JPH07242680A - 反応性小胞体、形成剤および機能性物質固定化小胞体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 リポソーム表面に存在するポリオキシアルキ
レン鎖の先端に機能性物質を固定した機能性物質固定化
リポソームを得る。 【構成】 ポリオキシアルキレン鎖が結合した下式のポ
リアルキレンオキシド誘導体を膜形成成分として含む反
応性リポソームに、脱水縮合剤の存在下に、機能性物質
を反応させ、アミド結合により機能性物質を固定化す
る。 【化１】 （Ｒ¹、Ｒ²はアシル基、ＡＯはオキシアルキレン基、
Ｘ、Ｙは２価の有機基、ｎは１〜１０００、ｐは０また
は１、Ｍ¹、Ｍ²はＨまたはアルカリ金属）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、反応性小胞体形成剤、
これを小胞体形成成分として含む反応性小胞体、この小
胞体に機能性物質を固定化した機能性物質固定化小胞
体、およびその製造方法に関する。さらに詳しくは医薬
の運搬体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒、バ
イオリアクター、バイオエレクトロニクス素子、マイク
ロカプセル代替品など、種々の機能性リポソームまたは
脂肪乳剤等の小胞体の製造などに用いられる反応性小胞
体形成剤、これを小胞体形成成分として含む反応性小胞
体、この小胞体に機能性物質を固定化した機能性物質固
定化小胞体、およびその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】リポソームはリン脂質の二分子膜からな
る小胞体であり、多分野での応用が試みられている。特
に、医薬運搬体、診断・検出用のセンサーなどへの応用
が注目されているが、リポソーム表面上または膜中に機
能性物質を固定して各種機能をもたせること、およびリ
ポソームの血中濃度を維持することなどが大きな課題と
なっている。

【０００３】従来、リポソーム表面上または膜中への機
能性物質の固定化に関しては、プルラン誘導体で被覆し
たリポソームの表面上の多糖上に置換したアミノエチル
カルバミルメチル基にγ−マレイミドブチルオキシサク
シニミジルを介して抗体フラグメントを結合させる方法
（Biochem. Biophys. Acta., 898, 323(1987)）、ある
いはあらかじめリポソーム膜形成成分中に糖脂質を加え
ておき、リポソーム形成後過よう素酸酸化を行い、生じ
たアルデヒド基と抗体とを反応させて固定化する方法
（J. Biol. Chem., 255, 10509(1980)）などがある。

【０００４】しかし、これらの従来法では、リポソーム
調製後にリポソーム膜表面上での多段階の化学反応を行
う必要があり、このため目的とする機能性物質の導入量
が低く制限され、また反応による副生成物や不純物が混
入し、リポソーム膜へのダメージが大きいなどの問題点
がある。

【０００５】一方、リポソームを生体内へ投与したと
き、その多くは肝臓、脾臓などの網内系器官で捕捉され
るため、十分な効果が得られないことが指摘されている
（Cancer Res., 43, 5328(1983)）。そこで、この網内
系器官で捕捉されてしまう問題点や、あるいはリポソー
ム自身の崩壊性・凝集性など安定性の低さに関する問題
点を改善する方法として、リポソームの表面にポリエチ
レングリコール鎖を導入することが試みられている（例
えば、特開平１−２４９７１７号公報、FEBS letters,
268, 235(1990)）。また、ポリエチレングリコールで修
飾されたリポソームは、長期間にわたり血液中濃度を維
持できることが明らかになっている（Biochem. Biophy
s. Acta., 1066, 29-36(1991)）。しかし、このような
方法により得られるポリエチレングリコール鎖の導入さ
れたリポソームは機能性物質と反応しないので、リポソ
ーム表面上に機能性物質を固定化することはできない。

【０００６】さらに、特表平４−３４６９１８号公報に
は、マレイミド基を有するリポソームにまずチオール基
を付与したタンパク質（チオール化タンパク質）を反応
させ、次いで残存マレイミド基にチオール基を付与した
ポリアルキレングリコール（チオール化ポリアルキレン
グリコール）部分を含む化合物を反応させることによ
り、網内系器官での取込の改善された薬剤含有抗体結合
リポソームが得られることが記載されている。しかし、
このリポソームでは、抗体がポリアルキレングリコール
層の下部に隠蔽され、標的部位の抗原との反応が妨げら
れるため、期待される効果が十分には得られないという
問題点がある。

