JPH0691815B2 - 免疫抑制剤を生産する新規な培養菌株 - Google Patents
免疫抑制剤を生産する新規な培養菌株Info
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- JPH0691815B2 JPH0691815B2 JP1191580A JP19158089A JPH0691815B2 JP H0691815 B2 JPH0691815 B2 JP H0691815B2 JP 1191580 A JP1191580 A JP 1191580A JP 19158089 A JP19158089 A JP 19158089A JP H0691815 B2 JPH0691815 B2 JP H0691815B2
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- agar
- demethomycin
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/045—Actinoplanes
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 この発明は新規な免疫抑制剤「デメトマイシン（demeth
omycin）」（Ｌ−682,993;31−デスメトキシ−31−ヒド
ロキシ−Ｌ−679,934とも称する） 及び「デメチムノマイシン（demethimmunomycin）」
（Ｌ−683,742;31−デスメトキシ−31−ヒドロキシ−Ｌ
−683,590とも称する） を生産することができる新規な微生物アクチノプラナセ
ート・エスピー（Actinoplanacetesp.）、（MA 6559）A
TCC No.53771に関する。免疫抑制剤はＬ−679,934又は
Ｌ−683,950のそれぞれのC31メトキシ基を脱メチルする
条件下で微生物をＬ−679,934又はＬ−683,950と共に培
養することにより生産される。
omycin）」（Ｌ−682,993;31−デスメトキシ−31−ヒド
ロキシ−Ｌ−679,934とも称する） 及び「デメチムノマイシン（demethimmunomycin）」
（Ｌ−683,742;31−デスメトキシ−31−ヒドロキシ−Ｌ
−683,590とも称する） を生産することができる新規な微生物アクチノプラナセ
ート・エスピー（Actinoplanacetesp.）、（MA 6559）A
TCC No.53771に関する。免疫抑制剤はＬ−679,934又は
Ｌ−683,950のそれぞれのC31メトキシ基を脱メチルする
条件下で微生物をＬ−679,934又はＬ−683,950と共に培
養することにより生産される。
1983年、米国FDAは臓器移植外科領域に大転換をもたら
した極めて有効な抗拒否反応薬であるサイクロスポリン
を認可した。この薬品は体の免疫系が移植臓器の外来蛋
白質を拒否する著しく蓄積した自然の保護剤を作動する
のを阻害することにより作用する。
した極めて有効な抗拒否反応薬であるサイクロスポリン
を認可した。この薬品は体の免疫系が移植臓器の外来蛋
白質を拒否する著しく蓄積した自然の保護剤を作動する
のを阻害することにより作用する。
この薬品は臓器移植拒否反応に対する抗争に有効である
が、多くの場合極めて重篤になる可能性のある腎不全、
肝障害及び潰瘍を起こす欠点を持っている。
が、多くの場合極めて重篤になる可能性のある腎不全、
肝障害及び潰瘍を起こす欠点を持っている。
フジサワ（Fujisawa）に対する欧州特許公開第0184162
号はサイクロスポリンより100倍有効と言われる新規な
マクロライド免疫抑制剤FK−506を記述しており、この
文献を先行例に組み入れる。このマクロライドはストレ
プトマイセス・ツクバエンシス（Streptomyces tsukuba
ensis）の特別の株の発酵により生産される。又エス・
ハイグロスコピクス・サブスプ・ヤクシマエンシス（S.
hygroscopicus subsp.yakushimaensis）により生産され
る密接に関連するマクロライド免疫抑制剤FK−520につ
いても記述されている。
号はサイクロスポリンより100倍有効と言われる新規な
マクロライド免疫抑制剤FK−506を記述しており、この
文献を先行例に組み入れる。このマクロライドはストレ
プトマイセス・ツクバエンシス（Streptomyces tsukuba
ensis）の特別の株の発酵により生産される。又エス・
ハイグロスコピクス・サブスプ・ヤクシマエンシス（S.
