JPH0698768A - シュードモナス・メンドシーナから得られ得る新規タイプＩＩ制限酵素ＰｍｅＩ及びその製造法 - Google Patents
シュードモナス・メンドシーナから得られ得る新規タイプＩＩ制限酵素ＰｍｅＩ及びその製造法Info
- Publication number
- JPH0698768A JPH0698768A JP4158803A JP15880392A JPH0698768A JP H0698768 A JPH0698768 A JP H0698768A JP 4158803 A JP4158803 A JP 4158803A JP 15880392 A JP15880392 A JP 15880392A JP H0698768 A JPH0698768 A JP H0698768A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- restriction enzyme
- pme
- dna
- pseudomonas mendocina
- site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 特定の８つの塩基対を特異的に識別切断す
る、新規なタイプII制限酵素を得る。 【構成】 本発明により、シュードモナス・メンドシー
ナから得られ得る、新規なタイプII制限酵素が与えられ
る。Pme I と命名された本制限酵素は、二本鎖デオキシ
リボ核酸分子の下記塩基配列： ５′−ＧＴＴＴ▽ＡＡＡＣ−３′ ３′−ＣＡＡＡ△ＴＴＴＧ−５′ を識別し、▽△印の位置に切断部位を有する。シュード
モナス・メンドシーナからPme I を得る方法についても
記載されている。
る、新規なタイプII制限酵素を得る。 【構成】 本発明により、シュードモナス・メンドシー
ナから得られ得る、新規なタイプII制限酵素が与えられ
る。Pme I と命名された本制限酵素は、二本鎖デオキシ
リボ核酸分子の下記塩基配列： ５′−ＧＴＴＴ▽ＡＡＡＣ−３′ ３′−ＣＡＡＡ△ＴＴＴＧ−５′ を識別し、▽△印の位置に切断部位を有する。シュード
モナス・メンドシーナからPme I を得る方法についても
記載されている。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、シュードモナス・メン
ドシーナ（Pseudomonas mendocina ）から得られ得る新
規タイプII制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）Pme I
と、その製造方法に関する。タイプIIとは、識別部位も
切断部位も特異的であることを意味する。
ドシーナ（Pseudomonas mendocina ）から得られ得る新
規タイプII制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）Pme I
と、その製造方法に関する。タイプIIとは、識別部位も
切断部位も特異的であることを意味する。
【０００２】
【従来技術】制限酵素とは、バクテリアが本来有する一
群の酵素である。これを他の随伴バクテリア性物質から
単離すると、実験室でこれら制限酵素をＤＮＡ分子を精
密にフラグメントに分けるのに使うことができる。この
性質を利用して、ＤＮＡ分子を同定したり、その構成遺
伝子に分別したりすることが可能となった。現代の遺伝
子工学では、制限酵素は欠くことのできない手段であ
る。それは生化学における「鋏」であり、これにより遺
伝子操作及び解析がなされる。
群の酵素である。これを他の随伴バクテリア性物質から
単離すると、実験室でこれら制限酵素をＤＮＡ分子を精
密にフラグメントに分けるのに使うことができる。この
性質を利用して、ＤＮＡ分子を同定したり、その構成遺
伝子に分別したりすることが可能となった。現代の遺伝
子工学では、制限酵素は欠くことのできない手段であ
る。それは生化学における「鋏」であり、これにより遺
伝子操作及び解析がなされる。
【０００３】制限酵素は、ＤＮＡ分子中の特定のヌクレ
オチド配列（識別部位）を識別し、これに結合する。一
旦結合すると、制限酵素は当該配列の中で、又はその一
方の側で分子を切断する。各制限酵素はそれぞれ異なっ
た識別部位に親和性を持つ。多くの制限酵素は長さにし
て４〜６ヌクレオチドの配列を識別するが、最近になっ
て７又は８個の特定ヌクレオチドを特異的に識別する制
限酵素も少数単離された。識別部位の多くは廻文的対称
軸を有し、多くの場合ヌクレオチドは全て特異的に特定
されている。しかしながら、ある種の制限酵素では識別
部位中の一又は二以上の位置において複数の塩基を識別
するという意味で退化し特異性が減少することがあり、
また一部の制限酵素では非対称的配列を識別するものも
ある。制限酵素Hae III は５′ＧＧＣＣ３′という配列
を識別し、対称的非退化識別部位を有する例であるが、
Hae IIは５′（Pu）ＧＣＧＣ（Py）３′という配列を識
別し、退化し特異性に欠ける識別部位を持つ制限酵素の
典型例である。（Pu）はプリンの略でＡ又はＧのいずれ
でも識別することを示し、（Py）はピリミジンの略でＣ
又はＴのいずれでもよいことを意味する。対称的配列を
識別する制限酵素は一般に識別部位内又はそれに隣接す
る位置で対称的切断をするが、非対称的配列を識別する
ものでは識別部位から１〜１８ヌクレオチド離れた位置
で切断する傾向がある。今日まで数千の菌株が検討さ
れ、少くとも１２５以上の異なる制限酵素が同定されて
いる。
オチド配列（識別部位）を識別し、これに結合する。一
旦結合すると、制限酵素は当該配列の中で、又はその一
方の側で分子を切断する。各制限酵素はそれぞれ異なっ
た識別部位に親和性を持つ。多くの制限酵素は長さにし
て４〜６ヌクレオチドの配列を識別するが、最近になっ
て７又は８個の特定ヌクレオチドを特異的に識別する制
限酵素も少数単離された。識別部位の多くは廻文的対称
軸を有し、多くの場合ヌクレオチドは全て特異的に特定
されている。しかしながら、ある種の制限酵素では識別
部位中の一又は二以上の位置において複数の塩基を識別
するという意味で退化し特異性が減少することがあり、
また一部の制限酵素では非対称的配列を識別するものも
ある。制限酵素Hae III は５′ＧＧＣＣ３′という配列
を識別し、対称的非退化識別部位を有する例であるが、
Hae IIは５′（Pu）ＧＣＧＣ（Py）３′という配列を識
別し、退化し特異性に欠ける識別部位を持つ制限酵素の
典型例である。（Pu）はプリンの略でＡ又はＧのいずれ
でも識別することを示し、（Py）はピリミジンの略でＣ
又はＴのいずれでもよいことを意味する。対称的配列を
識別する制限酵素は一般に識別部位内又はそれに隣接す
る位置で対称的切断をするが、非対称的配列を識別する
ものでは識別部位から１〜１８ヌクレオチド離れた位置
で切断する傾向がある。今日まで数千の菌株が検討さ
れ、少くとも１２５以上の異なる制限酵素が同定されて
いる。
【０００４】一の種に属するバクテリアは、通常少数の
制限酵素しか保有していない。各制限酵素は、それが得
られたバクテリアに基づいて命名される。即ち、例えば
ヘモフィラス・エジプチウス種は３種の異なる制限酵素
を合成し、これらはHae Ｉ、Hae II及びHae III と名付
けられており、それぞれ（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、
（Pu）ＧＣＧＣ（Py）及びＧＧＣＣを識別する。これに
対してエッシェリヒア・コリＲＹ１３は、制限酵素EcoR
Iの１種のみを産生し、これはＧＡＡＴＴＣを識別す
る。
制限酵素しか保有していない。各制限酵素は、それが得
られたバクテリアに基づいて命名される。即ち、例えば
ヘモフィラス・エジプチウス種は３種の異なる制限酵素
を合成し、これらはHae Ｉ、Hae II及びHae III と名付
けられており、それぞれ（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、
（Pu）ＧＣＧＣ（Py）及びＧＧＣＣを識別する。これに
対してエッシェリヒア・コリＲＹ１３は、制限酵素EcoR
Iの１種のみを産生し、これはＧＡＡＴＴＣを識別す
る。
【０００５】特定の説に拘束されるものではないが、自
然界においては制限酵素はバクテリア細胞の自衛的役割
に寄与していると考えられている。制限酵素は、殺傷な
いし寄生をもたらすようなウイルス及びプラスミドの如
き外来性ＤＮＡ分子にバクテリアが感染するのを防止す
る。即ち制限酵素は、感染するＤＮＡ分子に結合し、識
別部位がある度にそこを切断する。このような分断によ
り感染遺伝子の多くは不活化し、当該ＤＮＡはエキソヌ
クレアーゼ（核酸分解酵素）によりさらに分解され得る
ようになる。
然界においては制限酵素はバクテリア細胞の自衛的役割
に寄与していると考えられている。制限酵素は、殺傷な
