JPH07179355A - ＩｇＧおよびＩｇＭクラスの抗体産生を促進する 免疫賦活剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 哺乳類のラクトフェリン、哺乳類のアポラク
トフェリン、哺乳類の金属飽和ラクトフェリン、および
これらの任意の混合物からなる群より選択されたラクト
フェリンを加水分解して得られるラクトフェリン分解物
を有効成分として含有する。 【効果】 リンパ球の増殖を促進し、ＩｇＧおよびＩｇ
Ｍクラスの抗体の産生を増強することにより、疾病、老
化等による免疫能の低下を予防または改善することがで
き、乳等の天然物より調製したＬＦ分解物を有効成分と
しているので、極めて安全性が高い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、ＩｇＧおよびＩｇＭ
クラスの抗体産生を促進する免疫賦活剤に関するもので
ある。さらに詳しくは、この発明は、疾病、老化等によ
る免疫能の低下を予防または改善する作用を有し、かつ
安全性の高い免疫賦活剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ラクトフェリンは、生体内では、涙、唾
液、末梢血、乳汁等に含まれている鉄結合性タンパク質
であり、大腸菌、ブドウ球菌および腸球菌に対して、
０．５〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗菌作用を有すること
が知られている［ジャーナル・オブ・デイリー・サイエ
ンス (Journal of Dairy Science) 、第６７巻、第６０
６ページ、１９８４年］。また、ラクトフェリンは熱に
不安定であり、６２．５℃で３０分の加熱によりその生
理作用をほぼ失活し、７０℃で１５分の加熱により完全
に失活することが知られている［ジャーナル・オブ・ペ
ディアトリックス (Journal of Pediatrics)、第９０
巻、第２９ページ、１９７７年］。

【０００３】従って、従来ラクトフェリン含有液を処理
する場合であって、その工程中に加熱処理を包含する場
合には、ラクトフェリンが失活するおそれがあり、充分
な加熱処理を採用できないのが実情であった。さらに、
ラクトフェリンそのものには抗菌作用ばかりではなく、
無血清培地で培養したリンパ系細胞に対してその細胞の
増殖促進作用［バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・
アクタ(Biochimica et Biophysica Acta) 、第７６３
巻、第３７７ページ、１９８３年］および抗体の産生促
進作用［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル
・ケミストリー (Agricultural and Biological Chemis
try)、第５４巻、第１０８７ページ、１９９０年］の存
在が知られており、無血清培地における抗体産生促進に
関する技術も開示されている（特開平２−２５７８９２
公報）。

【０００４】この発明の発明者らは、ラクトフェリンそ
のものではなく、ラクトフェリン類の加水分解物から分
離され、２５アミノ酸残基からなる特定のペプチドに好
中球からのロイコトリエンＢ４の放出促進作用及び肥満
細胞からのヒスタミン放出促進作用のあることを発見し
て特許出願し（ＰＣＴ／ＪＰ９２／００２７５）、ラク
トフェリン加水分解物および／またはそれから分離した
特定のペプチドとビフィズス菌との併用によりＩｇＡ抗
体産生促進作用のあることを発見して特許出願し（特願
平４−１８８１９３号）、さらにラクトフェリン、ラク
トフェリン加水分解物またはこれらの混合物と上皮細胞
成長因子との併用による消化管細胞賦活作用のあること
も発見して特許出願した（特願平４−２０２７２４
号）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来ラ
クトフェリン類の加水分解物が血清の存在下で抗体産生
促進作用を有するという報告はなされておらず、さら
に、血清の存在下でＩｇＧおよびＩｇＭの両クラスの抗
体産生を同時に促進するという報告は皆無であった。
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたもの
であり、全身性免疫に関係するＩｇＧおよびＩｇＭの両
クラスの抗体産生能を血清存在下で同時に促進する新し
い免疫賦活剤を提供することを目的としている。

【０００６】

【問題を解決するための手段】この発明の発明者らは、
ラクトフェリン類の加水分解物の新規な作用効果につい
て鋭意研究を重ねた結果、ラクトフェリン類の加水分解
物が、血清存在下においても強い免疫賦活作用を発現
し、ＩｇＧおよびＩｇＭの両クラスの抗体産生を同時に
促進することを発見し、この発明を完成した。

【０００７】すなわち、この発明は、上記の課題を解決
するものとして、哺乳類のラクトフェリン、哺乳類のア
ポラクトフェリン、哺乳類の金属飽和ラクトフェリン、
およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された
ラクトフェリンを加水分解して得られるラクトフェリン
分解物を有効成分とする免疫賦活剤を提供する。次にこ
の発明について詳しく説明する。

