JPH0692439B2 - インタ−ロイキン２レセプタ−及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明はインターロイキン２レセプター（以下「IL−
2R」と記す）及びその製造法に関し、詳しくは、細胞表
層より離脱している可溶性IL−2R及びその製造法に関す
る。本発明のIL−2Rは過剰免疫による疾病等の治療薬と
して使用できる可能性が大きい。

〔従来の技術〕

IL−2Rは、ヒト成人Ｔ−細胞白血病株（ATL）又はヒト
成人Ｔ−細胞白血病ウィスルにより形質転換されたＴ−
細胞の表層に存在するTac抗原として見い出され（J.Ex
p.Med.,158,1332−1337（1983）,Nature311,631−635
（1984））、Ｔ−細胞表層においてIL−２を受容し、ひ
いてはＴ−細胞を増殖せしめる役割をしている。

本発明者らは先に、IL−2Rをコードする遺伝子をCOS細
胞の発現ベクターpKCRH2プラスミドに組込み、COS−７
細胞を形質転換したところ、COS細胞表層にTac抗原、即
ちIL−2Rを検出した（Nature,311,No.5987,631−635（1
984））。pKCRH2プラスミドに挿入されたDNAインサート
の全塩基配列が決定され、コーディングが推定されてい
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

IL−2Rは上に述べたように、IL−２を補捉する作用を有
するのであるが、従来IL−2Rは細胞表層に結合して生成
されるので、患者に投与することができなかた。従って
この発明の目的は、細胞表層より離脱して遊離している
IL−2R及びその製造方法を見い出すことにある。

〔問題点を解決するための手段〕

叙上の問題点を解決するため本発明者らは鋭意研究の結
果、プロモータ配列の下流に発現可能なように配置され
ている下記のポリペプチドをコードする遺伝子（「IL−
2R遺伝子」と記す）を有し、宿主細胞内で増殖できるベ
クターDNAを所持するＬ細胞を培養することにより、細
胞表層より離脱しているIL−2R結合能を保持する分泌型
インターロイキン２レセプターを生成せしめることに成
功した。

ＸはMetをＮ−末端に有するシグナルペプチド。

尚、上記塩基配列は、上記ポリペプチドをコードする遺
伝子の一例である。

又、これによってIL−2Rを得ることに成功した。

IL−2R遺伝子をプロモーター配列の下流に発現可能なよ
うに配置するには、Ｌ細胞の場合、この細胞内で発現可
能なヘクター例えばプラスミドpKCRH2（Nature,307,604
−608（1984））のSV40初期遺伝子プロモーターの下流
にIL−2R遺伝子を配置する。Ｌ細胞の場合、開始コドン
となるMetと下記に例示するようなシグナルペプチドを
Ｘとして配置した方がよい。

具体的にはpKCR・Tac−２・Ａプラスミド（Nature,311,
631−635（1984））のIL−2RcDNAのAat II制限酵素部位
に、５′端をリン酸化した第１図に示す合成DNA（ａ）
を挿入することによりIL−2R遺伝子のスレオニンコドン
のすぐ後に終止コドンTAGを配置する。かくしてSV40初
期遺伝子プロモーターの下流に開始コドンATG、シグナ
ルペプチドをコードする遺伝子そして分泌型IL−2Rペプ
チドをコードする遺伝子を配置したpKCRIL2R BTMLESSが
構築できる（第１図参照）。

IL−2R遺伝子を有するベクターDNAを用いて宿主細胞を
形質転換するには、以下に示す通常よく用いられる形質
転換法がある。宿主細胞がＬ細胞の場合、DNAをリン酸
カルシウム沈澱として感染させる方法、マイクロインジ
ェクション法、赤血球細胞あるいはリボソームにプラス
ミドを包括して挿入する方法、リゾフォスファチジルコ
リンのような試薬による細胞の処理法、あるいはウィル
スベクターを用いる方法などがある。