いし寄生をもたらすようなウイルス及びプラスミドの如
き外来性ＤＮＡ分子にバクテリアが感染するのを防止す
る。即ち制限酵素は、感染するＤＮＡ分子に結合し、識
別部位がある度にそこを切断する。このような分断によ
り感染遺伝子の多くは不活化し、当該ＤＮＡはエキソヌ
クレアーゼ（核酸分解酵素）によりさらに分解され得る
ようになる。
【０００６】バクテリア保護系における第２の特徴は、
修飾メチラーゼである。この酵素は制限酵素と相補的で
あって、これによりバクテリアは自身のＤＮＡを守り、
これを外来性感染ＤＮＡと区別することができる。修飾
メチラーゼも対応する制限酵素と同じヌクレオチド識別
部位を識別しこれに結合するが、ＤＮＡを破壊する代わ
りに配列内のどこかのヌクレオチドを化学的に修飾し、
メチル基を導入する。メチル化の後は、識別部位はもは
や制限酵素に結合切断されなくなる。バクテリア細胞の
ＤＮＡは、修飾メチラーゼの作用により常に完全に修飾
されているので、内因性制限酵素があっても全く非感受
性となっている。制限酵素に識別され攻撃を受けるの
は、非修飾の、従って外来性とわかるＤＮＡのみなので
ある。
修飾メチラーゼである。この酵素は制限酵素と相補的で
あって、これによりバクテリアは自身のＤＮＡを守り、
これを外来性感染ＤＮＡと区別することができる。修飾
メチラーゼも対応する制限酵素と同じヌクレオチド識別
部位を識別しこれに結合するが、ＤＮＡを破壊する代わ
りに配列内のどこかのヌクレオチドを化学的に修飾し、
メチル基を導入する。メチル化の後は、識別部位はもは
や制限酵素に結合切断されなくなる。バクテリア細胞の
ＤＮＡは、修飾メチラーゼの作用により常に完全に修飾
されているので、内因性制限酵素があっても全く非感受
性となっている。制限酵素に識別され攻撃を受けるの
は、非修飾の、従って外来性とわかるＤＮＡのみなので
ある。
【０００７】これまでに各種バクテリア株から１０００
以上の制限酵素が単離されている。このうち、１２５以
上は配列識別が特異的だが、他は共通の識別特性を有す
る。同一ヌクレオチド配列を識別する制限酵素を、アイ
ソシゾマー（isoschizomer）と呼ぶ。共通識別部位のア
イソシゾマー同士の間でも、切断部位については異なる
ことがある［例えばXmaIとSmaI、Endow ら、J.Mol.Bio
l. 112:521 (1977)及びWaalwijkら、Nucleic Acids Re
s. 5:3231 (1978)］。また、各部位での切断割合が異な
ることもある［XhoIとPaeR7I、Gingerasら、Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.80:402 (1983) ］。
以上の制限酵素が単離されている。このうち、１２５以
上は配列識別が特異的だが、他は共通の識別特性を有す
る。同一ヌクレオチド配列を識別する制限酵素を、アイ
ソシゾマー（isoschizomer）と呼ぶ。共通識別部位のア
イソシゾマー同士の間でも、切断部位については異なる
ことがある［例えばXmaIとSmaI、Endow ら、J.Mol.Bio
l. 112:521 (1977)及びWaalwijkら、Nucleic Acids Re
s. 5:3231 (1978)］。また、各部位での切断割合が異な
ることもある［XhoIとPaeR7I、Gingerasら、Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.80:402 (1983) ］。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】新規タイプII制限酵素
を求める動きは、引続き存在する。確かに多くの特異的
ヌクレオチド配列を識別するタイプII制限酵素が現在で
は得られるが、新しい配列を識別する新規制限酵素は遺
伝子工学にさらなる機会と可能性を与える。特に８個の
特定ヌクレオチドを識別するものは、僅かしか得られて
いない。これらには、Not I （ＧＣＧＧＣＣＧＣ）、Sf
i I （ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ）、Pac I （ＴＴＡ
ＡＴＴＡＡ）、Sse8387 I （ＣＣＴＧＣＡＧＧ）、Asc
I （ＧＧＣＧＣＧＣＣ）及びFse I （ＧＧＣＣＧＧＣ
Ｃ）があるが、Fse I は市販されていない。８個のヌク
レオチドを識別するタイプII制限酵素は、全染色体のよ
うな巨大ＤＮＡ分子の操作の際に格別有用である。何故
なら、８個の特定ヌクレオチドが一致する場合のみ切断
するため、これらの酵素によれば切断の機会が減り、特
定ＤＮＡ分子から少数のより扱いやすい数の断片を生ず
るからである。新規の特異的酵素があると、科学者はＤ
ＮＡ分子の従来とは別の位置で正確にＤＮＡを切ること
ができるようになり、実験の可能性が増大する。
を求める動きは、引続き存在する。確かに多くの特異的
ヌクレオチド配列を識別するタイプII制限酵素が現在で
は得られるが、新しい配列を識別する新規制限酵素は遺
伝子工学にさらなる機会と可能性を与える。特に８個の
特定ヌクレオチドを識別するものは、僅かしか得られて
いない。これらには、Not I （ＧＣＧＧＣＣＧＣ）、Sf
i I （ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ）、Pac I （ＴＴＡ
ＡＴＴＡＡ）、Sse8387 I （ＣＣＴＧＣＡＧＧ）、Asc
I （ＧＧＣＧＣＧＣＣ）及びFse I （ＧＧＣＣＧＧＣ
Ｃ）があるが、Fse I は市販されていない。８個のヌク
レオチドを識別するタイプII制限酵素は、全染色体のよ
うな巨大ＤＮＡ分子の操作の際に格別有用である。何故
なら、８個の特定ヌクレオチドが一致する場合のみ切断
するため、これらの酵素によれば切断の機会が減り、特
定ＤＮＡ分子から少数のより扱いやすい数の断片を生ず
るからである。新規の特異的酵素があると、科学者はＤ
ＮＡ分子の従来とは別の位置で正確にＤＮＡを切ること
ができるようになり、実験の可能性が増大する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、シュー
ドモナス・メンドシーナ NEB#698から得られ得る新規制
限酵素が与えられる。この制限酵素を以下Pme I と呼
ぶ。本酵素は、(1) 下記に示すような二本鎖ＤＮＡ分子
のヌクレオチド配列ＧＴＴＴＡＡＡＣ（Ｇはグアニン、
Ｃはシトシン、Ａはアデニン、Ｔはチミンをそれぞれ示
す）を識別し、 ５′−ＧＴＴＴ▽ＡＡＡＣ−３′ ３′−ＣＡＡＡ△ＴＴＴＧ−５′ (2) ▽△印で示されるＴとＡの間で上記配列のホスホジ
エステル結合を切断し、且つ(3) 二本鎖λＣＩ857 ＤＮ
Ａを位置8462及び 16296で、Adeno-2 ＤＮＡを位置 132
48で、並びにファージT7ＤＮＡを位置 276及び 10723で
それぞれ切断するが、pUC19 、pBR322、PhiX174 、SV40
及びM13mp18 の各ＤＮＡを切断しない。
ドモナス・メンドシーナ NEB#698から得られ得る新規制
限酵素が与えられる。この制限酵素を以下Pme I と呼
ぶ。本酵素は、(1) 下記に示すような二本鎖ＤＮＡ分子
のヌクレオチド配列ＧＴＴＴＡＡＡＣ（Ｇはグアニン、
Ｃはシトシン、Ａはアデニン、Ｔはチミンをそれぞれ示
す）を識別し、 ５′−ＧＴＴＴ▽ＡＡＡＣ−３′ ３′−ＣＡＡＡ△ＴＴＴＧ−５′ (2) ▽△印で示されるＴとＡの間で上記配列のホスホジ
エステル結合を切断し、且つ(3) 二本鎖λＣＩ857 ＤＮ
Ａを位置8462及び 16296で、Adeno-2 ＤＮＡを位置 132
48で、並びにファージT7ＤＮＡを位置 276及び 10723で
それぞれ切断するが、pUC19 、pBR322、PhiX174 、SV40
及びM13mp18 の各ＤＮＡを切断しない。
【００１０】本発明はさらに、上記した新規制限酵素Pm
e I の製造方法にも関する。本方法では、シュードモナ
ス・メンドシーナをPme I の発現に有利な条件で培養
し、培養細胞を採取し、これから細胞を含まない抽出物
を得、前記抽出物から制限酵素Pme I を分離収集する。
e I の製造方法にも関する。本方法では、シュードモナ
ス・メンドシーナをPme I の発現に有利な条件で培養
し、培養細胞を採取し、これから細胞を含まない抽出物
を得、前記抽出物から制限酵素Pme I を分離収集する。
【００１１】本発明において、Pme I はシュードモナス
・メンドシーナ株 NEB#698を培養し、細胞からエンドヌ
クレアーゼを回収することにより得られる。シュードモ
ナス・メンドシーナ NEB#698の試料は、American Type
Culture Collection (ATCC)に1991年５月８日受託番号
55181として寄託されている。
・メンドシーナ株 NEB#698を培養し、細胞からエンドヌ
