JPH0672158B2 - 精製されたヒトマクロファージ遊走阻止因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、精製されたヒト−マクロファージ遊走阻止
因子（ヒト−MIF）、その製造方法、及びそれを含む医
薬に関する。

〔発明の背景〕

ヒト細胞からのヒト−MIFは従来活性なものとしては知
られているが、混合物として、そして生物学的液体中の
他の蛋白質と一緒に記載されているに過ぎず、そして構
造的観点からは未だ特徴付けられていない。MIFはいわ
ゆるリンフォカイン群に属し、このリンフォカインは生
物学的に活性な可溶性ポリペプチドを含んで成り、この
ものはリンパ球及び単球又はマクロファージが抗原、マ
イトジェン等により刺激された場合にこれらの細胞から
分泌される。リンフォカインの他の例として、免疫イン
ターフェロン（γ−インターフェロン）、インターロイ
キン１及び２、並びにマクロファージ活性化因子（MA
F）を挙げることができる。これらのリンフォカイン
は、免疫系の種々の細胞タイプの分化、活性化及び増殖
を制御する。

知られている技術的状況によれば、ヒト−MIFは、マク
ロファージの遊走能力を阻害するポリペプチドの一群か
ら成る。ヒト−MIFは活性化されたリンパ球、Ｔ−及び
Ｂ−細胞からのみならず、非リンパ性細胞、例えば成長
中の線維芽細胞及びある種の腫瘍細胞からも分泌され
る。MIFは、γ−インターフェロン、マクロファージ活
性化因子（MAF）及び他のリンフォカインから明確に区
別される。しかしながら今まで、ヒト−細胞からのMIF
を純粋に調製し、そしてその構造を解明することは不可
能であった。ヒト−MIFについて、これが約8.5,18,27,3
6,45、及び67kg/Mol（キロダルトン,kD）の分子量及び
約pH5.1及び2.9の等電点を有する構造的に異るポリペプ
チドの混合物らしいことが知られている〔G.Baumeiste
r、H.Steffen、U.Feige、及びC.Sorg、イムノバイオロ
ジー（Immunobiology）160,15（1981）〕。

ヒト−MIFは炎症反応（遅延型過敏性反応）の初期にお
いて決定的な役割を演ずる。このものは単球及び無活動
組織マクロファージが炎症性マクロファージに分化する
のを導誘する。従って、精製されたヒト−MIF及びその
個々の蛋白質並びにヒト−MIFを特異的に結合してその
活性を阻害するモノクローナル抗体は、免疫調節疾患及
び慢性炎症疾患の診断及び治療のために重要である。ヒ
ト−MIFを結合しそしてそれを阻害するモノクローナル
抗体は、接触湿疹、一次的慢性多発関節炎及び種々の自
己免疫疾患の克服のために有用である。精製されたヒト
−MIF及びその個々の蛋白質は感染に対する耐性、例え
ば結核、らい病又はレーシュマニアに対する耐性、及び
キャンディダ症に対する耐性、並びに腫瘍、例えば転移
に対する耐性を上昇せしめる。

診断及び治療における抗体の用途の範囲は最近まで非常
に限定されていた。抗体は、種々の蛋白質の複雑な混合
物として動物の血清から非常に少量得られた。免疫され
た各動物個体、及び１つの個体でさえ、反復して免疫さ
れた場合には、各場合に種々の組成の抗体を含有する血
清をもたらすので、抗体の標準化は不可能であった。Ｋ
hler及びMilstein〔G.Kler及びＣ・Milstein,ネイ
チュアー（Nature）256,495（1975）〕により開発され
た技法を用いて、今や均質な形の抗体、すなわちいわゆ
るモノクローナル抗体を、細胞培養により工業的な量に
おいて再現性を伴って得ることができるようになった。
適当な骨髄腫細胞と抗原により免疫された供与体からの
抗体産生リンパ球との融合により、無限の細胞分裂及び
無限の増殖を行う能力と均一な抗体を産生する能力とを
共に有するハイブリドーマ細胞が生ずる。従って、特定
の抗原に対する生物の免疫応答を独立させ、そしてハイ
ブリドーマ細胞の連続的培養によりモノクローナル抗体
を製造することが可能である。

ハイブリドーマ技法により特定の抗体を製造するための
多くの例が今まで知られており、そして一般的手段が原
理的に記載されているが、新しい例に特有の問題点は、
特定の場合に技法を適合させること要求する。このよう
な適合なくしては、所望のハイブリドーマを生成せしめ
ること、該ハイブリドーマが所望の抗体産生しそして遺
伝的に安定であること、及びこのようにして製造された
抗体が所望の特異性を有することが保証されない。成功
の程度は、原理的には、供与体の免疫に使用する抗原の
種類及び純度、細胞融合の技法、適当なハイブリドーマ
セルラインを選択するための手段、並びに抗体の単離及
び精製のための方式及び態様により左右される。

均一なモノクローナル抗体の大量入手を前提とする抗体
の重要な用途、例えば今ハイブリドーマ技法により可能
となった用途はイムノアフィニティークロマトグラフィ
ーである。この場合、所望の特異性を有する抗体を固体
担体上に適用する。多数の異る化合物を含有する溶液か
ら、抗体によって認識されそしてそれに結合される構造
因子（決定基、エピトープ）を有する化合物が抗体に結
合され、そして従って固体担体に結合される。不所望の
化合物を含有する溶液を除去した後、抗体への結合を破
壊する試薬により洗浄することによって担体から所望の
化合物を溶出し、そして常法により単離する。

この発明の課題はヒト−MIF及びその個々の蛋白質を得
ることであり、この課題はこの発明のモノクローナル抗
体によって解決される。

〔発明の記載〕

この発明は精製されたヒト−マクロファージ遊走阻止因
子（ヒト−MIF）及びその個々の蛋白質に関する。

精製されたヒト−MIFは、ヒト−MIFに対する抗体に認識
されそして結合されるエピトープを有するヒト由来の蛋
白質のみを含有する。精製されたヒト−MIFは約８、約1
4、約28、及び約45kg/Molの分子量を有する少なくとも
４種類の個々の蛋白質、及び場合によってはさらに約45
kg/Molより大きい分子量を有するオリゴマー蛋白質凝集
体又は他の個々の蛋白質を含んで成る。精製されたヒト
−MIFは、マクロファージの遊走を測定する標準的試験
方法において活性である。

精製されたヒト−MIFの個々の蛋白質は、蛋白質分析の
常用法、例えばSDS−PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動）又はゲル過HPLC
（高圧液体クロマトグラフィー）において均一な、マク
ロファージの遊走を測定する標準的試験法において活性
な、そして精製されたヒト−MIFの構成要素である蛋白
質である。個個の蛋白質の分離及び単離の過程で洗剤又
は他の変性剤を添加した場合、一次構造は変化しないで
維持されるが蛋白質の天然の三次構造が変化し、そして
それと共にマクロファージの遊走を阻害する性質が変化
する。このような変性された形の個個の蛋白質もまたこ
の発明の対象である。精製されたヒト−MIFの個々の蛋
白質の例として、それぞれ約8kg/Mol及び約14kg/Molの
分子量並びにＮ−端アミノ酸配列： （ここで、アミノ酸X₁の意味は特定されない）を有する
２種類の蛋白質さらには約28kg/Mol、及び約45kg/Molの
分子量を有する蛋白質を挙げることができる。

この発明は特に、およその分子量8kg/Molを有しそして
Ｎ−端アミノ酸配列： （ここで、アミノ酸X₄₂,X₆₂,X₆₃,及びX₆₄は特定され
ず、しかしX₄₂はSer又はCysのみを意味することができ
る）を有する精製されたヒト−MIFの個々の蛋白質に関
する。

この発明はさらに、精製されたヒト−MIF及びその個々
の蛋白質の製造方法に関し、この方法は、ヒト−MIF含
有溶液、例えばヒト細胞の細胞抽出液、細胞培養上清液
又は細胞培養液を、所望によりそれ自体公知の精製段
階の後で、 ａ）ヒト−MIFに特異的なモノクローナル抗体を有する
担体と接触せしめ、非結合蛋白質及び他の外来性物質を
除去し、抗体に結合したヒト−MIFを選択的に切り離
し、そして単離し、 ｂ）そして所望により、精製されたヒト−MIFをその個
々の蛋白質に分離することを特徴とする。

