JPH07135998A - Method for measuring alpha-amylase activity and reagent composition therefor - Google Patents
Method for measuring alpha-amylase activity and reagent composition thereforInfo
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- JPH07135998A JPH07135998A JP28936793A JP28936793A JPH07135998A JP H07135998 A JPH07135998 A JP H07135998A JP 28936793 A JP28936793 A JP 28936793A JP 28936793 A JP28936793 A JP 28936793A JP H07135998 A JPH07135998 A JP H07135998A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、非還元性末端グルコー
スの４位または６位の水酸基をβ−ガラクトースで修飾
したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質として用い
るアミラーゼ活性測定法及びその試薬組成物に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for measuring amylase activity using a β-galactosylmaltooligosaccharide in which the 4- or 6-position hydroxyl group of non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose as a substrate, and a reagent composition thereof. .
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来から膵液や尿等の体液中に含有され
るα−アミラーゼ活性を測定することにより、各種疾患
の診断が行われている。この方法ではα−アミラーゼの
活性測定法には、例えばマルトオリゴ糖（マルトトリオ
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオース等）を基質とする方法がある。この方法
では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖とα
−グルコシダーゼとを作用させて基質からグルコースを
遊離させ、遊離するグルコース量の量を測定することに
より、α−アミラーゼの活性を知ることができる。2. Description of the Related Art Conventionally, various diseases have been diagnosed by measuring .alpha.-amylase activity contained in body fluids such as pancreatic juice and urine. In this method, there is a method for measuring the activity of α-amylase, for example, using maltooligosaccharide (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, etc.) as a substrate. In this method, an α-amylase-containing sample is treated with the maltooligosaccharide and α-amylase.
-The activity of α-amylase can be known by reacting with glucosidase to release glucose from the substrate and measuring the amount of released glucose.
【０００３】またマルトオリゴ糖誘導体として、還元性
末端グルコースにフェニル基、ナフチル基または、それ
らの誘導体をアグリコンとして結合させた基質を用いる
方法も提案されている。例えば基質としてｐ−ニトロフ
ェニルマルトペンタオシド（特公昭57-53079号公報）、
ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシド（特公昭57-530
79号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド
（特公昭62-50119号公報）、２，４−ジニトロマルトペ
ンタオシド（特公昭59-13199号公報）等が利用されてい
る。これらの基質を使用するとアグリコンが遊離し、遊
離したアグリコン、例えばｐ−ニトロフェニールを光学
的に測定することにより、α−アミラーゼの活性を測定
することが出来る。Further, as a maltooligosaccharide derivative, a method of using a substrate in which a reducing terminal glucose is bound with a phenyl group, a naphthyl group or a derivative thereof as an aglycone has been proposed. For example, p-nitrophenyl maltopentaoside as a substrate (Japanese Patent Publication No. 57-53079),
p-nitrophenyl maltohexaside (Japanese Patent Publication No. 57-530
79), p-nitrophenylmaltoheptaoside (JP-B-62-50119), 2,4-dinitromaltopentaoside (JP-B-59-13199), and the like. When these substrates are used, aglycone is released, and the activity of α-amylase can be measured by optically measuring the released aglycone, for example, p-nitrophenyl.
【０００４】上記方法では、α−グルコシダーゼの作用
により、僅かではあるがブランク値が上昇し、その結
果、測定値の誤差が大きくなるという欠点が生じ、α−
グルコシダーゼと基質とを一液化することは難しいこと
であった。このような欠点を解消するために、マルトオ
リゴ糖の非還元性末端のグルコースの４位および／また
は６位の水酸基を修飾したタイプの基質が市販され利用
されるようになった。最近、上記合成糖より天然糖に近
い形のα−アミラーゼの基質として、非還元性末端グル
コースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトース修
飾された、β−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体が開
発された（特開平3-264596号公報、特開平5-208989号公
報など) 。In the above method, the blank value slightly increases due to the action of α-glucosidase, resulting in a large error in the measured value, resulting in α-glucosidase.
It was difficult to liquefy the glucosidase and the substrate. In order to solve such a defect, a substrate of the type in which the non-reducing end of glucose of maltooligosaccharide is modified with hydroxyl groups at the 4-position and / or the 6-position has come to be commercially available. Recently, a β-galactosylmaltooligosaccharide derivative in which the 4- or 6-position hydroxyl group of non-reducing terminal glucose has been β-galactose modified has been developed as a substrate for α-amylase having a form closer to that of natural sugar than the above synthetic sugar. (JP-A-3-264596, JP-A-5-208989, etc.).
【０００５】このような基質としては、例えば、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−β−マルトテトラオシドなどがある。この
基質は、追随酵素（α−グルコダーゼ、β−グルコシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ等）の一液化条件において、α
−グルコシダーゼの作用を受けず、またその合成が容易
であり、水溶性に優れ、かつアミラーゼの作用様式をよ
り純粋に反映するなど多くの利点がある。通常、臨床診
断の場においては血清および尿中のα−アミラーゼを測
定し、疾患の有無を判断する。しかしながら、血清およ
び尿中にはβ−ガラクトシダーゼが存在する可能性を有
する。具体的に尿中には数ユニット（ＩＵ）存在するこ
とが知られている（東京化学同人発行、生化学データブ
ック、第1606頁、1979年発行) 。Examples of such a substrate include 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-β-maltotetraoside. This substrate is a α-glucodase, β-glucosidase, glucoamylase, etc.
-There are many advantages such as being unaffected by glucosidase, being easy to synthesize, excellent in water solubility, and more purely reflecting the action mode of amylase. Usually, in clinical diagnosis, serum and urine α-amylase is measured to determine the presence or absence of a disease. However, β-galactosidase may be present in serum and urine. Specifically, it is known that several units (IU) are present in urine (Tokyo Kagaku Dojin, Biochemistry Data Book, p. 1606, 1979).
【０００６】したがって、尿中にβ−ガラクトシダーゼ
が存在すると、基質であるガラクトシルマルトオリゴ糖
誘導体の非還元性末端グルコースに修飾されたガラクト
シル基のβ結合を加水分解し、ガラクトースとマルトオ
リゴ糖誘導体を生じることになる。生じたマルトオリゴ
糖誘導体は、追随酵素であるα−グルコシダーゼの作用
を受けることになり、測定のブランク値を上昇させ、そ
の結果、測定値の誤差が大きくなる。このことは非還元
性末端グルコースをブロックし、上記追随酵素の作用か
ら基質の分解を阻止するという本来の効果が消失するこ
とになる。Therefore, when β-galactosidase is present in urine, the β-bond of the galactosyl group modified to the non-reducing terminal glucose of the substrate galactosylmaltooligosaccharide derivative is hydrolyzed to give galactose and the maltooligosaccharide derivative. become. The resulting maltooligosaccharide derivative is subjected to the action of α-glucosidase, which is a tracking enzyme, and raises the blank value of the measurement, resulting in a large error in the measured value. This means that the non-reducing terminal glucose is blocked, and the original effect of blocking the decomposition of the substrate due to the action of the following enzyme disappears.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
非還元性末端グルコースがβ−ガラクトースで修飾され
たβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質とするアミラ
ーゼ測定方法において、血清や尿などの体液中のβ−ガ
ラクトシダーゼの作用により基質が分解することを抑制
し、アミラーゼ活性を正確に測定する方法および試薬を
提供することにある。DISCLOSURE OF THE INVENTION An object of the present invention is to measure the amylase using the β-galactose-malto-oligosaccharide whose non-reducing terminal glucose is modified by β-galactose as a substrate, in a body fluid such as serum or urine. Another object of the present invention is to provide a method and a reagent for accurately measuring amylase activity by suppressing the degradation of the substrate due to the action of β-galactosidase.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は還元末
端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元
末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラク
トースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、
α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼ
およびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料
中のα−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定
することを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法であ
る。That is, according to the present invention, the hydroxyl group at the 1-position of reducing terminal glucose is bound to a chromogen, and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose. -Galactosylmaltooligosaccharides,
In a method for measuring α-amylase activity, which comprises reacting a reagent containing α-glucosidase and / or β-glucosidase and β-galactosidase inhibitor with α-amylase in a sample, and measuring a chromogen produced. is there.
【０００９】また本発明は還元末端グルコースの１位の
水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位
または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ
−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼお
よび／またはβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシ
ダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするα−アミラーゼ活
性測定用試薬組成物である。Further, in the present invention, the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is bound to the chromogen, and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose.
A galactosylmaltooligosaccharide, an α-glucosidase and / or a β-glucosidase, and a β-galactosidase inhibitor are contained in the reagent composition for measuring an α-amylase activity.
【００１０】本発明において使用する還元末端グルコー
スの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコ
ースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修
飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖とは、グルコ
ース数が２〜７であるマルトオリゴ糖の還元末端グルコ
ースの１位の水酸基に、α−グルコシダーゼ及びβ−グ
ルコシダーゼの追随酵素により加水分解を受けると呈色
する色原体をα−結合またはβ−結合し、非還元末端グ
ルコースの４位または６位の水酸基がβ- ガラクトシル
基で修飾されたものをいう。A β-galactosylmalto-oligosaccharide in which the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose used in the present invention binds a chromogen and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose. Is the α-bond or the chromogen which is colored when hydrolyzed by the α-glucosidase and the β-glucosidase following enzyme to the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose of the maltooligosaccharide having a glucose number of 2 to 7; It is β-bonded, and the 4- or 6-position hydroxyl group of non-reducing terminal glucose is modified with a β-galactosyl group.