hygroscopicus subsp.yakushimaensis）により生産され
る密接に関連するマクロライド免疫抑制剤FK−520につ
いても記述されている。
ティー・アライ（T.Arai）に対する米国特許第3,244,59
2号は抗カビ性の「アスコマイシン（ascomycin）」を生
産するストレプトマイセス・ハイグロスコピクス・バー
ル・アスコマイセティクス（Streptomyces hygroscopic
us var ascomyceticus）の培養を記述している。
2号は抗カビ性の「アスコマイシン（ascomycin）」を生
産するストレプトマイセス・ハイグロスコピクス・バー
ル・アスコマイセティクス（Streptomyces hygroscopic
us var ascomyceticus）の培養を記述している。
しかしながら、これまでのところサイクロスポリンの副
作用のほとんどない任意の免疫抑制剤の生産について記
述した文献はない。
作用のほとんどない任意の免疫抑制剤の生産について記
述した文献はない。
より新しい副作用の少ないより安全な薬品の研究がこの
分野で絶えずなされている。
分野で絶えずなされている。
新規な免疫抑制剤「デメトマイシン」及び「デメチムノ
マイシン」は微生物アクチノプラナセート・エスピー、
ATCC No.53771をマクロライド免疫抑制剤Ｌ−679,934又
はＬ−683,590と共に窒素源を含む水性炭水化物培地中
で深部好気的条件下で発酵させることにより得られ、前
記条件は約pH7で実施され、Ｌ−679,934あるいはＬ−68
3,590をそれらのＣ−31位において選択的に脱メチル化
することができる。
マイシン」は微生物アクチノプラナセート・エスピー、
ATCC No.53771をマクロライド免疫抑制剤Ｌ−679,934又
はＬ−683,590と共に窒素源を含む水性炭水化物培地中
で深部好気的条件下で発酵させることにより得られ、前
記条件は約pH7で実施され、Ｌ−679,934あるいはＬ−68
3,590をそれらのＣ−31位において選択的に脱メチル化
することができる。
生成する「デメトマイシン」及び「デメチムノマイシ
ン」は免疫抑制活性、すなわちカルシウム・イオノホア
（イオノマイシン（ionomycin））及びホルボール・ミ
リステート・アセテート（phorbol myristate acetat
e）（PMA）誘導Ｔ細胞刺激アッセイ（検定）により実証
されるようにＴ細胞活性化の明確な阻害を示し、前記検
定はここでは「Ｔ細胞増殖検定」と称する。
ン」は免疫抑制活性、すなわちカルシウム・イオノホア
（イオノマイシン（ionomycin））及びホルボール・ミ
リステート・アセテート（phorbol myristate acetat
e）（PMA）誘導Ｔ細胞刺激アッセイ（検定）により実証
されるようにＴ細胞活性化の明確な阻害を示し、前記検
定はここでは「Ｔ細胞増殖検定」と称する。
この検定の原理はイオノマイシン及びPMAの組合せによ
り刺激されるマウスのＴリンパ球の増殖を測定すること
である。この検定で陽性の試料はＴ細胞増殖を阻害し、
これはトリチウム化チミジン取込みの減少により示され
る。
り刺激されるマウスのＴリンパ球の増殖を測定すること
である。この検定で陽性の試料はＴ細胞増殖を阻害し、
これはトリチウム化チミジン取込みの減少により示され
る。
この発明によりアクチノプラナセート・エスピー、MA65
59、ATCC No.53771の生物学的に純粋なカルチャー（cul
ture）が提供される。
59、ATCC No.53771の生物学的に純粋なカルチャー（cul
ture）が提供される。
本発明は微生物アクチノプラナセート・エスピー、MA65
59、ATCC No.53771の生物学的に純粋な培養を含む。こ
の微生物は現在メリーランド（Maryland）、ロックビル
（Rockville）、パークローン・ドライブ（Parklawn Dr
ive）12301に所在するアメリカン・タイプ・カラチャー
・コレクション（American Type Culture Collection）
にATCC No.53771として、及びニュー・ジャージー（Ne
w Jersey）、ローウェー（Rahway）に所在するメルク・
カルチャー・コレクション（Merck Culture Collectio
n）にMA6559として制限された寄託がなされている。物
理学的特徴と形態学的、培養的、生物学的及び生理学的
特徴を含む分類学的特徴を以下に要約して記述する。
59、ATCC No.53771の生物学的に純粋な培養を含む。こ
の微生物は現在メリーランド（Maryland）、ロックビル
（Rockville）、パークローン・ドライブ（Parklawn Dr
ive）12301に所在するアメリカン・タイプ・カラチャー
・コレクション（American Type Culture Collection）
にATCC No.53771として、及びニュー・ジャージー（Ne
w Jersey）、ローウェー（Rahway）に所在するメルク・
カルチャー・コレクション（Merck Culture Collectio
n）にMA6559として制限された寄託がなされている。物
理学的特徴と形態学的、培養的、生物学的及び生理学的
特徴を含む分類学的特徴を以下に要約して記述する。
これまでになされた分類学的分析に基づいて、この培養
は仮にアクチノミセターレス（Actinomycetales）目と
アクチノプラナセア（Actinoplanacea）科に分類され
た。この微生物の属と種を最終的に決定するため、更に
分類学的特徴が試験されている。
は仮にアクチノミセターレス（Actinomycetales）目と
アクチノプラナセア（Actinoplanacea）科に分類され
た。この微生物の属と種を最終的に決定するため、更に
分類学的特徴が試験されている。
この培養はトリプティケース・ソイ（trypticase soy）
寒天（28゜及び37℃）及び酵母麦芽エキス寒天、グリセ
リンアスパラギン寒天、無機塩スターチ寒天、オートミ
ール寒天、ツァペック・ドックス（Czapek Dox）、溶液
及びペプトン寒天及びベネット（Bennett）寒天を含む
通常の培地ですべて28℃でよく増殖する。
寒天（28゜及び37℃）及び酵母麦芽エキス寒天、グリセ