【０００７】また特表平５−５０８３８８号公報には、
α−ステアリル−ω−プロピオン酸−ポリオキシエチレ
ンに代表されるようなアニオン基を有するポリエチレン
グリコール誘導体からなるリポソーム製剤が開示されて
いる。しかし、このポリエチレングリコール誘導体は、
疎水部がモノアルキル基であるためリポソーム膜から脱
離しやすく、このためこのようなポリエチレングリコー
ル誘導体を膜形成成分として含むリポソームは長期間の
安定性に劣るという問題点がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
問題点を解決するため、リポソームその他の小胞体に
（ポリ）オキシアルキレン鎖を導入できるとともに、脱
離することなく長期にわたり安定して保持され、しかも
（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に、簡単にかつ効率
よく種々の機能性物質を共有結合によりまたは電気的に
固定化することが可能な反応性小胞体形成剤、この形成
剤を小胞体形成成分として含む反応性小胞体、この反応
性小胞体に機能性物質を固定した機能性物質固定化小胞
体、および固定化小胞体の製造方法を提供することであ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、次の反応性小
胞体形成剤、反応性小胞体、機能性物質固定化小胞体、
およびその製造方法である。 （１）下記一般式〔１〕で表わされる反応性ポリアルキ
レンオキシド誘導体からなることを特徴とする反応性小
胞体形成剤。

【化２】 〔式中、Ｒ¹およびＲ²は炭素数３〜３０の脂肪酸のアシ
ル残基を表わし、同一でも異なっていてもよい。ＡＯは
炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎはオキシアルキ
レン基の平均付加モル数で、１〜１０００の正数を表わ
す。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は同一でも
異なっていてもよく、またランダム状に付加していて
も、ブロック状に付加していてもよい。ＸおよびＹは２
価の有機残基、ｐは０または１、Ｍ¹およびＭ²は水素原
子またはアルカリ金属原子を表わす。〕 （２）上記（１）記載の反応性小胞体形成剤の一種以上
を小胞体形成成分として含むことを特徴とする反応性小
胞体。 （３）上記（２）記載の反応性小胞体に機能性物質を固
定してなることを特徴とする機能性物質固定化小胞体。 （４）水溶性の脱水縮合剤の存在下に、上記（２）記載
の反応性小胞体に機能性物質を反応させることを特徴と
する機能性物質固定化小胞体の製造方法。

【００１０】本発明において、「（ポリ）オキシアルキ
レン」はｎが１のオキシアルキレンまたはｎが２以上の
ポリオキシアルキレンを意味する。また「（ポリ）アル
キレン」も上記と同様にアルキレンまたはポリアルキレ
ンを意味する。

【００１１】一般式〔１〕においてＲ¹またはＲ²で表わ
される脂肪酸のアシル残基は、炭素数３〜３０、好まし
くは８〜２０のアシル残基である。このようなアシル残
基の具体的なものとしては、プロピオン酸、酪酸、カプ
ロン酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウン
デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、
ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン
酸、ソロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、２−エチル
ヘキサン酸等の飽和脂肪酸のアシル残基；オレイン酸、
リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、２，４−オクタデ
カジエン酸等の不飽和脂肪酸のアシル残基；イソステア
リン酸等の分岐脂肪酸のアシル残基；リシノール酸、１
２−ヒドロキシステアリン酸等のアルキル基中に水酸基
を有する脂肪酸のアシル残基などがあげられる。

【００１２】本発明の反応性小胞体形成剤をリポソーム
または脂肪乳剤などの製造に用いる場合は、Ｒ¹または
Ｒ²で表わされる脂肪酸のアシル残基は、安定なリポソ
ームまたは脂肪乳剤が形成できるという理由から、ミリ
スチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、
２，４−オクタデカジエン酸のアシル残基が好ましく、
特にパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸のアシル
残基が好ましい。Ｒ¹とＲ²とは同一であってもよいし、
異なっていてもよい。

【００１３】一般式〔１〕のＡＯで表わされるオキシア
ルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレン基であ
り、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシト
リメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ
−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン
基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、
エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、
１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒド
ロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基
である。一般式〔１〕のｎはオキシアルキレン基の平均
付加モル数であり、１〜１０００、好ましくは１０〜５
００、さらに好ましくは２０〜３００の正数である。

【００１４】ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の
種類は同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場
合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加し
ていてもよい。親水性を付与する場合、ＡＯとしてはエ
チレンオキシドが単独で付加したものが好ましく、この
場合、ｎが１０以上のものが好ましい。また種類の異な
るアルキレンオキシドが付加している場合、エチレンオ
キシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付
加しているのが望ましい。（ポリ）オキシアルキレン鎖
に親油性を付与する場合はエチレンオキシド以外の付加
モル数を多くする。

