列は、他に指示がない限り、相補的な配列を含むことを意図する。

（以下余白）ハイプリ　イゼーションア・セイ溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションの一般的なプロトコルを以下に示す。分析される核酸を、過剰量の以下に示す２つの一重鎖核酸ブローブセットを入れたマイクロタイターウェル中に入れる：（１）捕獲プローブのセット、それぞれ、分析物に実質的に相補的な第一結合配列、および、固体支持体く例えばウェル表面またはビーズ）に結合した核酸に実質的に相補的な第二結合配列を有する、および（２）増幅プローブ（分枝または直鎖状）のセフ）、それぞれ、分析物に特異的に結合し得る第一結合配列、および、マルチマーのセグメントに特異的に結合し得る第二結合配列を有する。得られた生成物は、それぞれの第一結合配列により分析物に／％イブリダイズした２つのプローブからなる３成分の核酸複合体である。

プローブの第二結合配列は、分析物と実質的に相補的ではないので、一本鎖セグメントのままで残っている。この複合体は、固体表面上の固定化プローブに、捕獲プローブの第二結合配列によってハイブリダイズする。得られた生成物は、固体表面に結合したオリゴヌクレオチドと、捕獲プローブの第二結合配列とにより形成された二重鎖によって、固体表面に結合した複合体を含む。次いで、非結合物質を、例えば洗浄により表面から除去する。

次いで、増幅マルチマーを、／Ｘイブリダイゼーシブン条件下で結合複合体に加え、マルチマーを複合体の増幅プローブの結合可能な第二結合配列に／Ｘイブリダイズさせる。次いで、得られた複合体を、洗浄によりいずれの非結合マルチマーからも分離する。次いで、［ａオリゴヌクレオチドを、マルチマーの相補的なオリゴヌクレオチド単位に）＼イブリダイズさせるような条件下で加える。次いで、得られた固定化標識核酸複合体を洗浄して、非結合標識オリゴヌクレオチドを除去し、読み取る。

分析される核酸は、種々の供給源（例えば、生物学的液体または固体）由来であり得、種々の手段（例えば、プロテイナーゼに／ＳＤＳ、　カオトロピック塩など）によりノ１イフ゛リダイゼーション分析のために調製され得る。また、酵素的、物理的、または化学的手段（例えば、制限酵素、音波処理、化学分解（例えば、金属イオン）など）によって、分析される核酸の平均サイズを小さくすることが有利であり得る。フラグメントは、Ｏ，ｌｋｂ程に小さくあり得、通常少なくとも約０．５ｋｂであり、そしてｌｋｂまたはそれ以上であり得る。分析される配列は、分析のため一本鎖形態で提供される。配列力≦天然（こ−水路形態で存在する場合、変性は必要とされな％ｚ０Ｌ、力）し、配列が二本鎖形態で存在し得る場合、配列を変性すべきである。変性は種々の技法（例えば、アＪレカリ、一般的りこＧｉ約０゜０Ｓ〜０．２Ｍの水酸化物、ホルムアミド、塩類、熱、酵素、またはそれらの組合せ）により行われ得る。

分析される配列に実質的に相補的である、捕獲プローブおよび増幅プローブの第一結合配列は、それぞれ少なくとも１５ヌクレオチド、通常少なくとも２５ヌクレオチド′、そして約５ｋｂ以下、通常約１ｋｂ以下、好ましくは約１００ヌクレオチド以下のヌクレオチドからなる。それらは、典型的には約３０ヌクレオチドである。それらは、通例、分析物の異なる配列に結合するように選択される。

第一結合配列は、種々の考察に基づいて選択され得る。分析物の性質に依存して、コンセンサス配列、多重性に関連した配列、特定の表現型または遺伝子型、特定の株などに関連し得る。

用いられる種々の増幅プローブおよび捕獲プローブの数は、アッセイの感度に影響する。なぜなら、これは用いられるプローブ配列が多いほど、アッセイ系で提供されるシグナルが強くなるからである。さらに、プローブ配列を多く用いるほど、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が用いられるようになり、それによって偽陽性結果の発生率が減少する。従って、セット中のプローブ数は、少なくとも１つの捕獲プローブおよび少なくとも１つの増幅プローブ、より好ましくは２つの捕獲プローブおよび２つの増幅プローブ、そして最も好ましくは５〜１００個の捕獲プローブおよび５〜１００個の増幅プローブである。

１（ＡＶのオリゴヌクレオチドプローブは、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能な５個のＨＡＩ／　ＩＩ離株のＲＮＡ配列を並べることにより設計した。

相同性が最も高い領域を捕獲プローブとして選択する一方、より相同性の低い領域を増幅プローブとして選択した。従って）ＩＡＶの添加株または単離株が有効とされるように、適当なプローブの設計が、新規の株または単離株を本発明のプローブを設計するために用いたヌクレオチド配列と共に並べること、モして捕捉プローブとして用いる相同性が最も大きい領域を増幅プローブとして選択されたより相同性の低い領域と共に選択することにより行われた。本発明の好ましいプローブセットのプローブ配列は連続し、そして概略的にはＨＡＹゲノムのヌクレオチド１〜１３００に対応する。本発明の好ましいプローブセットのヌクレオチド配列を実施例に示す。

捕獲プローブおよび増幅プローブの第二結合配列は、それぞれ、固体表面に結合したオリゴヌクレオチドに、およびマルチマーのセグメントに、実質的に相補的であるように、そして試料／分析物の内在性配列に遭遇することのないように選択される。第二結合配列は、第一結合配列に連続し得るか、または中間の非相補的配列によってそこから一定の間隔をとって配置され得る。プローブは、所望であれば他の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、結合配列の結合を妨げないか、または非特異的結合を生じさせないものでなければならない。

捕獲プローブおよび増幅プローブは、オリゴヌクレオチド合成法またはクローニングにより調製され得るが、前者が好ましい。

結合配列は、完全に相補的であってホモ二本鎖を提供する必要はない。多くの場合では、５個またはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、約１０％未満の塩基がミスマ・ソチであるヘテロ二本鎖で十分である。従って、本明細書中で用いられるように、用語「相補的」とは、結合領域内の各塩基が正確に対応するような正確な相補性を意味し、「実質的に相補的」とは、９０％またはそれ以上の相同性を有することを意味する。