形質転換後反応液中にMgCl₂またはRbClを共存させれば
形質転換効率は向上する。また宿主細胞のプロトプラス
トを調製後形質転換させることも可能である。

IL−2R遺伝子を組み込んで形質転換したマウスＬ細胞よ
りIL−2R蛋白を製造する方法は一般的に行なわれている
付着細胞の培養方法に従えばよい。即ち、５％炭酸ガス
通気中、ファルコン3024,3028フラスコ（Falcon Labwar
e,Div.Becton,Dickinson and Co.）のような組織培養フ
ラスコを使用し、培養することができる。また、ファル
コン3027のようなローラーフラスコを用いることもでき
る。培地は通常組織培養で用いられている合成培地でよ
い。例えば、ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）,RPM
I1640培地などがある。これらの培地を実際使用する場
合は、10％ウシ胎児血清アルブミン,100単位/mlのペニ
シリン,1000μg/mlのストレプトマイシン,2g/lのNaHCO₃
を添加することが望ましい。当該マウスＬ細胞を用い培
養することによって生産されるIL−2R蛋白量は経時的に
変化する。効率よくIL−2R蛋白を生産するには以下の方
法に従って行えばよい。即ち、10％のFCSを含むDMEM培
地（100U/mlペニシリン,100μg/mlストレプトマイシン,
2g/lNaHCO₃含有）を用い、細胞密度１×10⁵/mlで培養を
開始し、４〜５日後に細胞が稠密になったら培養上清を
回収し、さらに新鮮培地を添加し、３〜４日培養を続行
する。培養終了後、培地を回収してIL−2R蛋白の生産量
を定量すると、前半及び後半の培養でほぼ同量のIL−2R
蛋白が生産されていることが明らかとなった。

この様にして得られた当該マウスＬ細胞の培養上清より
IL−2RはIL−２を固定化したカラム，例えばIL−２セフ
ァローズ4BあるいはIL−２−Affi−ゲルを用いたアフィ
ニティクロマトグラフィーで精製することができる。更
に高純度に分離精製するには、ODSカラム（Octa decyle
silane）を用いた逆相HPLC（高速液体クロマトグラフ
ィー）を用いて行えばよい。これらの方法を用いて精製
された単一分子のIL−2R蛋白は以下の性質を有する。

（１）分子量43−40Kd（SDS−PAGE） （２）pI5.2〜4.4 （３）Ｎ末端アミノ酸構造 Glu−Leu−Cys−Asp−Asp−Asp−Pro−Pro−Glu−Ile− となり、Ｎ末端アミノ酸の一次構造はIL−2R遺伝子の塩
基配列から予想されるアミノ酸構造と全く一致した。

実施例１ 第１図に示すように、（１）IL−2RcDNAをSV40初期遺伝
子のプロモーターを含むベクターpKCRH2に組み込んだプ
ラスミドpKCR・Tac−２・Ａ（Nature,311,631−635（19
84））６μｇを制限酵素Aat IIで部分分解し、約6.5キ
ロベース（kb）の直鎖状プラスミドの断片をアガロース
ゲル電気泳動により分離回収した。回収された該断片は
１μｇであった。該断片を制限酵素BamHIで分解し、ア
ガロース電気泳動により0.35μｇの5.4kb断片と0.07μ
ｇの1.1kb断片を分離回収した。⁵′GAGATCTCACGT³′の
配列をもつオリゴヌクレオチドをDNA自動合成機（アプ
ライド・バイオシステム社製380A型）により合成し、逆
相HPLCにて精製後、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより
５′側をリン酸化した。5.4kb断片および1.1kb断片各々
0.04ピコモルと上記12個の配列をもつオリゴヌクレオチ
ド0.16ピコモルを10μｌの反応液中で15℃１時間、その
後100μｌに希釈し、さらに15℃にて12時間T4DNAリガー
ゼにより結合せしめた。

（２）この反応液10μｌを用い常法によりエシェリヒア
・コリHB101を形質転換せしめ、約250個のアンピシリン
抵抗性株を得た。この中から任意に12個を選び、そのプ
ラスミドDNAを抽出し、プラスミドの大きさが約6.5kb
であること、制限酵素Aat II切断部分が一つになって
いること、12個のオリゴヌクレオチドに由来する制限
酵素Bg1 II切断部位がもとの制限酵素Aat II切断部位に
存在すること、の３点を満足するプラスミドで形質転換
された形質転換株を５株得た。該形質転換株中のプラス
ミドの塩基配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Pr
oc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463（1977））により調
べ第１図pKCRIL2R BTMLESSの塩基配列をもつことを確認
した。