MIFを含有する液、例えばヒト細胞の細胞抽出液、細胞
培養上清液又は細胞培養液はそれ自体公知の方法によ
り調製される。適当なヒト細胞は例えば単核細胞であ
り、この細胞は、クエン酸塩又はヘパリンを添加された
静脈血を遠心する際に堆積する白血球の層である「バフ
ィーコート」から、ロイカフェレシス（leucapheresi
s）及び／又は密度勾配中での遠心分離によって得るこ
とができる。単核細胞は適当な助剤、例えばコンカナバ
リンＡ又はフィトヘマグルチニンによりMIF及び他のリ
ンフォカインを産生するように刺激されそして常法に従
って約12〜約72時間、好ましくは18〜36時間、適当な培
地、例えばRPMI1640培地（これには所望によりウシ胎児
血清、緩衝剤及び／又は抗生物質、例えばペニシリンも
しくはストレプトマイシンが添加される）中で、約37℃
において、そして所望によりCO₂ガス通気のもとで培養
される。ヒト−MIFを含有する溶液は、細胞又は細胞培
養上清液から、例えば抽出、過及び／又は遠心分離に
よって得られ、そして所望により抗生物質及び／又はプ
ロテアーゼ阻害剤の添加により安定化される。このよう
なヒト−MIF溶液を、段階ａ）において、担体に結合し
た抗体と直接接触せしめることができ、しかし好ましく
は約6kg/Mol又はこれより小分子量の分離限界を有する
膜上での限外過によりあらかじめ前精製し、濃縮し、
場合によっては透析し、そして所望によりクロマトグラ
フィー、例えばDEAE−セルロース又はセファデックス
（商標）によりさらに精製する。

段階ａ）においては、ヒト−MIFが溶液に含有されてい
る他の蛋白質及び外来性物質から分離され、この場合、
ヒト−MIFに対して特異的な抗体とヒト−MIF上の認識さ
れる抗原決定基との間の強制的な相互作用に基く分離作
用が用いられる。このために、MIF含有液を、それ自体
公知のイムノアフィニティークロマトグラフィー法に従
って、ヒト−MIFに特異的なモノクローナル抗体が結合
している担体と接触せしめる。

無機物又は有機物を基礎とする適当な担体、例えば珪酸
塩、架橋アガロース、デキストラン、又は適当に官能化
された形のポリアクリルアミドに、それ自体公知の方法
により、後に詳細に記載するこの発明のモノクローナル
抗体又はその誘導体を付加する。例えば、活性化された
エステル官能基、例えばＮ−ヒドキシサクシンイミドエ
ステル基を含有する担体を水性緩衝液に懸濁し、モノク
ローナル抗体の溶液と混合し、次に未結合モノクローナ
ル抗体を洗浄除去し、そして担体のふさがれていない反
応性部位を例えば第一級アミン、例えばエタノールアミ
ンによりブロックする。担体を、適当な水性溶剤、例え
ば塩溶液、例えばNaCl溶液、又は緩衝液、例えば燐酸緩
衝化NaCl溶液、NaHCO₃溶液又は３−（Ｎ−モルホリノ）
プロパンスルホン酸溶液に懸濁し、そしてヒト−MIFを
含有する溶液と接触せしめる。例えば、クロマトグラフ
カラムに充填し、そしてヒト−MIF含有液を導入し、そ
して所望により加圧を伴って、担体中にポンプ通過せし
める。未結合蛋白質及び他の汚染物を、水性液、例えば
約５〜約９のpHを有する緩衝液及び／又は塩溶液、例え
ばNaCl溶液で洗浄除去する。担体上の抗体に結合したヒ
ト−MIFを、適当な水性液、例えば約２〜約５のpH範囲
の緩衝液、例えばグリシン緩衝液、又は種々の混合物も
しくは塩溶液、例えば濃NH₄SCN溶液のpHグラジエントに
より溶出する。得られた精製ヒト−MIF含有液を場合に
よっては中和し、そしてそれ自体公知の方法により、例
えばセファデックス（商標）上でのクロマトグラフィ
ー、電気透析、電気泳動濃縮及び／又は真空濃縮によ
り、精製されたヒト−MIFを単離する。

所望により段階ｂ）において、精製されたヒト−MIFを
その個々の蛋白質に分離し、この場合例えばそれ自体公
知の方法に従って、蛋白質混合物をクロマトグラフィー
により異る分子量を有する画分に分離する。例えば精製
されたヒト−MIFを調製用ドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）により分
離し、均一な分子量画分をゲルから溶出し、そして例え
ばセファデックス（商標）上でのクロマトグラフィー、
電気泳動濃縮及び／又は真空濃縮により純粋な形で単離
する。精製されたヒト−MIFはまた、調製用ゲル過HPL
Cにより均一な分子量画分に分離し、そしてこれから個
々の蛋白質を単離することもできる。

この発明のMIFは、ヒト−マクロファージ遊走阻止因子
（ヒト−MIF）に対する新規な抗体、及びその誘導体の
製造のために使用することができる。

このモノクローナル抗体はヒト−MIFを結合し、そして
／又はその生物学的活性を阻害する。ヒト−MIFへのモ
ノクローナル抗体の結合はイムノアッセイにより便利に
決定することができ、例えば固体担体上にヒト−MIFを
適用し、この被覆された担体をモノクローナル抗体溶液
と共にインキュベートし、そしてこれによって結合した
モノクローナル抗体を、ラジオアイソトープ又は酵素で
標識した第２の抗体により表示する方法により決定する
ことができる。すなわち、ヒト−MIFに結合したモノク
ローナル抗体を、放射能又は酵素−基質反応の測定によ
り決定する。例えば、モノクローナル抗体を担体上に固
定し、ヒト−MIF含有溶液と共にインキュベートし、そ
して次にこの溶液の残留ヒト−MIF活性を測定する方法
もまた適当である。

溶液のヒト−MIF活性は、それ自体公知の方法により、
適当に活性化されたヒト−マクロファージの遊走に対す
る阻害作用を測定することにより、測定することができ
る。例えば、タイタープレート上のアガロース滴中に配
置されたプローブ溶液中マクロファージの試験溶液中で
の遊走距離を測定する試験方法を選択することができ
る。

マウス／マウスー、ラット／ラットー、又はラット／マ
ウスーハイブリドーマ細胞により産生される、ヒト−MI
Fに対するモノクローナル抗体が好ましい。例えば、こ
の発明のモノクローナル抗体として、ハイブリドーマセ
ルラインIC5により産生されるIC5と称するサブクラスIg
G₁κのモノクローナル抗体、及びハイブリドーマセルラ
イン7D10により産生される7D10と称するサブクラスIgG₂
aのモノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗
体IC5及び7D10はヒト−MIFの生物学的活性を阻害するこ
となくヒト−MIFに結合する。

モノクローナル抗体のこの発明の誘導体は、例えば、ヒ
ト−MIFの抗原決定基に対するその特異性を保持してい
る断片、例えばFab,Fab′もしくはＦ（ab′）_２断片；
例えば放射性ヨウ素（¹²⁵I、¹³¹I）、炭素（¹⁴C）、硫
黄（³⁵S）、トリチウム（³H）もしくはこれらに類似す
るものにより標識された放射性標識モノクローナル抗
体；ビオチンもしくはアビジンとのモノクローナル抗体
接合体；又は酵素、例えばホースラディッシュ−パ−オ
キシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、グリコースオキシダーゼ、グルコアミラ
ーゼ、カーボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエ
ステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼも
しくはグリコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
とのモノクローナル抗体接合体である。好ましい誘導体
は¹²⁵Iで標識されたモノクローナル抗体、及びビオチン
との抗体接合体である。

この発明はさらに、ヒト−MIFに対するモノクローナル
抗体及びその誘導体のそれ自体公知の製造方法に関し、
この方法は、前記の抗体を産生するハイブリドーマ細胞
を、 ａ）イン−ビトロ培養し、そして培養上清液からモノク
ローナル抗体を単離し、又は ｂ）適当な哺乳動物中でイン−ビボ増幅し、そして該哺
乳動物の体液からモノクローナル抗体を単離し、 ｃ）そして所望により、得られたモノクローナル抗体を
その誘導体に転換する、 ことを特徴とする。

変法ａ）のイン−ビトロ培養のための適当な培地は常用
の標準培地、例えば、ウシ胎児血清が補充されている場
合があるドゥルベコ（Dulbecco）の変形イーグル（Eagl
e）培地又はRPMI 1640培地である。モノクローナル抗体
の単離のために、培養上清液中の蛋白質を硫酸アンモニ
ウム又はこれに類似するものによって沈澱せしめ、そし
て常用のクロマトグラフ法、例えばゲル過、イオン交
換クロマトグラフィー、DEAE−セルロースクロマトグラ
フィー、又は免疫アフィニティークロマトグラフィーに
より精製する。