標識オリゴヌクレオチドは、マルチマーの繰り返しオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的な配列を含む。標識オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の分子（「標識」）を含み、これは検出し得るシグナルを直接または間接的に提供する。標識は、実質的に相補的な配列の個々のメンバーに結合され得るか、または複数の標識を有する末端メンバーまたは末端テイルとして存在し得る。オリゴヌクレオチド配列に結合した４１３ｍを提供するための種々の手段が、文献に報告されている。例えば、Ｌｅａｒｙら、Ｐ　ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　、　ＵＳＡ　（１９！１３）　８０：４０４Ｓ；　ＲｅｎｚおよびＫｕｒｚｓ　Ｎｕｃｌ、ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、（１９Ｂ４）　［：３４３Ｓ；　ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＧｕｍｐｏｒｔ％Ｎｕｃ、ｃ’　５（１９１１３）　１１：６１６７；　Ｓ＋１ｉｔｈら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、（１９８５）　ｕ：２３９９；　ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｅ、（１９８４）　１３８：２６７を参照のこと。標識は、実質的に相補的な配列に、共有結合または非共有結合で結合され得る。用いられ得る標識には、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、染料、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオンなどが包含される。例示の特定の標識には、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ）、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノール、ＮＡＤＰＨ，α−β− ガラクト／ダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが包含される。

分析物の予測モルに対する捕獲プローブおよび増幅プローブの割合は、それぞれ少なくとも化学量論であり、好ましくは過剰量である。この割合は、好ましくは少なくとも約１．５；ｌであり、より好ましくは少なくとも２；１である。通例、２：　ｌから１０６：１の範囲内である。各プローブの濃度は、一般的に約１０−５〜１０−　’Ｍの範囲であり、試料の核酸濃度は、１〇−２１〜１０−　 ’　２Ｍまでの種々の範囲をとる。アツセイのノ＼イブリダイゼーシコン工程は、一般的に約１０分から２０時間までを要し、多くは約１時間で完了する。ハイブリダイゼーション甑やや高めのａ度で、一般的には約２０℃から８０℃の範囲で、より通常には約３５℃から７０°Ｃまでで、特に６５℃で行われ得る。

ハイブリダイゼーション反応は、水性媒体中で、特（こ緩衝化水性媒体中で、通常行われる。媒体は種々の添加剤を含有し得る。用いられ得る添加剤には、低濃度のデタージエント（０，０１〜１％）、塩類（例えば、クエン酸ナトリウム（０，０１７〜０、１７Ｍ））　、フィコール、ポリビニルピロリドン、担体核酸、担体タンパク質などが包含される。非水性溶媒（よ、水性媒体に添加され得る。これは、例えばジメチルホＪレムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール、およびホルムアミドである。これらの池の溶媒は、一般的に２〜５０％の範囲内の量で存在する。

ハイブリダイゼーション媒体のストリンジエンシー（±、温度、塩濃度、溶媒系などにより制御され得る。従って、目的とする配列の長さおよび性質に依存して、ストリンジエンシーを変化させる。

標識の存在を検出するためには、標識の性質に依存して、種々の技法が用いられ得る。蛍光物質に対しては、多（の種々の蛍光光度計が有用である。化学発光物質に対しては、ルミ／メーターまたはフィルムが有用である。酵素を用いる場合は、蛍光産物、化学発光産物、または着色産物が提供され得、そして蛍光光度計、ルミノメータ−１分光光度計により、または視覚的に測定され得る。イムノアッセイに用いられる種々の標識およびイムノアッセイに適用され得る方法が、被検物のアッセイに用いられ得る。

本発明に基づく増幅した核酸ハイブリダイゼーシプンアッセイを行うためのキットは、以下の試薬の−まとめの組合せを包含する：増幅プローブまたはプローブのセット；捕獲プローブまたはプローブのセット；増幅マルチマー；および適当な標識オリゴヌクレオチド。これらの試薬は、典型的にキット内の分離容器中に存在し得る。このキットはまた、分析物を変性させるための変性試薬、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄溶液、酵素基質、陰性および陽性のコントロール、およびアッセイを行うための記述された指示書を含有し得る。

以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明をどのようにも限定することを意図しない。

実１１号実りｌ上コーム　ポリヌクレオチドのム本実施例は、１５個の分枝部位と、３つの標識プローブ結合部位を有する側鎖伸長とを有する、フーム型分岐ポリヌクレオチドの合成を例示する。このポリヌクレオチドは、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号に記載の溶液相ハイブリダイゼーシヨンに用いられるように設計した。

オリゴヌクレオチドの全ての化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌ　ｉｅｄ旧ｏｓｙｓＬｅｓｓ、Ｉｎｃ、、　（ＡＢＩ）モデル３８０Ｂ＞で行った。β ンアノエチル型のホスホルアミダイト化学を用いた。これには、ＰｈｏｓｔｅｌＴ″試薬（ＡＢＮ＞を用いる５゛リン酸化が包含される。

示したこと以外は、標準的なＡＢＩプロトコルを用いた。複数のサイクルを用いた（例えば、１．２サイクル）と示されている場合、ＡＢＩにより推奨された複数の標準量のアミダイトが、特定のサイクルに用いられた。　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０ＢＤＮＡ合成機で行われる、サイクル１．２および６．４を実施するためのプログラムを本明細書中に添付する。

以下の構造のコーム体を最初に調製した：３’Ｔ、、（ｌ！１ｌＩｌ）ＣＩ）ｔ５ＧＴＴＴＧＴＧＧ−５１（ＲＧ’！’ＣＡＧＴｐ−５勺、ここで、Ｘ゛は分枝モノマーであり、そしてＲは過ヨウ素酸切断可能リンカ−である。

１５個の（ＴＴＸ’）繰り返しによるコーム体の部分を、３３．８Ｂのアミノプロピル誘導体化チミジンの調整孔ガラス（ＣＰＧ）　（２０００１，２サイクルプロトコルで最初に合成する。分枝部位ヌクレオコーム体（側鎖を含まない）の合成に関して、βシアノエチルホスホルアミダイトモノマーの濃度は、Ａ％Ｃ，Ｇ、およびＴが０．１Ｍ、分枝部位モノ？−Ｅが０．１５Ｍ、およびＰｈｏｓｔｅｌ”試薬が０．２Ｍであった。脱トリチル化は、脱保護期間中に階段フロースルー（ｓｔｅｐｐｅｄ　ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）を用いて、塩化メチレン中の３％トリクロロ酢酸で行った。最終的に、５°ＤＭＴをアセチル基で置換した。