【０００８】この発明において、出発物質として使用す
るラクトフェリンは、市販のラクトフェリン、哺乳類
（例えば人、牛、羊、山羊、馬等）の初乳、移行乳、常
乳、末期乳等、またはこれらの乳の処理物である脱脂
乳、ホエー等（以下これらをまとめて乳等と記載する）
から常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）に
より分離したラクトフェリン、それらを塩酸、クエン酸
等により脱鉄したアポラクトフェリン、それらを鉄、
銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせた金属飽和
ラクトフェリン、あるいはそれらの混合物であって良い
（以下これらをまとめてＬＦと記載する）。

【０００９】この発明に使用するラクトフェリン加水分
解物は、前記ＬＦを酸または酵素で加水分解することに
よって得られる。酸による加水分解は、ＬＦを０．１〜
２０％（重量。以下、特に断りのない限り同じ）、望ま
しくは５〜１５％の濃度で水または精製水等に溶解し、
得られた溶液に塩酸、リン酸等の無機酸、またはクエン
酸等の有機酸を添加し、溶液のｐＨを１〜４、望ましく
は２〜３に調整する。得られた溶液は、調整されたｐＨ
に応じて、適当な温度で所定時間加熱して加水分解す
る。例えば、ｐＨが１〜２に調整された場合には８０〜
１３０℃、望ましくは９０〜１２０℃で、ｐＨ２〜４に
調整された場合には１００〜１３０℃、望ましくは１０
０〜１２０℃で、それぞれ１〜１２０分間、望ましくは
５〜６０分間加熱する。

【００１０】酵素により加水分解する場合には、ＬＦを
０．５〜２０％、望ましくは５〜１５％の濃度で水、精
製水等に溶解し、得られた溶液を使用される酵素の至適
ｐＨに調整して加水分解する。使用する酵素には特に制
限がなく、市販の酵素、例えばモルシンＦ（商標。盛進
製薬社製。至適ｐＨ２．５〜３．０）、豚ペプシン（和
光純薬社製。至適ｐＨ２〜３）スミチームＡＰ（商標。
新日本化学社製。至適ｐＨ３．０）、アマノＭ（商標。
アマノ製薬社製。至適ｐＨ３．０）、アマノＡ（商標、
アマノ製薬社製。至適ｐＨ７．０）、トリプシン（ノボ
社製。至適ｐＨ８．０）等を単用または併用するが、特
に、豚ペプシンを単用または他の任意の酵素との併用す
るのが望ましい。使用する酵素の量は、基質に対して
０．１〜５．０％の範囲、特に、０．５〜３．０％が望
ましい。

【００１１】すなわち、この酵素による加水分解は、具
体的には、ラクトフェリン類の溶液のｐＨを調整し、上
記の酵素を適量添加した後、得られた溶液の温度を１５
〜５５℃、望ましくは３０〜５０℃で３０〜６００分
間、望ましくは６０〜３００分間保持してラクトフェリ
ン類を加水分解する。次いで溶液をそのまま、または中
和した後、酵素を常法により加熱失活する。

【００１２】これらの酸または酵素を用いる方法によっ
て得られた反応液を、常法により冷却し、必要に応じて
中和、脱塩、脱色し、得られた溶液をそのまま、濃縮し
て液状の濃縮製品、または濃縮後乾燥して粉末製品とす
ることができる。前記の加水分解の条件は、厳密なもの
ではなく、製造コスト、例えば、温度、時間、酸または
酵素の種類および量、反応装置（加圧の有無）等を考慮
して適宜条件を設定できる。

【００１３】以上の方法によって得られたＬＦ分解物
は、種々の分子量を有する分解物の混合物であり、ＬＦ
分解物の分解率は、タンパク質の抗原性消失の観点か
ら、ホルモール滴定による分解度が６〜２０％、特に７
〜１５％の範囲が望ましい。こうして得られたＬＦ分解
物は、血清存在下においてＩｇＧおよびＩｇＭクラスの
抗体産生を促進する免疫賦活活性を有する。

【００１４】ＬＦ分解物の免疫賦活活性は、リンパ系細
胞を活性化し、主としてＩｇＧおよびＩｇＭクラスの抗
体産生を促進することにより全身性免疫を賦活化する。
従って、この発明によるラクトフェリン分解物は、その
まま、あるいは賦形剤または他の薬剤と混合してＩｇＧ
およびＩｇＭクラスの抗体産生を促進する免疫賦活剤と
して用いることができる。