変法ｂ）に従うハイブリドーマ細胞のイン−ビボ増幅に
より目的とする抗体を多量に得ることができる。この目
的のために、細胞クローンを哺乳動物、好ましくは同系
（Syngeneic）哺乳動物に注射し、そして１〜３週間
後、モノクローナル抗体を該哺乳動物の体液から単離す
る。例えば、Balb/cマウス由来のハイブリドーマ細胞
を、場合によってはプリスタンのごとき炭化水素により
前処理されたBalb/cマウスに腹腔内注射し、そして８〜
10日後に該動物から腹水を採取する。目的とするモノク
ローナル抗体を該体液から、それ自体公知の方法によ
り、例えば塩化アンモニウム又はこれに類似するものに
よる沈澱、及びクロマトグラフ精製、例えばDEAE−セル
ロース、ヒドロキシルアパタイト（HPHT、高速ヒドロキ
シルアパタイトカラムクロマトグラフィー）、イオン交
換樹脂によるクロマトグラフィー、ゲル過又は免疫ア
フィニティークロマトグラフィーにより単離する。

ヒト−MIFの抗原決定基に対する特異性が保持されてい
るこの発明のモノクローナル抗体断片、例えばＦ_ab、Ｆ
_ab′又はＦ_（ab′_{） ２}断片は、それ自体公知の方法によ
り製造することができ、例えば変法ａ）又はｂ）により
得られたモノクローナル抗体をペプシンもしくはパパイ
ンのごとき酵素により処理し、そして／又は化学還元に
よりジスルフィド結合を切断することにより製造するこ
とできる。

ヨウ素（¹²⁵I、¹³¹I）により放射性標識されたモノクロ
ーナル抗体は、この発明のモノクローナル抗体から、そ
れ自体公知の方法により、例えば放射性ヨウ化ナトリウ
ム又はヨウ化カリウムと化学的酸化剤、例えば次亜塩素
酸ナトリウム、クロラミンＴもしくはこれらに類似する
もの、又は酵素的酸化剤、例えばラクトパーオキシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼとグルコースとを用いて得
られる。この発明の放射性標識されたモノクローナル抗
体はまた、それ自体公知の方法により、放射性標識され
た炭素（¹⁴C）、トリチウム（³H）、硫黄（³⁵S）又はこ
れらに類似するものを含有する栄養素、例えばＬ−（¹⁴
C）−ロイシン、Ｌ−（³H）−ロイシン又はＬ−（³⁵S）
−メチオニンをイン−ビトロ培養のための倍地に添加
し、そして変法ａ）に従ってモノクローナル抗体を得る
ことにより製造することができる。

酵素標識されたこの発明のモノクローナル抗体はそれ自
体公知の方法により得られ、この方法においては、変法
ａ）又はｂ）によって製造されたモノクローナル抗体と
所望の酵素とを、カップリング剤、例えばグルタルアル
デヒド、過ヨウ素酸塩、N,N′−ｏ−フェニレンジマレ
イミド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−サ
クシンイミド、Ｎ−（３−（２′−ピリジルジチオ）−
プロピオンオキシ）−サクシンイミド又はこれらに類似
するものと共に反応せしめる。同様に、この発明のモノ
クローナル抗体とアビジンとの接合体が得られる。ビオ
チンとの接合体がそれ自体公知の方法により得られ、こ
の方法においてはこの発明のモノクローナル抗体を例え
ばビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジルエステル
と反応せしめる。

この発明はさらに、ヒト−マクロファーシ遊走阻止因子
（ヒト−MIF）に対するモノクローナル抗体を産生する
ことを特徴とするハイブリドーマセルラインに関する。

マウス−骨髄腫セルラインとマウス−又はラット−リン
パ球との雑種である、ヒト−MIFに対して向けられたモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマセルライン
が好ましい。

パスツール研究所（パリ）の“Collection Nationale d
e Cultures de Microorganismes"にNo I−316として198
4年７月13日に寄託され、そしてIC5と称するハイブリド
ーマセルラインが非常に好ましい。セルラインIC5は、
マウス骨髄腫セルラインP3−X63−Ag8.653とBalb/cマウ
スの脾臓のＬ−リンパ球との雑種である。同様に、パス
ツール研究所（パリ）の“Collection Nationale de Cu
ltures de Microorganismes"にNo I−418として1985年
１月29日に寄託され、そして7D10と称するハイブリドー
マセルラインが好ましい。セルライン7D10は、マウス骨
髄腫セルラインP3−X63−Ag8.653とDA−ラットの脾臓の
Ｂ−リンパ球との雑種である。これらのセルラインはい
ずれも遺伝的に安定であり、不変の特異性を有するモノ
クローナル抗体を分泌し、そして凍結された培養物を解
凍しそして再クローン化することによって活性化され得
る。

この発明はさらに、ヒト−MIFに対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマの製造のためのそれ自体
公知の方法に関し、この方法は、適当な哺乳動物をMIF
又はMIF接合体で免疫し、該哺乳動物から取り出された
抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、得られたハイ
ブリド細胞をクローン化し、そして目的とするモノクロ
ーナル抗体を産生する細胞クローンを選択することを特
徴とする。

抗原としてMIF含有蛋白質画分又はMIF接合体のいずれを
も使用することができ、例えばヒトの単核細胞からのも
の、例えば上記のようにして得られたMIF含有蛋白質画
分、又はこの蛋白質画分と適当な免疫原担体、例えば蛋
白質、ポリサッカライド、ラテックス粒子もしくは細胞
との接合体を用いることができる。動物−MIF及びヒト
−MIFが同一のエピトープを示すことが、当該動物、例
えばネズミのMIFを含有する蛋白質画分を使用するため
の前提である。接合体はそれ自体公知の方法により、例
えばカルボジイミド、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒ
ド、N,N′−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−
マレイミドベンゾイルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ−
（３−（２′−ピリジルジチオ）−プロピオンオキシ）
−サクシンイミド又はこれらに類似するものを用いるカ
ップリングにより製造することができる。免疫するため
に、グルタルアルデヒドであらかじめ処理された羊赤血
球とヒト又はマウス細胞からのMIF含有蛋白質画分との
接合体が好ましい。

ヒト−MIFにより免疫するための好ましい哺乳動物はマ
ウス又はラット、特にBalb/cマウスである。マウス−MI
Fにより免疫するためにはラット、例えばDA−ラットを
用いるのが好ましい。免疫操作はそれ自体公知の方法に
より行い、例えば抗原性ヒト−MIF接合体を、所望によ
りリンパ球産制刺激助剤、例えば完全フロインドアジュ
バント又は不完全フロインドアジュバントと共に、１〜
10日の間隔で、３〜８回非経口的に、例えば腹腔内又は
皮下に注射することにより行う。さらに、動物を２〜４
回の注射により前免疫し、そして８〜12ケ月後にさらに
注射を行うこともできる。

免疫された動物の抗体産生細胞、好ましくは脾臓細胞
を、最後の免疫の２〜６日後に動物から取り出し、そし
て融合促進剤の存在下で適当なセルラインの骨髄腫細胞
と融合せしめる。適合な融合のパートナーとして種々の
異る骨髄腫セルライン及びそれから誘導されたセルライ
ンが知られている。酵素ヒポキサンチン−グアニン−ホ
スホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）又は酵素チ
ミジンキナーゼ（TK）が欠落しており、そしてそれ故に
ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有す
る選択培地（HAT培地）、又はヒポキサンチン及びアザ
セリンを含有する選択培地中で生存することができない
骨髄腫細胞が好ましい。HAT培地又はヒポキサンチン／
アザセリン培地中に生存せず、そして免疫グロブリン又
はその部分を分泌しない骨髄腫細胞及びそれから調製さ
れたセルライン、例えばセルラインX63−Ag8.653、及び
Sp2/0−Ag14が好ましい。Balb/cマウス由来のセルライ
ンX63−Ag8.653はマウス、例えばBalb/cマウスのリンパ
球との融合に適当であるのみならず、ラット、例えばDA
ラットのリンパ球との融合のためにも適当である。

融合促進剤として、場合によってはUV不活性化された形
であるセンダイウイルス又は他のパラミキソウイルス、
カルシウムイオン、界面活性脂質、例えばリソレシチ
ン、又はポリエチレングリコールを挙げることができ
る。骨髄腫細胞と、２〜10倍過剰量の免疫された動物か
らの脾臓細胞とを、約1000〜約6000の分子量を有するポ
リエチレングリコールの約３〜約50％の溶液中で融合せ
しめるのが好ましい。

融合の後、細胞を分離し、そして選択用のHAT培地又は
ヒポキサンチン／アザセリン培地中で培養する。この
際、ハイブリドーマ細胞は骨髄腫細胞由来のイン−ビト
ロ生存能力、及び免疫された動物の抗体産生細胞由来の
HGPRT遺伝子又はTK遺伝子の欠落そしてそれによる選択
培地中での生存能力を兼備するため、ハイブリドーマ細
胞のみが生存する。