【００１５】一般式〔１〕のＭ¹およびＭ²は水素原子ま
たはナトリウムもしくはカリウム等のアルカリ金属原子
であり、同一でも異なっていてもよい。一般式〔１〕の
ＸおよびＹは２価の有機残基を表わす。Ｘの具体的なも
のとしては、次のような基などがあげられる。式中、ｑ
は１〜４の整数を表わす。

【化３】 またＹの具体的なものとしては、次のような基などがあ
げられる。式中、ｒは１〜４の整数を表わす。

【００１６】

【化４】

【００１７】一般式〔１〕で表わされる反応性（ポリ）
アルキレンオキシド誘導体は、例えば次のような種々の
方法により、容易に製造することができる。 １）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にカル
ボン酸ハライド基を有する（ポリ）アルキレンオキシド
誘導体とをトリエチルアミン、ピリジンなどの第３級ア
ミンの存在下で、１：１〜１：１０００モルの仕込み比
で反応させ、次に得られた化合物中に残存する活性エス
テル基を加水分解して得る方法。 ２）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にカル
ボニル−Ｎ−オキシコハク酸イミド基、あるいはカルボ
ニル−１−オキシベンゾトリアゾール基、カルボニル−
Ｎ−オキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシ
イミド、カルボニル−Ｎ−オキシフタルイミド、カルボ
ニル−４−オキシフェニルジメチルスルホニウム＝メチ
ルサルフェートなどの活性化エステル基を有する（ポ
リ）アルキレンオキシド誘導体とを、１：１〜１：１０
００モルの仕込み比で反応させ、次に得られた化合物中
に残存する活性エステル基を加水分解して得る方法。 ３）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にオキ
シカルボニルイミダゾール基を有する（ポリ）アルキレ
ンオキシド誘導体とを、１：１〜１：１０００モルの仕
込み比で反応させ、次に得られた化合物中に残存するオ
キシカルボニルイミダゾール基を加水分解し、次に得ら
れた化合物にさらに無水コハク酸、またはモノクロロ酢
酸などを作用させて得る方法。 ４）ホスファチジルコリンと両末端に水酸基を有する
（ポリ）アルキレンオキシドとを、１：１〜１：１００
０モルの仕込み比で、ホスホリパーゼＤの存在下でエス
テル交換反応を行い、得られた化合物にさらに無水コハ
ク酸、またはモノクロロ酢酸などを作用させて得る方
法。

【００１８】これらの反応は無溶媒で、または水、生理
的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液な
どの水系溶媒中で、またはクロロホルム、塩化メチレ
ン、ベンゼン、ジエチルエーテル、メタノール、エタノ
ール、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセ
トニトリル等の有機溶媒中で、反応温度−１００〜＋１
００℃、好ましくは０〜４０℃、反応時間１０分間〜５
００時間、好ましくは３０分間〜１２時間で行うのが望
ましい。反応終了後は、蒸留、再結晶、再沈澱、吸着剤
処理、カラム処理、イオン交換、ゲル濾過、限外濾過、
透析、薄層クロマトグラフィーなどの方法により単離・
精製することができる。

【００１９】本発明の反応性小胞体形成剤は、疎水性に
富む２本の脂肪酸残基と、親水性に富む（ポリ）オキシ
アルキレン基とを有しているので、優れた界面活性能を
有している。このため、本発明の反応性小胞体形成剤
は、小胞体形成成分などとして使用することができる。
ここで小胞体とは、小胞体形成成分の親水基が界面の水
相に向って配向した構造を有する粒子を意味する。具体
的なものとしては、二分子膜からなる閉鎖小胞であるリ
ポソーム、植物油およびリン脂質などの混合物が乳化さ
れた脂肪乳剤、またはミセルなどがあげられる。

【００２０】本発明の反応性小胞体形成剤は、末端に官
能性としてカルボキシル基を有しているので、アミノ
基、水酸基またはチオール基などの官能基、特に第１級
アミノ基に対して高い反応性を有している。このため、
このような官能基を有する機能性物質と容易に反応し、
共有結合が形成される。またカルボキシル基がプラスの
電荷を有する機能性物質と容易に電気的に結合する。従
って、本発明の反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分と
して用いることにより、小胞体に（ポリ）オキシアルキ
レン鎖を導入できるとともに、前記官能基を有する機能
性物質またはプラスの電荷を有する機能性物質に対する
反応性を付与することができ、反応性小胞体を製造する
ことができる。