【００１５】この発明の免疫賦活剤の投与量または摂取
量は、対象者の年齢、体重、症状等により異なるが、成
人１日当たりＬＦ分解物として少なくとも０．１ｍｇ／
ｋｇ体重が望ましい。ラクトフェリン類、およびその加
水分解物は、天然物であるから、それらの安全性につい
て問題がないことは明らかである。

【００１６】次に、試験例を示してこの発明の作用効果
を詳しく説明する。 試験例１ この試験は、マウス脾臓リンパ細胞のＤＮＡ合成促進作
用に及ぼすＬＦ分解物の作用について調べるために行っ
た。 １．試料の調製 １）ＬＦ分解物の調製 乳等から分離したままの市販のＬＦ［ベルギーのオレオ
フィナ社製。ここで「乳等から分離したままの」なる表
現は、ラクトフェリンの分離を行ったのみであって、脱
鉄、金属飽和等の化学処理を行っていないことを意味す
る（以下同じ）］を５％の濃度で精製水に溶解し、１Ｍ
の塩酸を添加し、ｐＨを２〜３に調整し、豚ペプシン
（和光純薬社製）を基質に対して３％の割合で添加して
均一に混和した。次いで、この溶液を３７℃で８時間保
持し、のち８０℃で１５分間保持して酵素を失活させ、
水酸化ナトリウム溶液で反応溶液を中和し、遠心（１０
００ｒｐｍで１０分間）して不溶解物を除去し、上清を
凍結乾燥し、試験試料を得た。２）マウス脾臓リンパ細
胞（以下リンパ細胞と記載する）の調製 ＳＰＦマウス（ＢＡＬＢ／ｃ系、雌、６週齢）を屠殺
し、脱血し、のち脾臓を無菌的に摘出し、常法（財団法
人日本生化学会編、『新生化学実験講座１２ 分子免疫
学Ｉ』、第１版、第９ページ、東京化学同人発行、１９
８９年）により個々のリンパ細胞を採取し、次の測定用
培地によりリンパ細胞を３回洗浄し、リンパ細胞数を４
×１０⁶ 個／ｍｌに調整した。 ３）測定用培地の調製 １０％のＦＢＳ、１５ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＲＰ
ＭＩ１６４０（大日本製薬社製）培地を調製した。 ２．実験方法 ９６穴マルチプレ−ト（ヌンク社製）に、１穴当たり２
×１０⁶ 個の前記リンパ細胞および表１に示す濃度でＬ
Ｆ分解物を添加し（試験試料）、５％ＣＯ₂ 存在下、３
７℃で４２時間培養した。その後、９．２５ｋＢｑ／ウ
エルの³ Ｈ−チミジン（ＩＣＮ バイオメディカルズ社
製）を加え、さらに６時間、同一環境下で培養した。培
養終了後、常法により各穴の細胞を回収し、シンチレ−
ションカウンター（ＬＫＢ社製）を用いてリンパ細胞に
取り込まれた³ Ｈ−チミジンのカウントを測定した。な
お、試験物質を添加しない対照試料についても同様に試
験した。

【００１７】得られた１分間当たりのカウント値を次式
により標準化し、その値（ＳＩ：刺激指標）を表示し
た。 ＳＩ＝（試験試料のカウント：ｃｐｍ）／（対照試料の
カウント：ｃｐｍ） ３．試験結果 この試験の結果は表１に示すとおりである。表１に示す
３回の反復試験の結果から明らかなように、ＬＦ分解物
を１０μｇ／ｍｌ以上の濃度で添加した試料では、リン
パ細胞のＤＮＡ合成を促進することが認められ、ＬＦ分
解物の添加量の増加によりリンパ細胞のＤＮＡ合成が顕
著に促進された。血液を含む培地でリンパ細胞のＤＮＡ
合成が促進されたことは、血液を含まない培地よりも生
体に近い状態で、ＬＦ分解物がリンパ細胞の増殖を促進
することを示しており、リンパ細胞の増殖は、ＩｇＧお
よびＩｇＭクラスの抗体産生を促進することが推定され
る。この推定は、次の試験例２により実証された。

【００１８】なお、試験例１の結果を検証するために、
リンパ細胞の増殖を促進することが公知である市販のＬ
ＰＳおよびＣｏｎＡを用いて同時に試験を行ったが、こ
の試験に誤りのないことが確認された。

