JPH0698799A - ポリヌクレオチド検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明の目的は、高感度で精度の高い定量的
な、スループットの高い自動化装置に適したポリヌクレ
オチドの検出法を提供する。 【構成】 蛍光標識プローブとして標的ポリヌクレオチ
ド鎖１にハイブリダイズする蛍光標識プローブ２を用
い、両者を反応させ標的ポリヌクレオチド１と結合した
螢光標識プローブ３を得る。未反応の過剰な蛍光標識プ
ローブを電気泳動で分離除去した後、標的ポリヌクレオ
チドと螢光標識プローブの結合体３の変性温度以上にし
た後、さらに電気泳動を続け標的ポリヌクレオチドに結
合していた螢光標識プローブ４が遊離させ、遊離した螢
光標識プローブ４にレーザー光ビーム６を照射し、発す
る螢光を螢光検出器７で検出する。 【効果】 一連の工程を逐次的に自動的に行える利点が
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明の目的は、ＤＮＡ、ＲＮＡ
等のポリヌクレオチドの検出法に関する。

【０００２】

【従来の技術】標的となるポリヌクレオチド（ＤＮＡま
たはＲＮＡ）試料に標識物を結合した標識ポリヌクレオ
チドを会合させる従来のポリヌクレオチド検出法は、プ
ロシーディングス オブ ナチュラル アカデミー サ
イエンス ユー エス エー８０巻（１９８３年）第２
７８頁から２８２頁（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８３）８０、２７８−２
８２）に記載されている。この方法は、まず、電気泳動
により分子量分離したポリヌクレオチド断片試料をニト
ロセルロース膜に転写して固定した後に、この膜を放射
性同位元素標識されたポリヌクレオチドプローブを含む
溶液に浸してハイブリダイゼーション反応を行う。反応
後、未反応の標識プローブを洗浄により膜から洗い流
す。その後に、膜に結合した残留標識プローブの量をオ
ートラジオグラフィーにより検出することで標的ポリヌ
クレオチドの有無を判定する。また、血液や排泄物等の
試料中の細菌やウィルス等の外来性の標的ポリヌクレオ
チドを検出する方法が、特開昭５８−３１９９８号公報
に開示されている。この方法では、精製した試料中のポ
リヌクレオチドを加熱等により変性させて一本鎖とした
後、これを、ニトロセルロース膜に固定する。次に、検
査したい細菌やウィルスのポリヌクレオチドと相補的な
塩基配列を持つ放射性同位元素標識されたポリヌクレオ
チドプローブを反応させた後、この膜を洗浄する。も
し、試料中に細菌やウィルスのポリヌクレオチドが含ま
れていれば、これに標識ポリヌクレオチドプローブがハ
イブリダイゼーション反応により会合して膜上に残る。
これをオートラジオグラフィーにより検出することで標
的ポリヌクレオチドの有無を判定できる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術は、ポリ
ヌクレオチドプローブの標識に放射性同位元素を必要と
した。この方法は検出に長時間を要する上に感度が足ら
ない場合がある。これは、トレーサー量の放射性同位元
素しか標識することができないため、プローブ当たりの
比放射活性を高くとれないこと、プローブがニトロセル
ロース膜に非特異的に吸着することに依存するバックグ
ランドの放射線が原因である。また、従来法では定量的
な計測は難しくほとんどが標的ポリヌクレオチドの有無
の判定かオートラジオグラムのフィルムの黒化度より半
定量的な測定が行われるにすぎない。さらにオートラジ
オグラフィーを用いるため自動化することが難しく、作
業者が放射線被爆を受けるため、臨床フィールドで多量
の検体を検査するには難があった。近年、定量性の改善
や、放射線被爆を防ぐため、標識物に酵素や化学発光物
質が用いられるようになりつつあるが、ニトロセルロー
ス等の膜の取扱が自動化に適さない点や、これら試料や
標識物の膜に対する非特異吸着があるため、測定間のバ
ラツキが大きく検出感度が不足する場合があることに変
わりはない。このため、高感度を必要とする例では、ポ
リメラーゼを用いて測定対象となるポリヌクレオチドを
あらかじめ増殖させる方法（ポリメラーゼ チェーン
リアクション法：ＰＣＲ法：Ｎａｔｕｒｅ ３３５、４
１４−４１７（１９８８））が主流となっている。ＰＣ
Ｒ法では、標的となるポリヌクレオチドの２本鎖のそ
れぞれの鎖の離れた位置にプライマーを結合させる、
ポリメラーゼを用いてプラマーを起点に相補鎖を合成す
る、加熱し合成した相補鎖を解離させる、の一連のサ
イクルを繰り返す。この方法では一旦合成した相補鎖が
次のサイクルの鋳型ポリヌクレオチドとなるために、サ
イクルを重ねるごとに合成される相補鎖はねずみ算式に
増える。サイクルを数十回繰り返すことで最初の標的ポ
リヌクレオチドは１０万倍程度に増幅される。しかし、
ＰＣＲ法では、プライマーとポリヌクレオチドが完全に
相補的でない場合でもポリメラーゼが働く場合が多いの