【００２１】また本発明の反応性小胞体形成剤はＲ¹お
よびＲ²の２本の脂肪酸アシル残基を有しているため、
小胞体中、特にリポソーム膜中から脱離しにくい。この
ため本発明の反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分とし
て含む小胞体、特にリポソームは、１本の脂肪酸残基か
らなるノニオン系界面活性剤を膜形成成分として含むリ
ポソームに比べて、優れた安定性を有するものとなる。

【００２２】本発明の反応性小胞体形成剤を用いて小胞
体を製造する場合、反応性小胞体形成剤は一種単独で、
または二種以上組合せて、あるいは小胞体を形成しうる
他の小胞体形成成分、例えば大豆レシチン、卵黄レシチ
ン、その他のリン脂質類、コレステロール、イントラリ
ピッド（大塚製薬（株）、商標）、大豆油、サフラワー
油などと混合して使用することができ、反応性リポソー
ムをはじめ反応性脂肪乳剤、反応性ミセルなどの反応性
小胞体を形成することができる。この場合、小胞体は公
知の方法により製造することができる。

【００２３】本発明の反応性小胞体形成剤を用いて得ら
れた反応性小胞体は、一般式〔１〕で表わされる化合物
中のカルボキシル基が小胞体の表面に存在するので、こ
の基を官能基として利用して、水溶性の脱水縮合剤など
を用いることにより種々の機能性物質を共有結合により
導入することができる。また種々の機能性物質を電気的
に固定化することもできる。これにより機能性物質固定
化小胞体が得られる。

【００２４】次に本発明の反応性小胞体形成剤を用いて
製造したそれぞれの反応性小胞体、および機能性物質固
定化小胞体について詳しく説明する。代表的な反応性小
胞体である反応性リポソームは、本発明の反応性小胞体
形成剤を膜形成成分（小胞体形成成分）として含有する
ものである。反応性小胞体形成剤の含有量は、反応性小
胞体形成剤および他の膜形成成分の合計量に対して０．
１〜５０モル％、好ましくは０．５〜３０モル％である
のが望ましい。０．１モル％未満では期待される効果が
小さくなるため、一般的には使用されない。また５０モ
ル％を超えるとリポソームの安定性が低下するため一般
的には使用されない。全膜形成成分中に占める本発明の
反応性小胞体形成剤の割合を多くするほど、固定化する
機能性物質の量をより多くすることができる。反応性小
胞体形成剤は、一種単独で使用することもできるし、二
種以上のものを組合せて使用することもできる。

【００２５】反応性小胞体形成剤と混合して用いられる
他の膜形成成分としては、従来からリポソームの膜形成
成分として用いられているものが制限なく使用できる。
具体的には、ジホスファチジルグリセロール、カルジオ
リピン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル
セリン、ホスファチジルエタノールアミン、大豆レシチ
ン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチ
ジルグリセロール等のリン脂質および脂肪酸部に不飽和
基を有する重合性リン脂質；スルホキシリボシルジグリ
セリド、ジガラクトシルジグリセリド、ラクトシルジグ
リセリド等の糖脂質類；コレステロール等の非極性脂
質；その他には、非イオン性界面活性剤、ホスファチジ
ルポリエチレングリコール、「Biochem. Biophys. Act
a., 1066, 29-36(1991)」に記載されているホスファチ
ジルエタノールアミンとポリエチレングリコールとの反
応物、およびこれらの混合物などがあげられる。

【００２６】反応性リポソームは、反応性小胞体形成剤
およびレシチン、コレステロール、リン脂質等の他の膜
形成成分を、有機溶媒等の適当な溶媒に溶解し、エクス
ツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、
界面活性剤除去法、逆層蒸発法、エタノール注入法、プ
レベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジ
ョン法、アニーリング法、凍結融解法など、種々の公知
の方法によりリポソーム化することにより製造すること
ができる。また、これらの製造法を選択することによ
り、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大き
な一枚膜リポソームなど、種々の大きさや形態を有する
反応性リポソームを製造することができる。

【００２７】このようにして得られた反応性リポソーム
は、リポソーム膜の内外表面に（ポリ）オキシアルキレ
ンからなるスペーサーを介してカルボキシル基が結合し
ているので、アミノ基、水酸基、チオール基などの官能
基、特に第１級アミノ基を有する機能性物質を効率よく
かつ簡単に、リポソームの二分子膜上に（ポリ）オキシ
アルキレンからなるスペーサーを介して、アミド結合、
エステル結合またはチオールエステル結合により化学的
に固定化することができ、機能性物質固定化リポソーム
が得られる。またカルボキシル基に、プラスの電荷を有
する機能性物質を電気的に固定化することができ、機能
性物質固定化リポソームが得られる。