【００１９】

【表１】

【００２０】試験例２ この試験は、ＬＦ分解物のＩｇＧおよびＩｇＭクラスの
抗体産生促進効果を調べるために行った。 １．試料の調製 試験例１と同一の方法によりＬＦ分解物を調製した。 ２．試験方法 リンパ細胞を試験例１と同一の方法により調製し、１０
⁶ 個／ｍｌの割合に調整したリンパ細胞を、チューブ当
たり１ｍｌずつ分注し、表２に示す濃度でＬＦ分解物を
添加し、５％ＣＯ₂ 存在下、３７℃で１週間培養した。
培養終了後、培養上清中のＩｇＧおよびＩｇＭクラスの
抗体量を酵素抗体法［イムノケミストリ−(Immunochemi
stry) 、第８巻、第８７１ペ−ジ、１９７１年］により
測定し、培養上清中にリンパ細胞から産生されたＩｇＧ
およびＩｇＭの量を測定した。なお、ＬＦ分解物を添加
しない対照試料についても、前記と同一の方法によりＩ
ｇＧおよびＩｇＭの量を測定した。 ３．試験結果 この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から
明らかなようにＬＦ分解物を１０μｇ／ｍｌ以上の濃度
で添加した試験試料において、ＩｇＧおよびＩｇＭクラ
スの抗体産生が格段に促進されることが認められ、ＬＦ
分解物の添加量の増加によりこれらの抗体産生が顕著に
促進された。この試験結果は、従来全く知られていなか
ったＬＦ分解物の新しい効果を示しており、この発明の
発明者らが初めて見出した事実である。

【００２１】

【表２】

【００２２】試験例３ この試験は、リンパ細胞のＤＮＡ合成促進作用に及ぼす
血清濃度について調べるために行った。 １．試料の調製および試験方法 培地中の血清濃度およびＬＦ分解物の添加量を表３に示
すとおり変更したことを除き、試験例１と同一の方法に
より試験を行った。 ２．試験結果 この試験の結果は、表３に示すとおりである。表３から
明らかなように、培地に添加する血清濃度およびＬＦ分
解物の添加量の増加にともない、リンパ細胞のＤＮＡ合
成が、相乗的に促進されることが認められた。

【００２３】

【表３】

【００２４】次に実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定さ
れるものではない。

【００２５】

【実施例】

実施例１ 試験例１と同一の方法によるラクトフェリン加水分解物 ５０．０（ｍｇ ） 結晶セルロ−ス １７０．０ コ−ンスタ−チ ６６．０ タルク １１．０ ステアリン酸マグネシウム ３．０ １錠当たり上記の割合の各原料を常法により均一に混合
し、造粒し、乾燥し、打錠し、錠剤を得た。なお、ラク
トフェリン加水分解物以外の原料はいずれも市販品を用
いた。 実施例２ 試験例１と同一の方法によるラクトフェリン加水分解物 ５０．０（ｇ） 結晶セルロ−ス ３７５．０ コ−ンスタ−チ ５７５．０ 上記各材料を均一に混合し、１ｇずつ常法により包装
し、散剤１０００袋を調製した。なお、ラクトフェリン
加水分解物以外の原料はいずれも市販品を用いた 。実施例３ 試験例１と同一の方法によるラクトフェリン加水分解物 ２０．０（ｇ） 結晶セルロ−ス ７８．０ コ−ンスタ−チ ２０．０ 乳糖 １７．０ ポリビニルピロリドン ３．０ 上記各材料を均一に混合し、常法により顆粒化し、約１
００ｍｇずつゼラチン硬カプセル１０００個に充填し、
カプセル剤を調製した。なお、ラクトフェリン加水分解
物以外の原料はいずれも市販品を用いた。

【００２６】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって奏せられる効果は、次のとおりである。 １）リンパ球の増殖を促進し、ＩｇＧおよびＩｇＭクラ
スの抗体の産生を増強することにより、疾病、老化等に
よる免疫能の低下を予防または改善することができる。 ２）乳等の天然物より調製したＬＦ分解物を有効成分と
しているので、極めて安全性が高い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 宮内 浩文 神奈川県横浜市旭区南希望が丘118 森永 希望が丘寮

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳類のラクトフェリン、哺乳類のアポ
   ラクトフェリン、哺乳類の金属飽和ラクトフェリン、お
   よびこれらの任意の混合物からなる群より選択されたラ
   クトフェリンを加水分解して得られるラクトフェリン分
   解物を有効成分とするＩｇＧおよびＩｇＭクラスの抗体
   産生を促進する免疫賦活剤。