で、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを増
幅するケースがある問題点がある。ＰＣＲ法では、増幅
率が高いがゆえに標的ポリヌクレオチド以外のコンタミ
ネーションによる妨害が大きい。さらに、ＰＣＲ法で
は、ポリヌクレオチドがねずみ算式に増えるため通常の
測定法では測定のダイナミックレンジが広くとれないう
えに、精度の面で問題があるため、定量測定が難しかっ
た。本発明の目的は、第一に、高感度で精度の高い定量
的ななポリヌクレオチドの検出法を提供することにあ
る。また、本発明の他の目的は、ポリヌクレオチドプロ
ーブの非放射性同位元素化を実現し、スループットの高
い自動化装置に適したポリヌクレオチド検出法を提供す
ることにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記目標のうちポリヌク
レオチドプローブの非放射性同位元素化を実現するため
に、本発明では、標識物に蛍光体を用いる。高感度で定
量的な測定を実現するために、本発明では、（１）電気
泳動を用いて標的ポリヌクレオチドと螢光標識プローブ
の複合体から未反応の螢光標識プローブを分離除去した
後、複合体を変性させ、標的ポリヌクレオチドに結合し
た蛍光標識プローブを電気泳動で分離し計測する。通常
標的ポリヌクレオチドは蛍光標識プローブに比べ十分巨
大なため蛍光標識プローブの方が泳動速度が速い。この
ため標的ポリヌクレオチドと螢光標識プローブの複合体
と未反応の螢光標識プローブは容易に分離出来る。特に
標的ポリヌクレオチドが数千塩基以上では変性とハイブ
リダイゼーション処理を行うと、未変性条件下ではほと
んど泳動されないので電気泳動による過剰量の蛍光標識
プローブの除去は有効である。未反応蛍光標識プローブ
を除去した後、標的ポリヌクレオチドと螢光標識プロー
ブの複合体を変性させ、さらに電気泳動をおこなうと、
標的ポリヌクレオチドに結合していた螢光標識プローブ
が溶離する。溶離した螢光標識プローブは未反応螢光標
識プローブと分離されているので、溶離した螢光標識プ
ローブ由来の螢光強度を測定することで標的ポリヌクレ
オチドの量を正確に知ることが出来る。（２）標的ポリ
ヌクレオチドと螢光標識プローブの複合体の変性法とし
ては、加熱あるいは尿素、ホルムアミド等の変性剤の添
加の少なくてもいずれか一方あるいは両方法の併用によ
り行うことが出来る。加熱法では、電気泳動担体を温水
やヒーター等で加熱する方法が一般的であるが、他に泳
動電圧を上げ、ジュール熱で加熱する方法やマイクロ波
や赤外線を用いる方法が有効であるが、速やかな温度上
昇を行える点と温度制御が可能な点で、ペルチェ素子で
電気泳動担体を直接加熱する方法と泳動電圧制御による
ジュール熱を利用する方法の単独使用あるいは併用が望
ましい。標的ポリヌクレオチドと螢光標識プローブの複
合体はほとんど泳動されずに試料添加部付近に留まって
いるので変性剤を用いる方法も有効である。変性剤を試
料添加部に添加すると、拡散により変性剤が該複合体に
到達し複合体を変性させる。変性剤としては尿素やホル
ムアミドが望ましいが、ＧＣ含有率の高い標的ポリヌク
レオチドと螢光標識プローブの複合体においては加熱法
と併用すると特に効果的である。（３）また、ペルチェ
素子やジュール熱を用いて温度を連続的あるいは段階的
に上昇させながら電気泳動を行うことで、試料中に混入
する標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに非
特異的に結合した螢光標識プローブを除くことが出来
る。スループットの高い自動化装置に適したポリヌクレ
オチド検出法を提供するために、（４）電気泳動を２工
程に分離し各々別の電気泳動担体を用いて泳動を行うこ
ととした。即ち、標的ポリヌクレオチドと螢光標識プロ
ーブの複合体から未反応の螢光標識プローブを分離除去
した後、複合体を含む電気泳動担体を蛍光標識プローブ
を分離計測する電気泳動担体に接触させ、変性条件下、
標的ポリヌクレオチドから螢光標識プローブを溶離計測
することにした。これにより、後者の電気泳動担体に
は、常に変性剤をいれ、あるいは加熱したままにするこ
とが出来る。（５）標的ポリヌクレオチドと螢光標識プ
ローブの複合体から未反応の螢光標識プローブを分離除
去させる工程に用いる担体は、ポリアクリルアミド、セ
ルロース、フルオロカーボン製等で標的ポリヌクレオチ
ドの透過しない細孔を持つゲルあるいは膜で、標的ポリ
ヌクレオチドと螢光標識プローブの複合体が捕捉出来る
かぎりにおいて厚さが薄い方が次の変性操作に都合がよ
い。複合体から蛍光標識プローブを分離計測する工程の
電気泳動用担体がポリアクリルアミドを主成分とするゲ
ル、あるいは無担体であることが螢光測定上望ましい。
螢光標識プローブの測定には、電気泳動担体の螢光測定
部を照射する励起用の光源と螢光測定用の光電子増倍管
あるいは２次元光子計数管あるいはＣＣＤアレー等の受
光素子と、受光素子からの信号を処理する装置からなる
検出装置をもちいる。ここで、光源にはレーザー光が励
起光強度が強く集光出来る点ですぐれている。