クレアーゼを回収することにより得られる。シュードモ
ナス・メンドシーナ NEB#698の試料は、American Type
Culture Collection (ATCC)に1991年５月８日受託番号
55181として寄託されている。
【００１２】本発明の酵素を回収するためには、シュー
ドモナス・メンドシーナはこれに適する手法で生育させ
得る。例えば、トリプトン10ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／
ｌ、塩化ナトリウム10ｇ／ｌ、デキストロース１ｇ／
ｌ、塩化マグネシウム六水塩１ｇ／ｌを含む培地（pH
7.2）でシュードモナス・メンドシーナを生育させ、撹
拌及び通気の下に37℃でインキュベートする。成熟末期
にある細胞を遠心採取し、直ちに破砕するか、又は-70
℃に冷凍保存する。
ドモナス・メンドシーナはこれに適する手法で生育させ
得る。例えば、トリプトン10ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／
ｌ、塩化ナトリウム10ｇ／ｌ、デキストロース１ｇ／
ｌ、塩化マグネシウム六水塩１ｇ／ｌを含む培地（pH
7.2）でシュードモナス・メンドシーナを生育させ、撹
拌及び通気の下に37℃でインキュベートする。成熟末期
にある細胞を遠心採取し、直ちに破砕するか、又は-70
℃に冷凍保存する。
【００１３】Pme I 酵素は、シュードモナス・メンドシ
ーナ細胞から常用の蛋白精製手法で単離できる。例え
ば、ペースト状細胞を緩衝液に懸濁し、音波、高圧分
散、酵素消化等により緩衝液にエンドヌクレアーゼを抽
出する。壊れなかった細胞と細胞砕片を遠心除去し、Pm
e I を含み細胞を除いた抽出物を得る。次いでこの細胞
を除いた抽出物からイオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、分子篩クロマトグラ
フィー、ないしはこれらの組合せでPme I 酵素を精製
し、本発明のエンドヌクレアーゼを取得する。
ーナ細胞から常用の蛋白精製手法で単離できる。例え
ば、ペースト状細胞を緩衝液に懸濁し、音波、高圧分
散、酵素消化等により緩衝液にエンドヌクレアーゼを抽
出する。壊れなかった細胞と細胞砕片を遠心除去し、Pm
e I を含み細胞を除いた抽出物を得る。次いでこの細胞
を除いた抽出物からイオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、分子篩クロマトグラ
フィー、ないしはこれらの組合せでPme I 酵素を精製
し、本発明のエンドヌクレアーゼを取得する。
【００１４】本発明のエンドヌクレアーゼ、さらには対
応するメチラーゼは、Wilsonらの欧州特許公開019413号
に開示されたメチル化選択手法等の組換ＤＮＡ法によっ
ても得ることができる。同公開の内容はここに参照して
組み入れるものとする。例えば、シュードモナス・メン
ドシーナのようなＲ−Ｍ系（識別修飾系）を有する菌株
からのＤＮＡを精製し、クローニング酵素で部分消化
し、適当に切断しデホスホリル化したクローニングベク
ターに接合する。接合したＤＮＡを大腸菌等の適当な宿
主に形質転換し、転換細胞を一括し、クローニングベク
ターの個体群を精製してライブラリーを作成する。ライ
ブラリーの各クローンは、複写すべきＲ−Ｍ系のメチラ
ーゼを含まず発現しないようなベクターのみを選択的に
破壊するエンドヌクレアーゼにより消化を試みる。問題
のメチラーゼ遺伝子を含み発現したベクターは、攻撃す
るエンドヌクレアーゼの識別部位が修飾されているか
ら、切断に対して免疫性である。処理済みのクローン群
を適する宿主に逆転換し、消化されなかったクローンを
回収する。形質転換体を酵素活性でスクリーニングした
り、精製選択の操作をさらに反復してもよい。最終的に
所望の形質転換体を取得し、そのＤＮＡを精製する。こ
れらクローンについては、問題のエンドヌクレアーゼに
よる切断に対する抵抗性や、共通挿入ＤＮＡに関する検
定をする。エンドヌクレアーゼ抵抗を示す形質転換体か
ら得られた細胞抽出物を、インビトロでメチルトランス
フェラーゼ及びエンドヌクレアーゼ活性につき検定す
る。
応するメチラーゼは、Wilsonらの欧州特許公開019413号
に開示されたメチル化選択手法等の組換ＤＮＡ法によっ
ても得ることができる。同公開の内容はここに参照して
組み入れるものとする。例えば、シュードモナス・メン
ドシーナのようなＲ−Ｍ系（識別修飾系）を有する菌株
からのＤＮＡを精製し、クローニング酵素で部分消化
し、適当に切断しデホスホリル化したクローニングベク
ターに接合する。接合したＤＮＡを大腸菌等の適当な宿
主に形質転換し、転換細胞を一括し、クローニングベク
ターの個体群を精製してライブラリーを作成する。ライ
ブラリーの各クローンは、複写すべきＲ−Ｍ系のメチラ
ーゼを含まず発現しないようなベクターのみを選択的に
破壊するエンドヌクレアーゼにより消化を試みる。問題
のメチラーゼ遺伝子を含み発現したベクターは、攻撃す
るエンドヌクレアーゼの識別部位が修飾されているか
ら、切断に対して免疫性である。処理済みのクローン群
を適する宿主に逆転換し、消化されなかったクローンを
回収する。形質転換体を酵素活性でスクリーニングした
り、精製選択の操作をさらに反復してもよい。最終的に
所望の形質転換体を取得し、そのＤＮＡを精製する。こ
れらクローンについては、問題のエンドヌクレアーゼに
よる切断に対する抵抗性や、共通挿入ＤＮＡに関する検
定をする。エンドヌクレアーゼ抵抗を示す形質転換体か
ら得られた細胞抽出物を、インビトロでメチルトランス
フェラーゼ及びエンドヌクレアーゼ活性につき検定す
る。
【００１５】標準的メチラーゼ選択法に対して、クロー
ニングにリカルシトラントであるＲ−Ｍ系が幾つかある
ことがわかった。これらにあっては、上記手法適用に際
して修正を要する。Lunnenら、Gene 74:25-32 (1988)の
記載を、ここに参照して組み入れるものとする。例え
ば、ライブラリー作成に使用したエンドヌクレアーゼに
よりＲ−Ｍ遺伝子の一方ないし双方が切断されることが
ある。メチラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子が結合し
ないことのある系もある。BamH IやDde I のように、形
質転換宿主でのメチラーゼ発現性能不良、メチラーゼ発
現系の本来的調節機構、ないし他の不明な理由で、メチ
ラーゼが相当するエンドヌクレアーゼによる切断を十分
防止し得ないようなこともある。さらに起こり得る困難
性として、McrA、McrB又はmrr といったある種の宿主に
あっては、内因性宿主制限系の働きでメチル化の様式に
制限があり、メチラーゼクローンが死滅してしまうこと
がある。さらに別の問題として、量的又は純度的にメチ
ラーゼ選択に適するクローンすべきエンドヌクレアーゼ
を得られないこともあり得る。最後に、他の細菌属の宿
主中でエンドヌクレアーゼを発現するのが難しい場合も
多い。
ニングにリカルシトラントであるＲ−Ｍ系が幾つかある
ことがわかった。これらにあっては、上記手法適用に際
して修正を要する。Lunnenら、Gene 74:25-32 (1988)の
記載を、ここに参照して組み入れるものとする。例え
ば、ライブラリー作成に使用したエンドヌクレアーゼに
よりＲ−Ｍ遺伝子の一方ないし双方が切断されることが
ある。メチラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子が結合し
ないことのある系もある。BamH IやDde I のように、形
質転換宿主でのメチラーゼ発現性能不良、メチラーゼ発
現系の本来的調節機構、ないし他の不明な理由で、メチ
ラーゼが相当するエンドヌクレアーゼによる切断を十分
防止し得ないようなこともある。さらに起こり得る困難
性として、McrA、McrB又はmrr といったある種の宿主に
あっては、内因性宿主制限系の働きでメチル化の様式に
制限があり、メチラーゼクローンが死滅してしまうこと
がある。さらに別の問題として、量的又は純度的にメチ
ラーゼ選択に適するクローンすべきエンドヌクレアーゼ
を得られないこともあり得る。最後に、他の細菌属の宿
主中でエンドヌクレアーゼを発現するのが難しい場合も
多い。
【００１６】本発明のエンドヌクレアーゼの識別部位
は、各種ＤＮＡのPme I 切断位置をマッピングし、これ
ら領域のＤＮＡ配列に同一性があるか比較することによ
り定められる。エンドヌクレアーゼPme I は、λファー
ジＣＩ857 を２ヵ所で切断することがわかった。λＣＩ
857 をPme I と切断位置既知の他の制限酵素、例えばAp
a I 、SnaB I、Xba I 、Xho I 、Nhe I 、Hind III、Bs
tE II 、Eco0109 I 、Eag I 及びKpn I で同時に消化す
ることにより、これら切断位置はほぼ8500及び16300 の