【００２８】反応性リポソームに固定化できる機能性物
質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、
蛍光化合物、化学発光化合物、電極感応性化合物等の標
識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性
化合物等の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、その他
のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホル
モン等の生理活性物質；医薬などであって、分子中にア
ミノ基、水酸基またはチオール基を有するもの、または
プラスの電荷を有するものなどがあげられる。これらの
中では、アミノ基、特に第１級アミノ基を有する機能性
物質が好ましい。

【００２９】反応性リポソーム上への機能性物質の共有
結合による固定化反応は、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′−
（２−モルホリノエチル）カルボジイミド＝メソ−ｐ−
トルエンスルホネート、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩など、カルボ
キシル基と前記官能基とを脱水縮合させることが可能な
水溶性の脱水縮合剤の存在下、生理的食塩水、またはｐ
Ｈ＝３〜１０、好ましくは４〜８のリン酸緩衝液、炭酸
緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の種々の緩衝液な
どの水系溶媒、またはこれらの水系溶媒とメタノール、
エタノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロ
フラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、
ジメチルアセタミド、ジメチルスルホキシド、ピロリド
ン等の有機溶媒との混合溶媒中で、反応性リポソームと
前記官能基を有する機能性物質とを−１０〜＋１００
℃、アミノ基との反応の場合は好ましくは０〜６０℃、
さらに好ましくは０〜４０℃、水酸基またはチオール基
との反応の場合は好ましくは３０〜８０℃で、１０分間
〜３００時間、好ましくは３０分間〜２４時間攪拌下に
反応させる方法などにより、一段階で容易に行うことが
できる。これらの条件外では、リポソームの安定性が悪
くなるため好ましくない。このようにして反応させるこ
とにより、リポソーム外表面に伸びる（ポリ）オキシア
ルキレンの先端に機能性物質が共有結合により固定化さ
れた機能性物質固定化リポソームが得られる。

【００３０】リポソーム表面上でのアミノ基を有する機
能性物質の固定化反応を模式的に示すと次のようにな
る。式中、ＡＯ、ｎ、Ｙ、Ｍ²は前記と同じものを示
す。

【化５】

【００３１】機能性物質を電気的に固定化する場合は、
種々の緩衝液等の水系溶媒中で、反応性リポソームにプ
ラスの電荷を有する機能性物質を接触させることによ
り、一段階で容易に行うことができる。

【００３２】反応性リポソームの内部には、一般のリポ
ソームと同様に種々の物質を公知の方法により封入する
ことが可能である。被封入物質としては、例えば色素、
染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合
物等の標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、
熱応答性化合物、電極感応性化合物等の外部刺激応答性
化合物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、
糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物質；医
薬；ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ
エチレングリコール、ヒアルロン酸等の水溶性高分子類
などがあげられる。固定化反応または封入操作の終了後
は、必要によりゲル濾過、限外濾過、透析、遠心分離、
静置沈降分離等の方法により精製を行うことができる。

【００３３】機能性物質固定化リポソームは、（ポリ）
オキシアルキレン鎖の先端に機能性物質が固定化されて
いるので、（ポリ）オキシアルキレン鎖に邪魔されるこ
となく機能性物質の作用が十分に発揮される。また、
（ポリ）オキシアルキレン鎖が導入されているので、従
来からの（ポリ）オキシアルキレン鎖導入の効果、例え
ば長期間にわたる血液中濃度の維持、非免疫原性、リポ
ソーム内部に封入した物質の漏れ防止などの効果も期待
できる。このため反応性リポソームは、機能性物質を固
定化して機能性物質固定化リポソームの形態で、医薬の
運搬体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒、バイ
オリアクター、バイオエレクトロニクス素子、マイクロ
カプセル代替品など、種々の機能性リポソームとして利
用できる。

【００３４】なお、反応性リポソームを製造する際、他
の膜形成成分として重合性リン脂質を配合することによ
り、重合性の反応性リポソームとすることができる。重
合性のリン脂質としては、公知の重合性リン脂質を使用
することができるが、例えば１，２−ジ（２，４−オク
タデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンの他、
野島庄七、砂本順三、井上圭三編集、１９８８年南江堂
発行の「リポソーム」ｐ３１３〜３１５に記載のものな
どがあげられる。これらの中では、１，２−ジ（２，４
−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリン
が好ましい。