ハイブリドーマ細胞増殖のための適当な培地は常用の標
準的培地、例えばドゥルベコの変形イーグル培地又はRP
MI1640培地である。好ましくは細胞増殖の最初にいわゆ
るフィーダー細胞、例えば正常な腹腔性のマウス浸出細
胞、脾細胞、骨髄マクロファージ又はこれらに類するも
のを添加する。ハイブリドーマ細胞の上に通常の骨髄腫
細胞が増殖するのを防止するために、規則的な間隔で上
記の培地に選択用のHAT培地又はヒポキサンチン／アザ
セリン培地を補充する。

次に、ハイブリドーマ細胞の細胞培養上清液を、それが
目的モノクローナル抗体を含有するか否かについて試験
する。このために好ましくは、すでに記載されているよ
うに、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
イ、及び／又はMIF活性の決定を用いる。このようにし
て選択した細胞クローンを常用の標準的培地中で培養
し、そして所望によりそれ自体公知の方法で凍結し、そ
して／又は限界稀釈法によりもしくは寒天上での分散に
より再クローン化する。

この発明はさらに、特に生物学的液体中又は細胞表面上
のヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒト−MIF）の
定量的測定のためにヒト−MIFに対するモノクローナル
抗体を使用することに関する。例えば、この発明のモノ
クローナル抗体は、抗原（ヒト−MIF）とモノクローナ
ル抗体との間の結合相互作用を用いるそれ自体公知のイ
ムノアッセイ法のいずれかにおいて使用することでき
る。このような測定方法の例として、ラジオイムノアッ
セイ、（RIA）、エンザイムイムノアッセイ、免疫螢光
試験、ラテックス凝集試験、又は血球凝集試験を挙げる
ことができる。

この発明の抗体は、それ自体として、又は放射性標識誘
導体として、場合によっては他の標識抗体及び／又は蛋
白質と組合わせて、ラジオイムノアッセイ（RIA）にお
いて使用することができる。RIAの公知の変法のいずれ
か、例えば均一相中でのRIA、固相もしくは不均一相RI
A、又はシングルRIAもしくはダブル（サンドイッチ）RI
Aを用いてヒト−MIFの直接又は間接（競争的）測定を行
うことができる。

好ましいRIAにおいては、適当な担体、例えばタイター
プレートのプラスチック表面、又は例えばポリスチレ
ン、ポリプロピレンもしくはポリ塩化ビニル製の試験
管、ガラス製もしくはプラスチック製のビーズ、紙、
デキストラン−、セルロースアセテート−もしくはニト
ロセルロース−シート、又はこれらに類似するものに、
ヒト−MIFを含有する試験液又は標準液を、単純吸着に
より又は場合によっては担体を例えばグルタルアルデヒ
ドもしくはブロムシアンで活性化した後に被覆し、そし
てこの発明のモノクローナル抗体とインキュベートしそ
して次に第２の抗体溶液とインキュベートする。この場
合、第２の抗体、例えばラビット抗−マウス免疫グロブ
リンがこの発明のモノクローナル抗体を認識し、そして
これと結合する。結合した第２抗体の量を、第２抗体が
放射性標識されている場合には直接に、又はこの第２抗
体に対して高い親和性を有する放射性標識された蛋白
質、例えばスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylo
coccus aureus）由来のプロテインＡとの反応の後に、
決定する。

この発明のモノクローナル抗体はそれ自体として、又は
酵素標識された誘導体としてエンザイムイムノアッセイ
において使用される。このようなイムノアッセイ法は、
例えば、この発明のモノクローナル抗体のエピトープを
認識しそして結合するそれ自体公知の酵素標識された抗
体、又は酵素標識されたこの発明のモノクローナル抗体
誘導体を使用する試験方法である。酵素標識された抗体
のほかに、抗体−ビオチン接合体及びアビジン−酵素接
合体も使用される。エンザイムイムノアッセイにおいて
使用する酵素の例としてホースラディッシュ−パーオキ
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラー
ゼ、カーボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエス
テラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、又
はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを挙
げることができる。

ELISA法（エンザイム・リンクド・イムノソルベント・
アッセイ）が好ましく、この方法においては、担体（こ
れは例えばシングルRIA試験について前記したものであ
り、そして場合によっては赤血球が付加されている）に
単純吸着により、又は場合によっては担体もしくは担体
に結合した赤血球をグルタルアルデヒドにより活性化し
た後に、ヒト−MIF含有試験液又は標準液を被覆し、あ
るいはヒト−MIFを測定すべき細胞を付加し、そして次
にこの担体をこの発明のモノクローナル抗体と共にイン
キュベートしそして次にこの発明のモノクローナル抗体
を認識しそして結合する酵素標識された第２の担体の溶
液と共にインキュベートする。この場合、結合した第２
抗体、例えばパーオキシダーゼで標識されたラビット抗
−マウス免疫グロブリンの量を、酵素基質を用いる発色
により可視化し、そして決定する。

次のELISA法が特に好ましい。すなわち、担体、例えば
シングルRIA法について前記した担体に、単純吸着によ
り、又は場合によっては担体をグルタルアルデヒドもし
くはブロムシアンにより活性化した後、この発明のモノ
クローナル抗体の溶液を被覆し、次にこの抗体をヒト−
MIF含有試験液又は標純液とインキュベートし、そして
次にヒト−MIFの他のエピトープを認識する場合がある
酵素で標識されたこの発明の担体の溶液と共にインキュ
ベートするか、あるいは好ましくはビオチンと接合した
この発明の抗体の溶液とインキュベートしそして次にア
ビジン−酵素接合体と共にインキュベートする。この
際、結合した酵素標識又はビオチン標識された担体が、
酵素基質を用いる発色により可視化されそして決定され
る。

この発明のエンザイムイムノアッセイにおける好ましい
酵素基質５−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレンジアミ
ン、3,3′−ジメトキシベンジジン、3,3′,5,5′−テト
ラメチルベンジジン、2,2′−アジノ−ビス−（３−エ
チルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）又はこれらに
類似するもの及び過酸化水素により発色することができ
るホースラディッシュ−パーオキシダーゼ、並びに酵素
基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートからｐ−ニトロフ
ェノールを遊離せしめるアルカリ性ホスファターゼであ
る。

ヒト−MIFの定性的又は定量的測定のための、ヒト−MIF
に対するモノクローナル抗体及びその誘導体のこの発明
の使用には、前記以外のそれ自体公知のイムノアッセ
イ、例えば螢光物質と抗体接合体又は抗原接合体を用い
る免疫螢光法、抗体又は抗原で被覆されたラテックス粒
子を用いるラテックス凝集法、抗体又は抗原で被覆され
た赤血球を用いる血球凝集法、等が含まれる。

前記のイムノアッセイは、生物学的溶液、特にヒトの血
液中に存在するか、又は固定された形で細胞表面上に存
在するヒト−MIFの量の決定に使用することができ、そ
してこれによって免疫調節障害を有する患者の診断が容
易になる。例えば、血液中にヒト−MIFが存在せず又は
その量が平均以下である場合、低い感染耐性について、
原因となる免疫調節障害を診断することができる。さら
に、MIFは特定の組織タイプ及び特定の病理状態におい
てのみ生ずる（次の表）から、病理組織中、例えば黒色
腫、肉芽腫及び肥厚中の村ヒト−MIFの測定が簡単な診
断を可能にする。

この発明はさらに、ヒト−マクロファージ遊走阻止因子
（ヒト−MIF）の定性的及び定量的測定のための試験キ
ットに関し、このキットは、ヒト−MIFに対するモノク
ローナル抗体及び／又はその誘導体、並びに場合によっ
ては付属物を含んで成ることを特徴とする。

ラジオイムノアッセイのためのこの発明の試験キット
は、例えば適当な担体、この発明の抗体又は放射性標識
されたこの発明の抗体誘導体の場合によっては凍結され
た又は濃縮された溶液、放射性標識されている場合があ
る第２抗体及び／又は場合によっては、スタフィロコッ
カス・アウレウス由来の放射性標識されたプロテイン
Ａ、精製されたヒト−MIF又はその個々の蛋白質の標準
溶液、緩衝液、グルタルアルデヒドを含有する固定液、
非特異的結合及び凝集体形成を防止するための洗剤、ピ
ペット、反応器、換算曲線等を含む。

エンザイムイムノアッセイのためのこの発明の試験キッ
トは例えば、適当な担体、この発明のモノクローナル抗
体の場合によっては凍結された又は濃縮された溶液、酵
素標識又はビオチン標識されているこの発明の抗体誘導
体、この発明のモノクローナル抗体を認識しそして結合
する酵素標識された抗体の場合によっては凍結された又
は濃縮された溶液、アビジン−酵素接合体の場合によっ
ては凍結された又は濃縮された溶液、固体の形又は溶解
した形の酵素基質、精製されたヒト−MIF又はその個々
の蛋白質の標準溶液、緩衝液、グルタルアルデヒドを含
有する固定液、洗剤、ピペット、反応器、換算曲線等を
含む。