リンアスパラギン寒天、無機塩スターチ寒天、オートミ
ール寒天、ツァペック・ドックス（Czapek Dox）、溶液
及びペプトン寒天及びベネット（Bennett）寒天を含む
通常の培地ですべて28℃でよく増殖する。
形態 この培養は直径0.2〜0.4ミクロンの分岐した糸状菌糸体
として増殖する。コロニーは不透明で盛り上がり、不斉
歯牙状の縁を有する。コロニーの組織は酵母麦芽エキス
寒天上ではゴム状であるが、他の培地上ではバター状に
なる傾向があり、この場合著しい菌糸の分断が認められ
る。コロニーの表面は外観が粉状になる傾向がある。拡
散性色素は認められなかった。
として増殖する。コロニーは不透明で盛り上がり、不斉
歯牙状の縁を有する。コロニーの組織は酵母麦芽エキス
寒天上ではゴム状であるが、他の培地上ではバター状に
なる傾向があり、この場合著しい菌糸の分断が認められ
る。コロニーの表面は外観が粉状になる傾向がある。拡
散性色素は認められなかった。
胞子嚢 大部分は球状であり、その直径は４〜25ミクロンであ
る。胞子嚢は一般にグリセリンアスパラギン寒天上で21
日培養で認めることができ、合体する傾向がある。胞子
は鈍端の棒状（0.76×1.98ミクロン）であり、非運動性
であり、長さが150ミクロンに達する長い分岐のない鎖
となる。
る。胞子嚢は一般にグリセリンアスパラギン寒天上で21
日培養で認めることができ、合体する傾向がある。胞子
は鈍端の棒状（0.76×1.98ミクロン）であり、非運動性
であり、長さが150ミクロンに達する長い分岐のない鎖
となる。
MA6559の培養的特徴 酵母エキス−麦芽エキス寒天（ISP Medium2） 栄養菌糸は透明ないし黄色であり、気菌糸は24〜72時間
に出現し、淡黄色ないし淡紅色で粉状の外観である。裏
面は黄褐色ないし赤褐色である。
に出現し、淡黄色ないし淡紅色で粉状の外観である。裏
面は黄褐色ないし赤褐色である。
オートミール寒天（ISP Medium3） 栄養菌糸は透明ないし黄色であり、裏面は透明ないし黄
褐色である。気菌糸は白色ないし淡い紅ベージュ色で粉
状の外観である。
褐色である。気菌糸は白色ないし淡い紅ベージュ色で粉
状の外観である。
無機塩スターチ寒天（ISP Medium4） 軽度の発育で気菌糸は少ない。栄養菌糸は透明であり、
高度に分断している。澱粉の液化がコロニーの周辺に７
日目に観察された。
高度に分断している。澱粉の液化がコロニーの周辺に７
日目に観察された。
グリセリンアスパラギン寒天（ISP Medium5） 栄養菌糸は透明ないし黄色であり、裏面は透明ないし肉
桂色である。気菌糸は粉状で白色ないし淡紅色である。
桂色である。気菌糸は粉状で白色ないし淡紅色である。
ペプチド−鉄−酵母エキス寒天（ISP Medium6） 栄養菌糸は黄褐色である。気菌糸は認められず、メラニ
ン様色素は生産されない。
ン様色素は生産されない。
チロシン寒天（ISP Medium7） 栄養菌糸は培養日数と共に黄褐色から深紫色となる。気
菌糸はビロード状ないし灰色がかった紅ベージュ色であ
る。
菌糸はビロード状ないし灰色がかった紅ベージュ色であ
る。
ツァペック・ドックス寒天 栄養菌糸は培養日数と共に紅色味を帯びた黄褐色とな
る。気菌糸は短く、湿ったもつれた外観を呈する。
る。気菌糸は短く、湿ったもつれた外観を呈する。
本発明の微生物は、メルク・アンド・コンパニー・イン
コーポレーテッド（Merck ＆ Co.,Inc.）に譲渡された
次の米国に出願係属中の出願に記述されているように、
それぞれ新規な免疫抑制剤「デメトマイシン」及び「デ
メチムノマイシン」の生産に利用することができ、前記
文献はこの目的のため先行例に組み入れる： 特許願第213,063号、1988年７月29日出願、微生物アク
チノプラナセート・エスピー、（Merck Culture Collec
tion MA6559）ATCC No.53771を使用し、新しい発酵条件
下で生産されれる新規な免疫抑制剤、Ｌ−679,934のＣ
−31位が脱メチルされたアナログである「デメトマイシ
ン」（Ｌ−682,993）を特許請求している；及び特許願
第213,025号、1988年７月29日出願、微生物アクチノプ
ラナセート・エスピー（MA6559）、ATCC No.53771を使
用し、新しい発酵条件下で生産される新規な免疫抑制
剤、Ｌ−683,590のＣ−31位が脱メチルされたアナログ
である「デメチムノマイシン」（Ｌ−683,742）を特許
請求している。
コーポレーテッド（Merck ＆ Co.,Inc.）に譲渡された
次の米国に出願係属中の出願に記述されているように、
それぞれ新規な免疫抑制剤「デメトマイシン」及び「デ
メチムノマイシン」の生産に利用することができ、前記
文献はこの目的のため先行例に組み入れる： 特許願第213,063号、1988年７月29日出願、微生物アク
チノプラナセート・エスピー、（Merck Culture Collec
tion MA6559）ATCC No.53771を使用し、新しい発酵条件
下で生産されれる新規な免疫抑制剤、Ｌ−679,934のＣ
−31位が脱メチルされたアナログである「デメトマイシ
ン」（Ｌ−682,993）を特許請求している；及び特許願
第213,025号、1988年７月29日出願、微生物アクチノプ
ラナセート・エスピー（MA6559）、ATCC No.53771を使
用し、新しい発酵条件下で生産される新規な免疫抑制
剤、Ｌ−683,590のＣ−31位が脱メチルされたアナログ
である「デメチムノマイシン」（Ｌ−683,742）を特許
請求している。
出発物質Ｌ−679,934）はフジサワに対する欧州特許公
開第0184162号（この目的のため先行例に組み入れる）
に記述されているようにエス・ツクバエンシス（Ｌ−67
9,934と同一のFR−900506又は「FK−506」を生産）を発
酵させるか、又はメリーランド、ロックビルに所在する
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに限定
された寄託がなされているアクチノプラナセート・エス
ピー（Merck Culture Collection MA6548）ATCCNo.5377
0を欧州特許公開第184162号に記述されたFR−900506生
産条件下で発酵させることにより得ることができる。
