JPH0698011B2 - グルコース−１−リン酸の製造法 - Google Patents
グルコース−１−リン酸の製造法Info
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- JPH0698011B2 JPH0698011B2 JP62219674A JP21967487A JPH0698011B2 JP H0698011 B2 JPH0698011 B2 JP H0698011B2 JP 62219674 A JP62219674 A JP 62219674A JP 21967487 A JP21967487 A JP 21967487A JP H0698011 B2 JPH0698011 B2 JP H0698011B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は固定化酵素によるグルコース−１−リン酸の製
造法に関し、更に詳細には解糖系の初期化合物であり、
例えば医薬用抗菌剤、抗腫瘍剤（白金錯体）、心臓病の
治療薬（アミン塩）等として有用なグルコース−１−リ
ン酸の固定化酵素による製造法に関する。
造法に関し、更に詳細には解糖系の初期化合物であり、
例えば医薬用抗菌剤、抗腫瘍剤（白金錯体）、心臓病の
治療薬（アミン塩）等として有用なグルコース−１−リ
ン酸の固定化酵素による製造法に関する。
従来、グルコース−１−リン酸（以下「Ｇ−１−Ｐ」と
略称する）の製造法としては、ホスホリラーゼの酵素触
媒作用によりα−グルカン（デンプン、グリコーゲン
等）とオルトリン酸塩とから製造する方法が種々知られ
ている。例えば、家兎筋肉抽出液を酵素液としてグルコ
ーゲンから製造する方法（Coriら;J.Biol.Chem.,121,46
5（1937））、ポテトの汁を酵素液としてデンプンから
製造する方法（C.S.Hanes;Proc.R.Soc.,B129,174（194
0））等がある。
略称する）の製造法としては、ホスホリラーゼの酵素触
媒作用によりα−グルカン（デンプン、グリコーゲン
等）とオルトリン酸塩とから製造する方法が種々知られ
ている。例えば、家兎筋肉抽出液を酵素液としてグルコ
ーゲンから製造する方法（Coriら;J.Biol.Chem.,121,46
5（1937））、ポテトの汁を酵素液としてデンプンから
製造する方法（C.S.Hanes;Proc.R.Soc.,B129,174（194
0））等がある。
具体的にはグルカンとオルトリン酸塩を基質とし、これ
にホスホリラーゼを作用させてＧ−１−Ｐを合成し、反
応後酵素を熱処理で変性凝固させて除き、未反応オルト
リン酸塩をMg3（PO4）２、MgNH4PO、Ba3（PO4）２等の
不溶塩にして除去廃棄後、イオン交換樹脂を使用したり
アルコール再沈したりして未反応グルカンを除いてＧ−
１−Ｐを製造するものである。
にホスホリラーゼを作用させてＧ−１−Ｐを合成し、反
応後酵素を熱処理で変性凝固させて除き、未反応オルト
リン酸塩をMg3（PO4）２、MgNH4PO、Ba3（PO4）２等の
不溶塩にして除去廃棄後、イオン交換樹脂を使用したり
アルコール再沈したりして未反応グルカンを除いてＧ−
１−Ｐを製造するものである。
しかし、これらの製造法はバッチで反応を行い、反応終
了の度に酵素を取り除かなければならないため、工業的
製造法としてはコスト上極めて不利なものであつた。
了の度に酵素を取り除かなければならないため、工業的
製造法としてはコスト上極めて不利なものであつた。
これを解決する手段として、ホスホリラーゼを担体に結
合させた固定化酵素の利用が考えられる。
合させた固定化酵素の利用が考えられる。
