JPH07501883A - ダイオキシン類似化合物の間接的な免疫学的検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 これまで数十年にわたり、ダイオキシンは熱心な公共的かつ科学的調査の対象に なってきた。これはその強い毒性たけてなく、それが環境中に広く拡散して存在 すると考えられているからである。ダイオキシンの毒性学的な側面は、主として 、動物モデル及び細胞培養系を用い、生物学的な作用のメカニズムの研究を介し て取り組まれてきた。加えて、ダイオキシンか人の健康に与える潜在的脅威は、 ダイオキシンに曝されたことか知られている人口集団の疫学的な研究を介する、 ごく限られた方法で取り組まれてきた。その環境的な問題点は、ダイオキシン及 びその関連物質の製造、放出、及び最終的な処理の研究を介して取り組まれてき た。これまで２０年間に、ダイオキシンについて広範囲な研究か行われてきたか 、生物系におけるダイオキシンの毒性の正確なメカニズム及び環境的な分布の範 囲は判っていない。これは、ダイオキシン及びその関連化合物に生物系が曝され たことを評価する簡単な方法か無かったことに、一部起因している。

環境におけるＴＣＤＤ及びその関連化合物用語“ダイオキシン”は、ニュースの 媒体で通常使用されているように、２，３゜７．８−テトラクロロジベンゾ−ｐ −ダイオキシン（ＴＣＤＤ）を短縮した言葉である。

ＴＣＤＤは、ポリ塩化ノヘンゾーｐ−ダイオキシンの僅か１種（同種化合物）に すぎず、構造か塩素原子の数及び位置に従って変化する花種の可能な同種化合物 かある。

混乱のもとになるのは、用語”ダイオキシンか、特にＴＣＤＤだけてなく、一般 にＰＣＤＤ　（ポリ塩化ジベンゾダイオキシン）を示すのに使用されていること である。

生物学的にいうと、ＴＣＤＤか最もあり得るＰＣＤＤてあり、はとんとの他のＰ ＣＤＤ類は数千から数百万の範囲の因子によってそれほと活性ではない。ＴＣＤ Ｄは、全てのＰＣＤＤＣＤ化合物のうち最も広く研究されてきた。

数種の他の芳香族炭化水素は、特に側鎖の位置か塩素で置換された場合、ＴＣＤ Ｄと生物学的特性か共通である。これらのうち最も重要なのはポリ塩化ジベンゾ フラン（ＰＣＤＦ）及びポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ　＞の特定のものである。

可能なＰＣＤＤ（７５）　、ＰＣＤＦ　（１３５’）及びＰＣＢ　（２０）同種 化合物の大きな数は、環境的分析を大いに複雑化させ、かつこのような分析に取 りかかることかできるようになる前に、複合体の除去工程を必要とする。本願明 細書において、　“ダイオキシン類似”とは、これらの同種化合物及び同し細胞 効果を引き起こす他の化合物全てを含む。

ＴＣＤＤが化学的かつ公共的に注意を引くようになったのは、１９７０年代前半 であり、２、４．５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ　）誘導体が 、合衆国とベトナムで森林への噴霧計画により著しく除草剤及び枯れ薬剤として 使用されたことと関係しＴＣＤＤの分子特性（化学的不活性、非極性、脂質溶解 性）は、このＴＣＤＤを、水性溶液から生態濃縮され、かつ脂肪組織に蓄積され る典型的な化合物にしている。

舊歯類では、ＴＣ叩の全体内半減期は数週間の範囲であり、これはある−人の男 性について報告されているＴＣＤＤの半減期（５，８年）と比へ短い。ＴＣＤＤ と関連毒性ハロゲン化芳香族炭化水素の毒性及び生物学的効果は、多くの因子、 例えば毒素の投与量、投与経路、動物の種、年齢、系統及び性別に依存している 。ＴＣＤＤか引き起こす毒性の面白い面は、この化合物に対する感受性か大きく 種に依存することである。薩歯類の間では、ＬＤＳ、　（テスト集団の５０％か 死ぬ投与量）は、感受性か高いモルモットから比較的抵抗性のあるハムスターま で少なくとも２５００倍の範囲で変化する。ＴＣＤＤの全体内半減期はモルモッ トとハムスターの間で僅か３倍異なるたけであるから、２つの種の間のＴＣＤＤ ＣＤ性に関する大きな変動は、ＴＣＤＤの生体内代謝速度の相違といった単純な ものではない。ＴＣＤＤの急性毒性か襲う特徴は、直ぐに死に至らしめるといっ たものではない。その動物は数日から数週間にわたり食欲不振に陥り痩せ衰える のである。この拒食のメカニズムは不明であるが、明らかなのは脳におけるＴＣ ＤＤの直接の効果てはないということである。

ＴＣＤＤに対する人間の感受性については知られていない。ＴＣＤＤに曝された 人間について、広範囲の障害及び症状か報告されている。ＴＣＤＤに職業土曜さ れた作業員に関する最近の遡及的な研究によると、２０年の潜伏期間を経て軟組 織の肉腫か増加することが示唆されているが、ＴＣＤＤて確実に人間か死ぬと結 論付けるのは難しい。ＴＣＤＤが示す環境的な健康への脅威の範囲を評価するに はさらに多くの作業が必要である。現在のところ、おそらく人間は、はとんとの 実験室て用いられている薩歯類よりもＴＣＤＩ）の効果に対する感受性か低いと 結論するのが妥当なようである。そして、あたかも感受性の最も高い種であるモ ルモットか、ダイオキシンに曝されることから起きる危険性か、人間についても 存在するというのは、確かに妥当てはない。

身体的な症状に加えて、ＰＣＤＤ及びＰＣＤＦは、哺乳類及び哺乳類の細胞培養 系において生物化学的な効果も発揮する。最も顕著で特徴的な応答の一つは、ミ クロソームのベンゾ［ａｌピレンヒドロキシラーゼ（アリール炭化水素ヒドロキ シラーゼ（ＡＩ（Ｈ）及び数種の関連チトクロムＰ−４５０依存性モノオキシゲ ナーゼ）の誘導である。薬剤代謝酵素の誘導は、誘導物を排泄できるような、よ り水溶性の形態に転換する生物学的機序に役に立つ。ＡＨＨ及びδ−ＡＬＡ　（ δ〜アミルプリン酸）ンンセターゼ活性の誘導という点からみると、ＴＣＤＤは 、３−アミノコランスレン（ＭＣ）のような他の誘導剤よりも、さらに大きく効 果的なものである。ＴＣＤＤはＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ同種化合物のうちで最も効果 的なものである。構造−活性の傾向は、誘導性（及び毒性）は、主として第２． 　３．　７及び８位のすへてか置換された同種化合物と関連することを示してお り、この効果は、非側鎖部位での塩素の付加又は側鎖部位からの塩素の除去によ り低下する。

ＴＣＤＤの緩慢毒性に関する１つの仮説は、その毒性に誘導された千１〜クロム Ｐ−４５０レヘルの上昇か脱脂肪酸の酸化速度を上げ、その結果、細胞膜の無傷 な状態を崩壊させるというものである。

作用のメカニズム 動物におけるＴＣＤＤ作用の様式を明らかにする包括的なメカニズムは、該化合 物に最初に曝されてから著しい毒性症状の発現を介する全ての事項について、分 子的なベースで説明するものでなけらはならない。それは幾つかの器官系（例え ば、リンパ系、肝臓、生殖器なと）に関して毒性及び生物学的効果たけてなく、 種間の効果、及び薬剤代謝酵素のレベル変化のような生物化学的現象についても 説明てきなけれはならない。

大きな一連の証拠は、ＴＣＤＤ及びその類似化合物と関連した生物学的及び毒性 応答は、毒素の直接的損傷の結果ではないことを示唆している。タンパク質又は 核酸とのＴＣＤＤ誘導共有付加物の形成を実証する証拠は何も示されていない。

しかし、ＴＣＤＤの毒性効果の多くはＡｈ（アリール炭化水素）レセプターとし て知られている特定のタンパク質に媒介されていることが示されている。レセプ ター媒介メカニズムに関連した一連の事項は、（ａ）毒素を細胞への導入、（ｂ ）　Ａｈレセプターに対する毒素の結合、（ｃ）ＤＮＡ認識部位へのレセプター リガンド複合体の結合、（ｄ）特定遺伝子の発現、及びそのタンパク質生成物の 翻訳、並びに（ｅ）発現されたタンパク質の作用の様式を含むこととして、明確 に合理的に解釈することができる。

分子レベルで十分に合理的に解釈できる初期の事項（ａ−Ｃ）と明らかな毒性の 最終的な表現（ｄ及びｅ）の間には大きなギャップがある。

ＴＣＤＤの外皮生育因子（ＥＧＦ）様効果は、その膜構成要素に影響を与える能 力に起因する。例えば、ＴＣＤＤはプラズマ膜εＧＦレセプターのレベルを高く 規定し、かつリン酸化を介してＥＧＦレセプターを活性化すると考えられている プロティンキナーゼＣの活性を高める。さらに最近の研究は、ＴＣＤＤはある細 胞株におけるプロティンキナーゼＣだけでなく、ホスホリパーゼＣの活性を高め ることか示されている。

レセプタータンパク質に関する初期の証明マウスにおける遺伝学的多形成の初期 の研究では、３−メチルコランスレンは、非応答性ＤＢＡ近文系マウスではなく て、応答性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ近交系マウスにおいて、ＡＨＨ活性を誘導できるこ とか示されていた。交雑研究により、支配的な特徴として分離された応答性フェ ノタイプは（他の芳香族炭化水素に誘導される応答に類似する。）、単一の常染 色体遺伝子により支配されていることが示された。多くの芳香族炭化水素に対す る応答を明らかに制御する位置は、この同種化合物に対する応答を調節すると推 定されている。

ＡＨＨ及びδ−ＡＬＡシンセターゼを誘導するＴＣＤＤの能力は、研究音速に酵 素活性を最終的に引き起こす膜通過シグナルとして、作用する誘導レセプターの 存在を仮定させた。放射性同位元素でラベルしたＴＣＤＤの合成により、ＴＣＤ Ｄと特異的に結合し、かつレセプターのすへての特性を示すＣ５７ＢＬ／６マウ スの肝臓のタンパク質か特定された。アリール炭化水素（Ａｈ）レセプター（す なわち、場合によってはダイオキシンレセプター）として知られている、このレ セプターの発見か重要なのは、分子レベルにおけるＴＣＤＤの作用と、明らかな 毒性又は酵素レベルの変化といった観察てきる現象の間を橋渡しすることである 。事実、現在の見解では、ＴＣＤＤの全ての公知の効果はＡｈレセプターを介す るものであろうというものである。