この発明はさらに、ヒト−MIFを精製するための、ヒト
−MIFに対するモノクローナル抗体及びその誘導体の使
用に関する。例えば、モノクローナル抗体とヒト−MIF
の抗原決定基との間の結合相互作用に基く分離作用を利
用するそれ自体公知の技法を用いてヒト−MIFを分離す
ることができる。好ましい分離方法は、前記に記載した
免疫アフィニティークロマトグラフィーである。

この発明はさらに、医療的に有効な量の精製されたヒト
−MIF、その個々の蛋白質、ヒト−MIFに対するモノクロ
ーナル抗体又はこのようなモノクローナル抗体の誘導
体、及び有意量の医薬担体を含んで成る医薬に関する。
モノクローナル抗体の適当な誘導体は、ヒト−MIFの抗
原決定基に対するその特異性を保持している断片、例え
ばFab、Fab′又はＦ（ab′）_２断片である。

この発明の医薬は、経腸投与により、例えば鼻内投与、
直腸投与又は経口投与により、そして好ましくは非経腸
投与により、例えば筋肉内投与、皮下投与、又は静脈内
投与により、温血動物、例えばヒトに投与される。意図
される投与方法に依存して、この医薬は単位投与形、例
えばアンプル、バイアル、坐薬、糖衣丸剤、錠剤、カプ
セル、又は流体もしくは固体の形の鼻内スプレーとして
存在することができる。

医療的に有効なこの化合物の投与すべき量は、温血動
物、例えばばヒトの状態、例えば体重、疾患の種類及び
重症度、並びに一般的状態、さらには投与方法に衣存
し、そして治療に当る医師による評価に従う。ヒト−MI
F及びその活性な個々の蛋白質の有効量は0.001〜１μg/
kg体重／日の範囲であり、ヒト−MIFに対するモノクロ
ーナル抗体及びその誘導体は0.001〜1mg/kg体重／日の
範囲である。

本発明のヒト−MIFを、上記の有効投与量の約100倍の量
でマウスに腹腔内投与した場合、実質的な急性毒性を示
さない。

この発明の医薬は常用の無機又は有機の固体又は液体の
医薬として許容される担体を、場合によっては他の医薬
として活性な化合物及び／又は助剤と供に含有する。活
性物質の溶液又は懸濁液、特に等張溶液又は懸濁液、さ
らには使用直前に水に溶解する凍結乾燥品が好ましい。
医薬は殺菌することができ、そして／又は防腐剤、安定
剤、、湿潤剤、乳化剤、溶解促進剤、増粘剤、浸透圧調
節塩及び／又は緩衝剤、さらには他の蛋白質、例えばヒ
ト−血清アルブミン又はヒト−血漿標品を含有すること
ができる。

医薬として有効な量のヒト−MIF又はその個々の蛋白質
を含有する水性分散体中リポゾームの形の医薬が好まし
い。特に、可能な限り均一な大きさの集団からなり、約
2.0×10^-8〜5.0×10^-6mの直径を有し、リピド成分、例
えば両親媒性リピド、例えばホスホリピド、例えばレシ
チン、ケフアリン又はホスフアチジル酸、及び場合によ
っては中性リピド、例えばコレステロールから成る１又
は複数の２重層から構成されており、そしてこの発明の
精製されたヒト−MIF又はその個々の蛋白質を含有する
水性内部空間を包囲しているリポゾームが好ましい。

次に例によりこの発明をさらに詳細に説明するが、これ
によってこの発明の範囲を限定するものではない。

例において使用する略号は次の意味を有する。

ELISA エンザイムアッセイ（エンザイムリンクドイム
ノソルベントアッセイ） HAT ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン HPLC 高圧液体クロマトグラフィー HT ヒポキサンチン／チミジン MIF マクロファージ遊走阻止因子 PBS 燐酸緩衝化生理的食塩水 RIA ラジオイムノアッセイ SDS ドデシル硫酸ナトリウム SDS−PAGE SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 SRBC 羊赤血球 トリス（Tris）トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン rpm 回転数／分 例１ ヒト−MIFを含有する蛋白質画分の取得 単核細胞を、“バフィーコート”、すなわちクエン酸塩
又はヘパリンを添加した静脈血の遠心分離により堆積す
る白血球層から得、そしてロイカフェレシスゼ（Leucap
heresis）及びIBM血球分離機（IBM 2997）中でのフィコ
ール（Ficoll）（商標）−グラジエントでの連続遠心分
離から成る２段階法により精製する〔U.Feige及びC.Sor
g,ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（J.Im
munol.Methods）66,161（1984）〕。単核細胞をスピン
ナー（Spinner）培地（セロメド）中で洗浄し、そして
培養器底cm²当り0.17mlのRPMI 1640培地中５×10⁶細胞
の濃度において２時間、16⁶個の細胞当り0.67μｇのコ
ンカナバリンＡにより刺激する。RMMI 1640培地の更新
及びそれに続く37℃にて20時間の５％CO₃を通気しなが
らのインキュベーションを行いリンフォカインを含有す
る培養上清液を得る。これを、４℃、17,000rpm（SS 3
4ローター、ソルバル遠心機）にて30分間遠心分離す
る。無細胞上清液を、0.05MのNH₄HCO₃中で平衡化された
セファデックスG25（商標）上で脱塩し、そして次に蛋
白質含有画分を凍結乾燥する。この凍結乾燥物を、0.1M
NaClが添加されている0.01燐酸ナトリウム緩衝液pH7.5
に入れ、そして同じ緩衝液中でセファデックスG100を用
いてクロマトグラフ処理する。８〜14kg/Mol（キロダル
トン）の範囲の分子量を有する蛋白質を含有するヒト−
MIF−含有画分を一緒にし、そしてローターベーパー中
で16倍濃縮する。

例2. ハイブリドーマ細胞の調製 2.1 ヒトMIF含有蛋白質画分と羊赤血球との接合 2.5mlの包装された羊赤血球〔羊赤血球細胞,SRBC,ベー
リングベルケ（Behringwerke）〕を20mlのPBSに懸濁す
る。このSRBC懸濁液100μを、PBS中ルグタルアルデヒ
ドの溶液900μと共に、グルタルアルデヒドの最終濃
度が0.05％となるようにして５分間インキュベートす
る。このようにして前処理したSRBCを氷冷蒸留水で２回
洗浄し、遠心分離し、そして例１からのヒト−MIF含有
画分300μと共に20℃にて１時間インキュベートす
る。この懸濁液を免疫処理のために使用する。

2.2 免疫処理 Balb/cマウスを、0,7,及び10日目に、例2.1からのヒト
−MIFと結合したSRBC懸濁液0.5mlずつを、0.5mlずつの
完全フロインドアジュバンドと共に３回注射することに
より免疫する。この場合、注射量の半分を腹腔内（i.
p.）に注射し、そして他の半分は４部分に分けて皮下
（s.c.）注射する。13日目及び14日目に、アジュバント
を伴わないで0.5mlずつの接合体懸濁液をさらに２回i.
p.投与により“追加（booster）”免疫注射する。18日
目に、処理されたマウスの脾臓を摘出する。

2.3 細胞融合 Ｋhler及びMilsteinの方法〔G.Khler及びC.Milstei
n,ネイチュアー（Nature）256,495（1975）〕に従っ
て、10⁸個の脾臓リンパ球を、ドゥルベコの変形イーグ
ル培地中35％ポリエチレングリコール4000（メルク，ダ
ルムスタット）及び9.7％ジメチルスルホキシドの溶液
1.5ml中で3.3×10⁷個のマウス骨髄腫細胞P3−X63−Ag8.
653〔J.F.Kearney,A.Radbruch,B.Liesegang及びK.Rajew
sky,ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）12
3,1548（1979）〕と混合する。融合の後、細胞をファル
コン3040の96−ウエルプレートの600個のウエル中にプ
レートし、そしてリトルフィールドのHAM培地（ヒポキ
サンチン／アミノプテリン／チミジン標準培地）〔J.W.
Littlefield,サイエンス（Science）145,709（1974）〕
中でフィーダー細胞としての骨髄マクロファージと共に
培養する。HAT培地中で10日間培養した後、RPMI 1640HT
培地中で培養を継続する。

例3. 抗体特異性にについてのハイブリドーマ細胞の試
験 3.1 γ−グロブリンの検出 ハイブリドーマ細胞培養液の上清液をELISA（エンザイ
ム・リンクド・イムノソルベント・アッセイ）において
試験する。この方法においては、ラビットから得られ、
パーオキシダーゼと接合されており、そしてマウスγ−
グロブリンを認識しそしてこれを結合する第２の抗体を
用いる。103個のハイブリドーマセルラインの内72個の
クローンがγ−グロブリンを産生する。