固定化ホスホリラーゼを用いたＧ−１−Ｐの合成法とし
ては、S.D.Larroqueらの報告（J.Appl.Biochem.,４,133
（1982））があり、ホスホリラーゼの固定化方法とし
て、セルロースにジエチルアミノエチル基を導入した弱
塩基性アニオン交換樹脂へのイオン結合による方法、ア
ガロースにオクチル基を導入した樹脂への疎水結合によ
る方法、CNBrで活性化されたアガロースへの共有結合に
よる方法が用いられているが、これらどの固定化方法も
ホスホリラーゼ吸着量が低いためＧ−１−Ｐ合成能力が
低く、かつまた多糖樹脂を利用しているため樹脂の再生
が困難である等取り扱いが難しく、コストも高い等の問
題があつた。
ては、S.D.Larroqueらの報告（J.Appl.Biochem.,４,133
（1982））があり、ホスホリラーゼの固定化方法とし
て、セルロースにジエチルアミノエチル基を導入した弱
塩基性アニオン交換樹脂へのイオン結合による方法、ア
ガロースにオクチル基を導入した樹脂への疎水結合によ
る方法、CNBrで活性化されたアガロースへの共有結合に
よる方法が用いられているが、これらどの固定化方法も
ホスホリラーゼ吸着量が低いためＧ−１−Ｐ合成能力が
低く、かつまた多糖樹脂を利用しているため樹脂の再生
が困難である等取り扱いが難しく、コストも高い等の問
題があつた。
従つて、ホスホリラーゼを有効に利用でき、上記問題点
を解決したＧ−１−Ｐの製造法が要望されていた。
を解決したＧ−１−Ｐの製造法が要望されていた。
そこで本発明者らは、固定化ホスホリラーゼ存在下での
α−グルカンとオルトリン酸塩との反応について、特
に、用いる固定化ホスホリラーゼについて鋭意研究をお
こなつた結果、特定の担体に固定化したホスホリラーゼ
が上記反応において好適であることを見い出し本発明を
完成させた。
α−グルカンとオルトリン酸塩との反応について、特
に、用いる固定化ホスホリラーゼについて鋭意研究をお
こなつた結果、特定の担体に固定化したホスホリラーゼ
が上記反応において好適であることを見い出し本発明を
完成させた。
すなわち本発明は、α−グルカンとオルトリン酸塩より
ホスホリラーゼを用いてグルコース−１−リン酸を製造
する方法において、合成高分子系樹脂にアニオン交換基
を導入したアニオン交換樹脂に固定したホスホリラーゼ
を用いることを特徴とするグルコース−１−リン酸の製
造法である。
ホスホリラーゼを用いてグルコース−１−リン酸を製造
する方法において、合成高分子系樹脂にアニオン交換基
を導入したアニオン交換樹脂に固定したホスホリラーゼ
を用いることを特徴とするグルコース−１−リン酸の製
造法である。
本発明に用いる合成高分子系樹脂としては、スチレン
系、ビニル系、プロピレン系、エチレン系、ブタジエン
系、アクリロニトリル系、イソプレン系、アクリル酸・
メタアクリル酸系、フエノール系、フエノール・ｍ−フ
エニレンジアミン系、エピクロルヒドリン系等が挙げら
れ、特にスチレン系、ビニル系の合成高分子樹脂が好ま
しい。
系、ビニル系、プロピレン系、エチレン系、ブタジエン
系、アクリロニトリル系、イソプレン系、アクリル酸・
メタアクリル酸系、フエノール系、フエノール・ｍ−フ
エニレンジアミン系、エピクロルヒドリン系等が挙げら
れ、特にスチレン系、ビニル系の合成高分子樹脂が好ま
しい。
上記合成高分子系樹脂に導入するアニオン交換基として
は、第一級〜第四級アンモニウム基、ホスホニウム基、
スルホニウム基等が挙げられ、特に第四級アンモニウム
基が好ましい。
は、第一級〜第四級アンモニウム基、ホスホニウム基、
スルホニウム基等が挙げられ、特に第四級アンモニウム
基が好ましい。