位置にあるとされた。Pme I はAdeno2ＤＮＡを１ヵ所で
切断することがわかったが、同様の操作でその位置は約
13,500にマップされた。λには位置8459及び 16293に、
Adeno-2 には位置 13245に配列ＧＴＴＴＡＡＡＣがそれ
ぞれあり、そこ以外にはこれらＤＮＡに上記配列は現わ
れない。ファージT7には、位置10720 にPme I 切断が同
様のマッピングにより認められた。T7の位置273 の方は
粗製ないし半精製酵素による消化ではこの位置の切断で
生ずる断片が小さいため観察されなかったが、精製した
Pme I を使った実験では、この位置の切断が認められ
た。pUC19 、pBR322、PhiX174 、M13mp18 及びSV40の各
ＤＮＡには配列ＧＴＴＴＡＡＡＣが存在しないところ、
これらＤＮＡはPme I により切断されない。これらの根
拠により、我々はPme I は配列ＧＴＴＴＡＡＡＣを識別
するものと結論した。
は、各種ＤＮＡのPme I 切断位置をマッピングし、これ
ら領域のＤＮＡ配列に同一性があるか比較することによ
り定められる。エンドヌクレアーゼPme I は、λファー
ジＣＩ857 を２ヵ所で切断することがわかった。λＣＩ
857 をPme I と切断位置既知の他の制限酵素、例えばAp
a I 、SnaB I、Xba I 、Xho I 、Nhe I 、Hind III、Bs
tE II 、Eco0109 I 、Eag I 及びKpn I で同時に消化す
ることにより、これら切断位置はほぼ8500及び16300 の
位置にあるとされた。Pme I はAdeno2ＤＮＡを１ヵ所で
切断することがわかったが、同様の操作でその位置は約
13,500にマップされた。λには位置8459及び 16293に、
Adeno-2 には位置 13245に配列ＧＴＴＴＡＡＡＣがそれ
ぞれあり、そこ以外にはこれらＤＮＡに上記配列は現わ
れない。ファージT7には、位置10720 にPme I 切断が同
様のマッピングにより認められた。T7の位置273 の方は
粗製ないし半精製酵素による消化ではこの位置の切断で
生ずる断片が小さいため観察されなかったが、精製した
Pme I を使った実験では、この位置の切断が認められ
た。pUC19 、pBR322、PhiX174 、M13mp18 及びSV40の各
ＤＮＡには配列ＧＴＴＴＡＡＡＣが存在しないところ、
これらＤＮＡはPme I により切断されない。これらの根
拠により、我々はPme I は配列ＧＴＴＴＡＡＡＣを識別
するものと結論した。
【００１７】Pme I の識別部位のうちの切断の地点につ
いては、適当なＤＮＡ基質をPme Iで切断して得られた
配列の末端塩基をジデオキシ配列解析法で求めることに
より決定される［F.Sangerら、PNAS 74:5463-5467 (197
7)及びN.L.Brown ら、J.Mol.Biol. 140,143-148 (198
0)］。上記引用文献記載の方法（実施例２に例示）によ
り、Pme I は識別配列ＧＴＴＴ／ＡＡＡＣのうち、大部
分の３′Ｔと大部分の５′Ａとの間のホスホジエステル
結合を切り、下記の▽△印 ５′−ＧＴＴＴ▽ＡＡＡＣ−３′ ３′−ＣＡＡＡ△ＴＴＴＧ−５′ で示されるような平滑（非粘着）末端を生ずることが見
いだされた。
いては、適当なＤＮＡ基質をPme Iで切断して得られた
配列の末端塩基をジデオキシ配列解析法で求めることに
より決定される［F.Sangerら、PNAS 74:5463-5467 (197
7)及びN.L.Brown ら、J.Mol.Biol. 140,143-148 (198
0)］。上記引用文献記載の方法（実施例２に例示）によ
り、Pme I は識別配列ＧＴＴＴ／ＡＡＡＣのうち、大部
分の３′Ｔと大部分の５′Ａとの間のホスホジエステル
結合を切り、下記の▽△印 ５′−ＧＴＴＴ▽ＡＡＡＣ−３′ ３′−ＣＡＡＡ△ＴＴＴＧ−５′ で示されるような平滑（非粘着）末端を生ずることが見
いだされた。
【００１８】本発明の酵素は、また以下の各特性をも有
する。
する。
【００１９】(a) 好適緩衝組成：試験した緩衝液で最適
のものはNEBuffer IV （トリス酢酸塩20mM、酢酸マグネ
シウム10mM、酢酸カリウム50mM、DTT 1 mMを含むpH 7.9
のものに牛血清アルブミン100 μｇ／mlを追加）であっ
た。これに対してNEBuffer I（ビストリスプロパン塩酸
塩10mM、塩化マグネシウム10mM、DTT 1 mMを含むpH 7.0
のもの）及びNEBuffer III（トリス塩酸塩50mM、塩化マ
グネシウム10mM、塩化ナトリウム 100mM、DTT 1 mMを含
むpH 7.9のもの）では比活性がいずれも10％以下であ
り、NEBuffer II （トリス塩酸塩10mM、塩化マグネシウ
ム10mM、塩化ナトリウム50mM、DTT 1 mMを含むpH 7.9の
もの）では比活性が約25％であった。
のものはNEBuffer IV （トリス酢酸塩20mM、酢酸マグネ
シウム10mM、酢酸カリウム50mM、DTT 1 mMを含むpH 7.9
のものに牛血清アルブミン100 μｇ／mlを追加）であっ
た。これに対してNEBuffer I（ビストリスプロパン塩酸
塩10mM、塩化マグネシウム10mM、DTT 1 mMを含むpH 7.0
のもの）及びNEBuffer III（トリス塩酸塩50mM、塩化マ
グネシウム10mM、塩化ナトリウム 100mM、DTT 1 mMを含
むpH 7.9のもの）では比活性がいずれも10％以下であ
り、NEBuffer II （トリス塩酸塩10mM、塩化マグネシウ
ム10mM、塩化ナトリウム50mM、DTT 1 mMを含むpH 7.9の
もの）では比活性が約25％であった。
【００２０】(b) 熱不活化：100 μｌのNEBuffer IV 中
のPme I 20単位は、65℃20分で不活化することができ
る。
のPme I 20単位は、65℃20分で不活化することができ
る。
【００２１】(c) 酵素安定性：50μｌのNEBuffer IV 中
の1 μｇのλファージＤＮＡを37℃16時間で完全に切断
するのに、Pme I 1 単位を要する。
の1 μｇのλファージＤＮＡを37℃16時間で完全に切断
するのに、Pme I 1 単位を要する。
【００２２】
【実施例】以下の各実施例は、現在実用上好適とされて
いる本発明の実施態様を示すためのものである。これら
実施例は単に説明のためのものであり、添付の特許請求
の範囲に記載された以上には本発明を限定するものと解
してはならない。
いる本発明の実施態様を示すためのものである。これら
実施例は単に説明のためのものであり、添付の特許請求
の範囲に記載された以上には本発明を限定するものと解
してはならない。
【００２３】実施例１ § Pme I 制限酵素の製造 シュードモナス・メンドシーナ NEB#698［ATCC#55181］
を、トリプトン10ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、塩化ナ
トリウム10ｇ／ｌ、塩化マグネシウム六水塩１ｇ／ｌ、
グルコース１ｇ／ｌを含む培地（pH 7.2に調整）で生育
させた。細胞は、撹拌及び通気の下に成熟末期まで37℃
でインキュベートした。細胞を遠心採取し、-70 ℃に冷
凍保存した。
を、トリプトン10ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、塩化ナ
トリウム10ｇ／ｌ、塩化マグネシウム六水塩１ｇ／ｌ、
グルコース１ｇ／ｌを含む培地（pH 7.2に調整）で生育
させた。細胞は、撹拌及び通気の下に成熟末期まで37℃
でインキュベートした。細胞を遠心採取し、-70 ℃に冷
凍保存した。
【００２４】上記のようにして得た細胞96ｇを、３容の
緩衝液Ａ（トリス塩酸塩20mM、EDTA0.1mM、2-メルカプ
トエタノール 6mM、グリセリン５％、10℃でpH 7.6に調
整）に分散し、塩化ナトリウム濃度が50mMになるように
調整した。この細胞懸濁液を超音波処理し、細胞１ｇ当
たり約80mgの蛋白を放出させた。Beckman JA17ローター
中で、溶菌したものを４℃ 120分間15,000rpm で遠心し
た。上澄液350 mlが得られ、これには約800,000 単位の
Pme I と6970mgの可溶蛋白が含まれていた。
緩衝液Ａ（トリス塩酸塩20mM、EDTA0.1mM、2-メルカプ
トエタノール 6mM、グリセリン５％、10℃でpH 7.6に調
整）に分散し、塩化ナトリウム濃度が50mMになるように
調整した。この細胞懸濁液を超音波処理し、細胞１ｇ当
たり約80mgの蛋白を放出させた。Beckman JA17ローター
中で、溶菌したものを４℃ 120分間15,000rpm で遠心し
た。上澄液350 mlが得られ、これには約800,000 単位の