ダイオキシンの毒性掌上の多くの未解決の問題の１つは、何故生物かＴＣＤＤに 対するレセプターを在さなければならないかということを問いかけている。ひと つ示唆されているのは、Ａｈレセプターか、高度の親和性でＡｈレセプターに結 合し、かつまた数種の混合画分オキシダーゼの生成を引き起こす、ＴＣＤＤに類 似するベンゾ［ａｌピレンのような燃焼生成物を解毒するために、進化したとい うものである。

Ａｈレセプターに対するＴＣＤＤの結合か、偶然にベンゾ［ａｌピレンのような 若干の他の外因性リガンドの役割を果たしていると推定できることを暗示してい る。他方、ＴＣＤＤは、またその重要な生理学的役割か明らかになっていない内 因性リガンドと置き変わるのかも知れない。この捕らえにくい天然のりガンｊへ の同定と機能に関する研究は現在の晋命に行われている研究のトピソクスである 。

種及び組織特異性 Ａｈレセプタータンパク質は、数種の哺乳類及び非哺乳類から得た組織で同定さ れている。Ｃ５７ＢＬ／６マウスか、比較的高い肝臓レベルの、ＴＣＤＤＣＤ性 （タンパク質１ｍｇあたり４０−１２０　ｆｍｏｌ　）　Ａｈレセプターを有す ることか見い出されており、かつＴＣＤＤて誘導される毒性に非常に感受性か強 い。対照してみると、初期の研究では、ＤＢＡ／２系統マウスか、低い肝臓レベ ルの、ＴＣＤＤＣＤ性（チトクロムタンパク質１ｍｇあたりｌ　ｆｍｏ１未満） Ａｈレセプターを有し、ＴＣＤＤ毒性に比較的抵抗性であることか示されている 。

また、このＡｈレセプターは幾つかのヒト組織で同定されている。ヒト組織から 得たＡｈレセプターはＤＢＡ／２系統マウスの肝臓から得たレセプターとよく似 ており、安定因子としてモリブデイトを必要とする。ステロイドホルモンレセプ ターか組織特異性を示すのと全く同しように、Ａｈレセプターは、ＴＣＩ）Ｄに 感受性である肝臓及び幾つかの非肝ｌ！組織で検出されている。ラットにおいて は、Ａｈレセプターは胸腺、柿、肝臓、腎臓、脳、精巣及び骨格筋で検出されて いるか、膵臓、副腎又は腹部前立腺では検出されていない。

リガント特異性 Ａｈレセプターに対する、ＰＣＤＤ及びその構造的類似ハロゲン化芳香族化合物 の結合に関する構造−活性関係の研究により、リガントの結合部位は疎水性であ って、はぼ１．ＯｎｍＸ０．３　ｎｍ方形の分子サイズを有する平面的な非極性 リガンドに優先的に適応することか示されている。ＴＣＤＤは仮定された結合部 位のサイズに最も近く、最も強く結合し、かつまたＰＣＤＤのうち、生物学的に 最も強い同種化合物である。

４ケ所の位置（２，３，７及び８）のうち少なくとも３ケ所か塩素で置換されて いるＰＣＤＤ及びＰＣＤＦは、Ａｈレセプターに最も強く結合する。これらの位 置から基を除去するか、又は非側鎖の位置に塩素原子を付加することにより、結 合親和性か著しく減少する。３−メチルコランスレンのようなＴＣＤＤに構造的 に似ている他の化合物も高い親和性でＡｈレセプターに結合する。

リガント結合 レセプターへのりガントの親和性は、速度論（結合速度）又は平衡論（会合の内 在的強度）との関連で論することかできる。親和性に関するこれらの理論の区別 はレセプターの論文において混乱のもととなっており、リガンド−レセプターの 会合に関し以前に報告された多くの平衡定数（Ｋｄ）は、それらに本来特徴かあ るとする有意性かないことを、いまここで明らかにしておく。

インビトロでの最適なＡｈレセプター−リガント結合ては、高度に還元的で、生 理学的なｐＨて緩衝されており、かつカルシウム依存性プロテアーゼに対し保護 されている環境か要求される。加えて、Ａｈレセプターに対するＴＣＤＤの結合 はＡＴＰとチオール基の存在に依存することか明らかである。このＡＴＰに対す る要求性は、結合したＴＣＤＤに誘導されたＡｈレセプターのサイクリックリン 酸化及び脱リン酸化を反映したものであると示唆されている。

現在までに研究された、ＴＣＤＤとほとんと全てのＡｈレセプターの相互作用に 関する平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｎＭの範囲であると推定されている。弱い結合 か非応答性ＤＢＡ／２マウス及び人レセプターとて観察されている。これらの測 定は、副反応かなく、結合か単純に平衡である場合にのみ作動であるスカチャー ド分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて行われる。不運なこ とに、はとんどの種から得られたＡｈレセプターはインビトロで急速に熱不活性 化する。これはＡｈレセプターをリガンドと結合できないようにするためである 。これらの条件の下では、スカチャート分析のような平衡法を用いて結合親和性 を測定すると、結合の実際の強度を過少に評価することになる。さらに最近の研 究では、結合は以前に考えられえいたよりも実質的に強いことか示されている。

新しい実験的アプローチでは、Ｋｄ値はｎＭではなく、ｐＭの範囲と結論付けら れている。

数種の薩歯類から得た肝臓Ａｈレセプターに対するインビトロでのＴＣＤＤ結合 の速度か研究されてきた。すべての場合において、結合は急速であり（室温にお ける飽和半減期は、１０１Ｍのリガント濃度で１時間未満である。）、かつ変遷 状態での水素結合の再構成と関連付けることができる、活性化の実質的なエント ロピーと関連するものである。このエントロピーという用語は、活性化の大きな 正のエントロピー（疎水性効果として説明することかできる。）、すなわち水に よる結合部位の溶媒和の損失及び溶媒和した水の容量水への転換によって、相殺 されるものである。この解釈は結合に伴うタンパク質における、実質的な構造的 変化と矛盾かない。

定量的な構造−活性関係（ＱＳＡＲ）を用いて、人間を含む多くの種から得たＡ ｈレセプターに対する、異なるＰＣＤＤ、　ＰＣＤＦ及びＰＣＢ同種化合物の相 対的な親和性か研究されてきた。ここで−貫して認められることは、親和性か、 リガントの脂肪親和性（ここでまたレセプター−リガンド結合の疎水性を強調す る。）と強く相関することである。しかし、水素結合能力及び置換基の電子供与 性又は電子吸引性のような他の因子の重要性は、各種化合物の間で相違する。現 在入手できるデータによると、毒性はＡｈレセプターに対するリガントの結合親 和性と強く相関することか明らかである。

発明も目的 本発明の各種の目的、利点及び特徴は、続く詳細な説明で容易に明らかになるも のであり、かつ新規な特徴は添付された請求の範囲に具体的に指摘されるであろ う。これら及び他の目的は、本発明と一致するものである。

発明の要約 本発明は、リガント−レセプター相互作用の性質、例えば、高度な親和性及び特 異性を有するリガンドに対する結合、細胞内におけるシグナル形質導入パターン の媒介、及びレセプターの分化遺伝アイソホーム、並びにリガンド−レセプター 相互作用に関連する酵素と細胞タンパク質を利用する、免疫学的検定法を提供す るものである。リガンド−レセプター相互作用に関連する各種リガント又は材料 を、リガンド−レセプター複合体又はリガンド−レセプター複合体の形成の結果 を測定することにより、間接的に検出し、かつ定量することかできる。

本発明の一実施態様において、本発明の間接的な免疫学的検定法は、ダイオキシ ン、ポリ塩化ビフェニル及び多環式芳香族炭化水素を含む、幾つかの重要な環境 中に拡散された化学物質を定量するものである。本発明の検定法は、抗体を用い て直接的に環境的な汚染を検出するものではなく、細胞相互のレセプター及び関 心かもたれている汚染の相互作用を検出するものである。この検定法は現場で直 接、キットとして使用できるものであり、測定すべき試料に存在するもの以外の 他の環境的汚染物質を含まないものである。この検定法は、現存する機器を用い る方法よりも低コストで数分のうちに実施することかでき、かつ数百におよぶ空 気、水又は土の試料の結果を、現場で得ることかできる。現場において結果が得 られるということは、改善努力の迅速な評価を可能にする。この検定法は、（１ ）干渉性物質を除く除去工程を伴わない試料抽出工程を採用し、関心をもたれて いる汚染に対する（１１）高度の感受性及び（山）高度の選択性を伴うものであ る。

本発明の好ましい実施態様は、哺乳類の細胞に見いだされるＡｈレセプター（ア リール炭化水素）に媒介されるタンパク質チロシンリン酸化（ｐＴＰ）を基礎と する、ダイオキシン類似化合物のインビボ及びインビトロ定量に関するものであ る。タンパク質チロシンリン酸化の範囲をタンパク質チロシンホスフェートに対 するモノクローナル抗体により測定することかできる。タンパク質チロシンホス フェートの量及び性質は、ダイオキシンに曝された動物又は細胞のインビボ又は インビボ濃縮に定量的に関連する。この実施態様は、１０１分の１及び１兆分の １という濃度でダイオキシン類似化合物の検出を可能にする。

この間接免疫学的検定法は、ダイオキシン、ポリ塩化ビフェニル又は多環式芳香 族炭化水素に対する個人的な以前の化学物質暴露を評価するよう適応させること かできる。他の環境的な化学物質に対する暴露の測定方法をとして、生物学的応 答を測定する池の検定法の例には、オルガノホスフェート綬虫剤に曝された反映 として血清コリネステラーゼ活性を、また煙草の煙に曝された反映として血清チ オシアナートのレベルかある。