かかるアニオン交換樹脂は、従来法で用いられたセルロ
ース、デキストリン、アガロース等の多糖を樹脂とした
アニオン交換樹脂に比べ、ホスホリラーゼ吸着能が高
い、Ｇ−１−Ｐ生産能力が高い、物理的強度が強く取り
扱いやすい、安価であるなどの利点を有する。
ース、デキストリン、アガロース等の多糖を樹脂とした
アニオン交換樹脂に比べ、ホスホリラーゼ吸着能が高
い、Ｇ−１−Ｐ生産能力が高い、物理的強度が強く取り
扱いやすい、安価であるなどの利点を有する。
本発明方法は、上記アニオン交換樹脂に固定したホスホ
リラーゼを用いる以外は、公知のホスホリラーゼを用い
るＧ−１−Ｐの製造法に準じて実施することができる。
リラーゼを用いる以外は、公知のホスホリラーゼを用い
るＧ−１−Ｐの製造法に準じて実施することができる。
具体的には例えば、活性化したアニオン交換樹脂もしく
は活性化したのち緩衝溶液で平衡化したアニオン交換樹
脂と動物、植物、微生物等から得られたホスホリラーゼ
またはその含有物とを混合し、撹拌または振とうするこ
とにより固定化ホスホリラーゼを調製する。
は活性化したのち緩衝溶液で平衡化したアニオン交換樹
脂と動物、植物、微生物等から得られたホスホリラーゼ
またはその含有物とを混合し、撹拌または振とうするこ
とにより固定化ホスホリラーゼを調製する。
調製時のホスホリラーゼまたはその含有物とアニオン交
換樹脂との混合比については特に限定しないが、体積比
として1.0以上、ホスホリラーゼ全活性（Ｕ）とアニオ
ン交換樹脂重量（ｇ）との比として5.0（U/g）以上で行
うことが望ましい。また目的に応じて、アニオン交換樹
脂をカラム等に充填し、これにホスホリラーゼまたはそ
の含有物を流通させ、固定化ホスホリラーゼを調製する
ことも可能である。
換樹脂との混合比については特に限定しないが、体積比
として1.0以上、ホスホリラーゼ全活性（Ｕ）とアニオ
ン交換樹脂重量（ｇ）との比として5.0（U/g）以上で行
うことが望ましい。また目的に応じて、アニオン交換樹
脂をカラム等に充填し、これにホスホリラーゼまたはそ
の含有物を流通させ、固定化ホスホリラーゼを調製する
ことも可能である。
次いでグルカンとオルトリン酸塩の混合溶液を調製す
る。グルカンとしてはデンプン、グリコーゲン、デキス
トリン、アミロース等が用いられ、濃度は0.01〜50重量
％、好ましくは0.1〜20重量％に調製する。一方オルト
リン酸塩はオルトリン酸を中和して用いても、またリン
酸二水素塩とリン酸一水素塩とを併用してもよく、濃度
0.01〜5mol/、好ましくは0.5〜2.0mol/であり、pH
は4.5〜10、好ましくは6.5〜8.5に調整する。ただし、
リン酸塩が高濃度の場合は正確にpHを調整することが難
しくなるので、リン酸二水素塩とリン酸一水素塩とのmo
l比が0.5対9.5〜９対１、好ましくは0.5対9.5〜5.5対4.
5になるように混合溶液を調製する。塩の種類に関して
は特に限定されないが、水への溶解度が高い塩が好まし
く、特にカリウム塩、ナトリウム塩が好ましい。
る。グルカンとしてはデンプン、グリコーゲン、デキス
トリン、アミロース等が用いられ、濃度は0.01〜50重量
％、好ましくは0.1〜20重量％に調製する。一方オルト
リン酸塩はオルトリン酸を中和して用いても、またリン
酸二水素塩とリン酸一水素塩とを併用してもよく、濃度
0.01〜5mol/、好ましくは0.5〜2.0mol/であり、pH
は4.5〜10、好ましくは6.5〜8.5に調整する。ただし、
リン酸塩が高濃度の場合は正確にpHを調整することが難
しくなるので、リン酸二水素塩とリン酸一水素塩とのmo
l比が0.5対9.5〜９対１、好ましくは0.5対9.5〜5.5対4.