切断可能リンカ−Ｒおよび式３−ＲＧＴＣＡＧＴＩ）　（配列番号＝１）の６塩基の側鎖伸長は、以下のようにして各分枝モノマー部位で合成した。塩基保護基（上式のＲ２）の除去は、コーム体の合成に用いたのと同じカラム中にＣＰＧ支持体を保持している間に、手動的に行った。Ｒ２がレブリニルである場合、０．５Ｍヒドラジン水和物のピリジン／氷酢酸（１：１　ｖ／ｖ）溶液を加え、１５分ごとに液体を取り替えながら９０分間ＣＰＧ支持体と接触させておき、続いてピリジン／氷酢酸（１：１　ｖ／ｖ）で、次いでアセトニトリルで十分に洗浄した。脱保護を行った後、切断可能リンカ−Ｒおよび６塩基側鎖伸長を、６．４サイクルを用いて加えた。

これらの合成において、ホスホルアミダイトの濃度は、０゜１Ｍであった（０２ＭのＲおよびＰｈｏｓｔｅｌ”を除く；Ｒは、２−＜４−（４−（２−ジメトキントリチルオキシ）エチル−）フェノキシ２．３−ジ（ペンゾイルオキシ）−ブチルオキシ）フェニル）エチル−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトであった）。

脱トリチル化は、３％トリクロロ酢酸の塩化メチレン溶液で連続フロースルーを用いて行い、次いでトルエン／クロロメタン（１：１　ｖ／ｖ）の溶液でリンスする。分枝ポリヌクレオチド鎖は、固体支持体から、サイクルｒｃＥＮＨ３Ｊを用いて３８０Ｂで自動的に除去した。水酸化アンモニウム溶液を４１のスクリューキャップＷｈｅａｔｏｎバイアルに集め、６０℃で１２時間加熱して全ての塩基保護基を除去した。室温まで冷却した後、溶媒を５ｐｅｅｄ−Ｖａｃエバポレーターで除去し、残渣を１００μｌの水に溶解した。

以下の構造の３°バツクボーン伸長（セグメントＡ）、側鎖伸長、および連結反応テンプレート／リンカ−もまた、自動合成機を用いて作成した。

３’ｔ（−１７木−〉４？＆　コ１−ｒｃｃｃｒｘｒｃｃＴｃｃｃｃｘｃｘｃｘｃｃＴｃｃｐ−ｓｌ　（ｉ［ｆ？Ｉｉ号　：２）イ賢１り４ｉ表　３Ｆ−ＧＡＴＧＣＧ（ＴＴＣＡＴＧｃ’ｒＧＴＴＧＧＴＧＴＡＧ）、−５’　（、ｌｉ’ｌｆ＋！ろ　：コ）粗製のコーム体を標準ポリアクリルアミドゲル法（７％、７Ｍ尿素およびＬＸ　ＴＢＥランニング緩衝液を含む）により精製した。

３°バツクボーン伸長および側鎖伸長を、以下のようにしてコーム体に連結した。コーム体（４ｐｍｏｌ／μｌ）、３°パツクホーン伸長（６，２５ｐｍｏｌ／　ｔｔ　＋）、側鎖伸長（９３，７５ｐｍｏｌ／　ｔｔ　Ｉ）、側鎖連結テンブレー）　（７５ｐｍｏｌ／μｌ）およびバックボーン連結テンプレート（５ｐｍｏｌ／　μｌ）を、１　＋ｓＭ　ＡＴＰ／　５　＋＊Ｍ　ＤＴＴ／　５０ｍＭ）リスＨＣＩ、　ｐＨ８，０／　１０＋ｉＭ　ＭｇＣ＋２／　２　ｍＭススペルミジン中、０．５単位／μｌの１４ポリヌクレオチドキナーゼと合わせた。この混合物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで水浴中で９５°Ｃに加熱し、次いで約１時間かけて３５℃未満までゆっくりと冷却した。２＋ｍＭ　ＡＴＰ、　１０ｍＭ　ＤＴＴ、　１４％ポリエチレングリコ−ル、および０．２１単位／μ ＩＴ４リガーゼを加え、そして混合物を２３℃で１６〜２４時間インキュベートした。ＤＮＡをＮａＣ１／エタノール中で沈澱させ、水中に再懸濁し、そして以下のような２回目の連結反応にかけた。混合物を調整して、１ｍＭ　ＡＴＰ、　５ｍＭＤＴＴ、　１４％ポリエチレングリコール、５０ｗ＋Ｍ　）　！Ｊ　スＨＣＩ、　ｐＨ７，５，１０５Ｍ　ＭｇＣｌ２．２ｗＭＸヘルミジン、ｏ、ｓ単位／ｕｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、および０．２１単位／μｌ　Ｔ４リガーゼを加え、そして混合物を２３℃で１６〜２４時間インキュベートした。次いで、連結反応産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。

連結反応および精製を行った後、生成物の一部を３２ｐで標識し、Ｒ部位での切断を行い、これは、水性Ｎａ１Ｏ４で１時間酸化することにより達成された。次いで、試料をＰＡＧＥにより分析して、取り込まれた側鎖伸長数を、ゲル上のバンドの放射性標識を定量することにより測定した。生成物は、全部で４５個の標識プローブ結合部位を有していることが分かった。

支立匠且１（ＡＹア・・セイのｒ１５Ｘ３Ｊ増幅溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーシヲンアッセイ形式を、本アッセイで用いた。ｒ１５Ｘ３Ｊの呼称は、この形式が２つのマルチマーを用いることに由来する：（１）増幅プローブは、ＨＡＹに結合する第一セグメン）　（Ａ）と、（２）増幅マルチマーにハイブリダイズする第二セグメント（Ｂ）とを有し、（２）増幅マルチマーは、セグメント（Ｂ）にハイブリダイズする第一セグメント（Ｂ＊）と、セグメント（Ｃ）の１５個の反復とを有し、ここでセグメントＣは、３つの標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。