本発明の他の実施態様には、リガンド−レセプター相互作用を測定する免疫学的 検定法を用いるフェノタイプ腫瘍細胞に対するものかある。腫瘍の生検試料のフ ェノタイプ化により、新生物性疾患の化学療法に関する適当な治療戦術の決定を 助けることかできる。特に好ましい実施態様は、胸部及び結腸の癌細胞のフェノ タイプ化である。ＡｈレセプターのｐＴＰフェノタイプは、低濃度ＴＣＤＤて生 検試料を処理することにより、これらの腫瘍細胞を検出することかできる。同し 腫瘍細胞の無処理コントロールに対し、ＴＣＤＤ処理細胞におけるｐＴＰにおけ る増加か現れることは、腫瘍細胞に対する最も効果的な潜在的治療剤であること を示している。

同様に、正常なリンパ芽球のＡｈ　ｐＴＰフェノタイプ化を実施できる。ｐＴＰ の増加は、ダイオキシン類似化合物に高度な親和性を有するＡｈレセプターの存 在を示している。この知見か暗示するものは、高度に親和性のフェノタイプを有 する個人は、ＰＣＢ又は多環式芳香族炭化水素の暴露に続く、ある癌の発達にさ らに感受性かあることである。

本発明の他の特徴及び利点は、添付した図面に言及する次の本発明の詳細な説明 から明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 例として挙げる次の詳細な説明は、添付した図面との関係で最も良く理解される であろう。

図１は、ＰＣＤＤ及び他の構造的に関連する化合物のテトラクロロ同種化合物に 関する化学構造及び関連する環のナンバリングシステムを図示する。ＴＣＤＤ− テトラクロロジヘンゾーｐ−ダイオキシン　ＴＣＤＦ＝テトラクロロジベンゾフ ラン、ＴＣＢＰ＝テトラクロロビフェニル、　ＴＣＡＢ−テトラクロロジゾヘン ゼン。

図２は、酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した投与量一応答関係を図 示する。このＥＬＩＳＡでは例えば、実施例１の動物の項に記載したように、雌 Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２．３．７．８−テトラクロロジヘンゾーｐ−ダイオキ シン（ＴＣＤＤ）を様々な投与量となるように腹膜内注射て投与した。ＥＬＩＳ Ａは、抗ホスホチロシルモノクローナル抗体を用いて実施し、その応答は、投与 後２４時間の総肝臓Ｓ−９タンパク質チロシルリン酸化を測定した。最大総タン パク質チロシルリン酸化か２μｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇて観察され、平均有効投与量 （ＥＤ、。）は０．５μｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇてあった。

図３は、総肝臓Ｓ−９タンパク質と抗ホスホチロンルモノクローナル抗体に関す る免疫プロットを図示する。ここでは、例えば、実施例１の動物の項に記載した ように、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス、２．３．７．８−テトラクロロジベンゾ−ｐ −ダイオキシンを様々な投与量となるように腹膜内注射て投与した。ＴＣＤＤの 投与により、投与量依存性の様式で、６種のタンパク質のｐＴＰか増加した。こ れらのタンパク質は、分子量か３７．３９．４４．４６．５１及び５２キロダル トンてあった。

図４は、免疫プロット法で視覚化した４４キロダルトンのタンパク質の濃度計測 定でめた投与量一応答関係を図示する。この免疫プロット法においては、実施例 １の動物の項に記載したように、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２．３．７．８−テ トラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンを様々な投与量となるように腹膜内注射 て投与した。免疫プロットは、抗ホスホチロシルモノクローナル抗体を用いて実 施し、その応答は、投与後２４時間の４４キロダルトンのタンパク質のタンパク 質チロシルリン酸化を測定した。最大４４キロダルトンタンパク質チロシルリン 酸化が１８ｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇて観察され、ＥＤ、。は０．０５ｇｇ　ＴＣＤＤ ／ｋｇてあった。

図５は、エトキシシソルフィン０−ジエチラーゼ検定法（ＥＲＯＤ）でめた投与 量一応答関係を図示する。この検定法においては、実施例１の動物の項に記載し たように、１ＩＣ５７ＢＬ／６マウスに２．３．７．８−テトラクロロジベンゾ −ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）を様々な投与量となるように腹膜内注射て投与 した。ＥＲＯＤは、投与後２４時間経たあと、タンパク質１ｍｇか１分間に生成 するレソルフィンのｐｍｏｌとして、総肝臓Ｓ−９チトクロムＰ−４５０＋ＡＩ を測定した。最大ＥＲＯＤ活性か５０ｇｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇて観察され、ＥＤｓ 。は５μｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇてあった。

図６は、酵素結合抗体法（ＥＬ［ＳＡ）によって測定した投与量一応答関係を図 示する。このＥＬＩＳＡでは例えば、実施例２の細胞培養系の項に記載したよう に、Ｘ３ヒトリンパ芽球腫細胞を様々な濃度の２．３．７．８−テトラクロロジ ベンゾ−ｐ−ダイオキシンに曝した。ＥＬＩＳＡは、抗ホスホチロシルモノクロ ーナル抗体を用いて実施し、その応答は、投与後１６時間の総細胞分離物タンパ ク質チロシルリン酸化を測定した。最大総タンパク質チロシルリン酸化がｌ　ｎ ｌＪ　ＴＣＤＤて観察され、平均有効濃度（ＥＣ，、）は０．　＋３　ｎＭ　Ｔ ＣＤＤてあった。

図７は、総細胞分離物タンパク質と抗ホスホチロンルモノクローナル抗体に関す る免疫プロットを図示する。ここでは、例えば、実施例２の細胞培養系の項に記 載したように、Ｘ３ヒトリンパ芽球腫細胞を様々な濃度の２．３．７．８−テト ラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンに曝した。免疫プロットは、暴露後１６時 間のタンパク質チロシルリン酸化を描いた。

図８は、免疫プロット法で視覚化した３３キロダルトンのタンパク質の濃度計測 定でめた投与量一応答関係を図示する。この免疫プロット法においては、実施例 ２の細胞培養系の項に記載したように、Ｘ３ヒトリンパ芽球腫細胞を様々な濃度 の２．３．７．８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンに曝した。免疫プ ロットは、抗ホスホチロノンモノクローナル抗体を用いて実施し、その応答は、 暴露後１６時間の３３キロダルトンのタンパク質のタンパク質チロノルリン酸化 を測定した。最大３３キロダルトンタンパク質に関するチロシルリン酸化か０． １μｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇて観察され、ＥＣ，。は０．０４μｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇ てあった。

図９は、エトキソレソルフィン０−ジエチラーゼ検定法（ＥＲＯＤ）でめた投与 量一応答関係のプロビットモデルを図示する。この検定法においては、例えば、 実施例２の細胞培養系の項に記載したように、Ｘ３ヒトリンパ芽球肝細胞を様々 な濃度の２．３．７．８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ ）に曝した。ＥＲＯＤは、投与？＆１６時間の細胞１０’個か１分間に生成する レソルフィンのｐｍｏ　ｌ　として、総細胞分離物チトクロムＰ−４５０１ＡＩ を測定した。最大ＥＲＯＤ活性かｌ　ｎＭ　ＴＣＤＤて観察され、εＣ３Ｑは０ ．３　ｎＭ　ＴＣＤＤてあった。

図１０において、ダイオキシン濃度の三次元プロットは、グリッドサンプリング パターンから汚染の発生点を限定する。グリツドの表面は、２７２カ所の試料採 取への束−西及び北−西座標を表す。垂直方向のしｉ、答は、各試料におけるダ イオキシン類似物質の濃度を表している。

図１１は、Ａｈレセプターとダイオキシン類似化合物の相互作用を図解的に表現 したものである。ダイオキシン類似化合物は暗い三角形で表されている。

図１２は、抗−ＭＡＰＳ抗血清３２１によるマウス肝臓シトツルタンパク質を識 別したものである。レーン５〜１１及び１３は、血清の各種希釈濃度における、 Ａｈレセプターの１００キロダルトン非結合形懇の血清認識を描いている。

図１３は、抗−ＭＡＰＳ抗血清３７７によるマウス肝臓シトツルタンパク質を認 識したものである。レーンｌ、２及び１９は、タンパク質を染色した標準タンパ ク質である。レーン５及び１８は、タンパク質を染色したシトツルである。レー ン１２〜１５はレセプターの１００キロダルトン非結合形態の血清認識を描いて いる。

好ましい実施態様の詳細な説明 実施例Ｉ 化学物質 すへての化学物質は市場から購入し、かつ入手できる最高の純度のものであった 。

動物 ｆｉｃ５７ＢＬ／６マウス（又はチトクロムＰ−４５０１Ａ＋誘導性系統マウス ）を入手した（入手先　Ｈａｒｔｏｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ；　Ｉｎ ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）。実験は、４〜６週齢で体重的１６〜２０ｇの 雌マウスを用いて実施した。マウスにはプロラボＲＭＨ１００Ｏラット、マウス 及びハムスターフート（Ａｇｗａｙ、　Ｃｏｒｔｌａｎｄ、　ＮＹ）を供餌し、 水道水（ａｄ　Ｉｉｂｉｔｕｍ）を与えた。全てのマウスを３〜５匹づつケージ に収容し、光照射時間を１２時間となるよう維持した。各マウスにコーンオイル 単独、又はＴＣＤＤ（Ａｎａｌａｂｓ）を０．２５．０．５．１．２．４．１０ ．５０μｇ／ｋｇを腹膜内に注射しく注射の容量はマウスあたり０．１〜０．２ 　ｍｌ）　、２４時間経過後殺した。３倍容の０．１５　Ｍ　ＫＣＩでその肝臓 を均質化して、肝臓Ｓ−９画分を調製した。続いて、９０００　Ｘ　ｇて２０分 間遠心分離し、上清（Ｓ−９）画分を注意深く除去し、速やかに一８０°Ｃに冷 却貯蔵した。

ＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡを、抗原を前もって被覆した９６ウエルマイクロタイタープレートを 使用して行った。Ｓ−９を抗原として使用し、０．４〜５００μｇタンパク質／ ｍｌ　ＰＢＳの範囲で、等比数列的に連続希釈して調製した。各希釈液からＩ／ ｌ０ｍ１を、４連となるよう、マイクロプレートのウェルにピペットで迅速に入 れた。このプレートを４°Ｃて一晩インキュベートした。リン酸緩衝食塩水（Ｐ ＢＳ）に溶かした０、０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ボリオキシエチレンソルヒタンモ ノラウレート）溶液で洗浄した後、個々のウェルを、３７°Ｃて２時間、牛血清 アルブミン（２０ｍｇ／　ｍｌ　ＰＢＳ）　０．２　ｍｌで満たした。次いて該 ウェルを、牛血清アルブミンＯ，１ｍｌと０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０　（ＰＢ Ｓに溶解）中の抗ホスホチロシンモノクローナル／６抗体（１，５μｇ／ｍｌ　 腹水）とともに、インキュベー１へし、２２°Ｃて１〜１．５時間維持した。セ イヨウワサビペルオキシダーセ結合抗マウスＩｇＧ　（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　 Ｌｏｕｉｓ：　０１５月０３ｍｇ　ＩｇＧ／　ｍｌ　ＰＢＳ）とともにインキユ ベートし、続いて、本来のモノクローナル抗体を使用して洗浄を行った。

１００　ｍＭクエン酸すｌ・リウム溶液（ｐ）！　４．２）に溶かした基質（０ ，０３％Ｈ２Ｏ２及びｌ閘２゜２°−アジノジ（ｄ−エチルベンズチアゾリンス ルホン酸−６）とともにインキュへ−１−した後、ベルオキシダーセ活性を測定 した。色変化の最初の視覚化で、Ａ４、値を記録した。

免疫プロット ＳＤＳ　ＰＡＧＥによるＳ−９タンパク質の分離を、該Ｓ−９と二倍強度ドデシ ル硫酸試料緩衝液とともに混合しく１：ｌ）　、かつ該溶液を１００°Ｃて３分 間加熱した後、１０％ポリアクリルアミドを用いた一次元ＳＤＳポリアクリルア ミドゲル電気泳動することにより行った。電気泳動のあと、ミリプロットＳＤＳ 　を気プロット装ｆｔ　（Ｍｉｌｌｉｂｌｏｔ。

ＳＤＳ　ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　（ＪＪｉｌｌｉｐｏｒ ｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ））を用いて、該タンパク質をポリアクリルアミ ドゲルからイモピロン（１ｍｍｏｂ　ｉ　Ｉｏｎ・商標）膜フイルタ−（Ｉｌｉ 　Ｉ　Ｉ　ｉ　ｐｏｒｅ）に移した。５００　ｍＡ、２５〜３０分間で完全に移 動を完了し、膜フィルター上に予備染色分子量スタンダードをトレースすること により評価した。膜フィルターを、ミルク５％を含むＴＢＳ（トリス緩衝食塩水 ）中において、３７°Ｃて３０分間インキュへ−１・することによりブロックし た。次いてこの膜を、ＴＢＳＴ　（０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＴＢＳ） 中で洗浄し、かつＴＢＳＴ中で、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（１５μ ｇ／ｍｌ）とともに−晩インキュベートした。最初の抗体を除去し、該膜をＴＢ ＳＴ中で４回洗浄した。抗体反応を視覚化するため、該膜を、ＴＢＳＴて１゜１ ０００て希釈したアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧとともに、３７° Ｃて３時間インキュベートし、ＴＢＳＴ中で３回洗浄し、かつ１５〜３０分間現 像した。免疫−染色タンパク質の分子量の測定を、参考レーンに分子量スタンダ ー）”（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）に加え、かつアミドブラックで膜フィルターを染色す ることにより行った。

レソルフィンのエステルの〇−説アルキル化検定法レしルフィン（ヒドロキシフ ェノキサシン）及びエトキシレソルフィンをモレキュラブロープ社（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｊｕｎｃｔｉｏｎ　Ｃ１ｔｙ、　ＯＲ）から購入し た。ＥＲＯＤを、エトキシ誘導体の脱アルカリ化によるレソルフィンの形成に起 因する蛍光の増加を追うことにより測定した。反応を３７°Ｃて実施した。蛍光 の基準線を５３０　ｎｍの励起波長と５８５　ｎｍの放射波長で記録した。該反 応をＮＡＤＰＨを加えることにより開始させ、かつ誘導体を脱アルキル化してレ ソルフィンにし、続いてレソルフインに伴う蛍光の連続的な増加を促した。各検 定法を実施する前に、レソルフィンアセテート（Ｓｉｇｎｍ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕ ｉｓ、　ＭＯ）から新しく発生したレソルフィンの蛍光を測定することにより、 記録を標準化した。代謝速度をＳ−９タンパク質１ｍｇについて１分間に形成さ れるレソルフィンのｐｍｏ　ｌ　ｅとして報告した。

溶液−１，０酬レソルフィンアセテートストックをＤＭＳＯ中で調製し、ホイル で包んだ小管に部分標本５０μｍ取り、使用するまで一２０°Ｃて冷蔵した。０ ．２３酬エトシキレソルフインをＤＭＳＯに溶解し、ホイルて包んだ小管に部分 標本５０μｌ取り一２０°Ｃて冷蔵した。５０ｍＭのリン酸緩衝液のストックを 、水５００　ｍｌにに、ＨＰＯ，（分子量１７４、１８）　８．７１　ｇととも にＫＨ，１（ＰＯ４（分子量１３６．０９）を加えることにより調製した。

ＮＡＤＰＨのストツタを、水１ｍ１ｌ：　ＮＡＤＰＨ９，３ｍｇ　（Ｓｉｇｍａ 、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を溶かすことにより調製した。

タンパク質の測定 重ンンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）を、タンパク質Ｉ！ ！度の分光光度測定に使用した。試験管で作用試薬２ｍｌと試料（スタンダード 又は未知）１００μｌを混合した。３７°Ｃて３０分間インキュベートすること により発色させた。吸収は５６２　ｎｍであった。作用試薬を試薬Ａ１００容量 に試薬Ｂ２容量を加えることにより調製した。

試薬Ａ０重シンコニン酸１　ｇ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｒｏｃ ｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）、Ｎａ２ｃｏ２　Ｈｚ０２ｇ、酒石酸Ｎａｙ　０．１６　 ｇ、　ＮａＯＨｏ、　４　ｇ及升ａＨＣＯｚ　Ｏ，９５ｇに水を加えて１００　 ｍｌにし、５０％ＮａＯＨ溶液でｐＨ１１，２５に調製したもの。試薬Ｂ　：　 ＣｕＳＯｓ　５Ｈ２０４，９ｇに水を加えて１００　ｍｌにしたもの。

ｍ度（Ｄｅｎｓｉｊｏｍｅｔｒｙ） 示された濃度測定を、バイオイメージ（Ｂｉｏｌｍａｇｅ　ＡＫ　Ｋｏｄａｋ　 Ｖｉｓａｇｅ　＋１０）て行った。

結果 ＥＬＩＳＡの結果は、ＴＣＤＤ／ｋｇの全ての投与量ての腹膜内投与に続く、／ ６Ｊ総肝臓Ｓ−９タンパク質チロンルリン酸化（ｐＴＰ）における投与量一応答 関係で示した。この全体にわたる双曲線的な増加は、２　ＴＣＤｒＪ／ｋｇて最 大てあった。図２は、２μｇまてのＴＣＤＤ／ｋｇの関数として、総肝臓Ｓ−９ ｐＴＰに関する投与量一応答関係を示している。ｙ＝０．２４３４１１０＋６１ Ｚ６＠ａｗｌの対数関数を４段階の投与量にわたるｐＴＰにおける増加を最も良 く示し、この関係に関する定量の係数は０．９７であった。半一最大ｐＴＰＩｉ 答（ＥＤ、、）は０．５　ＴＣＤＤ／ｋｇであった。

図３は、総肝臓Ｓ−９タンパク質と抗ホスホチロシンモノクローナル抗体に関す る免疫プロットを図示する。ＴＣＤＤの投与により、０．２５．０．５．１．２ 及び４　ＴＣＤＤ／ｋｇ投与に関連して、投与量依存性の様式で、６種のタンパ ク質のｐＴＰか増加した。

これらのタンパク質は、およその分子量か３７．３９．４４．４６．５１及び５ ２キロダルトンであった。

これらの５種のｐＴＰはコントロールレーンにおいて容易に観察てきたか、３７ キロダルトンのタンパク質は、コントロールレーンに、抗ホスホチロノンモノク ローナル抗体により、視覚化されたわずかなバントのみを有した。このことが示 すのは、正常な条件下では、非常に低いレベルのチロツルリン酸化されたタンパ ク質のみか形質転換されていない肝細胞に存在し、かつＴＣＤＤの投与が３７キ ロダルトンのタンパク質のチロシルリン酸化を生しさせたことである。

４４キロダルトンのタンパク質チロシルリン酸化とｔｉｃ５７ＢＬ／６マウスに 対するＴＣＤＤの投与量との関係か図４に示されている。このタンパク質の最大 のチロツルリン酸化は、１μｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇて観察され、かつ　このタンパ ク質のチロノルリン酸化に関するＥＤｇｏは０．５μｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇてあっ た。ＴＣＤＤの投与量と４４キロダルトンタンパク質のチロシルリン酸化との関 係は１．０７１ｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇまて直線的てあって、その定量の係数は０． ９６であった。

ＥＲＯＤ活性で測定される、チトクロムＰ−４５０１ＡＩの最大の誘導は、５０ μ［！　ＴＣＤＤ／ｋｇて観察された。この応答はｌＯμｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇ　 （図５）まで直線的であり（Ｒ＞０．９９９）、高い投与量では双曲線的になっ た（図示せず。）。チトクロムＰ−４５０［Ａｌの発現に関するＥＤｓ。は５μ ｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇてあった。これらの結果は、３日後の注射によるチトクロム Ｐ−４５０１ＡＩアリール炭化水素ビトロキンラーゼ特異的活性の誘導に関する 約３８ｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇの公開されているＥＤｓｏ（Ｐｏｌａｎｄ、　Ａ、Ｐ 、、　Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｅ、。

Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｊ、、　Ｒａｎｄ　Ｎｅｂｅｒｔ、　Ｄ、Ｗ、、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４９．５５９９．　１９７４）と■■ 一致する。