3.2 目的とする分子量範囲の蛋白質に対する特異性 同系マウスの赤血球（ホール当り100μのPBS中１×10
⁶個の赤血球）を、ポリ−Ｌ−リジン（25mg/ml）で被覆
された96−ウエルプレート（ダイナテック・ミクロタイ
マー）に適用し、そして４℃にて一夜インキュベートす
る。PBSで反復洗浄することにより未結合赤血球を除去
する。こうして結合した赤血球を例2.1に記載したよう
にしてグルタルアルデヒド中で固定し、洗浄、そして８
〜14kg/Molの分子量範囲のヒト−MIF含有画分（例１）
とインキュベートする。反復洗浄によって未結合蛋白質
を除去し、そしてこのプレートを0.1％NaN₃を含有するP
BS中に貯蔵する。プレートをハイブリドーマ細胞の培養
上清液とインキュベートし、そして次にアルカリ性ホス
ファターゼと結合したラビット抗−マウス免疫グロブリ
ン第２抗体とインキュベートし、そして２−アミノ−２
−エチル−1,3−プロパンジオール緩衝液中ｐ−ニトロ
フェニルホスフェート（セルバ）により発色せしめる。
放出されたｐ−ニトロフェノールを405nmにおいて分光
的に検出する。このELISA法により、例１からのヒト−M
IF含有分子量画分に結合するモノクローナル抗体が同定
される。γ−グロブリンを分泌する72個の細胞クローン
の内15クローンがこの測定において結合されるモノクロ
ーナル抗体を産生する。

3.3 ヒト−MIFに対する特異性 例3.2に従って同定されたクローンの培養上清液からの
γ−グロブリンを硫酸アンモニウムを用いて50％飽和に
おいて沈澱せしめ、そしてこの沈澱物をPSBに入れ、そ
して製造者により指示された方法によりAffi−Gel（商
標）10（ビオーラド）に結合せしめた。こうして固定化
したγ−グロブリンを４℃にて一夜、コンカナバリンＡ
により刺激された単核細胞のヒト−MIF含有上清液（例
１）と共にインキュベートし、そして次にIEC遠心分離
機中で3000rpm,4℃にて10分間遠心する。次に上清液
を、例４のMIF試験におけるヒト−MIFの残留量について
試験する。この方法において、ヒト−MIFに対するモノ
クローナル抗体を産生するIC5と称するセルラインが同
定される。

例4. ヒト−マクロファージ遊走阻止因子についての試
験（MIF試験） 4.1 パーコル（Percoll）グラジエントの調製 密度1.007のパーコル（商標，ファルマシア）９部、10
倍濃縮されたエール（Earl）のMEM（セロメド）１部、
及びスピンナー培地（セロメド）10倍を、ソルバル遠心
分離機（デュポン）中で12,000rpm,20℃にて12分間混合
する。

4.2 MIF試薬のための標的細胞の取得 ９〜12の供与体からの“バフィーコート”すなわち白血
球の細胞濃縮物を1:2の比率でスピンナー培地（セロメ
ド）により稀釈し、20℃に加熱し、そしてフィコール・
パク（Ficoll paque）（商標，ファルマシア）上で２℃
にて製造者によって指示された方法で分離する。中間相
の単核細胞を遠心分離した後、同じ培地で２回洗浄し、
そして次にIEC遠心分離機中で20℃,1600rpmにて40分間
にわたり遠心することにより、例4.1に従って調製した
パーコルグラジエント中で単球とリンパ球とに分離す
る。単球をスピンナー培地で３回洗浄し、20％のウマ血
清が添加されているマッコイ（McCoy）培地（セロメ
ド）に入れ、そしてテフロンバッグ中の同じ培地中で７
％CO₂を通しながら37℃にて一夜培養する。

4.3 MIF試験の実施 例4.2からの培養された単球をドゥルベコのMEM（セロメ
ド）中で２回洗浄し、そして細胞濃度が５×10⁵細胞/ml
となるように、２倍濃度のドゥルベコMEM1部及び0.4％
アガロース（マイルス）１部の混合物中に入れる。この
細胞懸濁液を、ハミルトンシリンジにより、96−ウエル
プレート（ファルコン，ミクロテストIII）の内側の60
ウエルに１μの滴として移す。４℃にて15分間の後ア
ガロースが固化する。次に、試験すべきサンプル溶液10
0μを各ウエルに加える。対照溶液として、１％のウ
マ血清が加えられているドゥルベコMEMを使用する。試
験すべきサンプル溶液の稀釈物を同じ培地中で調製す
る。プレートを、７％CO₂を通気しながら湿潤雰囲気下
で37℃にて15時間インキュベートする。

アガロース滴からの単球の遊走を、顕微鏡の接眼レンズ
中の目盛付網目印により測定する。この測定は、滴の縁
に接するように網目の１つの軸を配置し、そして滴の縁
から細胞の遊走限界までの距離をそれに対して垂直な軸
を用いて測定することにより実施する。目盛により測定
された対照溶液における細胞の遊走を100％の遊走又は
０％の遊走阻害とする。サンプル溶液において達成され
た遊走距離を、それに関して遊走阻害％として表示す
る。サンプル溶液の生物学的活性をMIF単位として表示
する。MIF単位は、前記の試験方法において30％の遊走
阻害を生じさせる生物学的活性として定義される。従っ
て、サンプル溶液のMIF単位の数値は、正確に30％の遊
走阻害を生じさせるために溶液を稀釈しなければならな
いその稀釈係数に対応する。

例5.腹水からのモノクローナル抗体の単離及び精製 Balb/cマウスを0.4mlのプリスタン（カール・ロス）に
より腹腔内前処理する。１週間後、２〜５×10⁶個のク
ローン化ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射する。各マウ
スから反復して腹水を採取し、そして−80℃にて凍結す
る。集められた液を解凍し、そして４℃、16,000rpmに
て30分間遠心分離する。脂肪を吸引去し、そして残っ
た破片を含有しない上清液に、０℃にて攪拌しながら、
50％の濃度に達するまで、飽和硫酸アンモニウム溶液を
ゆっくりと滴加する。こうして沈澱した粗免疫グロブリ
ン画分を、DEAE Affi−Gel Blue（商標，ビオーラド）
上で0.1Mトリス−HCl（pH8.2）を用いて、製造者により
特定された方法によりクロマトグラフ処理する。活性画
分を集め、そしてアミコンXM50フィルター（アミコン）
を用いて濃縮する。

例6.抗体カラムの調製 Affi−Gel 10（商標，ビオーラド）を、製造者により特
定された方法に従って、冷蒸留水及びカップリング緩衝
液pH7.5〔MOPS,3−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホ
ン酸〕により洗浄する。カップリング緩衝液（1ml）中
上記ゲルの50％懸濁液をプラスチックチューブに移し、
同じ量の精製抗体溶液（20mgのモノクローナル抗体1C
5）と混合し、そして室温にて４時間回転せしめる。次
にゲルをカップリング緩衝液で洗浄する。まだ遊離して
いる活性部位をブロックするため、ゲル1ml当り0.1mlの
1Mエタノールアミン−HCl（pH8.0）により室温にて２時
間ゲルを処理し、そしてゲル1ml当り10mモルのナトリウ
ムアジドを含有するPBSにより洗浄し、そしてこの中で
４℃にて保持する。カップリングの程度を280nmにおけ
る吸収を測定することにより決定する。これはゲル1ml
当り12〜30mgのモノクローナル抗体である。

例7. ヒト−MIF蛋白質の単離及び精製 7.1 ヒト−MIFの製造 例１に記載した方法に従って、10¹¹個の単核細胞をバフ
ィーコートから単離し、そしてコンカナバリンＡ（con
A）で刺激してリンフォカインを産生せしめる。刺激さ
れた細胞を、24時間、37℃、５％CO₂を通気しながら、6
000cm²の培養面積を有するNunc積層槽中で、各場合に面
積cm²当り0.25mlのRPMI 1640培地中５×10⁶細胞の細胞
濃度において培養する。次に、細胞培養上清液を35000
×ｇ、４℃にて30分間遠心分離する。次に、透明な上清
液にフェニルメタンスルホニルフルオリド、セリンプロ
テアーゼ阻害剤（最終濃度50μモル／）、及びナトリ
ウムアジド（最終濃度0.05％）を加える。

7.2 細胞培養上清液の濃縮 例7.1からの細胞培養上清液を、アミコン撹拌セル中YMS
メンブラン（名目分離限界：分子量5kg/Mol）上での限
外過により15倍に濃縮する。蛋白質の吸着による損失
を回避し、そして生ずる可能性のある凝集を防止するた
めに、限外過はトリトンＸ−100（商標）（アルキル
−フェニルポリエチレングリコール、ローム・アンド・
ハース）を添加して行う。トリトンＸ−100の最終濃度
は約0.2w/v％とする。濃縮物を35000×ｇにて遠心分離
し、そして0.25μｍのフィルター（ミリポア）を通して
過する。