【００３５】重合性リポソームは、リポソーム調製後
に、光重合開始剤の存在下または非存在下でＵＶ、γ
線、電子線などの光照射を行うことにより、あるいはレ
ドックス開始剤系により、あるいはアゾ系開始剤または
有機過酸化物などの存在下で加熱を行うことにより、容
易に重合を行うことができる。このようにして得られた
重合後のリポソームは、優れた安定性を有しているの
で、水溶液に分散させたままで、あるいは凍結乾燥等に
より粉末状に調製し、安定して使用することができる。

【００３６】他の反応性小胞体としての反応性脂肪乳剤
は、本発明の反応性小胞体形成剤と、大豆油、サフラワ
ー油等の植物油と、大豆レシチン、卵黄レシチン等のリ
ン脂質と、必要により添加される他の添加剤、例えばイ
ントラリピッド（大塚製薬（株）製、商標）、乳化補助
剤、安定化剤、等張化剤、脂溶性医薬、脂溶性生理活性
物質などを含む油脂混合物が乳化されたものである。油
脂混合物中に占める反応性小胞体形成剤の含有量は、
０．１〜５０モル％、好ましくは０．５〜３０モル％で
あるのが望ましい。

【００３７】反応性脂肪乳剤は、公知の方法により製造
することができる。例えば、本発明の反応性小胞体形成
剤、植物油、他のリン脂質および必要により配合する添
加剤を混合、加熱し、水を加えてホモミキサー等で粗乳
化し、次にマントン−ガウリン型の加圧噴射式ホモジナ
イザー等で均質化する方法などにより製造することがで
きる。

【００３８】このようにして得られた反応性脂肪乳剤に
は、反応性リポソームの場合と同様にして、同様の機能
性物質を容易に固定化することができ、機能性物質固定
化脂肪乳剤が得られる。このため反応性脂肪乳剤は、機
能性物質を固定化して機能性物質固定化脂肪乳剤の形態
で、医薬の運般体、検査薬、診断薬、センサー、固定化
触媒などとして利用できる。

【００３９】上記以外の反応性小胞体である反応性ミセ
ルは、本発明の反応性小胞体形成剤だけからなるもので
あっても、レシチン、コレステロール、リン脂質等の他
の成分が含有されているものであってもよい。反応性ミ
セルも反応性脂肪乳剤と同様にして機能性物質を固定化
することができ、同様の用途に利用できる。

【００４０】

【発明の効果】本発明の反応性小胞体形成剤は、一般式
〔１〕で表わされる構造を有しているので、小胞体に
（ポリ）オキシアルキレン鎖を導入できるとともに、こ
の（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に、簡単にかつ効
率よく種々の機能性物質を共有結合により、または電気
的に固定化することができる。この場合、小胞体は長期
間の保存安定性に優れている。また本発明の反応性小胞
体形成剤を小胞体形成成分として用いることにより、
（ポリ）オキシアルキレン鎖導入の効果、例えば長期間
にわたる血液中濃度の維持、非免疫原性、小胞体に内包
した物質の漏れ防止などの効果も期得できる。

【００４１】本発明の反応性小胞体は、上記反応性小胞
体形成剤を小胞体形成成分として含有しているので、反
応性小胞体形成剤が脱離せず、長期間の安定性に優れて
いる。また（ポリ）オキシアルキレン鎖からなるスペー
サーを介して、簡単にかつ効率よく種々の機能性物質を
共有結合により、または電気的に固定化することができ
る。

【００４２】本発明の機能性物質固定化小胞体は、（ポ
リ）オキシアルキレン鎖の先端に機能性物質が固定化さ
れているので、機能性物質の活性が十分に発揮される。

【００４３】本発明の機能性物質固定化小胞体の製造方
法は、水溶性の脱水縮合剤の存在下に、上記反応性小胞
体に機能性物質を反応させるようにしているので、一段
階の反応で簡単に、しかも小胞体にダメージを与えるこ
となく機能性物質固定化小胞体を製造することができ
る。

【００４４】

【実施例】以下、実施例により、さらに詳細な説明を行
うが、本発明はこれらに限定されるものではない。 合成例１ 両末端にカルボキシル基を有するポリエチレングリコー
ル誘導体（Ｍｗ≒３０００）

【化６】 ３．０ｇ（０．９ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカ
ルボジイミド２０４ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）を酢酸エチ
ル１０ｍｌに溶解させ、５℃で３０分間攪拌した。次に
ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン２１７
ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）を溶解させた酢酸エチル溶液１
０ｍｌを加え、さらに６時間攪拌した後、０℃で一晩静
置し、析出物をろ過除去した。得られた反応混合物をヘ
キサン１００ｍｌ中に注ぎ込み、沈殿物をろ過回収し、
目的の下記化合物からなる反応性小胞体形成剤を白色粉
末状で得た（収率８８％）。反応の進行は、ＩＲスペク
トル（ＫＢｒ法）において、ホスファチジルエタノール
アミン中のアミノ基（３０００ｃｍ^-1）の消失およびア
ミド結合（Ｃ＝Ｏ伸縮、１６４７ｃｍ^-1）の生成により
確認した。