この実施例はＴＣＤＤに正常な動物を暴露することに関する幾つかの新しい知見 を明らかにする。第１に、ＴＣＤＤに対する暴露は細胞内タンパク質チロシンの リン酸化を増加させることである。少なくとも６種の細胞内（Ｓ−９）タンパク 質はＴＣＤＤ投与量の増加に伴うチロシンリン酸化の増加を示す。これらのタン パク質の１種、３７キロダルトンタンパク質はチロシルリン酸化の非常に低い状 態で構造的に存在する。ＴＣＤＤＣＤ一対する応答では、３７キロダルトンタン パク質はチロシン残基て高度にリン酸化された。第２に、ＴＣＤＤの暴露に伴っ て観察されたｐＴＰの増加は、チトクロムＰ−４５０１ＡＩの増加に先立って起 きる。今まで、チトクロムＰ−４５０１ＡＩの発現は、一般に、ＴＣＤＤ又はダ イオキシン類似化合物に対する最も敏感な指標であると考えられていた（Ｒｏｂ ｅｒｔ、　Ｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２５１．６２４．１９９１）。

ｐＴＰの増加か、チトクロムＰ−４５０１ＡＩの誘導よりも、ＴＣＤＤのずっと 低い投与量で観察されていたか、この２種の効果の投与量一応答曲線は平行であ る。双方の効果は、投与の２対数単位内にすへて記載されており、すへてのタン パク質又は４４キロダルトンｐＴＰ及びＥＲＯＤに関するＥＤｓ。はｌＯの因子 により明瞭に分離される。

この２種の投与量一応答曲線か平行であることは、通常のメジエータ−を暗示し ている。ＴＣＤＤのすへての生物学的効果はＡｈレセプターを介して媒介される と一般に考えられているので（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ５１．６２４．１９９１）、ＴＣＤＤに対するｐＴＰ応答も、Ａｈレセプターに よって媒介されるよってある。

これらの結果はＴＣＤＤの毒性に関する新しい仮説の基礎を形成する。この新し い仮説は細胞シグナル形質導入活性におけるＡｈレセプターの関与に関するもの である。リガントとＡｈレセプターとの相互作用はＡｈレセプターの脱リン酸化 及びリン酸化のｈスケ−１〜（ｃａｓｃａｄｅ）の活性化によって達成される。

得られるリン酸化カスケード（種としてチロノルリン酸化）は正常な恒常性のシ グナリングの変質をもたらす。この変質したシグナリングは細胞に関する病的な 特徴条件を起こさせ、ダイオキシン及びダイオキシン類似化合物の主要な細胞障 害である。

実施例２ 化学物質 すべての化学物質は市場から購入し、かつ入手できる最高の純度のものであった 。

細胞培養 Ｘ３ヒトリンパ芽球腫細胞（Ｇｅｎｅｔｅｓｔ、　Ｗｏｌｂｕｒｎ、　ＭＡ）を 、馬血清９％を含むＲＰＭ１１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）を入れた７５　ｃｍ” 　ＴＶフラスコで培養した。チトクロムＰ−４５０１ＡＩを発現する、とのよう な細胞又は細胞株でも使用することかできる。該細胞を００２５％（残りは空気 ）の環境において、３７°Ｃて培養した。遠心分離（１００Ｏｒｐｍ、３分間） し、容量か５０ｍ１になるよう新しい培地に再懸濁（細胞密度１．０ＸｌＯ′細 胞／ｍ１）することにより、二次培養した。ＴＣＤＤ−コーンオイル溶液を血清 とともに均質化し最終濃度を０．１０ｇｇ／ｍｌとした。このＴＣＤＤ−血清溶 液を、各フラスコあたり０．０．０２．０．０５．０．１及び１．ＯｎＭ加え、 １６時間インキュベートした。

適切なインキュベート時間か経過したのち、遠心分離で細胞を集め、３回洗浄し た（ＰＢＳ、　４０°Ｃ）。次いで、最終的に細胞を計数した。

ＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡを、抗原を前もって被覆した９６ウエルマイクロタイタープレートを 使用して行った。Ｘ３細胞分離物を抗原として使用し、０．４〜５００μｇタン パク質／ｍｌ　ＰＢＳの範囲で、等比数列的に連続希釈して調製した。各希釈液 からＩ／ｌ０ｍ１を、４連となるよう、マイクロプレートのウェルにピペットで 迅速に入れた。このプレートを４°Ｃて一晩インキュベートした。ＰＢＳに溶か した０、０５％Ｔｗｅｅｎ　２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレー ト）溶液て洗浄した後、個々のウェルを、３７°Ｃて２時間、牛血清アルブミン （２０ｍｇ／　ｍｌ　ＰＢＳ）　０．２　ｍｌで満たした。

次いて該ウェルを、牛血清アルブミン０．１ｍｌと０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０ 　（ＰＢＳに溶解）中の抗ホスホチロノンモノクローナル抗体（１，５μｇ／ｍ ｌ　液体）とともに、インキュベートし、２２°Ｃてｌ〜１．５時間維持した。

セイヨウワサビベルオキシダーセ結合抗マウスＩｇＧ　（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、 　Ｌｏｕｉｓ：　０．５ｘｌＯ’　ｍｇ、　ＩｇＧ／　ｍｌ　ＰＢＳ）を加えた インキュベート及び続く洗浄を、本来のモノクローナル抗体を使用して行った。

１００　ｍＭクエン酸ナナトリウム溶液ｐＨ４，２）に溶かした基質（０，０３ ％Ｈ７０２及び１ｍＭ２．２“−アジメジ（ｄ−エチルベンズチアゾリンスルホ ン酸−６）とともにインキュベートした後、ベルオキシダーゼ活性を測定した。

色変化の最初の視覚化で、Ａ１、値を記録した。

免疫プロット ＳＯ３ＰＡＧＥによる細胞分離物タンパク質の分離を、該細胞分離物と二倍強度 ドデシル硫酸試料緩衝液とともに混合しく１：Ｉ）　、かつ該溶液を１００°Ｃ て３分間加熱した後、１０％ポリアクリルアミドを用いた一次元ＳＤＳポリアク リルアミドゲル電気泳動により行った。電気泳動のあと、ミリプロットＳＤＳ　 を気プロット装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を用いて 、該タンパク質をポリアクリルアミドゲルからイモビロン（１ｍｍｏｂｉｌｏｎ 　・商標）膜フイルタ−（Ｍｉ　ｌ　Ｉ　１ｐｏｒｅ）に移した。５００　ｍＡ 。

２５〜３０分間で完全に移動を完了し、膜フィルター上に予備染色分子量スタン ダードをトレースすることにより評価した。膜フィルターを、ミルク５％を含む ＴＢＳ（トリス緩衝食塩水）中において、３７°Ｃて３０分間インキュベートす ることによりブロックした。次いてこの膜を、ＴＢＳＴ　（０，０５％Ｔｗｅｅ ｎ　２０を含むＴＢＳ）中で洗浄し、かつＴＢＳＴ中て、抗ホスホチロシンモノ クローナル抗体（１，５μｇ／ｍｌ）とともに−晩インキュベートした。最初の 抗体を除去し、該膜をＴＢＳＴ中で４回洗浄した。抗体反応を視覚化するため、 該膜を、ＴＢＳＴてＩ　：　１０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合抗 マウスＩｇＧとともに、３７°Ｃて３時間インキュベートし、ＴＢＳＴ中で３回 洗浄し、かつ１５〜３０分間現像した。免疫−染色タンパク質の分子量の測定を 、参考レーンに分子量スタンダード（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）に加え、かつアミトブラ ソクで膜フィルターを染色することにより行った。

レソルフィンのエステルの〇−説アルキル化検定法レしルフィン（ヒドロキシフ ェノキンアゾン）及び工１〜キンレソルフィンをモレキュラブローブ７ｆ（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｊｕｎｃｊｉｏｎ　Ｃ１ｊｙ、　ＯＲ）から 購入した。

ＥＲＯＤを、工１〜ギノ誘導体の脱アルカリ化によるレソルフィンの形成に起因 する蛍光の増加を追うことにより測定した。反応を３７°Ｃて実施した。蛍光の 基準線を５３０ｎｍの励起波長と５８５　ｎｍの放射波長で記録した。該反応を ＮＡＤＰＨを加えることにより開始させ、かつ誘導体を脱アルキル化してレソル フィンにし、続いてレソルフイン（ご仕−）蛍光の連続的な増加を促しメ＝。各 検定を実施するｆＩｉｉに、１・７ノトフインアセテーｈ（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ 、　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ７）から新しべ発生したレソルフィンの蛍光を測定するこ とにより、記録を標準化した。代謝速度を１０９個の細胞か１分間に形成するレ ソルフィンのｐｍｏｌｅとして報告した。

溶液−１，０咄１ツノルフィンアセテートストックをジメチルスルホキシド（Ｄ ＭＳＯ）中で調製し、ホイルで包んだ小管に部分標本５０μｍ取り、使用するま で〜２０°Ｃて冷蔵した。０．２３酬ニトソキレツルフインをＤＭＳＯ＋、：溶 解し、ホイルで包んだ小管に部分標本５０μｍ取り一２０°Ｃて冷蔵した。５０ ｍＭのリン酸緩衝液のストックを、水５００ｍ１にに２ＨＰＯ４（分子＠１７４ ．１８）　８．７１　ｇどどちにＫＨ，ＰＯ，Ｃ分子量１３６．０９）を加える ことにより調製した。ＮＡＩ）ＰＨのストックを、水１ｍｌにＮＡＤＰ８９．３ 　ｍｇ　（Ｓｉｇｍａ、　５ＩＬｏｕｉｓ、　ＭＯ）を溶かすことにより調製し ５た。

結果 ０．０２．０．０５．０．１．０．５及び１．ｏｎＭの濃度のＴＣＤＩＩＩに曝 したＸ３ヒトリンパ芽球ＩＩ！細胞に一ついてＥＬＩＳＡで測定した投−（ｊ証 一応答関係を図６に図示する。このＥＬＩＳＡは、抗ホスホチロノンモノクロー ナル抗体を使用して実施し、その応答は投与−１６時間後に総細胞分離物タンパ ク質チロ５ノルリン酸化を測定した。最大総タンパク質チロノルリン酸化かＩ　 ｎＭ　ＴＣＤＤて観察され、ＥＣ６，は０．　＋３　ｎＡＪ　ＴＣＤＤてあった 。