【００１１】色原体としては、可視部に吸光度を有する
ものに限定されるものではなく、紫外部に吸光度を有す
るものや、蛍光測定あるいは発光測定が可能である化合
物でもよい。可視部に吸光度を有する色原体としては、
置換基としてニトロ基を有するフェノール類、例えば２
−クロロ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノー
ル等がある。紫外部に吸光度を有する色原体としては、
アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ
基、カルボキシフェニルアミノ基などがある。蛍光測定
が可能である化合物としては、２−ピリジルアミノ基、
３−ピリジルアミノ基、ウンベリフェリル基などがあ
る。The chromogen is not limited to one having an absorbance in the visible region, but may be one having an absorbance in the ultraviolet region or a compound capable of measuring fluorescence or luminescence. As a chromogen having an absorbance in the visible part,
Phenols having a nitro group as a substituent, such as 2
-Chloro-4-nitrophenol, p-nitrophenol and the like. As a chromogen having an absorbance in the ultraviolet region,
Examples include anilino group, methylanilino group, hydroxyanilino group and carboxyphenylamino group. As the compound capable of measuring fluorescence, a 2-pyridylamino group,
Examples include 3-pyridylamino group and umbelliferyl group.
【００１２】本発明に使用する基質としては、下記式に
て示される化合物が例示される。Examples of the substrate used in the present invention include compounds represented by the following formula.
【００１３】[0013]
【化１】 （式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクト
ピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ3 はｐ−ニ
トロフェニル基またはハロゲン置換ｐ−ニトロフェニル
基を示し、ｎは０〜５の整数を示す。）[Chemical 1] (In the formula, one of R 1 and R 2 represents a β-galactopyranosyl group, the other represents hydrogen, R 3 represents a p-nitrophenyl group or a halogen-substituted p-nitrophenyl group, and n Represents an integer of 0 to 5.)
【００１４】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖としては、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシ
ド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−α−マルトトリオシド、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテ
トラオシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−α−マルトペンタオシド、４−ニト
ロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α
−マルトテトラオシド、４−ニトロフェニル ６−Ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトペンタオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−α−テトラオシドまたは２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−α−マルトペンタオシド等がある。The hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose α-bonds to the chromogen, and the 4-position or 6-position of the non-reducing terminal glucose is obtained.
4-nitrophenyl is a β-galactosylmaltooligosaccharide in which the hydroxyl group at the position is modified with β-galactose.
4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside, 4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltotrioside, 4-nitrophenyl 4-O-β- D-galactopyranosyl-α-maltotetraoside, 4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltopentaoside, 4-nitrophenyl 6-O-β-D- Galactopyranosyl-α
-Maltotetraoside, 4-nitrophenyl 6-O-
β-D-galactopyranosyl-α-maltopentaoside, 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D
-Galactopyranosyl-α-tetraoside or 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltopentaoside.
【００１５】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖としては、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β
−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドまたは
２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−β−マルトペンタオシド、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−β−マルトテトラオシドまたは２−クロロ−
４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−β−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−テトラオシ
ドまたは４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−β−マルトペンタオシド等が挙げられ
る。このような化合物の製造法としては、特開平3-2645
96号公報、特開平5-208989号公報および特願平4-209277
号明細書に記載された方法などがある。The hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is β-bonded to the chromogen, and the 4-position or 6-position of the non-reducing terminal glucose.
Examples of β-galactosylmaltooligosaccharides in which the hydroxyl group at the position is modified with β-galactose include 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-β.
-Maltoside, 2-chloro-4-nitrophenyl 4-
O-β-D-galactopyranosyl-β-maltotrioside, 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D
-Galactopyranosyl-β-maltotetraoside or 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-β-maltopentaoside, 2-chloro-4-nitrophenyl 6 -O-β-D-galactopyranosyl-β-maltotetraoside or 2-chloro-
4-nitrophenyl 6-O-β-D-galactopyranosyl-β-maltopentaoside, 4-nitrophenyl
4-O-β-D-galactopyranosyl-β-tetraoside, 4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-β-maltopentaoside and the like can be mentioned. As a method for producing such a compound, JP-A-3-2645
Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 5-20989 and Japanese Unexamined Patent Publication No. 4-209277.
There are methods described in the specification.
【００１６】β−ガラクトシダーゼ阻害剤としては、例
えばβ−Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤またはア
ミン類、または１ｍＭ以上のカルシウムイオン、ラクト
ース、ガラクトスタインが挙げられる。β−チオガラク
トシド誘導体としては、例えばイソプロピルチオガラク
トシド、等がある。またキレート剤としては、ＥＤＴＡ
−２Ｎａ、ＥＤＴＡ−３Ｎａ等がある。さらにアミン類
としては、例えばエタノールアミン、メルカプチルアミ
ン等がある。カルシウイオンの供給源としては、塩化カ
ルシウム、酢酸カルシウム等がある。Examples of β-galactosidase inhibitors include β-D-thiogalactosyls, chelating agents or amines, or calcium ions of 1 mM or more, lactose, galactostein. Examples of β-thiogalactoside derivatives include isopropylthiogalactoside. Also, as a chelating agent, EDTA
-2Na, EDTA-3Na and the like. Further, examples of amines include ethanolamine and mercaptylamine. Sources of calcium ion include calcium chloride and calcium acetate.
【００１７】本発明に用いるα−グルコシダーゼは、動
物、植物または微生物などから得られるα−グルコシダ
ーゼが利用でき、その起源を問わない。As the α-glucosidase used in the present invention, an α-glucosidase obtained from an animal, a plant, a microorganism or the like can be used regardless of its origin.
【００１８】本発明において用いるβ−グルコシダーゼ
は、植物、微生物などから得られるβ−グルコシダーゼ
が利用でき、その起源を問わない。As the β-glucosidase used in the present invention, β-glucosidase obtained from plants, microorganisms and the like can be used regardless of its origin.
【００１９】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組
成物は、上記ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコ
シダーゼおよび／又はβ−グルコシダーゼおよびβ−ガ
ラクトシダーゼ阻害剤を含有するものであり、緩衝液の
ほかに必要に応じてその他の添加物、例えば界面活性
剤、塩化ナトリウム等の塩類、蛋白結合防止剤、防腐剤
などを含有しても良い。The reagent composition for measuring α-amylase activity of the present invention contains the above-mentioned galactosylmaltooligosaccharide, α-glucosidase and / or β-glucosidase and β-galactosidase inhibitor, and is necessary in addition to the buffer solution. Depending on the case, other additives such as surfactants, salts such as sodium chloride, protein binding inhibitors and preservatives may be contained.
【００２０】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖を基質とする場合、α−グルコシ
ダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。The hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose α-bonds the chromogen, and the 4-position or 6-position of the non-reducing terminal glucose is obtained.
When using β-galactosylmaltooligosaccharide whose hydroxyl group at position is modified with β-galactose as a substrate, an α-glucosidase and a β-galactosidase inhibitor are included.
【００２１】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が２また
は３のものを基質とする場合、β−グルコシダーゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。The hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is β-bonded to the chromogen, and the 4-position or 6-position of the non-reducing terminal glucose.
A β-galactosylmaltooligosaccharide whose hydroxyl group at the position is modified with β-galactose and having a glucose number of 2 or 3 as a substrate includes a β-glucosidase and a β-galactosidase inhibitor.
【００２２】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が４〜７
のものを基質とする場合、α−グルコシダーゼ、β−グ
ルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含
む。The hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is β-bonded to the chromogen, and the 4-position or 6-position of the non-reducing terminal glucose.
A β-galactosylmaltooligosaccharide in which the hydroxyl group at the position is modified with β-galactose, wherein the glucose number is 4 to 7
In the case of using as a substrate, it includes α-glucosidase, β-glucosidase and β-galactosidase inhibitors.
【００２３】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組
成物を用いたα−アミラーゼ活性の測定は、還元末端グ
ルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端
グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトー
スで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−
グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料中の
α−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定す
る。生成された色原体は常法に従って測定する。例えば
可視部に吸光度を有する化合物であれば、吸光度計によ
り吸光度変化を測定する。The measurement of α-amylase activity using the reagent composition for measuring α-amylase activity according to the present invention is carried out by coupling the chromogen to the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose, and at the 4-position of the non-reducing terminal glucose. Β-galactosylmaltooligosaccharide whose 6-position hydroxyl group is modified with β-galactose, α-
A reagent containing glucosidase and / or β-glucosidase and β-galactosidase inhibitor is allowed to act on α-amylase in the sample, and the resulting chromogen is measured. The produced chromogen is measured according to a conventional method. For example, in the case of a compound having an absorbance in the visible part, the absorbance change is measured with an absorptiometer.