【化７】

【００４５】実施例１−１ 卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、
コレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）および合成
例１で得られた化合物２．４ｍｇ（前記二者に対して１
０重量％）をナス型フラスコに入れ、２ｍｌのベンゼン
で溶解させた後、凍結乾燥を行った。これに生理的食塩
水１ｍｌを加え、バス型超音波照射およびボルテックス
ミキサーによりリポソーム化し、多重層リポソームを得
た。さらにエクスツルーダーにより３．０→１．０→
０．２μｍのポリカーボネートメンブランを順次通過さ
せ、大きな一枚膜リポソームを得た。得られた反応性リ
ポソームの粒径をレーザー散乱粒度分布計（ＮＩＣＯＭ
Ｐ社製、ＮＩＣＯＭＰ３７０ＨＰＬ、商標）を用いて測
定したところ、平均粒径２５４ｎｍ（ＣＶ値１８％）で
あった。上記リポソームを５℃で１か月間静置した後平
均粒径を測定したところ、平均粒径２５９ｎｍ、ＣＶ値
１９％であり、安定性に優れていた。

【００４６】実施例１−２ 実施例１−１と同様にして、ただし反応性小胞体形成剤
として下記の反応性ポリアルキレンオキシド誘導体を他
の成分２者に対して５重量％の量で用いて反応性リポソ
ームを得た（平均粒径２７５ｎｍ、ＣＶ値２１％）。上
記リポソームを５℃で１か月間静置した後平均粒径を測
定したところ、平均粒径２７８ｎｍ、ＣＶ値２２％であ
り、安定性に優れていた。

【化８】

【００４７】実施例１−３ 実施例１−１と同様にして、ただし反応性小胞体形成剤
として下記の反応性ポリアルキレンオキシド誘導体を他
の成分二者に対して３０重量％の量で用いて反応性リポ
ソームを得た（平均粒径２３８ｎｍ、ＣＶ値２５％）。
上記リポソームを５℃で１か月間静置した後平均粒径を
測定したところ、平均粒径２４０ｎｍ、ＣＶ値２４％で
あり、安定性に優れていた。

【化９】

【００４８】実施例１−４ 実施例１−１と同様にして、ただし反応性小胞体形成剤
として下記の反応性ポリアルキレンオキシド誘導体を他
の成分二者に対して１重量％の量で用いて反応性リポソ
ームを得た（平均粒径２４９ｎｍ、ＣＶ値２３％）。上
記リポソームを５℃で１か月間静置した後平均粒径を測
定したところ、平均粒径２５８ｎｍ、ＣＶ値２６％であ
り、安定性に優れていた。

【化１０】

【００４９】実施例１−５ 実施例１−１と同様にして、ただし反応性小胞体形成剤
として下記の反応性ポリアルキレンオキシド誘導体を他
の成分二者に対して５重量％の量で用いて反応性リポソ
ームを得た（平均粒径２４６ｎｍ、ＣＶ値２４％）。上
記リポソームを５℃で１か月間静置した後平均粒径を測
定したところ、平均粒径２５１ｎｍ、ＣＶ値２６％であ
り、安定性に優れていた。

【化１１】

【００５０】実施例１−６ 実施例１−１と同様にして、ただし反応性小胞体形成剤
として下記の反応性ポリアルキレンオキシド誘導体を他
の成分二者に対して５重量％の量で用いて平均粒径２９
４ｎｍ（ＣＶ値２５％）の反応性を有する小さな単層リ
ポソームを得た。上記リポソームを５℃で１か月間静置
した後平均粒径を測定したところ、平均粒径２９９ｎ
ｍ、ＣＶ値２７％であり、安定性に優れていた。

【化１２】

【００５１】実施例１−７ 実施例１−１と同様にして、ただし卵黄ホスファチジル
コリンの代わりに１，２−ジ（２，４−オクタデカジエ
ノイル）−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＤＰ）を用
いて、平均粒径２４９ｎｍ（ＣＶ値２７％）の反応性を
有する大きな一枚膜リポソームを得た。このリポソーム
に０．７５Ｍｒａｄのγ線照射を行ってＤＯＤＰを重合
させた。得られた反応性の重合性リポソームは、Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過後、凍結乾燥し
て粉末状サンプルとした。このリポソーム粉末は、生理
的食塩水で膨潤させ、再生することができた。