Pme I と6970mgの可溶蛋白が含まれていた。
【００２５】上澄溶液は、予め塩化ナトリウム濃度が50
mMになるように調整した緩衝液Ａで平衡させた350 ml D
EAE セパロースカラムに付した。溶出液は、区分して採
集した。塩化ナトリウム濃度が50mMになるように調整し
た緩衝液Ａ洗液 200mlをDEAEカラムに加え、カラム溶出
液と同じく採集した。このDEAE溶出液／洗液は、少くと
もPme I 800,000 単位の活性と1188mg（全蛋白から83％
の精製度）の可溶蛋白が含まれていた。
mMになるように調整した緩衝液Ａで平衡させた350 ml D
EAE セパロースカラムに付した。溶出液は、区分して採
集した。塩化ナトリウム濃度が50mMになるように調整し
た緩衝液Ａ洗液 200mlをDEAEカラムに加え、カラム溶出
液と同じく採集した。このDEAE溶出液／洗液は、少くと
もPme I 800,000 単位の活性と1188mg（全蛋白から83％
の精製度）の可溶蛋白が含まれていた。
【００２６】Pme I 活性を有するDEAE溶出液／洗液を、
予め塩化ナトリウム濃度が50mMになるように調整した緩
衝液Ａで平衡させた49mlヘパリン−セファロースカラム
に付した。カラムは塩化ナトリウム濃度が50mMになるよ
うに調整した緩衝液Ａ 250mlで洗浄した。蛋白溶液を、
塩化ナトリウム濃度が50mMから1Mまでの緩衝液Ａ 500ml
で傾斜溶出した。各分画につき、後記するようにしてPm
e I 及びエキソヌクレアーゼ活性を調べた。
予め塩化ナトリウム濃度が50mMになるように調整した緩
衝液Ａで平衡させた49mlヘパリン−セファロースカラム
に付した。カラムは塩化ナトリウム濃度が50mMになるよ
うに調整した緩衝液Ａ 250mlで洗浄した。蛋白溶液を、
塩化ナトリウム濃度が50mMから1Mまでの緩衝液Ａ 500ml
で傾斜溶出した。各分画につき、後記するようにしてPm
e I 及びエキソヌクレアーゼ活性を調べた。
【００２７】傾斜体積約45％の時点で、Pme I 活性を持
つものが溶出してきた。総量20mgの可溶蛋白の中にPme
I 活性物質480,000 単位を有する30mlを集め、塩化ナト
リウム濃度が50mMになるように調整した緩衝液Ｂ（ＫＰ
Ｏ4 20mM、EDTA 0.1mM、2-メルカプトエタノール 6mM、
グリセリン５％、pH 6.7に調整）で透析した。夾雑物で
あるエキソヌクレアーゼ活性を示すピークは、傾斜体積
約37％の時点で溶出してきた。尤もエキソヌクレアーゼ
の混入は、試験した全ての分画で認められた。ヘパリン
−セファロースカラムから集めたPme I は、全蛋白から
の精製度98％に相当する。
つものが溶出してきた。総量20mgの可溶蛋白の中にPme
I 活性物質480,000 単位を有する30mlを集め、塩化ナト
リウム濃度が50mMになるように調整した緩衝液Ｂ（ＫＰ
Ｏ4 20mM、EDTA 0.1mM、2-メルカプトエタノール 6mM、
グリセリン５％、pH 6.7に調整）で透析した。夾雑物で
あるエキソヌクレアーゼ活性を示すピークは、傾斜体積
約37％の時点で溶出してきた。尤もエキソヌクレアーゼ
の混入は、試験した全ての分画で認められた。ヘパリン
−セファロースカラムから集めたPme I は、全蛋白から
の精製度98％に相当する。
【００２８】透析液を塩化ナトリウム濃度が50mMになる
ように調整した緩衝液Ｂで平衡させたWCX 7 um HPLC カ
ラム（Custom LC 社）に付した。このカラムを塩化ナト
リウム濃度が50mMになるように調整した緩衝液Ｂで洗浄
し、Pme I 酵素を塩化ナトリウム濃度が50mMから0.6Mま
での緩衝液Ｂ 50ml で傾斜溶出した。Pme I 活性成分
は、塩化ナトリウム濃度が約0.3Mとなった時点で溶出し
てきた。Pme I 活性にして約384,000 単位のPme I 分４
mlを集めた。夾雑するエンドヌクレアーゼは塩化ナトリ
ウム濃度が約0.22M となった時点で溶出し、さらに夾雑
するエキソヌクレアーゼは塩化ナトリウム濃度が0.25M
及び0.34M となった時点でそれぞれ溶出した。
ように調整した緩衝液Ｂで平衡させたWCX 7 um HPLC カ
ラム（Custom LC 社）に付した。このカラムを塩化ナト
リウム濃度が50mMになるように調整した緩衝液Ｂで洗浄
し、Pme I 酵素を塩化ナトリウム濃度が50mMから0.6Mま
での緩衝液Ｂ 50ml で傾斜溶出した。Pme I 活性成分
は、塩化ナトリウム濃度が約0.3Mとなった時点で溶出し
てきた。Pme I 活性にして約384,000 単位のPme I 分４
mlを集めた。夾雑するエンドヌクレアーゼは塩化ナトリ
ウム濃度が約0.22M となった時点で溶出し、さらに夾雑
するエキソヌクレアーゼは塩化ナトリウム濃度が0.25M
及び0.34M となった時点でそれぞれ溶出した。
【００２９】上記のPme I 分を、塩化ナトリウム濃度が
0.5Mになるように調整した緩衝液Ｃ（トリス塩酸塩20m
M、2-メルカプトエタノール 6mM、EDTA 0.1mM、グリセ
リン10％、pH 7.5に調整）で平衡させた2.5 × 110 cm
G-75型エクスクルージョンカラムに付した。塩化ナトリ
ウム濃度が0.5Mになるように調整した緩衝液Ｃを用い、
G-75カラムから蛋白溶液を溶出した。Pme I 活性成分
は、約250 mlの時点で溶出してきた。Pme I 活性にして
90,000 単位のPme I 分42mlを集め、塩化ナトリウム濃
度が50mMになるように調整した緩衝液Ｂで透析した。エ
キソヌクレアーゼ活性を示す一成分が、280 mlの後に溶
出した。
0.5Mになるように調整した緩衝液Ｃ（トリス塩酸塩20m
M、2-メルカプトエタノール 6mM、EDTA 0.1mM、グリセ
リン10％、pH 7.5に調整）で平衡させた2.5 × 110 cm
G-75型エクスクルージョンカラムに付した。塩化ナトリ
ウム濃度が0.5Mになるように調整した緩衝液Ｃを用い、
G-75カラムから蛋白溶液を溶出した。Pme I 活性成分
は、約250 mlの時点で溶出してきた。Pme I 活性にして
90,000 単位のPme I 分42mlを集め、塩化ナトリウム濃
度が50mMになるように調整した緩衝液Ｂで透析した。エ
キソヌクレアーゼ活性を示す一成分が、280 mlの後に溶
出した。
【００３０】前記の如くして得られた透析液を、塩化ナ
トリウム濃度が50mMになるように調整した緩衝液Ｂでで
平衡させたMono-S FPLC カラム（Pharmacia ）に付し
た。塩化ナトリウムが50mMから0.6Mまでの濃度のもの31
mlにより、蛋白溶液を傾斜溶出した。Pme I 活性成分
は、塩化ナトリウム濃度が約0.16M となった時点で溶出
してきた。一方、夾雑するエキソヌクレアーゼは塩化ナ
トリウム濃度が約0.20M となった時点で溶出した。
トリウム濃度が50mMになるように調整した緩衝液Ｂでで
平衡させたMono-S FPLC カラム（Pharmacia ）に付し
た。塩化ナトリウムが50mMから0.6Mまでの濃度のもの31
mlにより、蛋白溶液を傾斜溶出した。Pme I 活性成分
は、塩化ナトリウム濃度が約0.16M となった時点で溶出
してきた。一方、夾雑するエキソヌクレアーゼは塩化ナ
トリウム濃度が約0.20M となった時点で溶出した。
【００３１】得られたPme I は実質上純粋で、エンドヌ
クレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有しない。安
定剤として牛血清アルブミンを最終濃度200 μｇ／mlま
で加え、貯蔵緩衝液（グリセリン50％、塩化ナトリウム
50mM、トリス塩酸塩20mM、ジチオトレイトール 0.1mM、
pH 7.5に調整）でPme I を透析した。最終的に集められ
たPme I はPme I 活性にして48,000単位を含み、回収率
は６％であった。
クレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有しない。安
定剤として牛血清アルブミンを最終濃度200 μｇ／mlま
で加え、貯蔵緩衝液（グリセリン50％、塩化ナトリウム
50mM、トリス塩酸塩20mM、ジチオトレイトール 0.1mM、
pH 7.5に調整）でPme I を透析した。最終的に集められ
たPme I はPme I 活性にして48,000単位を含み、回収率
は６％であった。
【００３２】§ 活性定量 Pme I 活性：１〜10μｌの試料を、0.5 μｇのλファー
ジＤＮＡを含む１容のNEBuffer IV から成る基質溶液25
μｌに加えた。37℃に５〜60分保ち、反応物をインキュ
ベートした。停止液（グリセリン50％、EDTA pH 8.0 50
mM、ブロモフェノールブルー0.02％）５μｌにより反応
を停止した。反応混合物を0.7 ％寒天ゲルに入れ、電気