【００２４】本発明において、体液中のβ−ガラクトシ
ダーゼ活性は以下の方法により測定する。ｏ−ニトロフ
ェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を基質と
して、β−ガラクトシダーゼの作用より生成するｏ−ニ
トロフェノールの生成量を４１０ｎｍの吸光度の変化で
測定する。１分間の１マイクロモルのｏ−ニトロフェノ
ールを生成する酵素量を１ユニット（ＩＵ）とする。In the present invention, β-galactosidase activity in body fluid is measured by the following method. Using o-nitrophenyl-β-galactopyranoside (ONPG) as a substrate, the amount of o-nitrophenol produced by the action of β-galactosidase is measured by the change in absorbance at 410 nm. The amount of enzyme that produces 1 micromol of o-nitrophenol for 1 minute is 1 unit (IU).
【００２５】β−ガラクトシダーゼの活性測定方法 １．試薬 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ７．３ （３７℃） ３．３６Ｍ メルカプトエタノール溶液 ３０ｍＭ ＭｇＣｌ2 溶液 ０．３４ｍＭ ＯＮＰＧ溶液（ｏ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド） ２．操作方法 下記反応混液をキュベットに調製し、３７℃で約５分予
備加温する。 ２．５ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．３ ０．１ｍｌ メルカプトエタノール溶液 ０．１ｍｌ ＭｇＣｌ2 溶液 ０．１ｍｌ ＯＮＰＧ溶液 酵素液を０．１ｍｌ添加し、緩やかに混和後、水を対照
に３７℃に制御された分光光度計で４１０ｎｍの吸光度
変化を２〜３分間記録し、その初期直線部分から、１分
間あたりの吸光度変化量を求める。（△ＯＤｔｅｓｔ） 盲検は、酵素液の代わりに酵素希釈液（１．０ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３）を
０．１ｍｌを加え、上記同様に操作を行って１分あたり
の吸光度変化を求める。（△ＯＤｂｌａｎｋ）Method for measuring β-galactosidase activity 1. Reagent 0.1 M Phosphate buffer pH 7.3 (37 ° C.) 3.36 M Mercaptoethanol solution 30 mM MgCl 2 solution 0.34 mM ONPG solution (o-nitrophenyl-β
-D-galactopyranoside) 2. Operation method Prepare the following reaction mixture in a cuvette and preheat at 37 ° C for about 5 minutes. 2.5 ml 0.1 M phosphate buffer pH 7.3 0.1 ml mercaptoethanol solution 0.1 ml MgCl 2 solution 0.1 ml ONPG solution 0.1 ml of enzyme solution was added and gently mixed, then water was used as a control at 37 ° C. The change in absorbance at 410 nm is recorded for 2 to 3 minutes by a spectrophotometer controlled to, and the amount of change in absorbance per minute is obtained from the initial linear portion. (△ ODtest) In the blind test, instead of the enzyme solution, an enzyme diluent (1.0 mM M
0.1 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.3) containing gCl 2 is added, and the same operation as above is performed to determine the change in absorbance per minute. (△ ODblank)
【００２６】３．計算式3. a formula
【数１】 3.5 ：ｏ−ニトロフェノールの上記測定条件下でのミリ
モル分子吸光係数(ｃｍ2/micromole) 1.0 ：光路長(cm)[Equation 1] 3.5: millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / micromole) of o-nitrophenol under the above measurement conditions 1.0: optical path length (cm)
【００２７】[0027]
【実施例】次に実施例および比較例により本発明を更に
詳細に説明する。 参考例１ 非還元末端グルコースをガラクトースで修飾し基質を使
用するα−アミラーゼの活性測定法へのβ−ガラクトシ
ダーゼの影響 １．試薬組成 ５０ｍＭ グッド緩衝液（ＰＩＰＥＳ） ｐＨ７．０ α−グルコシダーゼ ９０ Ｕ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２ Ｕ／ｍｌ ＣａＣｌ2 ０．５ｍＭ ２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ− −ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシド ２ｍＭ ２．サンプル 大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを０ＩＵ／ｍｌ、１０
ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、２０
０ＩＵ／ｍｌになるように蒸留水で調製した。 ３．検討方法 上記試薬３ｍｌにサンプル０．２５ｍｌを添加し、３７
℃において３分間放置した後、４０５ｎｍにおける吸光
度の変化を測定し、１分間あたりの吸光度変化量からα
−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダー
ゼの影響（△ＯＤ/min）を測定した。その結果を表１に
示す。EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples. Reference Example 1 Effect of β-galactosidase on α-amylase activity measurement method in which non-reducing terminal glucose is modified with galactose and a substrate is used. Reagent composition 50 mM Good buffer solution (PIPES) pH 7.0 α-glucosidase 90 U / ml β-glucosidase 12 U / ml CaCl 2 0.5 mM 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyra Nosyl-β-maltotetraoside 2 mM 2. Sample E. coli-derived β-galactosidase was added at 0 IU / ml, 10
IU / ml, 20 IU / ml, 100 IU / ml, 20
It was adjusted to 0 IU / ml with distilled water. 3. Examination method Add 0.25 ml of sample to 3 ml of the above reagent, and
After leaving it for 3 minutes at ℃, measure the change in absorbance at 405 nm, and from the change in absorbance per minute, α
The effect of β-galactosidase (ΔOD / min) on the method for measuring amylase activity was measured. The results are shown in Table 1.
【００２８】[0028]
【表１】 [Table 1]
【００２９】β−ガラクトシダーゼ活性が高くなるのに
つれて、測定値（△ＯＤ/min）が上昇し、α−アミラー
ゼの活性測定法に対する影響度が大きくなっていること
が表１から明らかである。It is clear from Table 1 that as the β-galactosidase activity increases, the measured value (ΔOD / min) increases, and the influence of α-amylase activity on the assay method increases.
【００３０】実施例１ イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その１） 参考例１の試薬に、イソプロピルチオガラクトシドを各
種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対するβ
−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルとし
て大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ１００ＩＵ／ｍｌを
用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施
した。なお、結果を表２に示す。Example 1 Examination of Effect of Isopropylthiogalactoside (Part 1) To the reagent of Reference Example 1, various concentrations of isopropylthiogalactoside were added, and β for the method for measuring the activity of α-amylase.
-The degree of influence of galactosidase was measured. Using 100 IU / ml of β-galactosidase derived from Escherichia coli as a sample, the examination was carried out based on the assay method described in Comparative Example 1. The results are shown in Table 2.
【００３１】[0031]
【表２】 [Table 2]
【００３２】イソプロピルチオガラクトシドの添加濃度
を高くするのに従い、測定値は低くなりα−アミラーゼ
の活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回
避されていることが表２から明らかである。。It is clear from Table 2 that the higher the added concentration of isopropylthiogalactoside, the lower the measured value and the effect of β-galactosidase on the method for measuring the activity of α-amylase is avoided. .
【００３３】実施例２ 各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤の効果の検討 参考例１の試薬に、各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤を
各種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対する
β−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルと
して大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ１００ＩＵ／ｍｌ
を用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実
施した。なお、結果を表３に示す。Example 2 Examination of Effect of Various β-Galactosidase Inhibitors Various concentrations of various β-galactosidase inhibitors were added to the reagent of Reference Example 1 to determine the degree of influence of β-galactosidase on the α-amylase activity measuring method. It was measured. E. coli-derived β-galactosidase 100 IU / ml as a sample
Was examined based on the assay method described in Comparative Example 1. The results are shown in Table 3.
【００３４】[0034]
【表３】 [Table 3]
【００３５】β−ガラクトシダーゼ阻害剤を添加するこ
とにより、測定値は低下しα−アミラーゼ活性測定法に
対するβ−ガラクトシダーゼの影響は、回避されている
ことが表３から明らかである。It is clear from Table 3 that the addition of the β-galactosidase inhibitor reduces the measured values and avoids the influence of β-galactosidase on the α-amylase activity assay method.
【００３６】参考例２ 尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定 健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性を上記
方法により測定した。結果を表４に示す。Reference Example 2 Measurement of β-galactosidase activity in urine The β-galactosidase activity in urine of 20 healthy persons was measured by the above method. The results are shown in Table 4.
【００３７】[0037]
【表４】 [Table 4]
【００３８】健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダー
ゼ活性は、０〜６ＩＵ／ｌ程度含まれていることがわか
った。各種疾患では、高値のβ−ガラクトシダーゼ含有
尿検体が存在する可能性は否定できない。It was found that the urinary β-galactosidase activity of 20 healthy subjects contained about 0 to 6 IU / l. It is undeniable that there is a high level of β-galactosidase-containing urine specimens in various diseases.
【００３９】実施例３ イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その２） 健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１
０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、
尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法によ
り測定した。また、終濃度５ｍＭのイソプロピルチオガ
ラクトシドを添加した試薬でも上記β−ガラクトシダー
ゼを添加した尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定
し、両者の測定値を比較した。また、非還元末端グルコ
ースがガラクトースで修飾されていないマルトオリゴ糖
誘導体基質を用いたα−アミラーゼ測定法である、体外
診断用医薬品ダイヤカラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡
績社製）を対照試薬として用いて同時に尿サンプル中の
α−アミラーゼ活性を測定した。α−アミラーゼ活性
は、キャリブザイムＰ（国際試薬社製）のα−アミラー
ゼ活性表示値をもとに各試薬での測定値を補正して、α
−アミラーゼ活性値とした。結果を表５に示す。Example 3 Examination of Effect of Isopropylthiogalactoside (Part 2) 1 β-galactosidase derived from Escherichia coli was added to urine of two healthy subjects.