【０００５】

【作用】図１に本発明の概念図を示す。蛍光標識プロー
ブとして標的ポリヌクレオチド鎖１にハイブリダイズす
る蛍光標識プローブ２を用いる。両者を反応させると標
的ポリヌクレオチドと結合した螢光標識プローブ３が得
られる。標的ポリヌクレオチドと結合した螢光標識プロ
ーブ３と未反応の過剰な蛍光標識プローブはサイズが異
なるため電気泳動で容易に分離できる。蛍光体として
は、フルオレッセイン系、ローダミン系、４−ニトロベ
ンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾール、フタロシアニ
ン等等とその誘導体等が使用できるが、望ましくは分子
吸光係数と量子収率が高く、長波長蛍光体であるスルホ
ローダミン１０１がよい。過剰な蛍光標識プローブを除
いた後、標的ポリヌクレオチドと螢光標識プローブの結
合体３の変性温度以上にした後、さらに電気泳動を続け
ると標的ポリヌクレオチドに結合していた螢光標識プロ
ーブ４が遊離する。遊離した螢光標識プローブ４がレー
ザー発信器５から発信されるレーザー光ビーム６を横切
ると螢光標識プローブ由来の螢光が発光する。この螢光
は螢光検出器７で検出できる。検出された螢光量は標的
ポリヌクレオチド鎖１と量的な相関があるため、試料中
の標的ポリヌクレオチド鎖を検出定量することが出来
る。螢光標識プローブの長さとしては標的ポリヌクレオ
チド鎖に特異的に結合できる範囲において限定されない
が、１２塩基長ないし数十塩基長の範囲がよい。これよ
り短いと、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチ
ドに対する非特異的な反応が増える。いろいろな配列の
螢光標識プローブを得るには、化学合成で作成するのが
よいが、数十塩基長以下長くても１００塩基長以下であ
れば容易に合成できる。合成したポリヌクレオチドプロ
ーブに蛍光体を結合させる方法は、ポリヌクレオチドプ
ローブ合成の最終段にアミノ基を結合させ、該アミノ基
に官能基を持つ螢光色素、例えばスルホローダミン１０
１酸クロライドを反応させて得られる。