開第0184162号（この目的のため先行例に組み入れる）
に記述されているようにエス・ツクバエンシス（Ｌ−67
9,934と同一のFR−900506又は「FK−506」を生産）を発
酵させるか、又はメリーランド、ロックビルに所在する
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに限定
された寄託がなされているアクチノプラナセート・エス
ピー（Merck Culture Collection MA6548）ATCCNo.5377
0を欧州特許公開第184162号に記述されたFR−900506生
産条件下で発酵させることにより得ることができる。
出発物質Ｌ−683,590は米国特許第3,244,592号に記述さ
れているようにエス・ハイグロスコピクス・バール・ア
スコマイセティクス、ATCC No.14891を発酵させるか、
又はフジサワに対する欧州特許公開第0184162号に記述
のようにエス・ハイグロスコピクス・サブスプ・ヤクシ
マエンシスNo.7278（Ｌ−683,590と同一のFR−900520又
は「FK−520」を生産）を発酵させることにより得るこ
とができ、前記文献はこの目的のために先行例に組み入
れる。
れているようにエス・ハイグロスコピクス・バール・ア
スコマイセティクス、ATCC No.14891を発酵させるか、
又はフジサワに対する欧州特許公開第0184162号に記述
のようにエス・ハイグロスコピクス・サブスプ・ヤクシ
マエンシスNo.7278（Ｌ−683,590と同一のFR−900520又
は「FK−520」を生産）を発酵させることにより得るこ
とができ、前記文献はこの目的のために先行例に組み入
れる。
次の実施例は本発明の例証する目的のために示すもので
あり、本発明の範囲又は思想をそれに限定しようとする
ものではない。
あり、本発明の範囲又は思想をそれに限定しようとする
ものではない。
実施例 １ 微生物と培養条件 凍結乾燥したカルチャーATCC No.53771をデキストリン
（10.0）、デキストロース（1.0）、牛肉エキス（3.
0）、アルダミン（ardamine）PH（イースト・プロダク
ツ・インク（Yeast Products,Inc.））（5.0）、Ｎ−Z
Amine type E（5.0）、MgSO4・7H2O（0.05）、KH2PO
4（0.37）及びCaCO3（0.5）（グラム／リッター）から
なる高圧滅菌した種菌培地の50mlを含む250mlの邪魔板
付きフラスコに植菌した。種菌培地のpHは高圧滅菌前7.
1に調節した。種菌は種菌培地中で220rpmの回転振盪機
上、27℃で48時間培養した。凍結した栄養菌糸又は寒天
斜面を使用する場合、種菌培地中で220rpm、27℃で24時
間培養した。得られる種菌培地の2.5mlを次の２つのあ
らかじめ高圧滅菌した生産培地の各々の50mlを含む250m
lの邪魔板のない振盪フラスコに植菌した。Ｌ−679,934
をジメチルスルホキシド溶液として0.1mg/mlの最終濃度
となるように添加した。次いで振盪フラスコの内容を22
0rpmの回転振盪機上、27℃で16時間培養した。
（10.0）、デキストロース（1.0）、牛肉エキス（3.
0）、アルダミン（ardamine）PH（イースト・プロダク
ツ・インク（Yeast Products,Inc.））（5.0）、Ｎ−Z
Amine type E（5.0）、MgSO4・7H2O（0.05）、KH2PO
4（0.37）及びCaCO3（0.5）（グラム／リッター）から
なる高圧滅菌した種菌培地の50mlを含む250mlの邪魔板
付きフラスコに植菌した。種菌培地のpHは高圧滅菌前7.
1に調節した。種菌は種菌培地中で220rpmの回転振盪機
上、27℃で48時間培養した。凍結した栄養菌糸又は寒天
斜面を使用する場合、種菌培地中で220rpm、27℃で24時
間培養した。得られる種菌培地の2.5mlを次の２つのあ
らかじめ高圧滅菌した生産培地の各々の50mlを含む250m
lの邪魔板のない振盪フラスコに植菌した。Ｌ−679,934
をジメチルスルホキシド溶液として0.1mg/mlの最終濃度
となるように添加した。次いで振盪フラスコの内容を22
0rpmの回転振盪機上、27℃で16時間培養した。
1.変換培地Ｂはブドウ糖（10.0）、ハイケース（Hycas
e）SF（2.0）、牛肉エキス（1.0）、コーン・スティー
プ・リカー（3.0）（グラム／リッター）から成り、pH
は高圧滅菌前7.0に調節した。
e）SF（2.0）、牛肉エキス（1.0）、コーン・スティー
プ・リカー（3.0）（グラム／リッター）から成り、pH
は高圧滅菌前7.0に調節した。
2.変換培地Ｃはマンニトール（5.0）、グリセリン（5.
0）、Hycase SF（2.0）、牛肉エキス（1.0）、コーン・
スティープ・リカー（3.0）（グラム／リッター）から
成り、pHは高圧滅菌前7.0に調節した。
0）、Hycase SF（2.0）、牛肉エキス（1.0）、コーン・
スティープ・リカー（3.0）（グラム／リッター）から
成り、pHは高圧滅菌前7.0に調節した。
各発酵液からの単離と精製方法 変換培地Ｂの全発酵液（100ml）を二塩化メチレン（３
×100ml）で３回抽出した。二塩化メチレン抽出液を合
併し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮して油
状残留物を得た。残留物をアセトニトリルに溶解し、高
速液体クロマトグラフ（HPLC）による精製を行った。
×100ml）で３回抽出した。二塩化メチレン抽出液を合
併し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮して油
状残留物を得た。残留物をアセトニトリルに溶解し、高
速液体クロマトグラフ（HPLC）による精製を行った。
HPLCはワットマン・パーティシル（Whatman Partisil）
100DSを使用するカラム（4.6mm×25cm）で行い、60℃で
205nmと225nmで監視した。カラムは0.1％リン酸水溶液
−CH3CN（45:55）から0.1％リン酸水溶液−CH3CN（20:8
0）に至るリニア・グラジエントにより30分間にわたっ
て展開した。化合物は上記抽出液の反復注入の間に集め
た。リテンション・タイム14分の画分をプールし、pH6.