Prepare the added sample so that it becomes 0 IU / ml,
The urinary α-amylase activity was measured by the method described in Reference Example 1. In addition, the α-amylase activity in the urine sample to which the β-galactosidase was added was measured with a reagent containing isopropylthiogalactoside at a final concentration of 5 mM, and both measured values were compared. In addition, an in-vitro diagnostic drug Diacolor AMY Neolate (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), which is an α-amylase measurement method using a maltooligosaccharide derivative substrate in which the non-reducing terminal glucose is not modified with galactose, is used as a control reagent at the same time. The α-amylase activity in the urine sample was measured. The α-amylase activity was corrected by correcting the measured value of each reagent based on the α-amylase activity display value of Calibzyme P (manufactured by International Reagents Co.)
-Amylase activity value. The results are shown in Table 5.
【００４０】[0040]
【表５】 [Table 5]
【００４１】イソプロピルチオガラクトシドを添加しな
い試薬（比較例）では、α−アミラーゼ活性測定値が、
約７ＩＵ／Ｌ程度高く測定されている。With the reagent containing no isopropylthiogalactoside (Comparative Example), the measured α-amylase activity was
It is measured as high as about 7 IU / L.
【００４２】実施例４ カルシウムイオンの効果の検討（その１） 参考例１の試薬に、ＣａＣｌ2 を各種濃度添加し、α−
アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼ
の影響度を測定した。サンプルとして大腸菌由来β−ガ
ラクトシダーゼ１００ＩＵ／ｍｌを用い、比較例１に記
載した検定方法に基づき検討を実施した。なお、結果を
表６に示す。Example 4 Examination of Effect of Calcium Ion (Part 1) Various concentrations of CaCl 2 were added to the reagent of Reference Example 1 to obtain α-
The degree of influence of β-galactosidase on the method for measuring the activity of amylase was measured. Using 100 IU / ml of β-galactosidase derived from Escherichia coli as a sample, the examination was carried out based on the assay method described in Comparative Example 1. The results are shown in Table 6.
【００４３】[0043]
【表６】 [Table 6]
【００４４】カルシウムイオンの添加濃度を高くするの
に従い、測定値は低くなりα−アミラーゼの活性測定法
に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回避されている
ことが表6 から明らかである。またカルシウムイオン0.
5mM 以下では影響を回避する効果がなく、1mM 以上でβ
−ガラクトシダーゼの影響を回避する効果があることが
わかる。It is clear from Table 6 that the higher the added concentration of calcium ions, the lower the measured value and the effect of β-galactosidase on the method for measuring the activity of α-amylase is avoided. Also calcium ion 0.
There is no effect of avoiding the effect below 5 mM, and β above 1 mM.
-It turns out that there is an effect of avoiding the influence of galactosidase.
【００４５】実施例５ マルシウムイオンの効果の検討（その２） 健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１
０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、
尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法によ
り測定した。また、終濃度５ｍＭのＣａＣｌ2 を添加し
た試薬でも上記β−ガラクトシダーゼを添加した尿サン
プル中のα−アミラーゼ活性を測定し、両者の測定値を
比較した。また、非還元末端グルコースがガラクトース
で修飾されていないマルトオリゴ糖誘導体基質を用いた
α−アミラーゼ測定法である、体外診断用医薬品ダイヤ
カラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡績社製）を対照試薬
として用いて同時に尿サンプル中のα−アミラーゼ活性
を測定した。α−アミラーゼ活性は、キャリブザイムＰ
（国際試薬社製）のα−アミラーゼ活性表示値をもとに
各試薬での測定値を補正して、α−アミラーゼ活性値と
した。結果を表７に示す。Example 5 Examination of Effect of Marsium Ion (Part 2) 1 β-galactosidase derived from Escherichia coli was added to the urine of two healthy persons.
Prepare the added sample so that it becomes 0 IU / ml,
The urinary α-amylase activity was measured by the method described in Reference Example 1. Further, the α-amylase activity in the urine sample to which the β-galactosidase was added was also measured using a reagent containing CaCl 2 at a final concentration of 5 mM, and both measured values were compared. In addition, an in-vitro diagnostic drug Diacolor AMY Neolate (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), which is an α-amylase measurement method using a maltooligosaccharide derivative substrate in which the non-reducing terminal glucose is not modified with galactose, is used as a control reagent at the same time. The α-amylase activity in the urine sample was measured. α-amylase activity is
The measured value of each reagent was corrected based on the α-amylase activity display value (manufactured by International Reagents Co., Ltd.) to obtain the α-amylase activity value. The results are shown in Table 7.
【００４６】[0046]
【表７】 [Table 7]
【００４７】ＣａＣｌ2 を添加しない試薬（比較例）で
は、α−アミラーゼ活性測定値が、約７ＩＵ／Ｌ程度高
く測定されている。With the reagent containing no CaCl 2 (Comparative Example), the measured α-amylase activity value is about 7 IU / L.
【００４８】[0048]
【発明の効果】本発明の非還元末端グルコースをβ−ガ
ラクトースで修飾したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖
を基質として測定するアミラーゼ活性測定法では、β−
ガラクトシダーゼ阻害剤を使用することにより、試料中
のβ−ガラクトシダーゼによるガラクトシルマルトオリ
ゴ糖の分解を阻止し、正確に試料中のα−アミラーゼ活
性測定方法を提供できる。さらに本発明では上記利点を
有するα−アミラーゼ活性測定試薬組成物を提供でき
る。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the amylase activity measuring method of the present invention in which the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose and β-galactosylmaltooligosaccharide is used as a substrate,
By using a galactosidase inhibitor, it is possible to prevent the degradation of galactosylmalto-oligosaccharide by β-galactosidase in the sample and to provide an accurate method for measuring α-amylase activity in the sample. Furthermore, the present invention can provide an α-amylase activity measuring reagent composition having the above advantages.
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【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成５年１２月２１日[Submission date] December 21, 1993
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】全文[Correction target item name] Full text
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【書類名】 明細書[Document name] Statement
【発明の名称】 α−アミラーゼ活性測定法およびその
試薬組成物Title: Method for measuring α-amylase activity and its reagent composition
【特許請求の範囲】[Claims]
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、非還元性末端グルコー
スの４位または６位の水酸基をβ−ガラクトースで修飾
したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質として用い
るアミラーゼ活性測定法及びその試薬組成物に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for measuring amylase activity using a β-galactosylmaltooligosaccharide in which the 4- or 6-position hydroxyl group of non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose as a substrate, and a reagent composition thereof. .
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来から膵液や尿等の体液中に含有され
るα−アミラーゼ活性を測定することにより、各種疾患
の診断が行われている。この方法ではα−アミラーゼの
活性測定法には、例えばマルトオリゴ糖（マルトトリオ
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオース等）を基質とする方法がある。この方法
では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖とα
−グルコシダーゼとを作用させて基質からグルコースを
遊離させ、遊離するグルコース量の量を測定することに
より、α−アミラーゼの活性を知ることができる。2. Description of the Related Art Conventionally, various diseases have been diagnosed by measuring .alpha.-amylase activity contained in body fluids such as pancreatic juice and urine. In this method, there is a method for measuring the activity of α-amylase, for example, using maltooligosaccharide (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, etc.) as a substrate. In this method, an α-amylase-containing sample is treated with the maltooligosaccharide and α-amylase.
-The activity of α-amylase can be known by reacting with glucosidase to release glucose from the substrate and measuring the amount of released glucose.
【０００３】またマルトオリゴ糖誘導体として、還元性
末端グルコースにフェニル基、ナフチル基または、それ
らの誘導体をアグリコンとして結合させた基質を用いる
方法も提案されている。例えば基質としてｐ−ニトロフ
ェニルマルトペンタオシド（特公昭57-53079号公報）、
ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシド（特公昭57-530
79号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド
（特公昭62-50119号公報）、２，４−ジニトロマルトペ
ンタオシド（特公昭59-13199号公報）等が利用されてい
る。これらの基質を使用するとアグリコンが遊離し、遊
離したアグリコン、例えばｐ−ニトロフェノールを光学
的に測定することにより、α−アミラーゼの活性を測定
することが出来る。Further, as a maltooligosaccharide derivative, a method of using a substrate in which a reducing terminal glucose is bound with a phenyl group, a naphthyl group or a derivative thereof as an aglycone has been proposed. For example, p-nitrophenyl maltopentaoside as a substrate (Japanese Patent Publication No. 57-53079),
p-nitrophenyl maltohexaside (Japanese Patent Publication No. 57-530
79), p-nitrophenylmaltoheptaoside (JP-B-62-50119), 2,4-dinitromaltopentaoside (JP-B-59-13199), and the like. Using these substrates aglycon is liberated, liberated aglycon, by measuring for example p- a nitrophenol Roh Lumpur optically, it can be measured the activity of α- amylase.