泳動させた。得られたバンドを、ＤＮＡ長さ標準と対比
して同定した。
ジＤＮＡを含む１容のNEBuffer IV から成る基質溶液25
μｌに加えた。37℃に５〜60分保ち、反応物をインキュ
ベートした。停止液（グリセリン50％、EDTA pH 8.0 50
mM、ブロモフェノールブルー0.02％）５μｌにより反応
を停止した。反応混合物を0.7 ％寒天ゲルに入れ、電気
泳動させた。得られたバンドを、ＤＮＡ長さ標準と対比
して同定した。
【００３３】エキソヌクレアーゼ活性：蛋白溶液の試料
５μｌを、25μｇ／mlの 3Ｈ−ＤＮＡを含むNEBuffer I
V 50 μｌに加えた。１時間インキュベートして反応さ
せ、溶菌分と非溶菌分とでカウント数を比較した。
５μｌを、25μｇ／mlの 3Ｈ−ＤＮＡを含むNEBuffer I
V 50 μｌに加えた。１時間インキュベートして反応さ
せ、溶菌分と非溶菌分とでカウント数を比較した。
【００３４】活性単位定義：牛血清アルブミン100 μｌ
／mlを加えて全量を50μｌとしたNEBuffer IV 中の1.0
μｇのλＤＮＡを37℃１時間で完全に切断するのに要す
るPme I の量を、Pme I 1 単位と定義する。
／mlを加えて全量を50μｌとしたNEBuffer IV 中の1.0
μｇのλＤＮＡを37℃１時間で完全に切断するのに要す
るPme I の量を、Pme I 1 単位と定義する。
【００３５】最適緩衝条件：Pme I 活性に最適のものは
NEBuffer IV （酢酸カリウム50mM、トリス酢酸塩20mM、
酢酸マグネシウム10mM、ジチオトレイトール1 mMを含む
25℃でpH 7.9のもの）に牛血清アルブミン100 μｇ／ml
を追加したものであった。
NEBuffer IV （酢酸カリウム50mM、トリス酢酸塩20mM、
酢酸マグネシウム10mM、ジチオトレイトール1 mMを含む
25℃でpH 7.9のもの）に牛血清アルブミン100 μｇ／ml
を追加したものであった。
【００３６】実施例２ § Pme I 切断箇所の特定 識別部位との関連でPme I 切断箇所を特定するため、プ
ライマー延長物（primer extension product）を切断
し、同一プライマーから作成した標準ジデオキシ配列決
定反応物と共に電気泳動した。鋳型（template）として
は、プライマーNEB#1201（５′ｄＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ
ＡＣＣＡＴＧ３′）によるpCU19 の初回抗原刺激位置
（priming site）から３′側79塩基対のところにPme I
識別部位があるという理由で、pRM517.122-3を用いた。
ライマー延長物（primer extension product）を切断
し、同一プライマーから作成した標準ジデオキシ配列決
定反応物と共に電気泳動した。鋳型（template）として
は、プライマーNEB#1201（５′ｄＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ
ＡＣＣＡＴＧ３′）によるpCU19 の初回抗原刺激位置
（priming site）から３′側79塩基対のところにPme I
識別部位があるという理由で、pRM517.122-3を用いた。
【００３７】§ 二本鎖鋳型の変性 pRM517.122-3 miniprep によるプラスミド（鋳型）３μ
ｇを、1.5 mlエッペンドルフ管中の総量20μｌのｄＨ2
Ｏに溶かした。2M NaOH 2 μｌ、EDTA 2mMを加え、室温
で５分間溶液をインキュベートした。次いでｄＨ2 Ｏ
（４℃）７μｌ、3M酢酸ナトリウムpH 6.0（４℃）７μ
ｌ及びエタノール（４℃）75μｌを手早く添加した。こ
の溶液を直ちにドライアイス／2-プロパノール浴に15分
間漬けて、ＤＮＡを沈澱させた。エッペンドルフ遠沈管
中で10分間遠心し、ＤＮＡをペレタイズした。上澄液の
95％を吸引除去し、300 μｌの70％EtOH／30％ｄＨ2 Ｏ
を加えて５分間遠心し、上澄液の約95％を吸引除去し
た。得られたペレットは10分間speed-vac 装置に置いて
完全に乾燥させた。
ｇを、1.5 mlエッペンドルフ管中の総量20μｌのｄＨ2
Ｏに溶かした。2M NaOH 2 μｌ、EDTA 2mMを加え、室温
で５分間溶液をインキュベートした。次いでｄＨ2 Ｏ
（４℃）７μｌ、3M酢酸ナトリウムpH 6.0（４℃）７μ
ｌ及びエタノール（４℃）75μｌを手早く添加した。こ
の溶液を直ちにドライアイス／2-プロパノール浴に15分
間漬けて、ＤＮＡを沈澱させた。エッペンドルフ遠沈管
中で10分間遠心し、ＤＮＡをペレタイズした。上澄液の
95％を吸引除去し、300 μｌの70％EtOH／30％ｄＨ2 Ｏ
を加えて５分間遠心し、上澄液の約95％を吸引除去し
た。得られたペレットは10分間speed-vac 装置に置いて
完全に乾燥させた。
【００３８】§ 配列決定反応 乾燥ペレットにｄＨ2 Ｏ13.5μｌ、10容配列決定用緩衝
液（トリス pH 7.6 75mM、DTT 55mM、塩化マグネシウム
50mM）2.25μｌ及び約1.0 μM 濃度のプライマー（NEB#
1201）溶液1.5 μｌを添加した。相補ＤＮＡ鎖合成の端
緒となるプライマーを鋳型一本鎖ＤＮＡにアニーリング
する目的で、この溶液を37℃30分インキュベートした。
800 Ci／ミリモル（10 mCi／ml）の［α-35S］dATP３μ
ｌを加えた。Klenow断片ＤＮＡポリメラーゼ（NEB#210
）1.5 μｌ（7.5 単位）を添加した。この溶液をＴＰ
Ｋ混合物と呼ぶ。
液（トリス pH 7.6 75mM、DTT 55mM、塩化マグネシウム
50mM）2.25μｌ及び約1.0 μM 濃度のプライマー（NEB#
1201）溶液1.5 μｌを添加した。相補ＤＮＡ鎖合成の端
緒となるプライマーを鋳型一本鎖ＤＮＡにアニーリング
する目的で、この溶液を37℃30分インキュベートした。
800 Ci／ミリモル（10 mCi／ml）の［α-35S］dATP３μ
ｌを加えた。Klenow断片ＤＮＡポリメラーゼ（NEB#210
）1.5 μｌ（7.5 単位）を添加した。この溶液をＴＰ
Ｋ混合物と呼ぶ。
【００３９】ＴＰＫ混合物3.2 μｌを、３μｌのＡＣＧ
Ｔ配列決定反応用デオキシ／ジデオキシヌクレオチド反
応混合物（NEB#410 ）に小分けした。残りのＴＰＫ混合
物をジデオキシヌクレオチドを含まないＡ配列反応混合
物９μｌに加え、Pme I 識別部位に跨がる標識ＤＮＡス
トランドを生ぜしめた。反応物を37℃15分インキュベー
トした。dNTP追尾溶液（NEB#410 ）各１μｌをＡＣＧＴ
各反応物に加え、延長反応物にも追尾溶液３μｌを添加
した。反応物をさらに37℃15分インキュベートした。Ａ
ＣＧＴ配列決定反応物に停止液（NEB#410 ）６μｌを添
加し、これを配列決定用ゲルで展開するまでの間、- 20
℃で保存した。
Ｔ配列決定反応用デオキシ／ジデオキシヌクレオチド反
応混合物（NEB#410 ）に小分けした。残りのＴＰＫ混合
物をジデオキシヌクレオチドを含まないＡ配列反応混合
物９μｌに加え、Pme I 識別部位に跨がる標識ＤＮＡス
トランドを生ぜしめた。反応物を37℃15分インキュベー
トした。dNTP追尾溶液（NEB#410 ）各１μｌをＡＣＧＴ
各反応物に加え、延長反応物にも追尾溶液３μｌを添加
した。反応物をさらに37℃15分インキュベートした。Ａ
ＣＧＴ配列決定反応物に停止液（NEB#410 ）６μｌを添
加し、これを配列決定用ゲルで展開するまでの間、- 20
℃で保存した。
【００４０】ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow）不活化のた
め、延長反応物を70℃25分、さらに室温で10分間インキ
ュベートした。延長反応物９μｌを0.5 mlエッペンドル
フ管中に置き、さらに６μｌを別の管に入れた。９μｌ
の方に１μｌ（約１単位）のPme I 酵素を加えた。これ
を撹拌し、うち２μｌを第２の管に移した。酵素消化反
応物を37℃30分インキュベートした。消化に引続き、反
応物４μｌを除き停止液５μｌと混合した。残りの４μ
ｌにはKlenow断片0.25μｌ（1.25単位）を加えて室温で
15分インキュベートしてから、停止液５μｌを加えた。
酵素消化反応物も、電気泳動に付するまで- 20℃で保存
した。
め、延長反応物を70℃25分、さらに室温で10分間インキ
ュベートした。延長反応物９μｌを0.5 mlエッペンドル
フ管中に置き、さらに６μｌを別の管に入れた。９μｌ
の方に１μｌ（約１単位）のPme I 酵素を加えた。これ
を撹拌し、うち２μｌを第２の管に移した。酵素消化反
応物を37℃30分インキュベートした。消化に引続き、反
応物４μｌを除き停止液５μｌと混合した。残りの４μ
ｌにはKlenow断片0.25μｌ（1.25単位）を加えて室温で