【０００６】

【実施例】図１により、本発明の概念を説明する。蛍光
標識プローブとして標的ポリヌクレオチド鎖１にハイブ
リダイズする蛍光標識プローブ２を用いる。両者を反応
させると標的ポリヌクレオチドと結合した螢光標識プロ
ーブ３が得られる。標的ポリヌクレオチドと結合した螢
光標識プローブ３と未反応の過剰な蛍光標識プローブは
サイズが異なるため電気泳動で容易に分離できる。蛍光
体としては、フルオレッセイン系、ローダミン系、４−
ニトロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾール、フタ
ロシアニン等等とその誘導体等が使用できるが、望まし
くは分子吸光係数と量子収率が高く、長波長蛍光体であ
るスルホローダミン１０１がよい。過剰な蛍光標識プロ
ーブを除いた後、標的ポリヌクレオチドと螢光標識プロ
ーブの結合体３の変性温度以上にした後、さらに電気泳
動を続けると標的ポリヌクレオチドに結合していた螢光
標識プローブ４が遊離する。遊離した螢光標識プローブ
４がレーザー発信器５から発信されるレーザー光ビーム
６を横切ると螢光標識プローブ由来の螢光が発光する。
この螢光は螢光検出器７で検出できる。検出された螢光
量は標的ポリヌクレオチド鎖１と量的な相関があるた
め、試料中の標的ポリヌクレオチド鎖を検出定量するこ
とが出来る。螢光標識プローブの長さとしては標的ポリ
ヌクレオチド鎖に特異的に結合できる範囲において限定
されないが、１２塩基長ないし数十塩基長の範囲がよ
い。これより短いと、標的ポリヌクレオチド以外のポリ
ヌクレオチドに対する非特異的な反応が増える。いろい
ろな配列の螢光標識プローブを得るには、化学合成で作
成するのがよいが、数十塩基長以下長くても１００塩基
長以下であれば容易に合成できる。合成したポリヌクレ
オチドプローブに蛍光体を結合させる方法は、ポリヌク
レオチドプローブ合成の最終段にアミノ基を結合させ、
該アミノ基に官能基を持つ螢光色素、例えばスルホロー
ダミン１０１酸クロライドを反応させて得られる。