【０００４】上記方法では、α−グルコシダーゼの作用
により、僅かではあるがブランク値が上昇し、その結
果、測定値の誤差が大きくなるという欠点が生じ、α−
グルコシダーゼと基質とを一液化することは難しいこと
であった。このような欠点を解消するために、マルトオ
リゴ糖の非還元性末端のグルコースの４位および／また
は６位の水酸基を修飾したタイプの基質が市販され利用
されるようになった。最近、上記合成糖より天然糖に近
い形のα−アミラーゼの基質として、非還元性末端グル
コースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトース修
飾された、β−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体が開
発された（特開平3-264596号公報、特開平5-208989号公
報など) 。In the above method, the blank value slightly increases due to the action of α-glucosidase, resulting in a large error in the measured value, resulting in α-glucosidase.
It was difficult to liquefy the glucosidase and the substrate. In order to solve such a defect, a substrate of the type in which the non-reducing end of glucose of maltooligosaccharide is modified with hydroxyl groups at the 4-position and / or the 6-position has come to be commercially available. Recently, a β-galactosylmaltooligosaccharide derivative in which the 4- or 6-position hydroxyl group of non-reducing terminal glucose has been β-galactose modified has been developed as a substrate for α-amylase having a form closer to that of natural sugar than the above synthetic sugar. (JP-A-3-264596, JP-A-5-208989, etc.).
【０００５】このような基質としては、例えば、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−β−マルトテトラオシドなどがある。この
基質は、追随酵素（α−グルコダーゼ、β−グルコシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ等）の一液化条件において、α
−グルコシダーゼの作用を受けず、またその合成が容易
であり、水溶性に優れ、かつアミラーゼの作用様式をよ
り純粋に反映するなど多くの利点がある。通常、臨床診
断の場においては血清および尿中のα−アミラーゼを測
定し、疾患の有無を判断する。しかしながら、血清およ
び尿中にはβ−ガラクトシダーゼが存在する可能性を有
する。具体的に尿中には数ユニット（ＩＵ）存在するこ
とが知られている（東京化学同人発行、生化学データブ
ック、第1606頁、1979年発行) 。Examples of such a substrate include 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-β-maltotetraoside. This substrate is a α-glucodase, β-glucosidase, glucoamylase, etc.
-There are many advantages such as being unaffected by glucosidase, being easy to synthesize, excellent in water solubility, and more purely reflecting the action mode of amylase. Usually, in clinical diagnosis, serum and urine α-amylase is measured to determine the presence or absence of a disease. However, β-galactosidase may be present in serum and urine. Specifically, it is known that several units (IU) are present in urine (Tokyo Kagaku Dojin, Biochemistry Data Book, p. 1606, 1979).
【０００６】したがって、尿中にβ−ガラクトシダーゼ
が存在すると、基質であるガラクトシルマルトオリゴ糖
誘導体の非還元性末端グルコースに修飾されたガラクト
シル基のβ結合を加水分解し、ガラクトースとマルトオ
リゴ糖誘導体を生じることになる。生じたマルトオリゴ
糖誘導体は、追随酵素であるα−グルコシダーゼの作用
を受けることになり、測定のブランク値を上昇させ、そ
の結果、測定値の誤差が大きくなる。このことは非還元
性末端グルコースをブロックし、上記追随酵素の作用か
ら基質の分解を阻止するという本来の効果が消失するこ
とになる。Therefore, when β-galactosidase is present in urine, the β-bond of the galactosyl group modified to the non-reducing terminal glucose of the substrate galactosylmaltooligosaccharide derivative is hydrolyzed to give galactose and the maltooligosaccharide derivative. become. The resulting maltooligosaccharide derivative is subjected to the action of α-glucosidase, which is a tracking enzyme, and raises the blank value of the measurement, resulting in a large error in the measured value. This means that the non-reducing terminal glucose is blocked, and the original effect of blocking the decomposition of the substrate due to the action of the following enzyme disappears.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
非還元性末端グルコースがβ−ガラクトースで修飾され
たβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質とするアミラ
ーゼ測定方法において、血清や尿などの体液中のβ−ガ
ラクトシダーゼの作用により基質が分解することを抑制
し、アミラーゼ活性を正確に測定する方法および試薬を
提供することにある。DISCLOSURE OF THE INVENTION An object of the present invention is to measure the amylase using the β-galactose-malto-oligosaccharide whose non-reducing terminal glucose is modified by β-galactose as a substrate, in a body fluid such as serum or urine. Another object of the present invention is to provide a method and a reagent for accurately measuring amylase activity by suppressing the degradation of the substrate due to the action of β-galactosidase.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は還元末
端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元
末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラク
トースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、
α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼ
およびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料
中のα−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定
することを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法であ
る。That is, according to the present invention, the hydroxyl group at the 1-position of reducing terminal glucose is bound to a chromogen, and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose. -Galactosylmaltooligosaccharides,
In a method for measuring α-amylase activity, which comprises reacting a reagent containing α-glucosidase and / or β-glucosidase and β-galactosidase inhibitor with α-amylase in a sample, and measuring a chromogen produced. is there.
【０００９】また本発明は還元末端グルコースの１位の
水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位
または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ
−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼお
よび／またはβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシ
ダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするα−アミラーゼ活
性測定用試薬組成物である。Further, in the present invention, the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is bound to the chromogen, and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose.
A galactosylmaltooligosaccharide, an α-glucosidase and / or a β-glucosidase, and a β-galactosidase inhibitor are contained in the reagent composition for measuring an α-amylase activity.
【００１０】本発明において使用する還元末端グルコー
スの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコ
ースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修
飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖とは、グルコ
ース数が２〜７であるマルトオリゴ糖の還元末端グルコ
ースの１位の水酸基に、α−グルコシダーゼ及びβ−グ
ルコシダーゼの追随酵素により加水分解を受けると呈色
する色原体をα−結合またはβ−結合し、非還元末端グ
ルコースの４位または６位の水酸基がβ- ガラクトシル
基で修飾されたものをいう。A β-galactosylmalto-oligosaccharide in which the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose used in the present invention is bound to a chromogen and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose. Is the α-bond or the chromogen that is colored when it is hydrolyzed by the α-glucosidase and β-glucosidase following enzyme to the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose of maltooligosaccharide having a glucose number of 2 to 7; It is β-bonded, and the 4- or 6-position hydroxyl group of non-reducing terminal glucose is modified with a β-galactosyl group.
【００１１】色原体としては、可視部に吸光度を有する
ものに限定されるものではなく、紫外部に吸光度を有す
るものや、蛍光測定あるいは発光測定が可能である化合
物でもよい。可視部に吸光度を有する色原体としては、
置換基としてニトロ基を有するフェノール類、例えば２
−クロロ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノー
ル等がある。紫外部に吸光度を有する色原体としては、
アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ
基、カルボキシフェニルアミノ基などがある。蛍光測定
が可能である化合物としては、２−ピリジルアミノ基、
３−ピリジルアミノ基、ウンベリフェリル基などがあ
る。The chromogen is not limited to one having an absorbance in the visible region, but may be one having an absorbance in the ultraviolet region or a compound capable of measuring fluorescence or luminescence. As a chromogen having an absorbance in the visible part,
Phenols having a nitro group as a substituent, such as 2
-Chloro-4-nitrophenol, p-nitrophenol and the like. As a chromogen having an absorbance in the ultraviolet region,
Examples include anilino group, methylanilino group, hydroxyanilino group and carboxyphenylamino group. As the compound capable of measuring fluorescence, a 2-pyridylamino group,
Examples include 3-pyridylamino group and umbelliferyl group.
【００１２】本発明に使用する基質としては、下記式に
て示される化合物が例示される。Examples of the substrate used in the present invention include compounds represented by the following formula.
【００１３】[0013]
【化１】 （式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクト
ピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ3 はｐ−ニ
トロフェニル基またはハロゲン置換ｐ−ニトロフェニル
基を示し、ｎは０〜５の整数を示す。）[Chemical 1] (In the formula, one of R 1 and R 2 represents a β-galactopyranosyl group, the other represents hydrogen, R 3 represents a p-nitrophenyl group or a halogen-substituted p-nitrophenyl group, and n Represents an integer of 0 to 5.)
【００１４】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖としては、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシ
ド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−α−マルトトリオシド、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテ
トラオシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−α−マルトペンタオシド、４−ニト
ロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α
−マルトテトラオシド、４−ニトロフェニル ６−Ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトペンタオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−α−テトラオシドまたは２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−α−マルトペンタオシド等がある。The hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose α-bonds to the chromogen, and the 4-position or 6-position of the non-reducing terminal glucose is obtained.
4-nitrophenyl is a β-galactosylmaltooligosaccharide in which the hydroxyl group at the position is modified with β-galactose.
4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside, 4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltotrioside, 4-nitrophenyl 4-O-β- D-galactopyranosyl-α-maltotetraoside, 4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltopentaoside, 4-nitrophenyl 6-O-β-D- Galactopyranosyl-α
-Maltotetraoside, 4-nitrophenyl 6-O-
β-D-galactopyranosyl-α-maltopentaoside, 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D
-Galactopyranosyl-α-tetraoside or 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltopentaoside.
【００１５】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖としては、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β
−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドまたは
２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−β−マルトペンタオシド、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−β−マルトテトラオシドまたは２−クロロ−
４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−β−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−テトラオシ
ドまたは４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−β−マルトペンタオシド等が挙げられ
る。このような化合物の製造法としては、特開平3-2645
96号公報、特開平5-208989号公報および特願平4-209277
号明細書に記載された方法などがある。The hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is β-bonded to the chromogen, and the 4-position or 6-position of the non-reducing terminal glucose.