5になるように混合溶液を調製する。塩の種類に関して
は特に限定されないが、水への溶解度が高い塩が好まし
く、特にカリウム塩、ナトリウム塩が好ましい。
最後に、調製したグルカンとオルトリン酸塩の混合溶液
に固定化ホスホリラーゼを加えるか、または固定化ホス
ホリラーゼを充填したカラムに混合溶液を流通させ、５
〜60℃、特に好ましく25〜40℃で反応させてＧ−１−Ｐ
を製造する。
に固定化ホスホリラーゼを加えるか、または固定化ホス
ホリラーゼを充填したカラムに混合溶液を流通させ、５
〜60℃、特に好ましく25〜40℃で反応させてＧ−１−Ｐ
を製造する。
上記反応におけるその他の条件、例えば反応時間、カラ
ム流通時間、添加剤、防腐剤の添加等は目的に応じて設
定すればよい。
ム流通時間、添加剤、防腐剤の添加等は目的に応じて設
定すればよい。
本発明方法は、ホスホリラーゼを特定のアニオン交換樹
脂に固定したものを使用することにより、ホスホリラ
ーゼを有効に利用できる。ホスホリラーゼの該樹脂へ
の吸着性が高いので反応性がよい、ホスホリラーゼの
活性保持性が優れている、該樹脂は物理的強度が強い
等の利点からＧ−１−Ｐを安価に製造することができ
る。
脂に固定したものを使用することにより、ホスホリラ
ーゼを有効に利用できる。ホスホリラーゼの該樹脂へ
の吸着性が高いので反応性がよい、ホスホリラーゼの
活性保持性が優れている、該樹脂は物理的強度が強い
等の利点からＧ−１−Ｐを安価に製造することができ
る。
以下に実施例を挙げて説明する。
（固定化ホスホリラーゼの調製） 再生したアニオン交換樹脂50〜200gに、ポテトをジュー
サーでつぶし遠心分離にかけて得られたポテトのすり汁
700〜3000mlを加え、25℃５時間振とう（100ストローク
／分）し、固定化ホスホリラーゼを調製した。その結
果、固定化ホスホリラーゼの活性は28.0〜33.9U/g−樹
脂であり、この値は固定化されていないホスホリラーゼ
活性の50％に相当した。なお、ここで示す酵素活性1Uと
は、30℃で１分間に１μmolの生成物を得るのに必要な
酵素量と定義する。
サーでつぶし遠心分離にかけて得られたポテトのすり汁
700〜3000mlを加え、25℃５時間振とう（100ストローク
／分）し、固定化ホスホリラーゼを調製した。その結
果、固定化ホスホリラーゼの活性は28.0〜33.9U/g−樹
脂であり、この値は固定化されていないホスホリラーゼ
活性の50％に相当した。なお、ここで示す酵素活性1Uと
は、30℃で１分間に１μmolの生成物を得るのに必要な
酵素量と定義する。
なお、ここではアニオン交換樹脂としてポリスチレン系
高分子に交換基としてトリメチルアンモニウム基を導入
した強塩基性アニオン交換樹脂を使用した。
高分子に交換基としてトリメチルアンモニウム基を導入
した強塩基性アニオン交換樹脂を使用した。
（Ｇ−１−Ｐの定量） 合成されたＧ−１−Ｐは高速液体クロマトグラフイによ
つて定量した。カラム東洋曹達（株）製イオン交換カラ
ムTSKゲルSAX6mm×15cm、溶離液は0.5mol/酢酸ナトリ
ウム、流速は1.5ml分であつて、ピーク検出には昭和電
工（株）製示差屈折計SE−51型を用いた。
つて定量した。カラム東洋曹達（株）製イオン交換カラ
ムTSKゲルSAX6mm×15cm、溶離液は0.5mol/酢酸ナトリ
ウム、流速は1.5ml分であつて、ピーク検出には昭和電
工（株）製示差屈折計SE−51型を用いた。
実施例１ DE（dextrose equivalen）3.97のデキストリン10.0g
を、KH2PO412.7g及びK2HPO418.6gを含有する80mlの水溶
液で溶解し、これに固定化ホスホリラーゼ5.9g（200U）
及び防腐剤としてトルエン2mlを加え、100mlに調製後40
℃で48時間振とうし、反応させた。その結果、88.4mmol
/のＧ−１−Ｐが合成された。