本アッセイで用いた増幅プローブセグメントおよび捕獲プローブのセグメントならびにそれらの個々の名称は、以下の１ＬＡＶ、６　（ａｗｌｓ’＞　＝６）λ τ入ＧＭＧＴＡＴＴＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＧＴＴＴＣＡＣＣＣＧＴＡ□ＡＶ、フ　（町６１借ら　ニア）ＣＣＧＣＣＧＣＴＧ’ｌ’ｒＲＣＣＣＴＡ’ｌ’ＣＣＡＡＲＧＣＡＴＣＴＣＴＴＣＨＡＶ、８　（ｉｌｕ’）Ｉ！　：８）ＴＧＡＡＴＧＧＴｒＴ！’ＴＧＴＣ！ ’ｒＡＡＣＡＡＣｒＣＡＣＣＡＡＴＡ？ＨＡＶ、９　（＠ｌｒ鴫％　：９）ＧＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧＡＧＹＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴｌｔＡＶ、ｌＯ（、隻Ｊ’４！　：１０）ＣＴλλ＾ＧＡＣＡＧＣＣＣｒＧ入Ｃ＾ＲＴＣＡ入ＴＣＣ入ＣＴＣＡＡＴＨＡＶ、ｌｌ　（（ｇｌｒｆ３　：１ｌ）ＴＴＧＣＣＣＴＡＡＧＣＡＣＡＧ入ＧＡＧＧτＣＴＧＲＲ講、Ｔτ入五人Ｃ１ｉＡｖ、１２＜　ｖｒｌｔろ　：１２）ＴＣＴＣＡＣＡＧＲＡＴＣＣＣＡＴｒＴＡＡＧＧＣＣＡＡＡＴＧＲＴＧ？ｍｖ、ｚコ　ｔ、ｌＲ＊ｇ　：１３）臥Ｖ、１４　（叡ハ番も：１４）ＨＡＶ、１５　（−％労）ｗｉｇ　＝１５）ＨＡｖ、ｘｇ　（配？Ｗｈ号”）ＧＧＡＡＡＡＴＷＣＣＴＴＧＴＹＴＲＧＡＣＡＴＲＴＴＣＡＴＴＡＴＴＲＨＡＶ、１７　（ｔＩｉ７）ａ’ｙ　：ｌ’）ＡＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＣＡＡＧＲＣＣＡＣＴＣＣＣＲＡＣＡＧＴＣＴＨＡＶ−１８（［ＸＪ’ｌ岳！３　：１ａ）ＧＡＡＴＣＡ’！ＴｒＧＣｒＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＲＴＣＴＧＣＣＡＡＡＧＨＡＶ、１９　（ｗ＋ｈｖｒｇ　：１９）五人ＧＣＷＣＣＡＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＡＷＣ入ＡＣＫＧＡＹＴＨＡＶ、２０　（ｗｆｆｉ曇１！＋　：２０）ＧＡＡＣＴＧ入ＡＧＡＴｒＧＲ’ｒＣＣＡＣＡＧＡＡＧＴＲＡＡＲＴＡＡＧＨＡＶ、２１　（晴１ｆｌ”Ｓ　：２１）ＧＴｒＣＡＡＹＹＴＧＲＴＧＴＲＡＸＣＣＡＡＣＣＴＣＡＧＣＷＧＴＡＴＨＡＶ、２２　（、％ｆｌｆｒ＆）　：２２）ＴＷＧＡＡＣＹＲＧＧＴｆ’ｒＡＴＣＡＡＣＡＧＡＧＧＴｒＴｒＣＡＡＲＧＨＡＶ、２３　（匣偵〃）ｌｌ”ｊ）　：２３）ＧＡＡＴＣＡＲＧλυμＡＹＴＴＹＴＣＹＣＣＣＴＧＡＧＴＹＹＴＣＴＨＡＶ、２４　（啄オｌ１ｌ）　：２すＨＡＶ、２５　（＃７Ｊｒ）８ち：２５）貼Ｖ、２６　（＊ｆ）傷ち　：２６）ＨＡｖ、２フ　（、＠Ｊｉｇ　：２７）（↓・ス下イ１０ＨＡＶ、２　（ｙＵｒ）ｉ弓：２９）ＣＴＣＣＡＴＧＣＴＡＡＴＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＧＧｙｖ、コ　（瞬己／￥’＞１’）：３０）ＡＭＡ　ｃＡＴＣＴＧＹＧＴＣＣＣＣＡＡＴｒＴＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＡＧ）ＬＡＶ、４　（＠Ｑ’ｆｌｒ’５　＝）コｘＧＣＣＴＡＣＣＣＣＴＴＧＴＧ４１：五人ＧＡＴＣＡＡＡＧＡＧＲＴＴＣＡＴＨＡＶ、２Ｂ　（ｄ）ｌｒＪｔ　：３３）入ＲＧＧＴＧＴＲＧＧＲｆｆｒＡＴＣＴＧＡＡＣＴＴＧ入ＡＴＹＴＣＡＡ）ＬＡＶ、２９　＜　＊ｌ’Ｗｋ弓　＝３４）ＨＡＶ、３１　（Ｑ８　＝３６）ＴＧＣＡＡＴＴＴＡＡＣＡＪｔＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＡＡＡＣ＾ＧＴＣＡＭＡＶ、３２　（、沼にレチ１ｆｔｌ！ｙ　：３７）ＡＴＧＧＡＡＣＣ！ＴＴＡＴＴＣＴＡＡＣＹＡＣＡＴＴＧｆｆＲＡＴＲτ各増幅プローブは、ＨＡＹ配列に対して実質的に相補的な配列に加えて、増幅マルチマーのセグメントに相補的な以下の５゜伸長を含んでいた：入ＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴ　（呪ケ）■−ろ　：３８）。

各捕獲プローブは、ＨＡＶ　ＲＮＡに対して実質的に相補的な配列に加えて、固相に結合したＤＮＡに対して相補的な以下の下流配列（ＸＴ１＊）を含んでいた：ｃｒｒｃｒｎＧＧＡｃ、ｐｍｃｓｃｃｒａ　（ＩＩＥｌｌ）番も＝３９）。