Examples of β-galactosylmaltooligosaccharides in which the hydroxyl group at the position is modified with β-galactose include 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-β.
-Maltoside, 2-chloro-4-nitrophenyl 4-
O-β-D-galactopyranosyl-β-maltotrioside, 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D
-Galactopyranosyl-β-maltotetraoside or 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-β-maltopentaoside, 2-chloro-4-nitrophenyl 6 -O-β-D-galactopyranosyl-β-maltotetraoside or 2-chloro-
4-nitrophenyl 6-O-β-D-galactopyranosyl-β-maltopentaoside, 4-nitrophenyl
4-O-β-D-galactopyranosyl-β-tetraoside, 4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-β-maltopentaoside and the like can be mentioned. As a method for producing such a compound, JP-A-3-2645
Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 5-20989 and Japanese Unexamined Patent Publication No. 4-209277.
There are methods described in the specification.
【００１６】β−ガラクトシダーゼ阻害剤としては、例
えばβ−Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤またはア
ミン類、または１ｍＭ以上のカルシウムイオン、ラクト
ース、ガラクトスタチンが挙げられる。β−チオガラク
トシド誘導体としては、例えばイソプロピルチオガラク
トシド、等がある。またキレート剤としては、ＥＤＴＡ
−２Ｎａ、ＥＤＴＡ−３Ｎａ等がある。さらにアミン類
としては、例えばエタノールアミン、メルカプチルアミ
ン等がある。カルシウムイオンの供給源としては、塩化
カルシウム、酢酸カルシウム等がある。[0016] As β- galactosidase inhibitors, for example beta-D-Chiogarakutoshiru acids, chelating agents or amines, or 1mM or more calcium ions, lactose, Garakutosuta switch down. Examples of β-thiogalactoside derivatives include isopropylthiogalactoside. Also, as a chelating agent, EDTA
-2Na, EDTA-3Na and the like. Further, examples of amines include ethanolamine and mercaptylamine. Sources of calcium ions include calcium chloride, calcium acetate and the like.
【００１７】本発明に用いるα−グルコシダーゼは、動
物、植物または微生物などから得られるα−グルコシダ
ーゼが利用でき、その起源を問わない。As the α-glucosidase used in the present invention, an α-glucosidase obtained from an animal, a plant, a microorganism or the like can be used regardless of its origin.
【００１８】本発明において用いるβ−グルコシダーゼ
は、植物、微生物などから得られるβ−グルコシダーゼ
が利用でき、その起源を問わない。As the β-glucosidase used in the present invention, β-glucosidase obtained from plants, microorganisms and the like can be used regardless of its origin.
【００１９】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組
成物は、上記ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコ
シダーゼおよび／又はβ−グルコシダーゼおよびβ−ガ
ラクトシダーゼ阻害剤を含有するものであり、緩衝液の
ほかに必要に応じてその他の添加物、例えば界面活性
剤、塩化ナトリウム等の塩類、蛋白結合防止剤、防腐剤
などを含有しても良い。The reagent composition for measuring α-amylase activity of the present invention contains the above-mentioned galactosylmaltooligosaccharide, α-glucosidase and / or β-glucosidase and β-galactosidase inhibitor, and is necessary in addition to the buffer solution. Depending on the case, other additives such as surfactants, salts such as sodium chloride, protein binding inhibitors and preservatives may be contained.
【００２０】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖を基質とする場合、α−グルコシ
ダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。The hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose α-bonds the chromogen, and the 4-position or 6-position of the non-reducing terminal glucose is obtained.
When using β-galactosylmaltooligosaccharide whose hydroxyl group at position is modified with β-galactose as a substrate, an α-glucosidase and a β-galactosidase inhibitor are included.
【００２１】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が２また
は３のものを基質とする場合、β−グルコシダーゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。The hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is β-bonded to the chromogen, and the 4-position or 6-position of the non-reducing terminal glucose.
A β-galactosylmalto-oligosaccharide in which the hydroxyl group at the position is modified with β-galactose, and a substrate having a glucose number of 2 or 3 includes a β-glucosidase and a β-galactosidase inhibitor.
【００２２】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が４〜７
のものを基質とする場合、α−グルコシダーゼ、β−グ
ルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含
む。The hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is β-bonded to the chromogen, and the 4-position or 6-position of the non-reducing terminal glucose.
A β-galactosylmaltooligosaccharide in which the hydroxyl group at the position is modified with β-galactose, wherein the glucose number is 4 to 7
In the case of using as a substrate, it includes α-glucosidase, β-glucosidase and β-galactosidase inhibitors.
【００２３】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組
成物を用いたα−アミラーゼ活性の測定は、還元末端グ
ルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端
グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトー
スで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−
グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料中の
α−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定す
る。生成された色原体は常法に従って測定する。例えば
可視部に吸光度を有する化合物であれば、吸光度計によ
り吸光度変化を測定する。The measurement of α-amylase activity using the reagent composition for measuring α-amylase activity according to the present invention is carried out by coupling the chromogen to the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose, and at the 4-position of the non-reducing terminal glucose. Β-galactosylmaltooligosaccharide whose 6-position hydroxyl group is modified with β-galactose, α-
A reagent containing glucosidase and / or β-glucosidase and β-galactosidase inhibitor is allowed to act on α-amylase in the sample, and the resulting chromogen is measured. The produced chromogen is measured according to a conventional method. For example, in the case of a compound having an absorbance in the visible part, the absorbance change is measured with an absorptiometer.
【００２４】本発明において、体液中のβ−ガラクトシ
ダーゼ活性は以下の方法により測定する。ｏ−ニトロフ
ェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を基質と
して、β−ガラクトシダーゼの作用より生成するｏ−ニ
トロフェノールの生成量を４１０ｎｍの吸光度の変化で
測定する。１分間の１マイクロモルのｏ−ニトロフェノ
ールを生成する酵素量を１ユニット（ＩＵ）とする。In the present invention, β-galactosidase activity in body fluid is measured by the following method. Using o-nitrophenyl-β-galactopyranoside (ONPG) as a substrate, the amount of o-nitrophenol produced by the action of β-galactosidase is measured by the change in absorbance at 410 nm. The amount of enzyme that produces 1 micromol of o-nitrophenol for 1 minute is 1 unit (IU).
【００２５】β−ガラクトシダーゼの活性測定方法 １．試薬 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ７．３ （３７℃） ３．３６Ｍ メルカプトエタノール溶液 ３０ｍＭ ＭｇＣｌ2 溶液 ０．３４ｍＭ ＯＮＰＧ溶液（ｏ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド） ２．操作方法 下記反応混液をキュベットに調製し、３７℃で約５分予
備加温する。 ２．５ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．３ ０．１ｍｌ メルカプトエタノール溶液 ０．１ｍｌ ＭｇＣｌ2 溶液 ０．１ｍｌ ＯＮＰＧ溶液 酵素液を０．１ｍｌ添加し、緩やかに混和後、水を対照
に３７℃に制御された分光光度計で４１０ｎｍの吸光度
変化を２〜３分間記録し、その初期直線部分から、１分
間あたりの吸光度変化量を求める。（△ＯＤｔｅｓｔ） 盲検は、酵素液の代わりに酵素希釈液（１．０ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３）を
０．１ｍｌを加え、上記同様に操作を行って１分あたり
の吸光度変化を求める。（△ＯＤｂｌａｎｋ）Method for measuring β-galactosidase activity 1. Reagent 0.1 M Phosphate buffer pH 7.3 (37 ° C.) 3.36 M Mercaptoethanol solution 30 mM MgCl 2 solution 0.34 mM ONPG solution (o-nitrophenyl-β
-D-galactopyranoside) 2. Operation method Prepare the following reaction mixture in a cuvette and preheat at 37 ° C for about 5 minutes. 2.5 ml 0.1 M phosphate buffer pH 7.3 0.1 ml mercaptoethanol solution 0.1 ml MgCl 2 solution 0.1 ml ONPG solution 0.1 ml of enzyme solution was added and gently mixed, then water was used as a control at 37 ° C. The change in absorbance at 410 nm is recorded for 2 to 3 minutes by a spectrophotometer controlled to, and the amount of change in absorbance per minute is obtained from the initial linear portion. (△ ODtest) In the blind test, instead of the enzyme solution, an enzyme diluent (1.0 mM M
0.1 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.3) containing gCl 2 is added, and the same operation as above is performed to determine the change in absorbance per minute. (△ ODblank)
【００２６】３．計算式3. a formula
【数１】 3.5 ：ｏ−ニトロフェノールの上記測定条件下でのミリ
モル分子吸光係数(ｃｍ2/micromole) 1.0 ：光路長(cm)[Equation 1] 3.5: millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / micromole) of o-nitrophenol under the above measurement conditions 1.0: optical path length (cm)
【００２７】[0027]
【実施例】次に実施例および比較例により本発明を更に
詳細に説明する。 参考例１ 非還元末端グルコースをガラクトースで修飾し基質を使
用するα−アミラーゼの活性測定法へのβ−ガラクトシ
ダーゼの影響 １．試薬組成 ５０ｍＭ グッド緩衝液（ＰＩＰＥＳ） ｐＨ７．０ α−グルコシダーゼ ９０ Ｕ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２ Ｕ／ｍｌ ＣａＣｌ2 ０．５ｍＭ ２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ− −ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシド ２ｍＭ ２．サンプル 大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを０ＩＵ／ｍｌ、１０
ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、２０
０ＩＵ／ｍｌになるように蒸留水で調製した。 ３．検討方法 上記試薬３ｍｌにサンプル０．２５ｍｌを添加し、３７
℃において３分間放置した後、４０５ｎｍにおける吸光
度の変化を測定し、１分間あたりの吸光度変化量からα
−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダー
ゼの影響（△ＯＤ/min）を測定した。その結果を表１に
示す。EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples. Reference Example 1 Effect of β-galactosidase on α-amylase activity measurement method in which non-reducing terminal glucose is modified with galactose and a substrate is used. Reagent composition 50 mM Good buffer solution (PIPES) pH 7.0 α-glucosidase 90 U / ml β-glucosidase 12 U / ml CaCl 2 0.5 mM 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyra Nosyl-β-maltotetraoside 2 mM 2. Sample E. coli-derived β-galactosidase was added at 0 IU / ml, 10
IU / ml, 20 IU / ml, 100 IU / ml, 20
It was adjusted to 0 IU / ml with distilled water. 3. Examination method Add 0.25 ml of sample to 3 ml of the above reagent, and
After leaving it for 3 minutes at ℃, measure the change in absorbance at 405 nm, and from the change in absorbance per minute, α
The effect of β-galactosidase (ΔOD / min) on the method for measuring amylase activity was measured. The results are shown in Table 1.