（３）この様にして得た形質転換株からpKCRIL2R BTMLE
SSプラスミドを塩化セシウム平衡遠心法により精製し、
該精製プラスミドを以下の方法によりマウスＬ細胞（tk
^-変異株）（以下Ｌ細胞と記す。）に感染せしめた。す
なわち10％牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地
（DMEM）10mlに懸濁したＬ細胞１×10⁵個をファルコン3
003シャーレに入れ、37℃で５％炭酸ガスインキュベー
ター内にて20時間培養した。その後、同培地10mlにて培
地交換し、同条件で４時間培養した。培養後、Ａ液（50
mM Hepes −280mM NaCl1.5mMリン酸ナトリウム緩衝液、
pH7.22）0.5mlとＢ液（2M CaCl₂−10μg pKCRIR2R BTML
ESS−１μgpBR322−herpes Tk）0.5mlを添加し、37℃で
５％炭酸ガスインキュベーター内にて12時間培養した。
TBS（0.137M NaCl−0.05M KCl−5.6mM Na_Z HPO₄−250m
Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5））で洗浄し、2.5％グリセ
ロール含有TBS溶液にて３分間処理した。処理後直ちにT
BSで洗浄し、10％牛胎児血清含有DMEM10mlを加え37℃で
５％炭酸ガスインキュベーター内にて２日間培養した。
その後、HAT培地（13.6mg/lヒポキサンチン、3.88mg/l
チミジン、0.176mg/lアミノプテリンおよび10％牛胎児
血清含有DMEM）10mlに培地交換し、37℃で５％炭酸ガス
インキュベーター内にて２日間培養した。この培地交換
を以後２日毎に行なった。14日目にはシャーレ当り12個
のコロニーが出現した。その様にして出現した各コロニ
ーを96穴マイクロプレートに移し、37℃で５％炭酸ガス
インキュベーター内にて培養し、稠密になったらさらに
２日間培養した。各コロニーの培養上清中の分泌型IL−
2Rを以下に述べる方法により同定した。その結果、分泌
型IL−2R産生細胞BTMLESS−ＪおよびBTMLESS−Ｑを得
た。

多数のIL−2Rを膜表面に表現しているATL由来細胞株MT
−１細胞は抗IL−2Rモノクローナル抗体（抗Tac抗体）
と補体で処理すると殺すことができる。そこで分泌型IL
−2R含有標本と抗体とを反応させ、この後MT−１細胞を
加えさらに補体で処理する。もしこの標本中に分泌型IL
−2Rが存在すれば抗体と結合し、MT−１細胞と反応する
抗体が減少し、その結果MT−１細胞は補体で処理しても
死ななくなる。この原理によりごく微量（約0.1ng）の
分泌型IL−2Rを同定することができる。具体的な分泌型
IL−2Rの同定方法は、まず96穴Ｖ底マイクロプレート中
で標品10μｌまたはこれを10％牛胎児血清含有RPMI 164
0培地で希釈したもの10μｌと同培地に溶解した1.6ng抗
Tac抗体溶液10μｌをよく混合し０℃で30分間放置す
る。そして上記培地に懸濁した５×10⁵個/mlのMT−１細
胞20μｌを加え、混合後０℃で30分間放置する。800rpm
5分間遠心し、上清を捨て補体（ウサギ新生児血清を10
％牛胎児血清含有RPMI1640培地で15倍希釈したもの）20
μｌを加え、混合後37℃で30分間放置する。そして0.5
％トリパンブルー含有PBS溶液20μｌを加え、200細胞中
の死細胞数を計測する方法である。

（４）この様にして産生した分泌型IL−2Rは−20℃にて
凍結保存することができ、また限外濾過（例えばセント
リコン10）により濃縮してもその性状は変わらない。さ
らにIL−2Rカラムに結合させることができる。即ち、セ
ントリコン10にて10倍濃縮した標品100μｌをIL−２−
セファデックス4B（IL−２を200μｇ含有）カラムに吸
着せしめ、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH3.0）で
溶出すると分泌型IL−2Rが溶出されてくるため、この溶
出画分を直ちに1Mトリスベースにて中和する。かくして
得られた分泌型IL−2RはMT−１細胞の抗Tac抗体と補体
による殺作用効果を阻害した。