マイクロタイタープレートを以下のようにして調製した。

Ｗｈｉｔｅ　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　Ｉ　Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌストリップ（ポリスチレンマイクロタイタープレート、９６ウエル／プレート）を、ＤｙｎａｔｅＣｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃから購入した。各ウェルに２００μｍのＩＮ　ＨＣＩを満たし、室温で１５〜２０分間インキュベートした。次いで、このプレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。次いでウェルに２００μｌのＩ　Ｎ　ＮａＯＨを満たし、室温で１５〜２０分間インキュベートした。プレートを再びＬＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。

ポリ（ｐｈｅ−Ｉｙｓ）をＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、から購入した。このポリペプチドは、ｐｈｅ：　ｌｙｓを１：１のモル比で有しており、平均分子量は４７．９００ｇｍ／ｍｏｌである。平均長さは３０９アミノ酸であり、１５５アミン／Ｉａｏｌを含む。ポリペプチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２Ｍ　ＮａＣ１／ＩＸ　ＰＢＳと混合し、最終濃度０．１ｍｇ／ｍ１（ｐＨ６，０）Ｅした。

各ウェルに、この溶液を１００μＬずつ加えた。プレートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、３０″Ｃで一晩インキユベートした。次いで、プレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。

プレートにオリゴヌクレオチドＸＴ１＊をカップリングするのに、以下の手順を用いた。ＸＴ１＊の合成は、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号に記載された。２０ −ｇのジスクシンイミジルスベレートを、３００μｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ＸＴ１＊の２６０Ｄ２６８単位を、１００μｍカップリング緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ）１７．８）に加えた。次いで、カップリング混合物をＤＳＳ−ＤＭＦ溶液に加え、マグネチソクスターラーで３θ分間攪拌した。

ＮＡＰ−２５カラムを１０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐｔ１６．５で平衡化した。

カップリング混合物ＤＳＳ−ＤＭＦ溶液を２職ｌの１（１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５に４℃で加えた。この混合物をポルテックスにかけて混合し、平衡化したＮＡＰ−２５カラムにかけた。ＤＳＳ活性化ＸＴＩ中ＤＮＡを、３．５１の１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５でカラムから溶出した。溶出したＤＳＳ活性化ＸＴ１４　ＤＮＡの５．６０Ｄ２ａｓ単位を、１５００ｉ　１の５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ１，８に加えた。各ウェルに、この溶液を５０μｍずっ加え、プレートを一晩インキユベートした。次いで、プレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートして液体を除去した。

プレートの最終的なストリッピングは、以下のようにして行った。０５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを含有する２００μＬの０．２Ｎ　ＮａＯＨを各ウェルに加えた。プレートをプラスチックで包み、６５°Ｃで６０分間インキュベートした。次いで、プレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄シ、ウェルをアスピレートし液体を除去した。ストリッピングしたプレートを、２〜８℃で乾燥剤ビーズと共に貯蔵した。

ＨＡｖ＠染した細胞培養（１００％ＨＡＶ感染したＦＲｈＫ４Ｒｈ系）、および、非感染の細胞培養（ＦＲｈＫ４Ｒｈ系）を以下のようにして調製した。

細胞を、ＳＴＶ　（等量の０．２５％トリプシンおよび１：２０００のバーイン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）のＰＢＳ溶液）でトリプシン処理し、そして細胞が増殖する培地（２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）　５＋ａｌで再懸濁した。次いで細胞を血球計で計数し、そして１０５細胞／１０μｌ、１０４細胞／１０μｌ、　１０’細胞／１０μｍ、および１０２細胞／１０μｌに希釈した。

ＨＡＹ特異的増幅プローブおよび捕獲プローブの反応混液をプロテイナーゼＸ溶液中で調製した。このプロテイナーゼに溶液は、はじめに１０■ｇのプロテイナーゼＸを５ｍｌの捕獲希釈液（５３ｍｌのトリス１（ＣＩ、ｐＨ８，０／１０．６＋＊Ｍ　ＥＤＴＡ／１．３％ＳＤＳ／１６　ｕ　ｇ／ｍｌの音波処理したサケの精子ＤＮＡ１５．３ＸＳＳＣ／１ｍｇ／＋＊ｌプロテイナーゼに７７％ホルムアミド）に添加して調製した。ごの反応混液は、３０μｌの緩衝液中にそれぞれのプローブを５Ｏｆｉｏｌｅ含有していた。この溶液の３０μｍを、それぞれのウェルに添加した。次いで上記の非感染の細胞、および感染した細胞の適当な希釈溶液１０μＩを、それぞれのウェルに添加した。プレートをカバーし、攪拌して試料を混合し、次いで６５％で一晩インキユベートした。

次の朝、このプレートを室温で１０分間冷却した。各ウェルの内容物を吸引して、全ての液体を除去し、そしてウェルを洗浄用緩衝液（０，１％５ＤＳ１０．０１５Ｍ　ＮａＣｌ／　Ｏ，００１５Ｍクエン酸ナトリウム）で２回洗浄した。次いで、増幅マルチマーを各ウェルに加えた（４Ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ／　０．５％　）ｏ　ッ＋　ン’）’　試１１ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、カタログ番号１０９６１７６）中に２０ｆｍｏｌｅ／ウェル）。プレートをカバーし、攪拌してウェル中の内容物を混合した後、６５°Ｃで１５分間インキュベートした。

室温でさらに５〜１０分間おいた後、ウェルを上記のように洗浄した。

次いで、アルカリホスファターゼ標識プローブ（ＥＰ第８８３０９６９７６号に開示されている）を、各ウェルに加えた（４Ｘ　５ＳＣ１０，１％５ＤＳ１０．　Ｓ％ブロッキング試薬４０μｍ中の２０ｆｍｏｌｅ／ウェル）。５５°Ｃで１５分間インキュベートした後、室温で５〜１０分間おき、ウェルを、上記のように２回洗浄し、次いで０．０１５Ｍ　ＮａＣ１１０，００１５Ｍクエン酸ナトリウムで３回洗浄した。

酵素のトリガーとなるジオキセタン（Ｓｃｈａａｐら、Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、（１９８７）　２８：１１５９−１１６２およびＥＰＡ公開第０２５４０５１号）をＬｕｗ＋ｉｇｅｎ、Ｉｎｃ、から得、これを用いた。検出手順は以下のとおりであった。３０μｍのＬｕ１ｉｐｈｏｓ　５３０　（Ｌｕｍｉｇｅｎ）を各ウェルに加えた。ウェルを軽く叩いて試薬を底まで落し、緩やかに回転させて試薬を底まで均等に分散させた。ウェルをカバーし、そして３７℃で４０分間インキュベートした。