【００２８】[0028]
【表１】 [Table 1]
【００２９】β−ガラクトシダーゼ活性が高くなるのに
つれて、測定値（△ＯＤ/min）が上昇し、α−アミラー
ゼの活性測定法に対する影響度が大きくなっていること
が表１から明らかである。It is clear from Table 1 that as the β-galactosidase activity increases, the measured value (ΔOD / min) increases, and the influence of α-amylase activity on the assay method increases.
【００３０】実施例１ イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その１） 参考例１の試薬に、イソプロピルチオガラクトシドを各
種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対するβ
−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルとし
て大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを用
い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施し
た。なお、結果を表２に示す。Example 1 Examination of Effect of Isopropylthiogalactoside (Part 1) To the reagent of Reference Example 1, various concentrations of isopropylthiogalactoside were added, and β for the method for measuring the activity of α-amylase.
-The degree of influence of galactosidase was measured. 25 IU / ml of β-galactosidase derived from Escherichia coli was used as a sample, and the examination was carried out based on the assay method described in Comparative Example 1. The results are shown in Table 2.
【００３１】[0031]
【表２】 [Table 2]
【００３２】イソプロピルチオガラクトシドの添加濃度
を高くするのに従い、測定値は低くなりα−アミラーゼ
の活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回
避されていることが表２から明らかである。。It is clear from Table 2 that the higher the added concentration of isopropylthiogalactoside, the lower the measured value and the effect of β-galactosidase on the method for measuring the activity of α-amylase is avoided. .
【００３３】実施例２ 各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤の効果の検討 参考例１の試薬に、各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤を
各種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対する
β−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルと
して大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを
用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施
した。なお、結果を表３に示す。Example 2 Examination of Effect of Various β-Galactosidase Inhibitors Various concentrations of various β-galactosidase inhibitors were added to the reagent of Reference Example 1 to determine the degree of influence of β-galactosidase on the α-amylase activity measuring method. It was measured. 25 IU / ml of β-galactosidase derived from Escherichia coli was used as a sample, and the examination was carried out based on the assay method described in Comparative Example 1. The results are shown in Table 3.
【００３４】[0034]
【表３】 [Table 3]
【００３５】β−ガラクトシダーゼ阻害剤を添加するこ
とにより、測定値は低下しα−アミラーゼ活性測定法に
対するβ−ガラクトシダーゼの影響は、回避されている
ことが表３から明らかである。It is clear from Table 3 that the addition of the β-galactosidase inhibitor reduces the measured values and avoids the influence of β-galactosidase on the α-amylase activity assay method.
【００３６】参考例２ 尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定 健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性を上記
方法により測定した。結果を表４に示す。Reference Example 2 Measurement of β-galactosidase activity in urine The β-galactosidase activity in urine of 20 healthy persons was measured by the above method. The results are shown in Table 4.
【００３７】[0037]
【表４】 [Table 4]
【００３８】健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダー
ゼ活性は、０〜６ＩＵ／ｌ程度含まれていることがわか
った。各種疾患では、高値のβ−ガラクトシダーゼ含有
尿検体が存在する可能性は否定できない。It was found that the urinary β-galactosidase activity of 20 healthy subjects contained about 0 to 6 IU / l. It is undeniable that there is a high level of β-galactosidase-containing urine specimens in various diseases.
【００３９】実施例３ イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その２） 健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１
０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、
尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法によ
り測定した。また、終濃度５ｍＭのイソプロピルチオガ
ラクトシドを添加した試薬でも上記β−ガラクトシダー
ゼを添加した尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定
し、両者の測定値を比較した。また、非還元末端グルコ
ースがガラクトースで修飾されていないマルトオリゴ糖
誘導体基質を用いたα−アミラーゼ測定法である、体外
診断用医薬品ダイヤカラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡
績社製）を対照試薬として用いて同時に尿サンプル中の
α−アミラーゼ活性を測定した。α−アミラーゼ活性
は、キャリブザイムＰ（国際試薬社製）のα−アミラー
ゼ活性表示値をもとに各試薬での測定値を補正して、α
−アミラーゼ活性値とした。結果を表５に示す。Example 3 Examination of Effect of Isopropylthiogalactoside (Part 2) 1 β-galactosidase derived from Escherichia coli was added to urine of two healthy subjects.
Prepare the added sample so that it becomes 0 IU / ml,
The urinary α-amylase activity was measured by the method described in Reference Example 1. In addition, the α-amylase activity in the urine sample to which the β-galactosidase was added was measured with a reagent containing isopropylthiogalactoside at a final concentration of 5 mM, and both measured values were compared. In addition, an in-vitro diagnostic drug Diacolor AMY Neolate (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), which is an α-amylase measurement method using a maltooligosaccharide derivative substrate in which the non-reducing terminal glucose is not modified with galactose, is used simultaneously as a control reagent. The α-amylase activity in the urine sample was measured. The α-amylase activity was corrected by correcting the measured value of each reagent based on the α-amylase activity display value of Calibzyme P (manufactured by International Reagents Co.)
-Amylase activity value. The results are shown in Table 5.
【００４０】[0040]
【表５】 [Table 5]
【００４１】イソプロピルチオガラクトシドを添加しな
い試薬（比較例）では、α−アミラーゼ活性測定値が、
約７ＩＵ／Ｌ程度高く測定されている。With the reagent containing no isopropylthiogalactoside (Comparative Example), the measured α-amylase activity was
It is measured as high as about 7 IU / L.
【００４２】実施例４ カルシウムイオンの効果の検討（その１） 参考例１の試薬に、ＣａＣｌ2 を各種濃度添加し、α−
アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼ
の影響度を測定した。サンプルとして大腸菌由来β−ガ
ラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを用い、比較例１に記載
した検定方法に基づき検討を実施した。なお、結果を表
６に示す。Example 4 Examination of Effect of Calcium Ion (Part 1) Various concentrations of CaCl 2 were added to the reagent of Reference Example 1 to obtain α-
The degree of influence of β-galactosidase on the method for measuring the activity of amylase was measured. Escherichia coli-derived β-galactosidase 25 IU / ml was used as a sample, and the examination was carried out based on the assay method described in Comparative Example 1. The results are shown in Table 6.
【００４３】[0043]
【表６】 [Table 6]
【００４４】カルシウムイオンの添加濃度を高くするの
に従い、測定値は低くなりα−アミラーゼの活性測定法
に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回避されている
ことが表6 から明らかである。またカルシウムイオン0.
5mM 以下では影響を回避する効果がなく、1mM 以上でβ
−ガラクトシダーゼの影響を回避する効果があることが
わかる。It is clear from Table 6 that the higher the added concentration of calcium ions, the lower the measured value and the effect of β-galactosidase on the method for measuring the activity of α-amylase is avoided. Also calcium ion 0.
There is no effect of avoiding the effect below 5 mM, and β above 1 mM.
-It turns out that there is an effect of avoiding the influence of galactosidase.