総Ｘ３ヒトリンパ芽球腫細胞分離物タンパク質及び抗ホスホヂ「フソンモノクロ ーナル抗体に関する免疫プロットは、６ｆｌ類のタンパク質に−〕いてのｐＴＰ の投惇量一応答増加を示した（１１７）。これらのタンパク質のおよその分子量 は、４７゜４３、４２．３５．３３及び２８ギロダルトンであった。５７キロダ ルトンての単一　ｐｒｐは、未処理Ｘ３細胞分離物では現れなかったか、ＴＣＤ Ｄて処理した全てのＸ３細胞には現ｔまた。１１０キロダルｌ−：／てのｐＴＰ は強度か低Ｔ−シた。

図８は、抗ボスホチロシンモノク【ｊ−ナル抗体を用いる総Ｘ３細胞分離物の免 疫プロット法で視覚化しノー３３十ロダルトンのタンパク質の濃度Ｊ１測定でめ た投与量一応答関係を図示する。３３キロダルトンタンパク質に関するチロノル リン酸化の最大値か０１μｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇて観察され、ＥＣ，。は０．０４ １Ｊｇ　ＴＣＤＤ／ｋｇてあった。

この知見は、報告されているＴＣＤＤ暴露の最も感受性か高い生物学的指標を表 している。

Ｘ３細胞もけるＴＣ［ｌ’ｌｉ：’よるチ）・りｒ、ｒ　ム１ｌ−４５（ＩＩＡ Ｉ　（ＤＢ導ｔｉｔ図９（ｔ；ｈ、され−Ｃいる。最大［ＥＲＯＤ活性か２　ｎ Ｍ　ＴＣＤＤて観察され、ＥＣ６゜は０．３ｎ藺てあった。エトキルツルフィン ｔｉｌｌ線としてモデル化した。

この実施例は、実施例１の新しい知見を支持するものてあり、かつかかる知見を 、ヒト由来形質転換細胞株におけるＴＣＤＤのノブナル形質導入効果を含むとこ ろまで広けるものである。インビボで見られるように、ＴＣＤＤに対する暴露は 細胞内タンパク質ヂロンンリン酸化の増加をもたらす。少なくとも６種の細胞タ ンパク質はＴＣＤＤ投与量増加にイ１゛い、チロノンリン酸化の増加を示した。

７番目のタンパク質（５７キロダルトンタンパク質）は、Ｘ３細胞においてチロ ノルリン酸化の非常に低い状態で構造的に存在する。ＴＣＤＤ暴露に対する応答 において、５７キロダルトンタンパク質はチロシン残基て高度にリン酸化された 。１１０キロダルトンでのルー　ｐｒｐはＴＣＤＤ濃度の増加に住い低■した。

インビボで暴露された正常な細胞を用いる場合、ＴＣＤＤ！！露により観察され るｐＴＰの増加はチトクロムＰ−４５０１ＡＩの増加よりも先である。

Ｘ３細胞において、＆Ｔｈ　ｐＴＰの増加は、チトクロムＰ−４５０１ＡＩを誘 導するＴＣＤＤの１９！ｉｎ範囲と同し範囲で観察された。この２種の効果の投 与量一応答曲線はほぼ重複した。両効果は投与量の１対数単位内で全体的に示さ れており、総ｐＴＰとＥＲＯＤに関するＥＣ，。はそれぞれ０．１３及び０．３ ｎＭてあった。しかし、３３キロダルトンタンパク質の最大チロツルリン酸化は Ｏ、Ｉ　ｎｌｉｌＴ観察され、かつＥら，は０．０４ｎＭてあった。３３キロダ ルトンタンパク質によって示される特定のｐＴＰは、チトクロムＰ−４５０ＩＡ １の誘導よりも、ＴＣＤＤ暴露指標として１０倍以上感受性かある。この２種の 投与量一応答曲線の重複は、全体に渡るｐＴＰとチトクロムＰ−４５０１Ａ＋発 現に関する通割のメツエータ−であることを暗示している。この証拠は、インビ ボｐＴＰ応答に関して、Ｘ３細胞におけるＴＣＤＩＩに対するｐＴＰｃ？答かＡ ｈ　Ｌ，セブターで媒介されることを強く示している。

実施例３ ダイオキシンに類似した化学的活性を有する物質を、経済的かー）迅速な生物学 的検定する際に使用する、：とかできる方法か得られる。次に記載するような方 法を採用して、ダイオキシン類似活性か陰性の試料を同定して、濃縮した試料か らそれらを分離できるようにし、ぞ第１により、次の高解像度化学分析で、ダイ オキシン類似活性を示す関連試料を取り扱うことかできるようになる。

Ａ　ダイオキシン類似活性のインビボ測定密閉容器の中で、少なくとも１０分間 、試料をジエチルエーテルと接触させることにより、試料のジエチルエーテル抽 出を行う（ジエチルエーテル３容量　試料１容量）。ジエチルエーテルを円錐形 の管に除去し、５°Ｃて溶媒を蒸発させて乾燥させた。残渣を最低量のコーンオ イルで溶かす（必要な場合のみ、穏やかにｂ＋．＋熱する。）。このコーンオイ ル溶液又は懸濁液を、実施例１の動物、ＥＬＩＳＡ及び免疫プロットの項記載と 同様にして、生物学的活性を測定する。免疫プロットにおける、３７ギロダルト ンホスホチロンルタンパク質を濃く染色した外観は、試料のダイオキシン類似活 性を示すことかできる。ダイオキシン類仰活性の定量を、標準曲線とＥＬＩＳＡ の結果を比較することにより、又は試料のダイオキシン類似活性に由来して増加 する６種のホスホチロンルタンパク質のいずれかを濃度計で測定することにより 、実施することかできる。

ダイオキシン類似活ｔトの検出の限界の評価を、最小有効投与量どして０２５μ ｇ、７ｋｇを採用して行うことかできる。ＴＣＤＤのこのレベルの投与は、３７ キロダルトン帯を容易に視覚化する。２０　ｇのマウスを想定すると、３７ギロ ダルトンタンパク質のチロノルリン酸化を開始するためには、ダイオキシン等ｌ ｉＩｌｉ物５ｎを含まなけれはならないであろう。この量は、ダイオキシン等漬 物１兆分の１４００を含む試料ｌ。

ｇ抽出物中に存在する。インヒポ生物学的検定法の最も関連する使用は、空気、 水又は土壌のような各種の環境ｆａｔオからダイオキシン類似化合物の生物的有 効性を測定することである。

Ｂ　ダイオキシン類似活性のインヒドロ測定密閉容器の中で、少なくとも１０分 間、試料をジエチルエーテルと接触させることにより、試料のジエチルエーテル 抽出を行う（ジエチルエーテル３容量　試料１容り。ジエチルエーテルを円錐形 の管に除去し、２５°Ｃて溶媒を蒸発させて乾燥させた。残渣を最低量のジメチ ルスルホキシ）〜に溶かす（必要な場合のみ、穏やかに加熱する。）。このジメ チルスルホキシト溶液又は懸濁液をＸ３細胞培養系に投与し、実施例２の細胞培 養系、ＥＬＩＳＡ及び免疫プロットの項記載と同様にして、生物学的活性を測定 する。免疫プロットにおける、５７キロダルトンホスホチロンルタンパク質を濃 く染色した外観は、試料のダイオキシン類似活性を示すことかできる。ダイオキ シン類似活性の定量を、標準曲線どＥＬＩＳＡの結果を比較することにより、又 は試料のダイオキシン類似活性に由来して増加する６種のボスホチロソルタンパ ク質のいずれかを濃度計で測定することにより、実施することかできる。

ダイオキシン類似活性の検出の限界の評価を、最小有効投与量として０．２ｎＭ を採用して行うことかてきる。ＴＣＤＤのこのレベルの投与は、５７キロダルト ン帯を容易に視覚化する。１００μｌインキユベートウエル（例えば、９６ウエ ルマイクロタイタープレート）を想定すると、ジメチルエーテル抽出物は、該キ ロダルトンダルトンタンパク質のチロノルリン酸化ヒを開始するためには、ダイ オキシン等漬物約３７．５１１１ｇを含まなければならない。この量は、ダイオ キシン等漬物を１兆分の２０を含む試料２ｇの抽出物に存在するものである。約 ３７．５ｐｇを含まなければならない。３３キロダルトンタンパク質を用いてダ イオキシン類似活性を定量した場合、ＥＣ，。０．０４ｎＭての応答に基づく検 出の限界は、約４１ｐｔである。一般に、ダイオキシンの作用濃度か５０　ｐｐ ｔで、現在の機器を用いる方法か約３．５１１１）ｔを検出すると考えられてい るので、この分析レベルで、初期調節（ｉｎｉｔｉａｌ　ｒｅｇｕｉａｔｏｒｙ ）又は健康を考慮するためには十分である。

実施例４ 先に述へたＸ３インヒドロ検定法を、ダイオキシン類似化合物に対する人又は動 物の暴露を評価する経済的かつ迅速な生物学的検定法として採用することかでき る。血液試料を人又は動物から採取し、次いてリンパ芽球を遠心分離又はフィコ ール勾配のような十分に確立された手順で分離する。該リンパ芽球を、実施例２ の項　ＥＬＩＳＡ及び免疫プロットに記載したのと同しように処理する。容易に 視覚化する５７キロダルトンｐＴＰの出現て、ダイオキシン類似化合物に対する 暴露を指示した。

実施例５ Ｘ３インビトロ検定法を、Ａｈシセブターフェノタイプを評価する経済的かつ迅 速な検定法として採用することかできる。いかなるタイプの細胞でも、実施例２ の項　細胞培養、ＥＬ［ＳＡ及び免疫プロットに記載したのと同しように、ＴＣ ＤＤ　Ｏ，５ｏＭて処理することかできる。ＴＣＤＤ処理細胞におけるｐＴＰの 増加の発生と、同じ細胞株の未処理コントロールとを比較することにより、ダイ オキシン類似化合物に高度の親和性を有するＡｈレセプターの存在か示される。

ｐＴＰの増加がなければ、該細胞が、ＴＣＤＤに対し低い親和性フェノタイプを 存するＡｈレセプターを有したことを示す。この情報は、胸部布の治療における 潜在的使用性を有する。その理由は、低チトクロムＰ−４５０［Ａ！誘導性を有 する胸部腫瘍は、高チｉ・クロムＰ−４５０１ＡＩ誘導性を有する胸部腫瘍細胞 とは、化学療法に対し異なる応答をするという知見か確立されているからである （Ｔｈｏｍａｓ、　Ｊ、Ｓ、、　Ｎ１５ｓｅｎ、　Ｌ、、　５ｔａｃｅｙ、　Ｓ 、Ｎ、、　Ｈｉｎｅｓ。