次イテ、プレートをＤｙｎａＬｅｃｈ　ＭＬ　１０００ルミノメータ−（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）で読み取った。出力を、反応の間に生じた光の総積分として示した。

結果を以下の表に示す。各標準試料に対する結果は、陰性コントロールの平均値プラス２倍の標準偏差値と、試料の平均値マイナス２倍の標準偏差値との差（デルタ）として表す。

デルタが０より大きい場合、試料は陽性であるとみなされる。

これらの結果は、約１０３〜１０’ＨＡＶ分子の感度を示す。

表 νＪ斗　ｌ　デノＬＬ非感染の細胞　１０５− 非感染の細胞　１０’　−０，２６非感染の細胞　１ｏ３−０．２５非感染の細胞　１０２−０．１６ＨＡＹ感染した細胞　１０５Ｉｓ、　５２ＨＡＶ＠染した細胞　１０’　２．５９ＨＡＹ感染した細胞　１０”　−０，０９ＨＡＹ感染した細胞　１０２−０．０３本発明を実施するための生化学、核酸ハイブリダイゼーシッンアッセイ、および関連分野における当業者に明らかな上記態様の改変は、以下の請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

（以下余白）（＋ｌ　１ｆ）ｎＮ　：　””” （ｉｉｉ）配列数　３９（ｉｖｌ連絡住所・（２）配列＃号１の情報：（１）配列の特色（ｘｌ）配ヲリ、配列番号１ τＧ＾ｃＴｃｓ（２）配列番号２の情報：（司配り「Ｉ：配列番号２：ＣＧＴｃＴＧＣｋＧＡＣＪｋＣＧＧＧＴＣＣＴ　ｋＴＧｃｃＴ（２）ＩＥＪＩＩ。９３゜ヤ、　“ （ｘｌ）配列：配列番号３・（ｘｌ）配列：配列番号４゜ＴＣｅＡＣＧｋ）ＪＪｋ　ｋｋｆｉＡｆｉＪｋ　ｉ＆（２）配列番号５の情報：（ｘｉ）配列：配列番号５゜ °°“ＣＪｋＣＴｋＣＧＣ１゜（２）配列１６号６の情報：（１）配列の特色：（Ａ）長さ　３３塩基対（Ｂ）！１２：核酸ＦＣ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（×１）配列：配列番号６：＾丁ＡにＡＡ。テ、丁　テ、。ｒＡＡＧＡ　Ｃ４ｆｆＴＣＡＣＣＣＧτ＾　ココ（２）配列番号フの情報・（１）配列の特色；（＾）長さ＝３３塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数　一本箱〈Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号７：Ｃ可哀１１Ｔｃ？　ＴｈＣｃｃ？Ａ丁ＣＣｋＮＩＧｃＡτＣ′ｒｃ　ｆｒｃ　３３（２）配列番号８の情報・（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ：３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トヂロノー、直鎖状（ｘｌ）配列・配列番号８・ＷへＡ％Ｇ丁Ｔ丁’ｒｒｃ丁ｅｒｒ“０＾＾ＣＴａ入ｃｃＡ＾？Ａ？コ３（２）配列番号９の情報・（１）配列の特色（Ａ）長さ　３３塩基λ１（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数・一本箱（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号９：（、（ｌＪＴｃｃＡｃｔＧ　ＧｋＴＧｋＧｋＧＹＣｋＧＴｃｃＴｃｃｆ　ｃｃ５丁ココ〈２）配列番号：１０の情報：（１）配列の特色：（＾）長さ＝３３塩基対（８）梨：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号１０：ＡｊＬＡＧＡＣＡＧ　Ｃｅ−ＡＣＡＰＩＴ　Ｃ）ＡＴＣＣＪｋＣｌＣｋＡＴ　、。

（２）配列番号１１の情報：（１）配列の特色：（＾）長さ：３３塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号１１：〈２）配列番号・１２の情Ｉｌｉ：（１）配列の特色：（Ａ）長さ・３３塩基対（８）型・核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号１２：丁ＣＴＣＪｋＣＡＧλ＾　？ｅＣｅＡＴＴ丁ＡＡ　ＧＧＣＪＪＪＪｋＴＩＪＩ　ＴＧＴ　３゜（２）配列番号１３の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ＝３３塩基対ｆＢｌ型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（買ｌ）配列、配ツリ番号１３（２）配列番号１４の情報・（１）配列の特色：（＾）長さ　３３塩基対（Ｒ１！Ｌ！　核酸（Ｃ）鎖の数、一本箱（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号１４・ＧＴｋＣ″ＣＡＣ；Ａ　ＣＡＡＡＣＪｋＣＣＡＣＡ？ＭＧＣＣｅ　Ｃ（Ｊ　、。

（２）配列番号１５の情報：（１）配列の特色：（Ａ）長さ：３３塩基対（Ｂ）型：核酸ＦＣ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号１５・ＴＴ丁入＾Ｇ入＾τＧ　ＡＧＧＡＡＡＡＡＣＣ丁入λ＾ｍｃｃ　π＾　ココ（２）配列番号１６の情報：（ｉ）配列の特色・（Ａｌ長さ、３３塩基対（Ｂｌ型　核酸（Ｃ）鎖の数・一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列・配列番号１６゜ＧＣ，ｍｎｔＣＣｎｍＡｃ　ＡＴｊｌｆｆｉ（ＪＴ’ｒＡ　ｆｆ＊　３３（２）配列番号１７の情報・（１）配列の特色。

（Ａｌ長さ　３３塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数ニー末梢（Ｄ）トボロノー、ｌＩｔ鎖状（買１）配列：配列番号１７：＾Ｃ＾ＧＣ＾丁ｃｙａｃτＣ入＾ＧＩＩＣＣ＾Ｃτａｃｅλ＾（ＪｋＧ丁Ｃτコ〕（２〉配列番号１８の情報。