【００４５】実施例５カ ルシウムイオンの効果の検討（その２） 健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１
０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、
尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法によ
り測定した。また、終濃度５ｍＭのＣａＣｌ2 を添加し
た試薬でも上記β−ガラクトシダーゼを添加した尿サン
プル中のα−アミラーゼ活性を測定し、両者の測定値を
比較した。また、非還元末端グルコースがガラクトース
で修飾されていないマルトオリゴ糖誘導体基質を用いた
α−アミラーゼ測定法である、体外診断用医薬品ダイヤ
カラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡績社製）を対照試薬
として用いて同時に尿サンプル中のα−アミラーゼ活性
を測定した。α−アミラーゼ活性は、キャリブザイムＰ
（国際試薬社製）のα−アミラーゼ活性表示値をもとに
各試薬での測定値を補正して、α−アミラーゼ活性値と
した。結果を表７に示す。[0045] Example 5 month study of the effects of Rushiumuion (Part 2) a urine derived from E. coli β- galactosidase of healthy individuals 2 person 1
Prepare the added sample so that it becomes 0 IU / ml,
The urinary α-amylase activity was measured by the method described in Reference Example 1. Further, the α-amylase activity in the urine sample to which the β-galactosidase was added was also measured using a reagent containing CaCl 2 at a final concentration of 5 mM, and both measured values were compared. In addition, an in-vitro diagnostic drug Diacolor AMY Neolate (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), which is an α-amylase measurement method using a maltooligosaccharide derivative substrate in which the non-reducing terminal glucose is not modified with galactose, is used as a control reagent at the same time. The α-amylase activity in the urine sample was measured. α-amylase activity is
The measured value of each reagent was corrected based on the α-amylase activity display value (manufactured by International Reagents Co., Ltd.) to obtain the α-amylase activity value. The results are shown in Table 7.
【００４６】[0046]
【表７】 [Table 7]
【００４７】ＣａＣｌ2 を添加しない試薬（比較例）で
は、α−アミラーゼ活性測定値が、約７ＩＵ／Ｌ程度高
く測定されている。With a reagent containing no CaCl 2 (comparative example)
The measured value of α-amylase activity is about 7 IU / L.
Has been measured .
【００４８】参考例１ カルシウムイオンがアミラーゼ活性測定に与える影響 １．試薬組成 ５０ｍＭ グッド緩衝液（ＰＩＰＥＳＵ） ｐＨ７．０ α−グルコシダーゼ ９０Ｕ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２Ｕ／ｍｌ ＮａＣｌ ２０ｍＭ ２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β −マルトテトラオシド ２ｍＭ ２．サンプル ヒト由来α−アミラーゼ １００ＩＵ／ｍｌ ３．検出方法 上記試薬組成にさらにＣａＣｌ2 を下表にように各種濃
度添加したのち、３ｍｌをとり、サンプルを０．２５ｍ
ｌ添加して、３７℃において３分間放置した後、４０５
ｎｍにおける吸光度の変化を測定し、１分間当たりの吸
光度変化量からα−アミラーゼの活性を測定した。その
結果を表８に示す 。 Reference Example 1 Effect of Calcium Ion on Amylase Activity Measurement 1. Reagent composition 50mM Good's buffer (PIPESU) pH7.0 α- glucosidase 90U / ml beta-glucosidase 12U / ml NaCl 20mM 2- chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D- galactopyranosyl-beta - malto Tetraoside 2 mM 2. Sample human α-amylase 100 IU / ml 3. Detection method In addition to the above reagent composition, CaCl 2 was added in various concentrations as shown in the table below.
After adding 3 times, take 3 ml and sample 0.25m
1 addition, left at 37 ° C. for 3 minutes, then 405
The change in absorbance at nm is measured and the absorbance per minute
The activity of α-amylase was measured from the change in light intensity. That
The results are shown in Table 8 .
【００４９】[0049]
【表８】 [Table 8]
【００５０】カルシウムイオンの添加濃度を高くするに
従い、ＣａＣｌ2 ０．８ｍＭ以上では測定値が変わら
ず、α−アミラーゼの活性測定法それ自体へのカルシウ
ムイオンの影響はないことが確認された。 To increase the concentration of calcium ions added
Therefore, the measured value changes when CaCl 2 is 0.8 mM or more.
The activity of α-amylase itself
It was confirmed that there was no effect of muion .
【００５１】[0051]
【発明の効果】本発明の非還元末端グルコースをβ−ガ
ラクトースで修飾したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖
を基質として測定するアミラーゼ活性測定法では、β−
ガラクトシダーゼ阻害剤を使用することにより、試料中
のβ−ガラクトシダーゼによるガラクトシルマルトオリ
ゴ糖の分解を阻止し、正確に試料中のα−アミラーゼ活
性測定方法を提供できる。さらに本発明では上記利点を
有するα−アミラーゼ活性測定試薬組成物を提供でき
る。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the amylase activity measuring method of the present invention in which the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose and β-galactosylmaltooligosaccharide is used as a substrate,
By using a galactosidase inhibitor, it is possible to prevent the degradation of galactosylmalto-oligosaccharide by β-galactosidase in the sample and to provide an accurate method for measuring α-amylase activity in the sample. Furthermore, the present invention can provide an α-amylase activity measuring reagent composition having the above advantages.
Claims (10)
原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位
の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクト
シルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／また
はβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害
剤を含む試薬を、試料中のα−アミラーゼに作用させ、
生成する色原体を測定することを特徴とするα−アミラ
ーゼ活性測定法。1. A β-galactosylmaltooligosaccharide or α-glucosidase in which the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is bound to a chromogen and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose. And / or a reagent containing a β-glucosidase and a β-galactosidase inhibitor is allowed to act on α-amylase in the sample,
A method for measuring α-amylase activity, which comprises measuring a chromogen produced.
元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をα−結合ま
たはβ−結合したものであることを特徴とする請求項１
項記載のα−アミラーゼ活性測定法。2. The β-galactosylmaltooligosaccharide is characterized in that the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is α-bonded or β-bonded with a chromogen.
Item 7. The method for measuring α-amylase activity according to item.
原体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または
６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラ
クトシルマルトオリゴ糖が、４−ニトロフェニル ４−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオ
シドまたは４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシル−α−マルトペンタオシドであることを
特徴とする請求項１記載のα−アミラーゼ活性測定法。3. A β-galactosylmaltooligosaccharide in which the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is α-bonded to the chromogen and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose, 4-nitrophenyl 4-
O-β-D-galactopyranosyl-α-maltotetraoside or 4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltopentaoside. 1. The method for measuring α-amylase activity according to 1.
原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または
６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラ
クトシルマルトオリゴ糖が、２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マ
ルトテトラオシドまたは２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルト
ペンタオシドであることを特徴とする請求項１記載のα
−アミラーゼ活性測定法。4. A β-galactosylmaltooligosaccharide in which the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is β-bonded to the chromogen and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose, 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-β-maltotetraoside or 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α -Maltopentaoside, α according to claim 1 characterized in that
-Amylase activity assay.
−チオガラクトシル類、キレート剤、アミン類、１ｍＭ
以上のカルシウムイオン、ラクトースまたはガラクトス
タチンであることを特徴とする請求項１項記載のα−ア
ミラーゼ活性測定法。5. A β-galactosidase inhibitor is β-D.
-Thiogalactosyls, chelating agents, amines, 1 mM
2. The method for measuring α-amylase activity according to claim 1, wherein the calcium ion, lactose, or galactostatin described above is used.
原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位
の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクト
シルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／また
はβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害
剤を含むことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定用試
薬組成物。6. A β-galactosylmaltooligosaccharide or α-glucosidase in which the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose binds a chromogen and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose. And / or a β-glucosidase and a β-galactosidase inhibitor, and a reagent composition for measuring α-amylase activity.
原体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または
６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラ
クトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよびβ
−ガラクトシダーゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求
項６記載のα−アミラーゼ活性測定用試薬組成物。7. A β-galactosylmalto-oligosaccharide in which the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is α-bonded to the chromogen and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose, α -Glucosidase and β
-The reagent composition for measuring α-amylase activity according to claim 6, which comprises a galactosidase inhibitor.
原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または
６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラ
クトシルマルトオリゴ糖、β−グルコシダーゼおよびβ
−ガラクトシダーゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求
項６記載α−のアミラーゼ活性測定用試薬組成物。8. A β-galactosylmalto-oligosaccharide in which the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is β-bonded to the chromogen and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose, β -Glucosidase and β
A reagent composition for measuring α-amylase activity according to claim 6, which comprises a galactosidase inhibitor.
原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または
６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラ
クトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼ、β−グ
ルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む
ことを特徴とする請求項６記載のα−アミラーゼ活性測
定用試薬組成物。9. A β-galactosylmalto-oligosaccharide in which the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose is β-bonded to the chromogen and the hydroxyl group at the 4- or 6-position of the non-reducing terminal glucose is modified with β-galactose, α -Glucosidase, β-glucosidase, and β-galactosidase inhibitor are contained, The reagent composition for (alpha) -amylase activity measurement of Claim 6 characterized by the above-mentioned.
Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤、アミン類、１ｍ
Ｍ以上のカルシウムイオン、ラクトースまたはガラクト
スタチンであることを特徴とする請求項６項記載のα−
アミラーゼ活性測定試薬組成物。10. The β-galactosidase inhibitor is β-galactosidase.
D-thiogalactosyls, chelating agents, amines, 1 m
7. The α- according to claim 6, which is a calcium ion having M or more, lactose or galactostatin.
Amylase activity measuring reagent composition.
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|---|---|---|---|
| JP28936793A JP3627817B2 (en) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | α-Amylase activity measuring method and reagent composition thereof |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002355097A (en) * | 2001-06-01 | 2002-12-10 | Kyowa Medex Co Ltd | Reagent for measuring alpha-amylase activity and measuring method |
-
1993
- 1993-11-18 JP JP28936793A patent/JP3627817B2/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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