実施例２ IL−2R蛋白を含む当該マウスＬ細胞の培養上清をアミコ
ンホローファイバーで10倍濃縮し、IL−２−セファロー
ズ4Bカラムクロマトグラフィーにより他の夾雑蛋白と分
離した。即ち、当該マウスＬ細胞を10％FCSを含むDMEM
培地（100U/mlペニシリン,100μg/mlストレプトマイシ
ン,2g/l NaHCO₃）でファルコン3027ローラーボトルを用
いて培養し、培養上清15lを得た。この上清をアミコン
ホローファイバー（分子量１万カット）で10倍濃縮し15
00mlとし、容量1mlのIL−２セファローズ4Bカラム（ゲ
ル1ml当りIL−2 1.9mgを結合）に展開した。試料展開
後、10mlのPBSでカラムを充分洗浄し、さらにカラム溶
量と等量の蒸留水で洗浄した。0.1M酢酸（pH3.1）によ
りIL−２セファローズ4BカラムからIL−2R蛋白を溶出し
た。本操作によりIL−2Rは１万５千倍程度精製され、又
回収率は75％となった。さらに、IL−２セファローズ4B
カラムの溶出画分をODSカラム（山村科学,4mm×60mm）
を用いた逆相HPLCにより高純度に精製した。IL−２セフ
ァローズ4Bカラム溶出画分4mlを0.1mlトリフルオロ酢酸
（pH2.0）で平衡化したODSカラムに添加し、吸着蛋白を
流速0.5ml/min.で０〜80％のアセトニトリルの直線濃度
勾配により溶出した。IL−2Rは38〜40％のアセトニトリ
ルで溶出された。以上の精製方法により、培養上清15l
より最終的に３万５千倍に、又回収率50％でIL−2R分子
を分離精製することができた。

〔分泌型IL−2Rの分子量〕 HPLC後のIL−2R標品を用いて本標品の純度検定及び分子
量をSDS−PAGEにより検討した。0.1％SDSを含む10％ポ
リアクリルアミドゲルに試料を添加し、電気泳動を行な
った結果、分子量40kdから43kdに相当する位置にシング
ルバンドを与えた。尚、標準蛋白質としては、ウシ血清
アルブミン，卵白アルブミン，キモトリプシノーゲン，
タイズ豆トリプシンインヒビターを用いた。

〔pI〕

精製IL−2R標品を用いてpIを測定した。25mM Bis−Tris
−Iminodiacetic Acid（pH7.0）で平衡化したMonoPカラ
ム（Fharmacia Fine Chemicals,スウェーデン）に添加
し、ポリバッファー74−Iminodiacetic Acid（pH4.0）
で溶出した。pH5.2〜4.4の範囲にIL−2Rは溶出され、等
電点が5.2〜4.4であることが明らかとなった。

〔分泌型IL−2R分子のＮ末端構造〕 分泌型IL−2R蛋白のアミノ酸配列を決定するために精製
IL−2Rをプロテインシークエンサー（Applied Biosyste
m Co,.）に導入した。アミノ酸配列の決定方法はJ.Bio
l.Chem.193,265−275（1951）に記載されている方法に
従った。

IL−2R蛋白は以下に示すＮ末端構造を示す分子からなる
ことが明らかとなった。

Glu−Leu−Cys−Asp−Asp−Asp−Pro−Pro−Glu−Ile− 本構造はIL−2R遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ
酸構造と全く一致した。