を、KH2PO412.7g及びK2HPO418.6gを含有する80mlの水溶
液で溶解し、これに固定化ホスホリラーゼ5.9g（200U）
及び防腐剤としてトルエン2mlを加え、100mlに調製後40
℃で48時間振とうし、反応させた。その結果、88.4mmol
/のＧ−１−Ｐが合成された。
実施例２ DE3.97のデキストリン10.0gを、KH2PO412.7g及びK2HPO4
18.6gを含有する80mlの水溶液で溶解し、これに固定化
ホスホリラーゼ11.8g（400U）及び防腐剤としてトルエ
ン2mlを加え、100mlに調製後40℃で48時間振とうし反応
させた。その結果、114.0mmol/のＧ−１−Ｐが合成さ
れた。
18.6gを含有する80mlの水溶液で溶解し、これに固定化
ホスホリラーゼ11.8g（400U）及び防腐剤としてトルエ
ン2mlを加え、100mlに調製後40℃で48時間振とうし反応
させた。その結果、114.0mmol/のＧ−１−Ｐが合成さ
れた。
実施例３ DE3.97のデキストリン5.0gを、KH2PO46.4g及びK2HPO49.
3gを含有する40mlの水溶液で溶解し、これに固定化ホス
ホリラーゼ2.98g（101U）及び腐剤としてトルエン1mlを
加え、50mlに調製後40℃で48時間振とうし反応させた。
その結果、111.6mmol/のＧ−１−Ｐが合成された。
3gを含有する40mlの水溶液で溶解し、これに固定化ホス
ホリラーゼ2.98g（101U）及び腐剤としてトルエン1mlを
加え、50mlに調製後40℃で48時間振とうし反応させた。
その結果、111.6mmol/のＧ−１−Ｐが合成された。
次いで反応液をろ過して回収された固定化酵素を、DE3.
97のデキストリン5.0g、KH2PO46.4g及びK2HPO49.3gを含
有する約40mlの水溶液に加え、さらにトルエン1mlを加
え、50mlに調製後40℃48時間振とうし反応させた。その
結果、113.9mmol/のＧ−１−Ｐが合成された。
97のデキストリン5.0g、KH2PO46.4g及びK2HPO49.3gを含
有する約40mlの水溶液に加え、さらにトルエン1mlを加
え、50mlに調製後40℃48時間振とうし反応させた。その
結果、113.9mmol/のＧ−１−Ｐが合成された。
次いでさらに、反応液をろ過して回収された固定化酵素
を、E3.97のデキストリン5.0g、KH2PO46.4g及びK2HPO
49.3gを含有する約40mlの水溶液に加え、さらにトルエ
ン1mlを加え、50mlに調整後40℃で48時間振とうし反応
させた。その結果、112.8mmol/のＧ−１−Ｐが合成さ
れた。
を、E3.97のデキストリン5.0g、KH2PO46.4g及びK2HPO
49.3gを含有する約40mlの水溶液に加え、さらにトルエ
ン1mlを加え、50mlに調整後40℃で48時間振とうし反応
させた。その結果、112.8mmol/のＧ−１−Ｐが合成さ
れた。
比較例 再生したセルロースにジエチルアミノエチル基を導入し
たアニオン交換樹脂50gに、ポテトをジューサーでつぶ
し遠心分離にかけて得られたポテトのすり汁700mlを加
え、25℃で５時間振とう（100ストローク／分）し、固
定化ホスホリラーゼを調製した。その結果、このセルロ
ース系アニオン交換樹脂固定化ホスホリラーゼの活性は
21.9U/g−樹脂であつた。
たアニオン交換樹脂50gに、ポテトをジューサーでつぶ
し遠心分離にかけて得られたポテトのすり汁700mlを加
え、25℃で５時間振とう（100ストローク／分）し、固
定化ホスホリラーゼを調製した。その結果、このセルロ
ース系アニオン交換樹脂固定化ホスホリラーゼの活性は
21.9U/g−樹脂であつた。
次いでこの固定化ホスホリラーゼ4.62g（101U）を用
い、DE3.97のデキストリン5.0gを、KH2PO46.4g及びK2HP
O49.3gを含有する40mlの水溶液で溶解した水溶液に防腐