（１）配列の特色：（Ｃ）鎖の数・一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号１８：ＧｋＡＴＣｋＴＴＴＱ　ＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡ　Ａ？’ｌＬ？Ｃ丁ＣＣＣＡ　入＾０　３３（２）配列番号】９の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ：３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（ｐ）トポロジー：直鎖状（×１）配り１１．配列番号１９− 人へｃｃｗｃｃｘａｔ　ｃＡＣｉＧｃＡａ丁ｃ　ｃ？＾ｗｅ＾ＡＣＫａ　入丁丁　３２（２）配列番号２０の情報：（］）配列の特色：（Ａ）長さ＝３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号２０：ｃｘＡｃＴ’ｃＡＡＧＡ　ｉＲ？ＣｅＡ（！Ａ　ＧＪＷ：？’ＲＭｊＬ？　ｙａ　３３（２）配列番号２１の情報：（Ｉ）配列の特色：（Ａｌ長さ・３３塩基対（８１型、核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本箱（Ｄ）トポロジー　直鎖状（Ｘｌ）配列：配列番号２１：（２）配列番号２２の情報。

（ｉ）配列の特色：（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号２２： τ賛Ｇλ入ｅｎｔｃｃ　τｉ丁＾τＣ＾入ＣＡ　ＧｋｅＡＴ丁Ｙ丁Ｃ＾　λ真Ｃ（２）配列番号２３の情報：（１）配列の特色：（Ａｌ長さ：３３塩基対ＣＢｌ型；核酸（Ｃ）鎖の数・一本鎖（Ｄ）トボロノー：直鎖状（×１）配列、配列番号２３：ＧＭＴＣＡＲＧＡＡＮ入入！Ｔτττｃｒ五人ｃＴｔ、ｋＧ’ｒｎＴＣＴ（２）配列番号２４の情報。

（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ、３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数　一本鎖（Ｄ）トイロジー：直鎖状（ｘｉ）配列・配列番号２４：＾Ｄ＾ＧＡＧｅｋＴＣａ％ＴＡＣＴＲＡＣＣＣＡＡ？ＣＷＧＣＡＧＡＡ丁（２）配列番号２５の情報・（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー。直鎖状（×蔦）配列：配列番号２５：（２）配列番号２６の情報：（１）配列の特色：（ｘｌ）配列：配列番号２６：コ’　Ｎ４ＣＣＴ’ＴＧＲＡＣｌＧＣ入入五人ＴＧＣＴＣＡＴ’Ｔ訳ＴｋＹｋ　＊Ｔｋ（２）配列番号２７の情報：３３（・・）配列“配列番号２７゛（２）配列番号２８の情報。

（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉｌ配列：配列番号２８；ｃｃｅＡＡｃｃｃｃｅ　入ＣＷテ＾ｃｃ　ｃｃＡＡｃｃｃｃｘｃ　ｙ（２）配列番号２９の情報・（ｘｌ）配列：配列番号、２９ −３゜７゜−３８，。３．−８゜Ｔ　ｒｃｘｃｃｅｃ。。。＝゛（２）配列＃号３０の情報：（１）配列の特色・（Ｄ）トポロジー・１宣鎖状りｘｌ）配列；配シ１１番号３ｏ：入に＾Ｃ＾ＴＣＴＧＹ　Ｇ？ＣＣＣＣ入Ａ丁τ　τ＾Ｃ八ｃへｃｃ丁＾　ＣＸＧ　３３（２）配列番号３１の情報：（Ｂ）！！２：核酸（Ｃ）鎖の数、一本鎖（Ｄ）トポロノー：ｆｌｌ鎖状（ｘｌ）配列：配列番号３１゜ＪＧＡＪＬＡＧＣＣ）ＪｋＧ　Ｔ’ＴＩＩ＾ＣＡＣ？ＧＣｋ）Ｇｅ；ＴＧｋＣＧＴ　ＹＣＣ（２）配列番号３２の清報：（Ｂ）梨・核酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｘｌ）配列　配列番号３２ｃｃｃ’ｒｘｃｃ″Ｔ　ＴＧＴＧＧＭＧｋＴ　ＣＪＪＪｋＧｋＧ＊ＴＴ　ＣＡＴ　、。

（２）配列番号３３の情報（Ｃ＞鎖の数ニー水路（Ｄ）トヂロノー、直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号：３３：入ＲＣ６τｃｔ＊ｃｃ　＊’ｒｔτ＾丁ＣＴＧ＾　＾Ｃ？テＧ入＾τＹＴＣ入＾　】３（２）配列番号３４の情報：（ｘｉ）配列：配列番号・３４：ＧＡＡＣＣＪｋＴ＊ＧＣ＾Ｃ＾ＭＴＹ入ＲＹ　ＣＣＹ（：Ｃ丁Ｔ’ＱＹＴ　６λ ＾　ココ（２）配列番号３５の情報：（ｘｉ）配列：配列番号３５：ＡＸＧＩ″１０″＾？）ＩＣＩＡＣＣＡ？Ａｊ１ｍＴＧＧＴｃＡｃτ＾Ｇココ（２）配列番号３６の情報＝（！１）配列；配列番号３６；舊ＱＭ？ＴＡＡ　ｅＡＲＡｃｃＡπＡ　ＧＣＡＴＡＡＡ７　ｍ　３３（２）配列番号３７の情報・（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トヂロノー：直鎖状（ｘｉ）配列・配列番号３７：（２）配列番号３８の情報：（Ｉｔ）配列：配列番号３８：＜２１配列番号３９の情報：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列；配列番号３９； ′″″″−゛°−°″′ａ″、。

ＩｓＸ　Ｃｏ■ｂを合成するために用いた全てのサイクル、手順、および配列のリスト３８０Ｂ　ＤＮＡ合成機用ｓ・ｔ／ｚ−７ｏ　１ビーデイスクに収容されている（以下余白）フ了４１し偽１イア°　イ５１へ□ワ′１ノ・−一７１イルり９４７°、’　＋７−Ｆ−し’（ｌｋ＝Ｔ・１１」）Ｙづい刀７′　−系も）チー１１象７フイルシ７４７’：ｆ罰つ６子゛廉５ＴＤｐＦＩＥＰ　Ｈ２フ、　１ｇ引　９８　２７．！９１　ｍ１ｗ５Ｈ！　− ア　・１．嘗ダ８８　「　・１，１９８８Ｉｓ’Ｘ−２＠８　２７．＋９引　＠ＩＩ　２７．Ｉｌ’ｌｌ　−１５Ｘ−Ｉ　ＩＩ　２フ、１９’ＩＩ　１１８　２７．　１９９１Ｃ僕シ１；ｊ’Ｌ（り（仄ｑ１つ暁。