5に調節し、蒸発してアセトニトリルを除いた。化合物
は更にC18セプ・パック（sep−Pak）（ウォータース・
アソシエーテス（Waters Associates））と溶離用溶媒
としてアセトニトリル−水を用いて精製し、1mgを得
た。この化合物をＬ−682,993、「デメトマイシン」と
呼称した。同様の結果が変換培地Ｃを使用して得られ
た。
100DSを使用するカラム（4.6mm×25cm）で行い、60℃で
205nmと225nmで監視した。カラムは0.1％リン酸水溶液
−CH3CN（45:55）から0.1％リン酸水溶液−CH3CN（20:8
0）に至るリニア・グラジエントにより30分間にわたっ
て展開した。化合物は上記抽出液の反復注入の間に集め
た。リテンション・タイム14分の画分をプールし、pH6.
5に調節し、蒸発してアセトニトリルを除いた。化合物
は更にC18セプ・パック（sep−Pak）（ウォータース・
アソシエーテス（Waters Associates））と溶離用溶媒
としてアセトニトリル−水を用いて精製し、1mgを得
た。この化合物をＬ−682,993、「デメトマイシン」と
呼称した。同様の結果が変換培地Ｃを使用して得られ
た。
実施例２ Ｔ細胞増殖検定 1.試料の調製 上述のようにHPLCにより調製した精製デメトマイシンを
無水エタノールに1mg/ml溶解した。
無水エタノールに1mg/ml溶解した。
2.検定 C57B1/6マウスから脾臓を無菌的に取り出し、10％の熱
不活化したウシ胎児血清（GIBCO、グランド・アイラン
ド（Gland Island）、ニュー・ヨーク（N.Y.））を添加
した氷冷RPMI 1640培地（GIBCO）中で穏やかに磨砕し
た。1500rpmで８分間遠心分離して細胞をペレット化し
た。混入した赤血球は塩化アンモニウム溶解用緩衝液
（GIBCO）で４℃で２分間処理して除いた。次いで細胞
懸濁液をナイロンウールカラム上で次のようにして分離
することによりＴリンパ球を単離した。すなわち、約40
gの洗浄し乾燥したナイロンウールを20mlのプラスチッ
ク製注射筒に充填してナイロンウールカラムを作った。
このカラムを250゜Ｆで30分間高圧滅菌した。ナイロン
ウールカラムを温培地（37℃）で加湿し、同一培地です
すいだ。温培地に再懸濁した洗浄脾臓細胞をゆっくりナ
イロンウールに添加した。次いでカラムを直立させて37
℃で１時間定温保持した。付着していないＴリンパ球を
温培地でカラムから溶離し、細胞懸濁液を上のように遠
心分離した。
不活化したウシ胎児血清（GIBCO、グランド・アイラン
ド（Gland Island）、ニュー・ヨーク（N.Y.））を添加
した氷冷RPMI 1640培地（GIBCO）中で穏やかに磨砕し
た。1500rpmで８分間遠心分離して細胞をペレット化し
た。混入した赤血球は塩化アンモニウム溶解用緩衝液
（GIBCO）で４℃で２分間処理して除いた。次いで細胞
懸濁液をナイロンウールカラム上で次のようにして分離
することによりＴリンパ球を単離した。すなわち、約40
gの洗浄し乾燥したナイロンウールを20mlのプラスチッ
ク製注射筒に充填してナイロンウールカラムを作った。
このカラムを250゜Ｆで30分間高圧滅菌した。ナイロン
ウールカラムを温培地（37℃）で加湿し、同一培地です
すいだ。温培地に再懸濁した洗浄脾臓細胞をゆっくりナ
イロンウールに添加した。次いでカラムを直立させて37
℃で１時間定温保持した。付着していないＴリンパ球を
温培地でカラムから溶離し、細胞懸濁液を上のように遠
心分離した。
精製したＴリンパ球を10％熱不活化ウシ胎児血清、100m
Mのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、２×10-5
Mの２−メルカプトエタノール及び５μg/mlのゲンタマ
イシンを添加したRPMI 1640培地から成る完全培地に2.5
×105細胞/mlで再懸濁した。イオノマイシンを250ng/ml
で、PMAを10ng/mlで添加した。細胞懸濁液を96槽平底ミ
クロ培養板（コスター（Coster））に200μl/槽で直接
添加した。次いで試験薬品の無い培地である対照と試験
をする試料（上述の精製したデメトマイシン）の種々な
下表に示す希釈液を繰返し３つの槽に20μl/槽で添加し
た。Ｌ−679,934を標準として使用した。培養板を37℃
で５％CO2−95％空気の加湿した気体中で44時間定温保
持した。Ｔリンパ球の増殖をトリチウム化チミジンの取
込みの測定により評価した。44時間培養後、細胞を２μ
Ci/槽のトリチウム化チミジン（NEN、ケンブリッジ（Ca
mbridge）、マサチューセッツ（MA））でパルスラベル
化した。更に４時間定温保持後、培養を多重試料採取装
置を使用してガラス繊維フィルター上で採取した。個々
の槽に対応するフィルター・ディスクの放射能を標準の
液体シンチレーション計数法（ベータカウンター（Beta