剤（トルエン1ml）とともに加え、50mlに調製後40℃で4
8時間振とうし反応させた。その結果、112.1mmol/の
Ｇ−１−Ｐが合成された。
い、DE3.97のデキストリン5.0gを、KH2PO46.4g及びK2HP
O49.3gを含有する40mlの水溶液で溶解した水溶液に防腐
剤（トルエン1ml）とともに加え、50mlに調製後40℃で4
8時間振とうし反応させた。その結果、112.1mmol/の
Ｇ−１−Ｐが合成された。
次に反応液をろ過して回収された固定化酵素を、DE3.97
のデキストリン5.0g、KH2PO46.4g及びK2HPO43.3gを含有
する約40mlの水溶液に加え、さらにトルエン1mlを加
え、50mlに調製後40℃48時間振とうし反応させた。その
結果、88.2mmol/のＧ−１−Ｐが合成された。
のデキストリン5.0g、KH2PO46.4g及びK2HPO43.3gを含有
する約40mlの水溶液に加え、さらにトルエン1mlを加
え、50mlに調製後40℃48時間振とうし反応させた。その
結果、88.2mmol/のＧ−１−Ｐが合成された。
次いでさらに、反応液をろ過して回収された固定化酵素
を、DE3.97のデキストリン5.0g、KH2PO46.4g及びK2HPO4
9.3gを含有する約40mlの水溶液に加え、さらにトルエン
1mlを加え、50mlに調整後40℃で48時間振とうし反応さ
せた。その結果、73.2mmol/のＧ−１−Ｐが合成され
た。
を、DE3.97のデキストリン5.0g、KH2PO46.4g及びK2HPO4
9.3gを含有する約40mlの水溶液に加え、さらにトルエン
1mlを加え、50mlに調整後40℃で48時間振とうし反応さ
せた。その結果、73.2mmol/のＧ−１−Ｐが合成され
た。
実施例４ 固定化ホスホリラーゼ167.g（4989U）をカラムにつめ、
カラムのまわりに40℃の水を流通させカラムを保温す
る。KH2PO412.7g/v％、K2HPO418.6g/v％及びDE3.97のデ
キストリン10g/v％を含有する水溶液を流速6.6ml/hr、
空間速度0.024/hrでカラムに供給し、カラム出口でのＧ
−１−Ｐ合成量を測定した。その結果、少なくとも70日
は安定にＧ−１−Ｐが合成された。結果を第１表に示
す。
カラムのまわりに40℃の水を流通させカラムを保温す
る。KH2PO412.7g/v％、K2HPO418.6g/v％及びDE3.97のデ
キストリン10g/v％を含有する水溶液を流速6.6ml/hr、
空間速度0.024/hrでカラムに供給し、カラム出口でのＧ
−１−Ｐ合成量を測定した。その結果、少なくとも70日
は安定にＧ−１−Ｐが合成された。結果を第１表に示
す。
Claims (1)
- 【請求項１】α−グルカンとオルトリン酸塩よりホスホ
リラーゼを用いてグルコース−１−リン酸を製造する方
法において、合成高分子系樹脂にアニオン交換基を導入
したアニオン交換樹脂に固定したホスホリラーゼを用い
ることを特徴とするグルコース−１−リン酸の製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62219674A JPH0698011B2 (ja) | 1987-09-02 | 1987-09-02 | グルコース−１−リン酸の製造法 |
| ES88114155T ES2056861T3 (es) | 1987-09-02 | 1988-08-30 | Procedimiento para preparar glucosa-1-fosfato. |
| EP88114155A EP0305981B1 (en) | 1987-09-02 | 1988-08-30 | Process for preparing glucose-1-phosphate |
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