【０００７】実施例１ 本実施例では、標的ポリヌクレオチド試料としてＭ１３
ｍｐ８ １本鎖ＤＮＡを用いた。この標的ＤＮＡに相
補的なプローブは、標的Ｍ１３ ｍｐ８ １本鎖ＤＮＡ
の塩基配列の６２６９番から６２９２番に相補的に結合
するポリヌクレオチドで、その５’末端にアミノ基を持
ち、以下の塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドで
ある。 ＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ このプローブは、標的ポリヌクレオチドに相補的に結合
する部位の５’末端にアミノ基を介してスルホローダミ
ン１０１が結合している。この螢光標識プローブの調製
法を示す。合成ポリヌクレオチドの合成最終段に周知の
方法でＮ−モノメトキシトリチルアミノヘキサ−６−オ
キシ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミ
ノホスホアミダイトを反応させて５’末端にアミノ基を
導入する。０．１Ｍ 炭酸緩衝液（ｐＨ ９）中で１０
０倍モル量のスルホローダミン１０１酸クロライドを反
応させる。生成したは螢光標識プローブは、エタノール
沈殿法とポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。
得られた螢光標識プローブは、電気泳動的に純品であ
る。ハイブリダイゼーション反応は図２に示す装置を用
いて、以下の手順にしたがって行う。各種濃度の標的Ｍ
１３ ｍｐ８ １本鎖ＤＮＡ溶液を容器３０１にいれ、
これを容器保持ステージ３０２にセットする。標識プロ
ーブ等も同様の容器にいれ容器保持ステージ３０２にセ
ットする。容器ステージには各反応容器毎に専用の使い
捨てピペットチップ３０３が装着されている。容器３０
１中の試料等は加熱器３０４により必要に応じて加熱さ
れ、試料等を変性させることができる。容器保持ステー
ジ３０２は円盤状で、ステッピングモーター３０５で回
転させることができ、任意の容器を自動ピペット３０６
の位置にセットすることができる。自動ピペット３０６
は、ステッピングモーター３０７により回転と上下動が
可能で、容器保持ステージ３０２と反応ステージ３０９
の間を自由に行き来できる。

【０００８】まず、自動ピペット３０６を移動させ、ピ
ペットチップ３０３をセットする。次に、容器３０１中
の試料を２５μｌ（マイクロリットル）吸い上げ、反応
ステージ３０９にセットした反応容器３０８に添加す
る。使用済みのピペットチップはチップ破棄箱３５０に
捨てられる。さらに、容器保持ステージ３０２に装着し
た他の容器から標識プローブ２５μｌ（マイクロリット
ル）を分注し反応容器３０８に添加する。反応ステージ
３０９はステッピングモーター３０７で回転できる構造
になっており、複数の反応容器に順次試料溶液と標識プ
ローブを添加できる。さらに、反応ステージ３０９の個
々の反応容器３０８は加熱器３０４を持つ構造で、反応
担体を独立に一定温度に保ことができる。ここでは９５
℃１分間加熱した後、４２℃に設定し３０分間反応させ
る。反応終了後、図３に示すように自動ピペット３１０
で反応液を電気泳動担体４００の試料注入部４０１に添
加する。電気泳動担体４００は回転可能な電気泳動担体
保持ステージに装着されており、ステッピングモーター
４１０で回転できる構造になっている。まず、ピペット
チップ３１１を昇降装置３１２を用いて自動ピペット３
１０に装着する。ピペットチップは電気泳動担体保持ス
テージに装着されている。電気泳動担体は電気泳動担体
保持ステージを回転させることで順次供給される。電気
泳動担体の長さは２ｃｍで、試料注入部４０１は円錐状
の形状で容量は１００μｌ（マイクロリットル）であ
る。電気泳動担体４００は電極槽４０２と温度調製装置
４０３が装着されている。まず、４２℃、１０ｖ／ｃｍ
で泳動を行い、未反応の標識プローブを除去する。標識
プローブの結合した標的Ｍ１３ ｍｐ８ １本鎖ＤＮＡ
はほとんど泳動されないので、反応担体の入り口に濃縮
される。次に温度を５５℃に上げ泳動し、標的ポリヌク
レオチド以外のポリヌクレオチドに非特異的に結合して
いる螢光標識プローブを除く。最後に、電気泳動担体
は、螢光検出部に移動させ、温度調製装置４０３を９５
℃に設定し、８０ｖ／ｃｍで泳動する。螢光検出部はレ
ーザー発信器４２１と螢光検出器４２２とデータ処理部
４２３からなる。標的Ｍ１３ ｍｐ８から遊離した螢光
標識プローブがレーザー光を横切る時に発する螢光を螢
光検出器で検出する。レーザーは５９４ｎｍのＨｅ／Ｎ
ｅレーザー、検出器光電子増倍管で集光レンズ４０４で
集光されている。