15分インキュベートしてから、停止液５μｌを加えた。
酵素消化反応物も、電気泳動に付するまで- 20℃で保存
した。
【００４１】反応結果物を８％ビスアクリルアミド配列
決定用ゲルで電気泳動した。この際、同一プライマーか
ら得た一連の配列決定反応物の横に、延長反応物をPme
I 消化したものを並べて対比した（図１）。
決定用ゲルで電気泳動した。この際、同一プライマーか
ら得た一連の配列決定反応物の横に、延長反応物をPme
I 消化したものを並べて対比した（図１）。
【００４２】延長反応物をPme I 酵素で消化したもの
は、Pme I の識別部位ＧＴＴＴＡＡＡＣの４番目のヌク
レオチドと同じ位置に展開した。Pme I 消化に続きKlen
ow断片処理したものも、同じくPme I の識別部位ＧＴＴ
ＴＡＡＡＣの４番目のヌクレオチドと同じ位置に展開し
た。この結果、Pme I は識別配列５′ＧＴＴＴ／ＡＡＡ
Ｃ３′のうち、４番目のＴと５番目のＡとの間でＤＮＡ
を切り、平滑（非粘着）末端を生ずることが見いだされ
た。
は、Pme I の識別部位ＧＴＴＴＡＡＡＣの４番目のヌク
レオチドと同じ位置に展開した。Pme I 消化に続きKlen
ow断片処理したものも、同じくPme I の識別部位ＧＴＴ
ＴＡＡＡＣの４番目のヌクレオチドと同じ位置に展開し
た。この結果、Pme I は識別配列５′ＧＴＴＴ／ＡＡＡ
Ｃ３′のうち、４番目のＴと５番目のＡとの間でＤＮＡ
を切り、平滑（非粘着）末端を生ずることが見いだされ
た。
【図１】Pme I の切断部位を定めるために用いたＤＮＡ
配列決定ゲルを示す。 凡例 ＋ プライマー延長物をPme I で切断した
後、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow断片）で処理 − プライマー延長物をPme I で切断した後、ＤＮＡ
ポリメラーゼ処理なし Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの列は、標準ジデオキシ配列決定反応の
産物
配列決定ゲルを示す。 凡例 ＋ プライマー延長物をPme I で切断した
後、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow断片）で処理 − プライマー延長物をPme I で切断した後、ＤＮＡ
ポリメラーゼ処理なし Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの列は、標準ジデオキシ配列決定反応の
産物
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年７月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】Pme I の切断部位を定めるために用いたＤＮＡ
配列決定ゲルを示す電気泳動の写真である。 凡例 ＋ プライマー延長物をPme I で切断した
後、ＤＮＡポリメラーゼ(Klenow断片)で処理 − プライマー延長物をPme I で切断した後、ＤＮＡ
ポリメラーゼ処理なし Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの列は、標準ジデオキシ配列決定反応の
産物
配列決定ゲルを示す電気泳動の写真である。 凡例 ＋ プライマー延長物をPme I で切断した
後、ＤＮＡポリメラーゼ(Klenow断片)で処理 − プライマー延長物をPme I で切断した後、ＤＮＡ
ポリメラーゼ処理なし Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの列は、標準ジデオキシ配列決定反応の
産物
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38）
Claims (6)
- 【請求項１】 シュードモナス・メンドシーナ［ATCC#5
5181］から得られ得る実質的に純粋なタイプII制限酵素
であって、二本鎖デオキシリボ核酸分子の下記塩基配
列： ５′−ＧＴＴＴ▽ＡＡＡＣ−３′ ３′−ＣＡＡＡ△ＴＴＴＧ−５′ を識別し、▽△印の位置に切断部位を有する制限酵素。 - 【請求項２】 二本鎖デオキシリボ核酸λＣＩ857 を２
ヵ所で、adeno-2 を１ヵ所でそれぞれ切断する、請求項
１に記載の制限酵素。 - 【請求項３】 シュードモナス・メンドシーナの試料を
前記制限酵素の産生に有利な条件で培養し、次いで前記
酵素をそれから分離する、請求項１に記載のタイプII制
限酵素を得る方法。 - 【請求項４】 前記制限酵素は65℃で20分間インキュベ
ートすると不活化する、請求項１に記載のタイプII制限
酵素。 - 【請求項５】 前記制限酵素はシュードモナス・メンド
シーナ［ATCC#55181］から精製したものである、請求項
１に記載のタイプII制限酵素。 - 【請求項６】 前記制限酵素は当該制限酵素をエンコー
ドするＤＮＡ配列を含む形質転換宿主から精製したもの
である、請求項１に記載のタイプII制限酵素。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US710040 | 1991-06-03 | ||
| US07/710,040 US5196330A (en) | 1991-06-03 | 1991-06-03 | Type ii restriction endonuclease, pme i, obtainable from pseudomonas mendocina and a process for producing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0698768A true JPH0698768A (ja) | 1994-04-12 |
| JP3061222B2 JP3061222B2 (ja) | 2000-07-10 |
Family
ID=24852374
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4158803A Expired - Lifetime JP3061222B2 (ja) | 1991-06-03 | 1992-05-26 | シュードモナス・メンドシーナから得られ得る新規タイプＩＩ制限酵素ＰｍｅＩ及びその製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5196330A (ja) |
| EP (1) | EP0517111B1 (ja) |
| JP (1) | JP3061222B2 (ja) |
| DE (2) | DE69201012T2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5945288A (en) * | 1997-11-24 | 1999-08-31 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the PmeI restriction endonuclease |
| EP1847611B1 (en) * | 2003-10-03 | 2009-09-09 | Promega Corporation | Rhamnose-inducible expression system |
| US8293503B2 (en) | 2003-10-03 | 2012-10-23 | Promega Corporation | Vectors for directional cloning |
| EP2540823A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-01-02 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
| CN102897278B (zh) * | 2011-07-28 | 2014-11-05 | 本田技研工业株式会社 | 电动自行车的电装件配置构造 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc | |
| ATE113653T1 (de) * | 1986-06-06 | 1994-11-15 | New England Biolabs Inc | Verfahren zur klonierung eines restriktionsmodifizierungssystems. |
-
1991