【００５２】実施例２−１ 実施例１−１で得られたリポソーム溶液（固形分量０．
２５％）の５００μｌに、１ｍｇ／ｍｌの１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩水溶液（ｐＨ５）５００μｌを加え、５℃で３０分
間攪拌した。さらに１ｍｇ／ｍｌ濃度の西洋山葵ペルオ
キシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）／０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）１００μｌを加え、５℃で２４時間
攪拌してＨＲＰをリポソームに固定化した。これをＳｅ
ｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過を行い、含リ
ポソーム分画を分取し、ＨＲＰ固定化リポソームを得
た。このようにして得られたＨＲＰ固定化リポソーム溶
液５００μｌに、ＨＲＰの基質である１，２−フェニレ
ンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）１００μｌを加
え、３０℃で１０分間インキュベートし、さらに０．１
Ｎ硫酸１０μｌを加えたところ、褐色の呈色が見られ
た。この結果から、実施例１−１の反応性リポソーム
は、ＨＲＰと攪拌するだけでＨＲＰを固定化できること
が確認できた。

【００５３】実施例２−２ないし２−７ 実施例１−２ないし１−７で得られた反応性リポソーム
を用いて実施例２−１と同様にしてＨＲＰを固定化し、
ＨＲＰ固定化リポソームを得た。それぞれのＨＲＰ固定
化リポソームについて実施例２−１と同様にして発色試
験を行ったところ、いずれの場合も褐色の呈色が見ら
れ、ＨＲＰの固定化が確認された。

【００５４】比較例１ 卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、
コレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）のみを用い
て、実施例１−１と同様の操作により、固形分量２．５
％の多重層リポソームを得た。このリポソームに実施例
２−１と全く同様にしてＨＲＰを作用させ、ゲル濾過に
より精製した。得られたリポソーム溶液の５００μｌ
に、１，２−フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／
ｌ）１００μｌを加え、３０℃で１０分間インキュベー
トし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたが、発色は
見られなかった。この結果から、反応性小胞体形成剤を
膜形成成分として含まない比較例１のリポソームでは、
ＨＲＰを固定化することができなかったことがわかる。

【００５５】比較例２ 卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２μｍｏｌ）、コ
レステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）およびα−ス
テアリル−ω−ヒドロキシ−ポリオキシエチレン（平均
付加モル数約１０）２．４ｍｇ（前記二者に対して１０
重量％、７μｍｏｌ）をナス型フラスコに入れ、２ｍｌ
のベンゼンで溶解させた後、凍結乾燥を行った。これに
生理的食塩水１ｍｌを加え、バス型超音波照射およびボ
ルテックスミキサーにより、リポソーム化し、多重層リ
ポソームを得た。さらのエクスツルーダーにより３．０
→１．０→０．２μｍのポリカーボネートメンブタンを
順次通過させ、大きな一枚膜リポソームを得た。得られ
たリポソームの平均粒径を測定したところ、平均粒径１
９６ｎｍ（ＣＶ値１１％）であった。さらに、５℃で一
週間静置後、再び平均粒径を測定したところ２８８ｎｍ
（ＣＶ値６５％）と、平均粒径、ＣＶ値ともに大きく変
化しており、リポソームが安定に存在していないことが
分かった。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式〔１〕で表わされる反応性ポ
   リアルキレンオキシド誘導体からなることを特徴とする
   反応性小胞体形成剤。 【化１】 〔式中、Ｒ¹およびＲ²は炭素数３〜３０の脂肪酸のアシ
   ル残基を表わし、同一でも異なっていてもよい。ＡＯは
   炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎはオキシアルキ
   レン基の平均付加モル数で、１〜１０００の正数を表わ
   す。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は同一でも
   異なっていてもよく、またランダム状に付加していて
   も、ブロック状に付加していてもよい。ＸおよびＹは２
   価の有機残基、ｐは０または１、Ｍ¹およびＭ²は水素原
   子またはアルカリ金属原子を表わす。〕
2. 【請求項２】 請求項１記載の反応性小胞体形成剤の一
   種以上を小胞体形成成分として含むことを特徴とする反
   応性小胞体。
3. 【請求項３】 請求項２記載の反応性小胞体に機能性物
   質を固定してなることを特徴とする機能性物質固定化小
   胞体。
4. 【請求項４】 水溶性の脱水縮合剤の存在下に、請求項
   ２記載の反応性小胞体に機能性物質を反応させることを
   特徴とする機能性物質固定化小胞体の製造方法。