（；賢田１：、慢く１（二ｔ！’、１：ｉ叩ト（）（１人丁企白）い×Ｔ光ｂ）（１・弓♀諭）（１・人−Ｆ４ｒ白）Ｓ’−ｉｉ！Ｔ　Ｇｎ　Ｔａ２　ＴＴＨＴＴＧ　Ｔ％ｉ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴｉ　ＴＴｌｉ　ＴＴＧ　ＴＴ６ＴＴＳ　ＴＴｉｉ　Ｔ１５　ＴＴＧｉ　ＴＴｌｉ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ｍ　ＴＴＴ、ＴＴＴ　ＴＴ　−３’Ｓ’−ｍ　Ｇ関　Ｔｅ３　Ｔ　−３’ フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：９２）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＨＡＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーシヨンアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、ＨＡＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、オリゴヌクレオチド酸マルチマーに実製的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＡＶ核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、合成オリゴヌクレオチド：【配列があります】（配列番号：６）【配列があります】（配列番号：７）【配列があります】（配列番号：８）【配列があります】（配列番号：９）【配列があります】（配列番号：１０）【配列があります】（配列番号：１１）【配列があります】（配列番号：１２）【配列があります】（配列番号：１３）【配列があります】（配列番号：１４）【配列があります】（配列番号：１５）【配列があります】（配列番号：１６）【配列があります】（配列番号：１７）【配列があります】（配列番号：１８）【配列があります】（配列番号：１９）【配列があります】（配列番号：２０）【配列があります】（配列番号：２１）【配列があります】（配列番号：２２）【配列があります】（配列番号：２３）【配列があります】（配列番号：２４）【配列があります】（配列番号：２５）【配列があります】（配列番号：２６）【配列があります】（配列番号：２７）
２．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：３８）を含む、請求項１に記載の合成オリゴヌクレオチド。
３．ＨＡＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、ＨＡＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、核第一セグメントが、以下からなる群から選択される、合成オリゴヌクレオチド：【配列があります】（配列番号：２８）【配列があります】（配列番号：２９）【配列があります】（配列番号：３０）【配列があります】（配列番号：３１）【配列があります】（配列番号：３２）【配列があります】（配列番号：３３）【配列があります】（配列番号：３４）【配列があります】（配列番号：３５）【配列があります】（配列番号：３６）【配列があります】（配列番号：３７）
４．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：３９）を含む、請求項３に記載の合成オリゴヌクレオチド。
５．ＨＡＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであって、該セットは２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、各オリゴヌクレオチドが、ＨＡＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、オリゴヌクレオチド酸マルチマーに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＡＶ核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、合成オリゴヌクレオチドのセット：【配列があります】（配列番号：６）【配列があります】（配列番号：７）【配列があります】（配列番号：８）【配列があります】（配列番号：９）【配列があります】（配列番号：１０）【配列があります】（配列番号：１１）【配列があります】（配列番号：１２）【配列があります】（配列番号：１３）【配列があります】（配列番号：１４）【配列があります】（配列番号：１５）【配列があります】（配列番号：１６）【配列があります】（配列番号：１７）【配列があります】（配列番号：１８）【配列があります】（配列番号：１９）【配列があります】（配列番号：２０）【配列があります】（配列番号：２１）【配列があります】（配列番号：２２）【配列があります】（配列番号：２３）【配列があります】（配列番号：２４）【配列があります】（配列番号：２５）【配列があります】（配列番号：２６）【配列があります】（配列番号：２７）
６．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：３８）を含む、請求項５に記載の合成オリゴヌクレオチド。
７．ＨＡＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであって、該セットが、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、各オリゴヌクレオチドが、ＨＡＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＡＶ核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、合成オリゴヌクレオチドのセット：【配列があります】（配列番号：２８）【配列があります】（配列番号：２９）【配列があります】（配列番号：３０）【配列があります】（配列番号：３１）【配列があります】（配列番号：３２）【配列があります】（配列番号：３３）【配列があります】（配列番号：３４）【配列があります】（配列番号：３５）【配列があります】（配列番号：３６）【配列があります】（配列番号：３７）
８．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：３９）を含む、請求項７に記載の合成オリゴヌクレオチド。
９．試料中のＨＡＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、以下の工程を包含する、アッセイ：（ａ）核試料を、過剰の（ｉ）請求項５に記載の合成オリゴヌクレオチドのセットを含む増幅プローブ、および、（ｉｉ）ＨＡＶＲＮＡのセグメントに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、捕獲プローブオリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した核オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）その後、固相に結合していない物質を分離する工程；（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーシヨン条件下で接触させる工程であって、核マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくともつのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程（ｅ）非結合マルチマーを除去する工程；（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌクレオチドと、ハイプリダイズする条件下で接触させる工程；（ｇ）非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および（ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。
１０．試料中のＨＡＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、以下の工程を包含する、アッセイ：（ａ）該試料を、過剰の（ｉ）ＨＡＶＲＮＡのセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、増幅プローブオリゴヌクレオチド、および、（ｉｉ）請求項７に記載の合成ヌクレオチドのセットを含む捕獲プローブのセットと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した核オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）その後、固相に結合していない物質を分離する工程；（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、該核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーシヨン条件下で接触させる工程であって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程；（ｅ）非結合マルチマーを除去する工程；（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｇ）非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および（ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。
１１．試料中のＨＶＡの検出のためのキットであつて、以下の相み合わせを含む、キット：（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、核増幅プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＶＡ核酸のセグメントに実費的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、セット：（ｉｉ）捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、核捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＡＶ核酸のセグメントに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、セット：（ｉｉｉ）核酸マルチマーであって、核マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実費的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である少なくとも１つの第二オリゴヌクレオチド単位を含む、核酸マルチマー；および（ｉｖ）標識オリゴヌクレオチド。
１２．それらの使用のための指示書をさらに含む、請求項１１に記載のキツト。
１３．前記増幅プローブオリゴヌクレオチドのセツトが、請求項５に記載の合成オリゴヌクレオチドのセットを含む、請求項１１に記載のキット。
１４．前記捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットが、請求項７に記載の合成オリゴヌクレオチドのセットを含む、請求項１１に記載のキット。