counter））により測定した。繰返しの槽の１分当たり
計数の平均値を算出し、結果を下式のようにトリチウム
化チミジン取込み（増殖）の阻害％として表した。
Mのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、２×10-5
Mの２−メルカプトエタノール及び５μg/mlのゲンタマ
イシンを添加したRPMI 1640培地から成る完全培地に2.5
×105細胞/mlで再懸濁した。イオノマイシンを250ng/ml
で、PMAを10ng/mlで添加した。細胞懸濁液を96槽平底ミ
クロ培養板（コスター（Coster））に200μl/槽で直接
添加した。次いで試験薬品の無い培地である対照と試験
をする試料（上述の精製したデメトマイシン）の種々な
下表に示す希釈液を繰返し３つの槽に20μl/槽で添加し
た。Ｌ−679,934を標準として使用した。培養板を37℃
で５％CO2−95％空気の加湿した気体中で44時間定温保
持した。Ｔリンパ球の増殖をトリチウム化チミジンの取
込みの測定により評価した。44時間培養後、細胞を２μ
Ci/槽のトリチウム化チミジン（NEN、ケンブリッジ（Ca
mbridge）、マサチューセッツ（MA））でパルスラベル
化した。更に４時間定温保持後、培養を多重試料採取装
置を使用してガラス繊維フィルター上で採取した。個々
の槽に対応するフィルター・ディスクの放射能を標準の
液体シンチレーション計数法（ベータカウンター（Beta
counter））により測定した。繰返しの槽の１分当たり
計数の平均値を算出し、結果を下式のようにトリチウム
化チミジン取込み（増殖）の阻害％として表した。
デメトマイシンの種々な濃度における阻害％の結果を次
表に示す。
表に示す。
表デメトマイシンによるＴ細胞増殖の阻害 デメトマイシン（ng/ml） 阻害％ 5 98.1 3.3 97.2 2.2 92.9 1.5 80.5 0.99 67.1 0.66 36.8 0.44 0 0.29 0 註1.マウスＴ細胞培養は48時間の試料採取に先立ち、４
時間かけて3H−チミジンでパルス化した。
時間かけて3H−チミジンでパルス化した。
註2.標準のＬ−679,934（10ng/ml）は99％の阻害を示し
た。
た。
註3.デメトマイシン（Ｌ−682,993）はIC50＝0.86ng/ml
＝1.09nMであり、一般には0.6〜1.2×10-9Mであった。
＝1.09nMであり、一般には0.6〜1.2×10-9Mであった。
註4.デメトマイシンによるＴ細胞増殖の阻害は、培養開
始時50μ/mlのIL−２（組換えIL−２）により逆転し
た。
始時50μ/mlのIL−２（組換えIL−２）により逆転し
た。
実施例３ 微生物と培養条件 凍結乾燥した培養（MA6559）ATCCNo.53771をデキストリ
ン（10.0）、デキストロース（1.0）、牛肉エキス（3.
0）、アルダミンPH（イースト・プロダクツ・インク）
（5.0）、Ｎ−Z Amine type E（5.0）、MgSO4、7H2O
（0.05）、KH2PO4（0.37）及びCaCO3（0.5）（グラム／
リッター）からなる高圧減菌した種菌培地の50mlを含む
250mlの邪魔板付きフラスコに植菌した。種菌培地のpH
は高圧減菌前7.1に調節した。種菌は種菌培地中で220rp
mの回転振盪機上、27℃で48時間培養した。凍結した栄
養菌糸又は寒天斜面を使用する場合、種菌培地中で220r
pm、27℃で24時間培養した。得られる種菌培地の2.5ml
をあらかじめ高圧滅菌した変換培地Ｂの50mlを含む250m
lの邪魔板のない振盪フラスコに植菌した。Ｌ−683,590
をジメチルスルホキシド溶液として0.1mg/mlの最終濃度
となるように添加した。次いで振盪フラスコの内容を22
0rpmの回転振盪機上、27℃16時間培養した。
ン（10.0）、デキストロース（1.0）、牛肉エキス（3.
0）、アルダミンPH（イースト・プロダクツ・インク）
（5.0）、Ｎ−Z Amine type E（5.0）、MgSO4、7H2O
（0.05）、KH2PO4（0.37）及びCaCO3（0.5）（グラム／
リッター）からなる高圧減菌した種菌培地の50mlを含む
250mlの邪魔板付きフラスコに植菌した。種菌培地のpH
は高圧減菌前7.1に調節した。種菌は種菌培地中で220rp
mの回転振盪機上、27℃で48時間培養した。凍結した栄
養菌糸又は寒天斜面を使用する場合、種菌培地中で220r
pm、27℃で24時間培養した。得られる種菌培地の2.5ml
をあらかじめ高圧滅菌した変換培地Ｂの50mlを含む250m
lの邪魔板のない振盪フラスコに植菌した。Ｌ−683,590
をジメチルスルホキシド溶液として0.1mg/mlの最終濃度
となるように添加した。次いで振盪フラスコの内容を22
0rpmの回転振盪機上、27℃16時間培養した。
1.変換培地Ｂはブドウ糖（10.0）、ハイケースSF（2.