【０００９】図４に標的ポリヌクレオチド試料として標
的Ｍ１３ ｍｐ８ １本鎖ＤＮＡを用いたときの電気泳
動時の蛍光発光の経時変化を示す。標的Ｍ１３ ｍｐ８
１本鎖ＤＮＡに結合していた螢光標識プローブが明瞭
に検出できる。異なる濃度の標的Ｍ１３ ｍｐ８ １本
鎖ＤＮＡを試料として測定した検量線を図５に示す。本
発明を用いれば、未反応蛍光標識プローブや非特異的に
反応した蛍光標識プローブと標的ポリヌクレオチドに特
異的にハイブリダイゼーションした蛍光標識プローブが
分離できるので、標的ポリヌクレオチドを高感度に検出
できる利点がある。また、本発明では、ハイブリダイゼ
ーション反応、未反応蛍光標識プローブの分離、特異的
にハイブリダイゼーションした蛍光標識プローブの溶離
検出の一連の工程を逐次的に自動的に行える利点があ
る。さらに、試料や螢光標識プローブの選択が回転式ス
テージを用いて自由に行えるランダムアクセスが可能な
ため、臨床検査分野での使用に有効である。本実施例で
は電気泳動担体の温度を段階的に上げているが、４２℃
から９５℃まで連続的に上昇させても同様の効果が得ら
れる。但し、温度上昇率が早過ぎると、非特異的に結合
している螢光標識プローブと標的Ｍ１３ ｍｐ８ １本
鎖ＤＮＡに結合している螢光標識プローブの分離が不十
分になるので、温度上昇率は５℃／分以下（但し、泳動
電圧が１０ｖ／ｃｍの場合）が適当である。

【００１０】実施例２ 本実施例では、電気泳動担体が、未反応螢光標識プロー
ブの分離用と、標的ポリヌクレオチドに結合した螢光標
識プローブの計測用に分かれている例について説明す
る。試料と螢光標識プローブは実施例１と同様である。
実施例１の様に未反応螢光標識プローブの分離と標的ポ
リヌクレオチドに結合した螢光標識プローブの計測を同
一の電気泳動担体で行うと、大過剰の未反応螢光標識プ
ローブと微量の標的ポリヌクレオチドに結合した螢光標
識プローブを分離する必要があるので泳動に時間がかか
る。実施例１のように２ｃｍの電気泳動担体で泳動電圧
１０ｖ／ｃｍで未反応螢光標識プローブを除去するには
約４０分間かかる。以下の本実施例に示す様に極薄い未
反応螢光標識プローブの分離用の電気泳動担体を専用に
設けると、未反応螢光標識プローブが螢光計測用電気泳
動担体中を泳動する必要がないので、迅速に未反応螢光
標識プローブの除去が可能である。未反応螢光標識プロ
ーブの分離用の電気泳動担体は、直径約０．５ｍｍ分画
分子量１００００ダルトンのセルロースアセテート膜で
ある。この膜６００には図６に示すように実施例１と同
様に円錐状の試料添加装置６０１が結合している。試料
添加装置の容量は１００μｌ（マイクロリットル）であ
る。未反応螢光標識プローブ分離用の電気泳動担体は、
電極槽６０２と温度調節機６０３が結合している。実施
例１で調製した試料５０μｌ（マイクロリットル）を試
料添加装置６０１に添加する。試料には２０％シューク
ロースあるいは１０％グリセリンで比重を上げておく。
４２℃、１０ｖ／ｃｍで１０分間泳動し、未反応螢光標
識プローブを除去する。続いて、５５℃で１０分間泳動
を行い、標的Ｍ１３ ｍｐ８１本鎖ＤＮＡ以外のポリヌ
クレオチドに非特異的に結合した螢光標識プローブを除
去する。プローブ分離用の電気泳動単体はステッピング
モータ４１０で上下、回転、移動ができるターンテーブ
ルに取り付けてある。次に未反応螢光標識プローブ分離
用電気泳動担体を移動し長さ２ｃｍの螢光検出用の電気
泳動用担体６１０に装着する。この螢光検出用電気泳動
担体は濃度６％のポリアクリルアミド製で石英のキャピ
ラリーチューブに充填され、螢光検出用のＨｅ／Ｎｅレ
ーザーと螢光検出用光電子増倍管が装着されている。温
度調節機６０３を９５℃に設定し、８０ｖ／ｃｍで泳動
すると、約２ないし４分で標的Ｍ１３ ｍｐ８ １本鎖
ＤＮＡから遊離した螢光標識プローブ由来の螢光ピーク
が検出される。