〔作用〕

この発明によれば、IL−２を捕捉して不活性化すること
により過剰免疫による疾病等を治癒することができると
ころの、細胞表層より離脱しているIL−2Rを構造するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pKCRIL2RBTMLESSの造成経過説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/12 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の性質を有し、IL−２結合能を保持す
   る分泌型インターロイキン２レセプター。 （ａ）分子量:40から43Kd （ｂ）pI5.2から4.4 （ｃ）下記の配列からなるアミノ酸配列 Glu−Leu−Cys−Asp−Asp−Asp−Pro−Pro−Glu−Ile−
   Pro−His−Ala−Thr−Phe−Lys−Ala−Met−Ala−Tyr−
   Lys−Glu−Gly−Thr−Met−Leu−Asn−Cys−Glu−Cys−
   Lys−Arg−Gly−Phe−Arg−Arg−Ile−Lys−Ser−Gly−
   Ser−Leu−Tyr−Met−Leu−Cys−Thr−Gly−Asn−Ser−
   Ser−His−Ser−Ser−Trp−Asp−Asn−Gln−Cys−Gln−
   Cys−Thr−Ser−Ser−Ala−Thr−Arg−Asn−Thr−Thr−
   Lys−Gln−Val−Thr−Pro−Gln−Pro−Glu−Glu−Gln−
   Lys−Glu−Arg−Lys−Thr−Thr−Glu−Met−Gln−Ser−
   Pro−Met−Gln−Pro−Val−Asp−Gln−Ala−Ser−Leu−
   Pro−Gly−His−Cys−Arg−Glu−Pro−Pro−Pro−Trp−
   Glu−Asn−Glu−Ala−Thr−Glu−Arg−Ile−Tyr−His−
   Phe−Val−Val−Gly−Gln−Met−Val−Tyr−Tyr−Gln−
   Cys−Val−Gln−Gly−Tyr−Arg−Ala−Leu−His−Arg−
   Gly−Pro−Ala−Glu−Ser−Val−Cys−Lys−Met−Thr−
   His−Gly−Lys−Thr−Arg−Trp−Thr−Gln−Pro−Gln−
   Leu−Ile−Cys−Thr−Gly−Glu−Met−Glu−Thr−Ser−
   Gln−Phe−Pro−Gly−Glu−Glu−Lys−Pro−Gln−Ala−
   Ser−Pro−Glu−Gly−Arg−Pro−Glu−Ser−Glu−Thr−
   Ser−Cys−Leu−Val−Thr−Thr−Thr−Asp−Phe−Gln−
   Ile−Gln−Thr−Glu−Met−Ala−Ala−Thr−Met−Glu−
   Thr
2. 【請求項２】プロモーター配列の下流に発現可能なよう
   に配列されている下記のポリペプチドをコードする遺伝
   子及びその遺伝子の３′−末端のスレオニンコドンの直
   後に終止コドンを有する宿主細胞内で増殖できるベクタ
   ーDNAを所持するＬ細胞を培養し、細胞表層より離脱し
   ているIL−２結合能を保持する分泌型インターロイキン
   ２レセプターを生成せしめることを特徴とするIL−２結
   合能を保持する分泌型インターロイキン２レセプターの
   製造法。 Ｘ−Glu−Leu−Cys−Asp−Asp−Asp−Pro−Pro−Glu−I
   le−Pro−His−Ala−Thr−Phe−Lys−Ala−Met−Ala−T
   yr−Lys−Glu−Gly−Thr−Met−Leu−Asn−Cys−Glu−C
   ys−Lys−Arg−Gly−Phe−Arg−Arg−Ile−Lys−Ser−G
   ly−Ser−Leu−Tyr−Met−Leu−Cys−Thr−Gly−Asn−S
   er−Ser−His−Ser−Ser−Trp−Asp−Asn−Gln−Cys−G
   ln−Cys−Thr−Ser−Ser−Ala−Thr−Arg−Asn−Thr−T
   hr−Lys−Gln−Val−Thr−Pro−Gln−Pro−Glu−Glu−G
   ln−Lys−Glu−Arg−Lys−Thr−Thr−Glu−Met−Gln−S
   er−Pro−Met−Gln−Pro−Val−Asp−Gln−Ala−Ser−L
   eu−Pro−Gly−His−Cys−Arg−Glu−Pro−Pro−Pro−T
   rp−Glu−Asn−Glu−Ala−Thr−Glu−Arg−Ile−Tyr−H
   is−Phe−Val−Val−Gly−Gln−Met−Val−Tyr−Tyr−G
   ln−Cys−Val−Gln−Gly−Tyr−Arg−Ala−Leu−His−A
   rg−Gly−Pro−Ala−Glu−Ser−Val−Cys−Lys−Met−T
   hr−His−Gly−Lys−Thr−Arg−Trp−Thr−Gln−Pro−G
   ln−Leu−Ile−Cys−Thr−Gly−Glu−Met−Glu−Thr−S
   er−Gln−Phe−Pro−Gly−Glu−Glu−Lys−Pro−Gln−A
   la−Ser−Pro−Glu−Gly−Arg−Pro−Glu−Ser−Glu−T
   hr−Ser−Cys−Leu−Val−Thr−Thr−Thr−Asp−Phe−G
   ln−Ile−Gln−Thr−Glu−Met−Ala−Ala−Thr−Met−G
   lu−Thr ＸはMetをＮ−末端に有するシグナルペプチド。