Ｒ，Ｎ、　、及びＡｕけｕｐ、　Ｈ，Ｅｕｒ、１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９７． ５７７、１９９１）　ｏ他のタイプの癌（例えば、色素腫瘍）をフェノタイプ化 することも治療−Ｆ有用である。ｐＴＰ測定における独自の利【なは、より短い 暴露期間及び多重ｐＴＰ帯に関連する該応答の細かいフェノタイプに関する潜在 性である。

実施例６ Ｘ３リンパ芽球（又はチトクロムＰ−４５０１Ａ、１誘導性の細胞株）の分離物 を、野外の条件下で、午後たけて実施することかできるダイオキシン類似化合物 に対する迅速な生物学的検定法において使用することかできる。−晩培養したＸ ３細胞を２６０Ｏｒｐｍで遠心分離し、バニティ）（Ｖａｎｉｄａｔｅ）　ｌＯ ｎＭを含むＰＢＳに再懸濁して１００Ｉｌｌあたり１０ｇ細胞の密度とし、かつ 均質化する。

該均質化液の１００μ１部分標本を９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウ ェルに入れる。該プレートを４°Ｃて、−晩インキュへ一トシ、かつ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ　２０のＰＢＳ溶液て洗浄することにより検定の＃備をする。この準 備工程に続いて、該プレー１〜を２０〜２５°Ｃて１日間保ｒγしてもよい。密 閉容器の中で、少なくとも１０分間、試料をジエチルエーテルと接触させること により、試料のノエチルエーテル抽出を行う（ノエチルエーデル３容量　試料１ 容量）。ジエチルエーテルを円錐形の管に除去し、２５°Ｃて溶媒を蒸発させて 乾燥させた。残渣を最低量のジメチルスルボギソトに溶かず（必要な場合のみ、 穏やかに加熱する。）。各つ丁ルに２ｏＭ　ＡＴＰ溶液１００μｍを、次いてｒ ｌＭｓｏて安定化された抽出物５７Ｊｌを入れ、この混合物を２５〜３７°Ｃて Ｉ（１−１５分間インキュベートする。０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０のＰＢＳ溶 液てずへてのウェルを洗浄し、３７°Ｃで５分間牛血清アルブミンで満たした。

次いて・勺しルに、抗ホスボチロノンモノクローナル抗体（１，５ｍｇ／腹水１ ｍｌ／牛血清アルブミンと０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０　（ＰＢＳに溶解）１ｍ ｌ）を入れ、３７°Ｃで５分間インキコヘートして、結合させる。セイヨウワサ ビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（０，５ＸｌＯ’　ｍｇ　［ｇＧ／　ｍ ｌ　ＰＢＳ）とともにインキュベ−１’Ｌ、続いて、直ちに洗浄をする。１００ １ＴＩ１１１クエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４，２）に溶かした基質（０，０箕 １１２０□及び１咄２．２゛−アジノジ（ｄ−エチルヘンズチアジンンスルホン 酸−６）とともに、２２°Ｃてインキユヘー　トした後、ペルオキシダーゼ活性 を測定する。色変化の最初の視覚化で、Ａ４７．値を記録する。

１５の値を市販されている形態のマイクロタイタープレート読み取り機で測定す る。ダイオキシン類似化合物の３次元プロットを、北−南及び東−内床標上にプ ロットされたＡａｌＦ値から作成することかできる。垂直方向の応答は図１０に しめされている各試料におけるダイオキシン類似物質の濃度を表している。サン プリング工程のために要求される計数時間かないので、数百回の検定を一日で行 うことかできる。

全細胞分離物の代わりに、精製した、又は半は精製したＡｈレセプター複合体を 使用した場合、１記工程の改良を利用することかできる。さらに前記工程の改善 は、精製した、又は半ば精製したへ旧ノセブター複合体を使用することからなり 、かつリン酸化されるタンパク質を全細胞分離物の代わりに使用する。さらにキ ットマイクロタイター検定法は、全細胞分離物の代わりに、精製した、又は半は 精製したＡｈレセプター複合体を使用すること、及び当該技術分野で周知の技術 に従って調製された、構造変化されたＡｈレセプターのエピ１−−ブに対するモ ノクローナル抗体を用いる、ダイオキシン類似化合物によるＡｈレセプター構造 変化の測定を含む。Ａｈレセプターの活性化（構造変化）を図１１に図示する。

図ＩＩに示されているモデルは、Ａｈレセプターか少なくとも２個の構成要素を 有するか、これらは、同し分子−の２種のドメインとしても存在することかでき る。

本明細書において、レセプターはりガン１−と相互作用するすべての分子を含む 。

この場合、該レセプターか細胞表面の腔から見いたされるか否か、前記リガント と結合出来るか否かとは関わりかない。リガントも同様に定義され、生物内でリ ガントとして作用する環境的又は内生的な物質を含む。Ａｈレセプターとダイオ キシン類似化合物（リガント）の相互作用は、複合体の三次元的な構造変化をも たらす。構造変化した複合体の数量は、存在するダイオキシン類似化合物の量に 比例するので、構造変化した複合体に対する抗体を使用して、ダイオキシン類似 化合物を定量することかできる。

実施例７ ダイオキシン類似化合物の存在及び量を測定することかできるポリクローナル抗 体を調製した。この調製方法、特性及び使用方法を、以下に記載する。

複合的抗原ペプチド合成（ＭＡＰＳ）を、Ｐｏ１ａｎｄらの論文（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ。

３９巻、２０〜２６頁、＋９９０’）で報告されているように、Ａｈレセプター のＮ１（２末端部に基ついて行った。ＭＡＰＳ抗原は、分枝リシンセブテイマー （ｓｅｐｊａｍｅｒ）とペプチドのカルボキシ末端を介してカップリングした、 合成ペブチｌ”　Ｎｌ２−ＬＹＳ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＰＲＯ−ＶＡＬ− ＧＬＹ−ＣＯＯＨ（以下、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ　という。）からなるもので あった。

ベブチ）−とリジンセブテイマーの比率は８１てあった。該抗原の純度はアミノ 酸分析によると３８重量％てあった。該抗原の合成はＴＡＥＳ研究所（ＴＡＥＳ 　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、　Ｔｅｘａｓ　Ａ　＆　Ｍ　Ｌ ｌｎｖｅｒｓｉｌｙ、　ＣｏＣｏ１１ｏ　５ｔａｔｉｏｎ、@ＴＸ　７７８４３ ） との契約に基ついて行われた。

粗抗原を濃度か２　ｍｇ、／ｍｌとなるようにリン醜緩衝食塩水に溶かし、部分 標本０゜５ｍｌを等量のフロイント完全アジュバント（第１回の感作用）又はフ ロイン］・不完全アジュバント（第１回以降の感作用）と混合した。ウサギ（Ｆ ｌｅｍｉｓｈ　Ｇｉａｎｔ／Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ　ｃｒｏｓｓ　ｒａｂｂｉＤ に１ｍ１（抗原３８０　μｇ　）を皮下注射することにより感作を、行った。感 作のスケジュールは次のとおりどした　０．２１．３５及び４９０口に注射し、 ６３日ｌ−採血した。感作と血液採取は次に機関との契約に基づいて行われた　 Ｃｏｒｎｅｌｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ａｎｉｍａｌ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ、　Ｃ ｏｒｎｅｌｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　１ｔｈａモ＝B ＮＹ　１４８５３゜ 血液をＩＯ’ｃて一晩血餅状態にし、ＩＥｃセンターー−７遠心分離機で、２９ ０Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離することにより血清を分離した。さらに使用する まで、１ｍｌの部分標本を一８０’Ｃて凍結した。

動物 ２匹の成熟雌ニュージーラン］・ホワイトラビット（動物３２１及び３７７）を 入手した（入手先　Ｔｈｅ　Ｍ’ｔ’Ｓ　ＣｏＣｏ１１ｅ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉ ｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　ｏこのラビットにアゲウェイラビットペレット （Ａｇｗａｙ　ｒｅｂｂｉｔ　ｐｅｌｌｅｌ　Ａｇｗａｙ、　Ｃｏｒｔｌａｎｄ 、　ＮＹ）を供餌し、水道水（ａｄ　ｌｉｂｉｊｕｍ）を与えた。それぞれの動 物には、抗原を５０ｍ１皮−ドに注射した。該抗原は先に述へたフロイント完全 アジュバントにおけるものである（以下、ＭＡＰＳという。）。３週間後、この 手順を繰り返した。最初の注射を行った８週間後、各動物から血液を２５ｍ　ｌ 採取した。血液から血清を調製し、１ｍｌ管に取り、−８０″Ｃで凍結保存した 。前記のように抗血清を調製した。

マウス肝臓ソトソルをｔｉｃ５７ＢＬ／６マウス（又はヂトクロムＰ−４５０１ ＡＩ誘導性系統マウス）から調製した。マウスはＪａｃｋｓｏｎ　ｌ、ａｂｏｒ ａｊｏｒｉｅｓ　（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＭＥ）から人手した。実験は、４ 〜６週齢て体重約１６〜２０ｇの雌マウスを用いて実施した。

マウスにはプロラボＲＭＨ１００Ｏラット、マウス及びハムスターフ−１”（Ａ ｇｗａｙ。

Ｃｏｒｊｌａｎｄ、　Ｎｌ’）を供餌し、水道水（ａｄ　ｌｉｂＨｕｍ）を与え た。全てのマウスを３〜５匹づつケーンに収容し、光照射時間を１２時間となる よう維持した。３倍容のＭＥＮＧ緩衝液中でその肝臓を均質化して肝臓ソトソル 画分を調製した（Ｐｏｌａｎｄらの論文、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃ ｏｌｏｇｙ、　３９巻、２０〜２６頁、１９９０年）。続いて、９０００　Ｘ　 ｇて２０分間遠心分離し、上清（Ｓ−９）を１００．０００　Ｘ　ｇで６０分間 遠心分離することにより、得られたノトソル両分を注意深く除去し、速やかに一 ８０°Ｃに冷凍貯蔵しまた。