【００１１】本実施例では、試料ごとに未反応プローブ
分離と検出を行うが、図７に記載の装置を用いて複数の
試料を同時に分析しても同様な結果が得られる。この例
では試料は試料注入装置７０１に添加される。試料注入
装置７０１は細管７０２で未反応プローブ分離用担体で
あるセルロースアセテート膜７１２に結合している。試
料添加後、上部電極槽７１０と下部電極槽７１１に電解
をかける。未反応プローブはセルロースアセテート膜を
通りぬけて除去される。傾向標識プローブと標的ポリヌ
クレオチドの複合体はセルロースアセテート膜上に残
る。次に下部電極槽７１１を除いた後、未反応プローブ
分離用担体であるセルロースアセテート膜の下に螢光検
出用電気泳動担体７２２を結合させる。加熱器７１４を
用いて未反応プローブ分離用担体を７０℃に加熱しなが
ら電極槽７１０と７２３の間に電界をかけ、標的ポリヌ
クレオチドに結合している螢光標識プローブを螢光検出
用担体７２２に移行させる。螢光検出用担体７２２はポ
リアクリルアミド製で上部から２ｃｍの位置にレーザ７
３１が照射されラインセンサ７３３で螢光が検出される
構造である。図７の例では同時に複数の試料の分析が可
能となる利点がある。

【００１２】本実施例のように、極薄い未反応螢光標識
プローブの分離用の電気泳動担体を専用に設けると、未
反応螢光標識プローブが螢光計測用電気泳動担体中を泳
動する必要がないので、迅速に未反応螢光標識プローブ
を除去出来るので、電気泳動時間を短く出来る効果があ
る。また、未反応螢光標識プローブや非特異的に反応し
た螢光標識プローブの除去が容易になるために、これら
の螢光標識プローブ由来のバックグランド螢光の妨害が
少なくなり、制度のよい測定が可能になる利点がある。
本発明は要約すれば次のようになる。、あらかじめ試料
と蛍光標識プローブを反応させ、両者の複合体を形成さ
せ、電気泳動にかけ、未反応の蛍光標識プローブを除去
する。この時点で、複合体はほとんど泳動されない。次
に、変性剤添加あるいは加熱により複合体を変性させ
る。電気泳動を続けると標的ポリヌクレオチドに結合し
ていた蛍光標識プローブが遊離し泳動されるようになる
ので、これを検出する。

【００１３】

【発明の効果】本発明を用いれば、未反応蛍光標識プロ
ーブや非特異的に反応した蛍光標識プローブと標的ポリ
ヌクレオチドに特異的にハイブリダイゼーションした蛍
光標識プローブが分離できるので、標的ポリヌクレオチ
ドを高感度に検出できる利点がある。また、本発明で
は、ハイブリダイゼーション反応、未反応蛍光標識プロ
ーブの分離、特異的にハイブリダイゼーションした蛍光
標識プローブの溶離検出の一連の工程を逐次的に自動的
に行える利点がある。さらに、試料や螢光標識プローブ
の選択が回転式ステージを用いて自由に行えるランダム
アクセスが可能なため、臨床検査分野での使用に有効で
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるポリヌクレオチドの検出法の概念
を示す図。