- 1991-06-03 US US07/710,040 patent/US5196330A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-26 JP JP4158803A patent/JP3061222B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-29 DE DE69201012T patent/DE69201012T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-29 DE DE92109085T patent/DE517111T1/de active Pending
- 1992-05-29 EP EP92109085A patent/EP0517111B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69201012T2 (de) | 1995-06-29 |
| US5196330A (en) | 1993-03-23 |
| DE517111T1 (de) | 1993-11-25 |
| DE69201012D1 (de) | 1995-02-09 |
| EP0517111A1 (en) | 1992-12-09 |
| JP3061222B2 (ja) | 2000-07-10 |
| EP0517111B1 (en) | 1994-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6423338B2 (ja) | Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ複合体によるＲＮＡ指向性ＤＮＡ切断 | |
| CA3129158A1 (en) | Adenosine deaminase base editors and methods of using same to modify a nucleobase in a target sequence | |
| CA3128876A1 (en) | Methods of editing a disease-associated gene using adenosine deaminase base editors, including for the treatment of genetic disease | |
| JP3040544B2 (ja) | シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）から得ることができる新規なタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼとその製法 | |
| Arber | Restriction endonucleases | |
| US6168918B1 (en) | Method of detecting foreign DNA integrated in eukaryotic chromosomes | |
| US5192676A (en) | Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same | |
| Mayer et al. | Restriction endonucleases: general survey procedure and survey of gliding bacteria | |
| JP3061222B2 (ja) | シュードモナス・メンドシーナから得られ得る新規タイプＩＩ制限酵素ＰｍｅＩ及びその製造法 | |
| JP3064065B2 (ja) | ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 | |
| US6238904B1 (en) | Type II restriction endonuclease, HpyCH4III, obtainable from Helicobacter pylori CH4 and a process for producing the same | |
| Golz et al. | Improved large-scale preparation of phage T4 endonuclease VII overexpressed in E. coli | |
| US5310664A (en) | Site specific double stranded DNA endonuclease | |
| JPH04211378A (ja) | ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼのクローニングおよび製造方法 | |
| DE69424592T2 (de) | Verfahren zur Klonierung und zur Herstellung der Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase BglII | |
| JPH029373A (ja) | ＡｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼとメチラーゼの製造方法 | |
| EP0539160B1 (en) | A type II restriction endonuclease, Apo I, obtainable from Arthrobacter protophormiae and a process for producing the same | |
| US6238901B1 (en) | Type II restriction endonuclease, HPY 188 III, obtainable from Helicobacter pylori J188 and a process for producing the same | |
| US6280992B1 (en) | Type II restriction endonuclease, Hpy99I, obtainable from Helicobacter pylori J99 and a process for producing the same | |
| US6258583B1 (en) | Type II restriction endonuclease, Hpy188I, obtainable from helicobacter pylori J188 and a process for producing the same | |
| DE69426608T2 (de) | Methode zur Analyse und Manipulation von DNA mit Hilfe der Reparatursystemebei fehelerhaften Basenpaarungen | |
| US6194188B1 (en) | Type II restriction endonuclease, HpyCH4IV, obtainable from Helicobacter pylori CH4 and a process for producing the same | |
| JP2777947B2 (ja) | Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法 | |
| Hale | Characterization of gene 46 and gene 47 proteins from bacteriophage T4 and characterization of the RAD51 protein from Saccharomyces cerevisiae | |
| Yarrow | Isolation and characterization of site-specific endonucleases from oral bacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080428 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090428 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100428 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100428 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110428 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120428 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130428 Year of fee payment: 13 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130428 Year of fee payment: 13 |