0）、牛肉エキス（1.0）、コーン・スティープ・リカー
（3.0）（グラム／リッター）から成り、pHは高圧滅菌
前7.0に調節した。
0）、牛肉エキス（1.0）、コーン・スティープ・リカー
（3.0）（グラム／リッター）から成り、pHは高圧滅菌
前7.0に調節した。
発酵液からの単離と精製方法 変換培地Ｂの全発酵液（100ml）を二塩化メチレン（３
×100ml）で３回抽出した。二塩化メチレン抽出液を合
併し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮して油
状残留物を得た。残留物をアセトニトリルに溶解し、HP
LCによる精製を行った。
×100ml）で３回抽出した。二塩化メチレン抽出液を合
併し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮して油
状残留物を得た。残留物をアセトニトリルに溶解し、HP
LCによる精製を行った。
HPLCはワットマン・パーティシル100DSを使用するカラ
ム（9.4mm×25cm）で行い、60℃で205nmと225nmで監視
した。カラムは0.1％リン酸水溶液−CH3CN（45:55）か
ら0.1％リン酸水溶液−CH3CN（20:80）に至るリニア・
グラジエントにより30分間にわたって展開した。化合物
は上記抽出液の反復注入の間に集めた。リテンション・
タイム24分の画分をプールし、pH6.5に調節し、蒸発し
てアセトニトリルを除いた。化物は更にC18セプ・パッ
ク（ウォータース・アソシエーテス）と溶離用溶媒とし
てアセトニトリル−水を用いて精製してＬ−683,422、
「デメチムノマイシン」と呼称する生成物1.4mgを得
た。同様の結果が変換培地Ｃを使用して得られた。
ム（9.4mm×25cm）で行い、60℃で205nmと225nmで監視
した。カラムは0.1％リン酸水溶液−CH3CN（45:55）か
ら0.1％リン酸水溶液−CH3CN（20:80）に至るリニア・
グラジエントにより30分間にわたって展開した。化合物
は上記抽出液の反復注入の間に集めた。リテンション・
タイム24分の画分をプールし、pH6.5に調節し、蒸発し
てアセトニトリルを除いた。化物は更にC18セプ・パッ
ク（ウォータース・アソシエーテス）と溶離用溶媒とし
てアセトニトリル−水を用いて精製してＬ−683,422、
「デメチムノマイシン」と呼称する生成物1.4mgを得
た。同様の結果が変換培地Ｃを使用して得られた。
実施例４ Ｔ細胞増殖検定 1.試料の調製 上述のようにHPLCにより調製した精製デメチムノマイシ
ンを無水エタノールに1mg/mlで溶解した。
ンを無水エタノールに1mg/mlで溶解した。
2.検定 C57B1/6マウスから脾臓を無菌的に取り出し、10％の熱
不活化したウシ胎児血清（GIBCO、グランド・アイラン
ド、ニュー・ヨーク）を添加した氷冷RPMI 1640培地（G
IBCO）中で穏やかに磨砕した。1500rpmで８分間遠心分
離して細胞をペレット化した。混入した赤血球は塩化ア
ンモニウム溶解用緩衝液（GIBCO）で４℃で２分間処理
して除いた。次いで細胞懸濁液をナイロンウールカラム
上で次のようにして分離することによりＴリンパ球を単
離した。すなわち、約40gの洗浄し乾燥したナイロンウ
ールを20mlのプラスチック製注射筒に充填してナイロン
ウールカラムを作った。このカラムを250゜Ｆで30分間
高圧滅菌した。ナイロンウールカラムを温培地（37℃）
で加湿し、同一培地ですすいだ。温培地に再懸濁した洗
浄脾臓細胞をゆっくりナイロンウールに添加した。次い
でカラムを直立させて37℃で１時間定温保持した。付着
していないＴリンパ球を温培地でカラムから溶離し、細
胞懸濁液を上のように遠心分離した。
不活化したウシ胎児血清（GIBCO、グランド・アイラン
ド、ニュー・ヨーク）を添加した氷冷RPMI 1640培地（G
IBCO）中で穏やかに磨砕した。1500rpmで８分間遠心分
離して細胞をペレット化した。混入した赤血球は塩化ア
ンモニウム溶解用緩衝液（GIBCO）で４℃で２分間処理
して除いた。次いで細胞懸濁液をナイロンウールカラム
上で次のようにして分離することによりＴリンパ球を単
離した。すなわち、約40gの洗浄し乾燥したナイロンウ
ールを20mlのプラスチック製注射筒に充填してナイロン
ウールカラムを作った。このカラムを250゜Ｆで30分間
高圧滅菌した。ナイロンウールカラムを温培地（37℃）
で加湿し、同一培地ですすいだ。温培地に再懸濁した洗
浄脾臓細胞をゆっくりナイロンウールに添加した。次い
でカラムを直立させて37℃で１時間定温保持した。付着
していないＴリンパ球を温培地でカラムから溶離し、細
胞懸濁液を上のように遠心分離した。
精製したＴリンパ球を10％熱不活化ウシ胎児血清、100m
Mのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、２×10-5
Mの２−メルカプトエタノール及び５μg/mlのゲンタマ
イシンを添加したRPMI 1640培地から成る完全培地に2.5
×105細胞/mlで再懸濁した。イオノマイシンを250ng/m
l、PMAを10ng/mlで添加した。細胞懸濁液を96槽平底ミ
クロ培養板（コスター）に200μl/槽直接添加した。次
いで試験薬品のない培地である対照と試験をする試料
（上述の精製したデメチムノマイシン）の種々な下表に
示す希釈液を繰返し３つの槽に20μl/槽添加した。Ｌ−
679,934を標準として使用した。次いで培養板を37℃で
５％CO2−95％空気の加湿した気体中で44時間定温保持
した。Ｔリンパ球の増殖をトリチウム化チミジンの取込
みの測定により評価した。44時間培養後、細胞を２μCi
/槽のトリチウム化チミジン（NEN、ケンブリッジ、マサ
チューセッツ）でパルスラベル化した。更に４時間定温
保持後、培養を多重試料採取装置を使用してガラス繊維
フィルター上で採取した。個々の槽に対応するフィルタ
ー・ディスクの放射能を標準の液体シンチレーション計
数法（ベータカウンター）により測定した。繰返しの槽
の１分当たり計数の平均値を算出し、結果を下式のよう
にトリチウム化チミジン取込み（増殖）の阻害％として
表した。
Mのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、２×10-5
Mの２−メルカプトエタノール及び５μg/mlのゲンタマ
イシンを添加したRPMI 1640培地から成る完全培地に2.5