7.3 イムノアフィニティークロマトグラフィー 例7.2からの１のリンフォカイン濃縮物を、４℃に
て、約10ml/時の流速で、ゲルml当り12mgの抗体のカッ
プリングの程度を有するゲル4mlを収容する抗体カラム
（例６）に、ポンプを用いて通す。非特異的に結合した
蛋白質及び随伴する物質を、100mlのPBS/0.5M NaCl/0.2
％トリトンＸ−100/0.02％ナトリウムアジド、pH7.3に
より洗浄し、そして次に20mlのPBSにより、そして最後
に10ml/0.1M NaClにより15ml/時の流速で洗浄すること
によりカラムから溶出する。特異的に結合したヒト−MI
F蛋白質を0.1Mグリシンヒドロクロリド/0.1M NaCl,pH2.
6の溶液で溶出する。この溶出は280nmにおける吸収の自
動測定（ユビコードS,LKSインストルメンツ）により監
視する。吸着による損失を回避するため、溶出液を100
μの３％SDS溶液を収容するポリプロピレンチューブ
中に3mlずつの画分として集める。蛋白質含有画分を集
め、そして1Mトリス溶液の添加により中和する。

7.4 電気透析、電気泳動濃縮 “ISCOエレクトロフォレティック・コンセントレータ
ー”モデル1750（Isco社）及び分子量3.5kg/Molの名目
分離限界を有するスペクトラポール（商標）膜（スペク
トラム・メディカル・インダストリーズ社）を用いて、
例7.3からの中和された溶出液を25mモルの酢酸アンモニ
ウム/0.01％SDS,pH8.3に対して透析し、そして同時に0.
2mlの容量に濃縮する。透析された濃縮物を真空遠心機
（スピード・バク・コンセントレーター，サバント社）
中で蒸発により濃縮乾固して酢酸アンモニウムを除去す
る。

7.5 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAG
E）によるMIF蛋白質の分析 透析された濃縮物（例7.4）のアリコート（約２％）
を、Laemmli法〔U.K.Laemmli,ネイチュアー（Nature）2
27,680−685（1970）〕に従って、15％ポリアクリルア
ミドスラブゲル上での電気泳動にかける。蛋白質バンド
を、クマッシーブリリアントブルー（フルカ）による染
色及びC.R.Merril等〔アナリティカル・ビオケミストリ
ー（Anal.Biochem.）110,201（1981）〕に従う銀染色法
により可視化する。これによれば、抗体カラムから溶出
された物質は分子量が約8kg/Molの蛋白質及び約14kg/Mo
lの蛋白質、並びに相対的に非常に少量の分子量が約28k
g/Molの蛋白質及び約45kg/Molの蛋白質を有する。

7.6 イムノアフィニティークロマトグラフィーにより
単離された蛋白質のMIF活性の特徴付け ヒト−MIFの個々の蛋白質の低損失調製分離及び単離は
洗浄、例えばSDSの存在下で有利に行われる（例7.3、7.
4及び7.7を参照のこと）。蛋白質のMIF活性はSDSとの相
互作用により破壊される。MIF活性は、次のようにして
生合成的に放射性標識されたリンフォカインにより個々
の分子量画分に帰属せしめる。10⁸個のヒト単核細胞
を、３μg/mlのコンカナバリンＡを含有するRPMI 1640
培地5mlに懸濁し、そして25cm²の面積を有する細胞培養
器〔ヌンコロン（商標）TC25〕中で５％CO₃を通気しな
がら37℃にて２時間インキュベートする。次に培地を除
去し、そして細胞をロイシン不含RPMI 1640培地中で20
時間培養し、これに10μCi/mlのＬ−〔Ｕ−¹⁴C〕ロイシ
ンを加える。放射性細胞培養上清液を500mlの非標識ヒ
ト−MIF含有細胞培養上清（例7.1）と一緒にし、そして
例7.2に記載したようにして15倍に濃縮する。例7.3と同
様にして、0.5mlのゲルを収容するカラムを用いてイム
ノアフィニティークロマトグラフィーにより単離し、SD
Sを加えないで溶出液を集める。1Mトリス溶液で中和し
た後、溶出後を50mモルの炭酸水素アンモニウム中セフ
ァデックスＧ−25カラム（ファルマシア）上でのクロマ
トグラフィーに移し、そして凍結する。残渣を0.5mlのP
BSに溶解し、そして約35000×ｇにおいて遠心する。0.1
mlのアリコートをBio−Sil（商標）TSK−125カラム（7.
5×300mm,Bio−Rad）を用いるHPLCにより画分する。画
分を、放射能を測定し（標識された蛋白質として）、そ
してMIF活性を決定する（例４）ことにより特徴付け
る。放射能及びMIF決性が、約8kg/Mol及び約14kg/Molの
分子量領域に対応する位置の画分に存在する。放射性溶
出液の他のアリコートを例7.5と同様にしてSDS−PAGEに
かける。放射性蛋白質をオートラジオグラフィーにより
可視化する。約8kg/Mol及び約14kg/Molの分子量領域に
強いバンドが現われ、そして約28kg/Mol及び約45kg/Mol
の領域に弱いバンドが現われる。

7.7 SDS−PAGEによるヒト−MIF蛋白質の調製的分離及
び電気溶出による単離 約50の細胞培養上清液から成る例7.4に従って調製さ
れた材料を、垂直スラブゲル電気泳動系でのLaemmli法
〔ネイチュアー（Nature）227,680（1970）〕に従う不
連続緩衝液系においてSDS−PAGEにより分離する。サン
プルを、0.05トリス−HCl/3w/v％SDS/0.02Mジチオスレ
イトール/10v/v％グルセリン（pH6.8）から成る組成の
緩衝液300μ中に溶解し、そして幅1.5cm、厚さ1.5cm
の、15％アクリルアミドを含有するゲルに適用する。ゲ
ル中の遊離基及び酸化剤によって生ずる可能性がある蛋
白質の誘導体化を回避するため、ナトリウムチオグリコ
レートを0.1mモルの濃度になるようにカソード緩衝液に
加える〔M.W.Hunkapiller等、メソッズ・イン・エンチ
モロジー（Methods in Enzymology）91,227（1983）を
参照のこと〕。蛋白質を可視化するため、ゲルを氷冷し
た0.25M KCl溶液中に５分間置く〔D.A.Hager及びR.R.Bu
rgess、アナリティカル・ビオチミストリー（Anal.Bioc
hem.）109,76（1980）を参照のこと〕。8kg/Mol及び14k
g/Molの分子量領域の可視バンドを切り取り、そしてBho
wn等〔アナリティカル・ビオケミストリー（Anal.Bioch
em.）103,184（1980）〕により記載された技法を用いて
蛋白質をゲルから溶出する。この目的のため、スペクト
ロポール（商標）膜（スペクトラム・メディカル・イン
ダストリーズ、名目分離限界3.5kg/Mol）を有する“ISC
Oエレクトロホーレティック・コンセントレーター”モ
デル1750（ISCO社）中で、0.05M酢酸アンモニウム10.01
％SDSを用いて、２ワットの出力において８間にわたっ
て溶出する。溶出した蛋白質は約150μの容量でサン
プリングカップ中に見出され、そして緩衝物質（グリシ
ン．トリス）を含有しない。酢酸アンモニウムを除去す
るため、電気溶出液を真空遠心機（スピード・バク・コ
ンセントレーター、サバント社）中での蒸発により濃縮
乾固する。

溶出された蛋白質の均一性及び収量を、各場合に約５％
の溶出液を分析用SDS−PAGE例7.5）にかけることにより
試験する。この際、既知の分子量を有する規定された量
の蛋白質をサンプルと平行して電気泳動にかける。SDS
−PAGEは、8kg/Molの分子量領域からの溶出液中の均一
蛋白質バンド、及び14kg/Molの分子量領域からの溶出液
中の均一バンドを示す。

7.8 ゲル過HPLCによるヒト−MIF蛋白質の調製的分離
及び単離 例7.2からのヒト−MIF含有培養上清液の濃縮液２を、
約15ml/時の流速で、ゲルml当り約12mgのIC5抗体のカッ
プリングの程度を有するゲル5mlを収容する抗体カラム
（例６）に、ポンプにより通す。例7.3と同様にしてカ
ラムを洗浄し、そして特異的に結合したヒト−MIF蛋白
質を0.1Mグリシンヒドロクロリド10.1M NaCl（pH2.6）
により溶出する。溶出液は、SDSを添加してないポリプ
ロピレンチューブ中に画分して集める。溶出液は280nm
における吸収の測定、及びMIF活性の検出（例４）によ
り監視する。