【図２】本発明による反応装置の概念図。

【図３】本発明による電気泳動装置と蛍光検出部の概念
図。

【図４】本実施例における試料の検出結果を示す例。

【図５】本実施例で得られる標的ポリヌクレオチドの検
量線の例。

【図６】本発明による電気泳動装置と螢光検出部の概念
図。

【図７】本発明による電気泳動装置と螢光検出部の他の
例の概念図。

【符号の説明】

１…標的ポリヌクレオチド、２…蛍光標識プローブ、３
…標的ポリヌクレオチドと蛍光標識プローブの複合体、
４…標的ポリヌクレオチドから遊離した蛍光標識プロー
ブの電気泳動バンド、５…レーザー発信機、６…レーザ
ービーム、７…蛍光検出器、３０１…容器、３０２…容
器保持ステージ、３０３…ピペットチップ、３０４…加
熱器、３０５…ステッピングモーター、３０６…自動ピ
ペット、３０７…ステッピングモーター、３０８…反応
容器、３０９…反応ステージ、３１０…自動ピペット、
３１１…ピペットチップ、３１２…昇降装置、３５０…
チップ破棄箱、４００…電気泳動担体、４０１…試料添
加部、４０２…電極槽、４０３…温度調節器、４０４…
集光レンズ、４１０…ステッピングモーター、４２１…
レーザー発信器、４２２…蛍光検出器、４２３…デ−タ
処理装置。６００、７１２…未反応プローブ分離用電気
泳動担体、６０１、７０１…試料添加装置、６０２、７
１０、７１１、７２３…電極槽、６０３、７１４…温度
調節器、６１０、７２２…螢光検出用電気泳動担体、７
０２…細管、７２５…電極、７３１…レーザ、７３２…
レーザ光路、７３３…ラインセンサ、７３４…データ回
線、７３５…データ処理装置。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】標的ポリヌクレオチドに螢光標識プローブ
   をハイブリダイゼーション条件下で結合させ、結合した
   螢光標識プローブの発する螢光を測定することにより前
   記標的ポリヌクレオチドを検出するポリヌクレオチド検
   出法において、電気泳動を用いて前記標的ポリヌクレオ
   チドと前記螢光標識プローブの複合体から未反応の前記
   螢光標識プローブを分離除去した後、前記複合体を変性
   させ、前記標的ポリヌクレオチドに結合した前記蛍光標
   識プローブを電気泳動で分離し計測することを特徴とす
   るポリヌクレオチド検出法。
2. 【請求項２】前記複合体の変性法が、加熱あるいは尿
   素、ホルムアミド等の変性剤の添加の少なくてもいずれ
   か一方あるいは両方法の併用によることを特徴とする請
   求項１記載のポリヌクレオチド検出法。
3. 【請求項３】電気泳動担体の温度を連続的あるいは段階
   的に上昇させながら電気泳動を行うことを特徴とする請
   求項１あるいは請求項２に記載のポリヌクレオチド検出
   法。
4. 【請求項４】前記複合体から未反応の前記螢光標識プロ
   ーブを分離除去する工程と、前記複合体から前記蛍光標
   識プローブを分離計測する工程に、各々独立した電気泳
   動用担体を用いることを特徴とする請求項１から請求項
   ３に記載のいずれかのポリヌクレオチド検出法。
5. 【請求項５】前記複合体から未反応の前記螢光標識プロ
   ーブを分離除去し前記複合体を変性させる工程に用いる
   担体が、前記標的ポリヌクレオチドが透過しない細孔を
   持つゲルあるいは膜であり、ポリアクリルアミド、セル
   ロース、フルオロカーボンのうちのいずかからなり、前
   記複合体から前記蛍光標識プローブを分離計測する工程
   に用いる電気泳動用担体がポリアクリルアミドを主成分
   とするゲル、あるいは無担体であることを特徴とする請
   求項３に記載のポリヌクレオチド検出法。
6. 【請求項６】螢光標識プローブ励起用の光源と光電子増
   倍管あるいは２次元光子計数管あるいはＣＣＤアレー等
   の受光素子と、該受光素子からの信号を処理する装置か
   らなる請求項１から請求項５のいずれかに記載のポリヌ
   クレオチド検出法を用いたポリヌクレオチド検出装置。