×105細胞/mlで再懸濁した。イオノマイシンを250ng/m
l、PMAを10ng/mlで添加した。細胞懸濁液を96槽平底ミ
クロ培養板（コスター）に200μl/槽直接添加した。次
いで試験薬品のない培地である対照と試験をする試料
（上述の精製したデメチムノマイシン）の種々な下表に
示す希釈液を繰返し３つの槽に20μl/槽添加した。Ｌ−
679,934を標準として使用した。次いで培養板を37℃で
５％CO2−95％空気の加湿した気体中で44時間定温保持
した。Ｔリンパ球の増殖をトリチウム化チミジンの取込
みの測定により評価した。44時間培養後、細胞を２μCi
/槽のトリチウム化チミジン（NEN、ケンブリッジ、マサ
チューセッツ）でパルスラベル化した。更に４時間定温
保持後、培養を多重試料採取装置を使用してガラス繊維
フィルター上で採取した。個々の槽に対応するフィルタ
ー・ディスクの放射能を標準の液体シンチレーション計
数法（ベータカウンター）により測定した。繰返しの槽
の１分当たり計数の平均値を算出し、結果を下式のよう
にトリチウム化チミジン取込み（増殖）の阻害％として
表した。
デメチムノマイシンの種々な濃度における阻害％の結果
を次表に示す。
を次表に示す。
表デメチムノマイシンによるＴ細胞増殖の阻害 デメチムノマイシン（ng/ml） 阻害％ 10 98.6 6.6 97.9 4.4 91.9 2.9 86.3 1.9 72.1 1.3 38.2 0.9 9.0 0.6 ０ 註1.マウスＴ細胞培養は48時間の試料採取に先立ち、４
時間かけて3H−チミジンでパルス化した。
時間かけて3H−チミジンでパルス化した。
註2.標準のＬ−679,934（10ng/ml）は99％の阻害を示し
た。
た。
註3.デメチムノマイシン（Ｌ−638,742）はIC50＝1.4ng
/ml＝1.81nMであり、一般には1.6〜1.9×10-9Mであっ
た。
/ml＝1.81nMであり、一般には1.6〜1.9×10-9Mであっ
た。
註4.デメチムノマイシンによるＴ細胞増殖の阻害は、培
養開始時50μ/mlのIL−２（組換えIL−２）により逆転
した。
養開始時50μ/mlのIL−２（組換えIL−２）により逆転
した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨージ エム．ギヤリテイ アメリカ合衆国，07090 ニユージヤーシ イ，ウエストフイールド，クラーク スト リート 617 (72)発明者 エドワード エス．イナミネ アメリカ合衆国，07065 ニユージヤーシ イ，ローウエイ，ラツセル アヴエニユー 376 (72)発明者 リンダ エス．ヴイツカー アメリカ合衆国，07090 ニユージヤーシ イ，ウエストフイールド，アローウツド ドライヴ 2096 (72)発明者 サグラリオ モハレス スペイン国，28007 マドリツド 14 ペ ス ヴオラドール
Claims (1)
- 【請求項１】免疫抑制剤デメトマイシンあるいはデメチ
ムノマイシンを産生する、生物学的に純粋なアクチノプ
ラナセートsp.（MA6559）ATCC No.53771の培養菌株。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US22936588A | 1988-08-05 | 1988-08-05 | |
| US229,365 | 1988-08-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02231074A JPH02231074A (ja) | 1990-09-13 |
| JPH0691815B2 true JPH0691815B2 (ja) | 1994-11-16 |
Family
ID=22860898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1191580A Expired - Lifetime JPH0691815B2 (ja) | 1988-08-05 | 1989-07-26 | 免疫抑制剤を生産する新規な培養菌株 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0353827A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0691815B2 (ja) |
| CA (1) | CA1315227C (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5912196A (en) * | 1995-12-20 | 1999-06-15 | Kimberly-Clark Corp. | Flame inhibitor composition and method of application |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4981792A (en) * | 1988-06-29 | 1991-01-01 | Merck & Co., Inc. | Immunosuppressant compound |
| EP0349061B1 (en) * | 1988-06-29 | 1995-03-29 | Merck & Co. Inc. | Immunosuppressant agent |
-
1989
- 1989-07-26 JP JP1191580A patent/JPH0691815B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-31 EP EP19890202003 patent/EP0353827A3/en not_active Withdrawn
- 1989-08-02 CA CA000607325A patent/CA1315227C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0353827A3 (en) | 1991-01-30 |
| JPH02231074A (ja) | 1990-09-13 |
| CA1315227C (en) | 1993-03-30 |
| EP0353827A2 (en) | 1990-02-07 |
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