免疫ブロン１一 実施例１と同様に実施した。

結果 図１２における、レーン１〜３及び２０〜２２はタンパク質か染色された蛋白質 スタンダートを表している。スタンダード（頂αから底部まで）は、＋１６．９ ７．４．６６及び４５キロダルトンである。１ノーン４及び１９は予備染色され たタンパク質スタンダードであり、これらはそれぞれ（頂点から底部まて）　２ ０５．１１６．５．８０及び４９．５キロダルトンであった。タンパク質か染色 された総ストソルはレーン５及び１８に現れる。全ての池のレーンは抗血清で免 疫染色されていた。

次の抗血清（希釈）を使用した。レーン６及び７ては抗ＭＡＰＳ　３２１−１　 （１：１１）、レーン８ては抗熱ショックタンパク［９０（ｔ（ＳＰ９０．５ｏ ｕｒｃｅ）（１：５００）　、レーンＩＱ及びＩＩテは坑ＭＡＰＳ　３２１−２ 　（１：１１）　、レ−：／＋２及び１３ては抗ＭＡＰＳ　３２１−２　（１： ５０）、レーン１４及び１５ては膣ＡＰＳ　３２１−２　（１：２５０）、及び レーンＩ６及び１７ては抗ＭＡＰＳ　３２１２（１：ｌ０００）。この結果は、 第２の採血ラヒットが、１００キロダルトンタンパク質（Ａｈレセプターの非形 質転換状態）を滴定ｊｌｌ：５０て認識てきる抗体を産生していたことを示す。

図１３のレーン１，２及び１９はタンパク質が染色された蛋白質スタンダードを 表している。分子量はスタンダードは、１１６．９７．４．６６及び４５キロダ ルトンであることを示していた。レーン３及び１８は分子量２０５．１１６．５ ．８０及び４９．５キロダルトンを表していた。タンパク質か染色された総シト ツルはレーン４及び１７である。

全ての他のレーンは抗血清で免疫染色されていた。

次の抗血清（希釈）を使用した。レーン５及び７てはＩ旬払ＰＳ　３ｎ−２（１ ：１０００）、レーン６及び８ては抗ＭＡＰＳ　３７７−２　（１：２５０）、 レーン９及び１０テは抗ＭＡＰＳ　３７７−２（１：５０）　、レ−：／ＩＩ及 び＋６’ｆｆｌ抗ＭＡＰＳ　３７７−２　（１：１１）　、’ｖ−ンＩ３テハ抗 ＭＡＰＳ　３７７−Ｉ　（１：１１）　、レーン１４及び１５テハ抗Ｈ３Ｐ９０ （１：５００）。コノ結果は、第２の採血ラビ・月−３７７か、１００キロダル トンタンパク質（Ａｈレセプターの非形質転換状態）を滴定量１：２５０て認識 てきる抗体を産生していたことを示す。

ＡｈレセプターのＮ末端のアミノ酸配列に対する調製された抗血清３２１−２及 び３７７−１は、双方とも、ＴＣＤＤ又はダイオキシン類似化合物との相互作用 の前に存在するＡｈレセプターを認識できた。このような抗血清は、非形質転換 Ａｈレセプターの定量により、空気、水又は土壌の環境的抽出物に存在するダイ オキシン類似化合物の検定に使用することかできる。この定量は、先に述へたＥ ＬＩＳＡ技術によって実施することかできる。

実施例８ これまて述へた方法は、レセプターにおける構造的及び／又は機能的な変化の観 察による、リガント定量の最初の例を示している。本明細書に記載されている方 法は、ダイオキシン類似化合物に加えて他のりガントを検定するのに適している 。この技術の池の例には、細胞レセプター又は細胞レセプターの性質又は合成部 分における構造的又は酵素的な（機能的な）変化の測定を医薬的な基礎として、 ペプチド又はタンパク質の生物学的活性濃度を決定するものかある。

これまて述へた直接又は間接免疫学的検定法は、レセプター−リガンド相互作用 イオン、及び続くタンパク質チロシルリン酸化を介する細胞シグナル形質導入に 基づいている。ダイオキシン類似化合物に対する、これまで述べたような直接又 は間接な免疫学的検定法に類似するものを、レセプター−リガント相互作用の他 の例、及びこのようなレセプター−リガンド相互作用に続いておきる他の細胞シ グナル形質導入に関連して、開発することかできる。適当なレセプター−リガン ド相互作用には、タンパク質及びベンゾ（ａ）ピレン、ＥＧＦレセプターと表皮 成長因子作用剤及び拮抗剤、インツユリンレセプターとインシュリン作用剤及び 拮抗剤との相互作用、エストゲンとエストゲン作用剤及び拮抗剤との相互作用か ある。

これまて用いられてきた用語及び表現は、記述するためのものであって、限定を 意図しておらず、示され、かつ記述されてきた特徴と等価なもの又はその一部を 排除するような用語及び表現の使用を意図することはなく、それは本発明の範囲 内において、様々な改良か可能であると認識しなければならない。

本発明は特定の好ましい実施態様との関係において、具体的に記述されてきたか 、各種の変形及び改良は、本発明の思想及び範囲内から離れることなく当業者に とって容易である。本発明は記載された実施態様にのみ限定されるものではない 。むしろ、添付された請求の範囲は、前記変形及び改良並びに等個物をカバーす ると解釈しなければならない。

本発明のイオンは、その具体的な実施態様との関係て記述されてきたか、多くの 他の変形及び改良並びに他の使用法か当業者にとって明らかになるであろう。

したかって、本発明は、明細書中の具体的な記述によっててはなく、添付された 請求の範囲によってのみ制限されるのか好ましい。

ｎＭ ２　１　０．５０．１００５０．０２００’＋　２　３４５６７８９ＩＯＩＩ１ ２［３１４１５１６ｒ７１８１９２０２１２２１　２　３　４５６７８　９１０ １１１２Ｂ）４１５１６１７１８　１９フロントページの続き アパートメント　３ イサ力　ハンショウ　ロード　１３２０

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はチトクロムＰ−４５０［Ａ］誘導性を有する他 系統マウスの肝細胞中におけるホスホチロシルタンパク質の調製を含む、試料中 に存在するポリ塩化ジベンゾダイオキシン、ポリ塩化ジベンゾフラン、及びポリ 塩化ジベンゾダイオキシンの生物学的活性の特性を示す、これらの構造的類似化 合物の検出法てあって、前記マウスにテスト試料を投与すること、並びにポリ塩 化ジベンゾダイオキシン、ポリ塩化ジベンゾフラン、及びポリ塩化ジベンゾダイ オキシン及びポリ塩化ジベンゾフランの生物学的活性の特性（この特性はＳ−９ タンパク質のチロシン残基のリン酸化を含む。）を示す、これらの構造的類似化 合物の存在を示す特性に関する肝臓Ｓ−９上清面分を検定することを含む検出法
2. ２．Ｘ３リンパ芽球腫細胞又はチトクロムＰ−４５０［Ａ］誘導性を有する細胞 株を用い、試料中に存在するポリ塩化ジベンゾダイオキシン、ポリ塩化ジベンゾ フラン、及びポリ塩化ジベンゾダイオキシンの生物学的活性の特性（この特性は ホスホチロシルタンパク質イオンの生成を含む。）を示す、これらの構造的類似 化合物の検出を行うインビトロの生物学的検定法であって、前記Ｘ３細胞の培養 系にテスト試料を投与すること、並びにポリ塩化ジベンゾダイオキシン、ポリ塩 化ジベンゾフラン、及びポリ塩化ジベンゾダイオキシン及びポリ塩化ジベンゾフ ランの生物学的活性の特性（この特性は、ある種のタンパク質のチロシン残基の リン酸化を含む。）を示す、これらの構造的類似化合物の存在を示す特性に関す る細胞分離物を検定することを含む生物学的検定法。
3. ３．新鮮な採取リンパ芽球を用い、ポリ塩化ジベンゾダイオキシン、ポリ塩化ジ ベンゾフラン、及びポリ塩化ジベンゾダイオキシンの生物学的活性の特性（この 特性はホスホチロシルタンパク質の生成を含む。）を示す、これらの構造的類似 化合物に、過去に暴露されたことを検出するインビトロの生物学的検定法であっ て、新鮮な採取血液試料からリンパ芽球を分離すること、並びにポリ塩化ジベン ゾダイオキシン、ポリ塩化ジベンゾフラン、及びポリ塩化ジベンゾダイオキシン 及びポリ塩化ジベンゾフランの生物学的活性の特性（この特性は、ある種のタン パク質のチロシン残基のリン酸化を含む。）を示す、これらの構造的類似化合物 に暴露されたことを示す特性に関する細胞分離物を検定することを含む生物学的 検定法。
4. ４．生検で得た新鮮な試料を用い、ホスホチロシルタンパク質を生成するＡｈレ セプターフェノタイプの検出を行うインビトロ生物学的検定法であって、生検で 得た新鮮な試料から細胞を分離すること、細胞をＴＣＤＤに暴露すること、並び にポリ塩化ジベンゾダイオキシン、及びポリ塩化（特性はある種のタンパク質の チロシン残基のリン酸化を含む。）に対する高度ＴＣＤＤ結合性フェノタイプ暴 露を示す特性に関する細胞分離物を検定することを含む生物学的検定法。
5. ５．Ｘ３リンパ芽球腫細胞又はチトクロムＰ−４５０［Ａ］誘導性を有する細胞 株を用い、試料中に存在するポリ塩化ジベンゾダイオキシン、ポリ塩化ジベンゾ フラン、及びポリ塩化ジベンゾダイオキシンの生物学的活性の特性（この特性は ホスホチロシルタンパク質の生成を含む。）を示す、これらの構造的類似化合物 の検出を行う、インビトロ生物学的検定法であって、前記Ｘ３細胞の培養系にテ スト試料を投与すること、並びにポリ塩化ジベンゾダイオキシン、ポリ塩化ジベ ンゾフラン、及びポリ塩化ジベンゾダイオキシン及びポリ塩化ジベンゾフランの 生物学的活性の特性（この特性は、ある種のタンパク質のチロシン残基のリン酸 化を含む。）を示す、これらの構造的類似化合物の存在を示す特性に関する細胞 分離物を検定することを含む生物学的検定法に使用するキット。