４バッチ（合計８の培養上清濃縮液から成る）からの
一緒にした溶出液を、0.005M酢酸アンモニウム（pH7.
5）に対して透析し、そして例7.4と同様にして同時に0.
2mlの容量に濃縮する。この濃縮物を、Si300Polyol（商
標）0.003mmを収容する0.05M酢酸アンモニウム（pH7.
5）で平衡化されたHPLCカラム（セルバ、ハイデルベル
グ、西独）に導入し、そして40バールの圧力及び0.3ml/
分の通流速度で0.05M酢酸アンモニウム（pH7.5）により
溶出する。280nmにおける吸収の測定、MIF活性の決定
（例４）、及び例10のエンザイムイムノアッセイにより
溶出を監視する。蛋白質含有量及びMIF活性に関する主
要部分が約8kg/Mol及び約14kg/Molの分子量領域に対応
する位置の画分に見出され、一層少い部分が約28kg/Mol
及び約45kg/Molの分子量領域の画分中に見出される。酢
酸アンモニウムを除去するため、ヒト−MIF蛋白質を含
有する画分を反復して凍結乾燥する。

例8.アミノ酸配列分析 8.1 分子量8kg/MolのMIF蛋白質 例7.7からの分子量8kg/Molの精製蛋白質を“ガス−フェ
ーズ・プロティン・シークエンサー・モデル470"（アプ
ライド・ビオシステムス）を用いて、M.W.Hunkapiller
及びL.E.Hood〔メソッズ・イン・エンチモロジー（Meth
ods in Enzymology）91,399（1983）〕に従って配列決
定する。フェニルチオヒダントイン−（PTH）−アミノ
酸へのアニリノ−チアゾリノン誘導体の再配置を、50℃
にて25％トリフルオロ酢酸で処理することにより行う。
PTHアミノ酸をゾルバックス（Zorbax）CN（商標）カラ
ム（デュポン、200×4.6mm）上で分析する〔R.Knecht
等、アナリティカル・ビオケミストリー（Anal.Bioche
m.）130,65（1983）を参照のこと〕。次のような明確な
Ｎ−端アミノ酸配列が見出される。

この配列中、X₄₂はSer又はCysである。X₆₂,X₆₃及びX₆₄
は特定されていないアミノ酸を示す。

8.2 分子量14kg/MolのMIF蛋白質 例7.7からの分子量14kg/Molの精製蛋白質を例8.1と同様
にして配列決定する。次のような明確なＮ−端アミノ酸
配列が見出される。

この配列中X₁は特定されていないアミノ酸を示す。

例9. マウスMIFに対するモノクローナル抗体の製造 9.1 マウスMIFを含有する蛋白質画分の取得 C.Sorg〔モレキュラー・イムノロジー（Molecular Immu
nology）17,565（1980）〕により記載された方法に従っ
て、100匹のBalb/cマウスからの脾臓細胞をコンカナバ
リンＡで刺激することにより細胞上清液を得、これをセ
ファデックスＧ−100上でクロマトグラフ処理すること
により40〜70kg/Molの範囲の分子量のマウス−MIF蛋白
質を含有する溶液約50mlを得る。

9.2 羊赤血球へのマウス−MIF含有蛋白質画分の接合 例9.1からの画分を4.5mlの合計容量に濃縮し、そして例
2.1と同様にして、グルタルアルデヒドにより前処理さ
れた羊赤血球（SRBC）に連結する。

9.3 ラットの免疫 0,10,43,及び309日目に、例9.2からのマウスMIFと連結
された0.5mlずつのSRBCを、0.5mlずつの完全フロインド
アジュバントと一緒に７回注射することにより、DAラッ
トを免疫する。この場合注射量の半分を腹腔内（i.p.）
注射し、そして他の半分は４分割して皮下（s.c.）注射
する。さらに、312,313,及び314日目に、0.5mlずつの接
合体懸濁液をアジュバントを伴わないで“追加”免疫注
射（i.p.）する。処理されたラットの脾臓を317日目に
摘出する。

9.4 細胞融合 例2.3と同様にして、免疫されたラットの脾臓リンパ球
1.14×10⁸個を3.5×10⁷個のマウス骨髄腫細胞P3−X63−
Ag8.653と融合せしめ、そしてHAT培地中で培養する。

9.5 所望の特異性を有する抗体を分泌するハイブリド
ーマ細胞の選択 例3.1及び3.2に記載した方法と同様にして、例9.4に従
って得られた244個のハイブリドーマセルラインから、
ラット赤血球に連結された（例9.2と同様にして連結す
る）マウスMIFを含有する画分からの蛋白質に結合する
モノクローナル抗体を分泌する49クローンを選択する。
これら49細胞クローンの培養上清液からのγ−グロブリ
ンを、例3.3の方法に従ってAffi−Gel（商標）10（ビオ
ーラド）に連結し、そしてコンカナバンＡで刺激された
脾臓細胞のマウス−MIF含有上清液（例9.1）と共にイン
キュベートする。次に、上清液をマウス−MIFのその残
留量について試試する。この目的のために、マウス−MI
Fの含量を例4.3と同様にして行われるMIF試験により決
定する。しかしながらこの場合、培養されたヒト単球の
代りに、10％FCSを含有するドゥルベコMEMに入れられそ
してアガロース滴中に固定されたマウス腹腔マクロファ
ージを使用する。

この選択法を用いて、マウス−MIFに対するモノクロー
ナル抗体を産生する６個のハイブリドーマセルライン、
特に7D10と称する細胞クローンが同定される。これらの
抗体はまた例４に従うMIF試験においてヒト−MIFと結合
し、従って交差活性を示す。

9.6 腹水からのモノクローナル抗体の単離及び精製 例５と同様にして、プリスタンにより前処理されたBalb
/cマウス（nu/nu）に、１×10⁷個のクローン化ハイブリ
ドーマ細胞を腹腔内注射し、そして腹水から抗体を得
る。

例10. ヒト−MIFの決定のためのエンザイムイムノアッ
セイ（MIF−ELISA） 100μg/mlの濃度の精製された抗体溶液IC5（抗−ヒト−
MIF）100μを96−ウエルミクロタイタープレート（コ
スター、テクノラマ）の各ウエル中で37℃にて１時間イ
ンキュベートする。PGT−20−緩衝液〔0.2％ゼラチン
（メルク）及び0.05％トゥイーン20が添加されているPB
S〕により３回洗浄し、そしてプレート底のなお存在す
る蛋白質反応性結合部位を、ウエル当り250μのPGT−
20−緩衝液との37℃にて１時間にわたるインキュベーシ
ョンにより飽和する。試験溶液の一連の稀釈物50μ又
はヒト−MIFを含有する標準溶液をミクロタイタープレ
ートのウエル中で37℃にて１時間インキュベートする。
未結合部分をPGF−20−緩衝液で３回洗浄して除去し、
そして次に抗体7D10（抗−マウス−MIF、ヒト−MIFと交
差反応性である）とビオチンＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミジルエステルとから調製され（マデック、ビオチンと
抗体7D10とのモル比＝４〜7:1）そしてセファデックス
Ｇ−25上で精製された接合体（10μg/ml）のPBS中溶液
をウエル中で37℃にて30分間インキュベートする。プレ
ートをPGT−20−緩衝液により３回洗浄した後、プレー
トに結合したビオチン−抗体接合体を、アビジン−ホー
スラディッシュパーオキシダーゼ接合体（0.3μg/ml）
（シグマ）の1:3000稀釈溶液100μとインキュベート
することにより反応せしめる。プレートを洗浄した後、
2,2′−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩の溶液（ABTS、ベ
ーリンガーマンハイム、16μの30％H₂O₂を含有する10
0mlのクエン酸／燐酸緩衝液、0.05Mクエン酸塩、0.1M N
a₂HPO₄、pH4.0中55mg）による発色、及び405nmにおける
光度計による測定により、捕捉された酵素の量を決定す
る。

ビオチン−抗体7D10接合体の代りに、同様にして調製さ
れたビオチン−抗体IC5接合体を使用することができ
る。しかし、この方法により行われるELISAはヒト−MIF
に対して低い感度を有する。

例11. MIF−ELISA用の試験キット 例10に記載したエンザイムイムノアッセイ用試験キット
は次のものを含む。

ポリプロピレンミクロタイタープレート。

モノクローナル抗体IC5の溶液（10μg/ml）20ml。

モノクローナル抗体7D10のビオチン接合体（ビオチン
と抗体7D10とのモル比＝5:1、10μg/ml）10ml。

アビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼ接合
体（0.3μg/ml）1ml。

2,2′−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩11mg。

クエン酸／燐酸緩衝液（0.05Mクエン酸塩/0.1M Na₂HP
O₄）20ml。

30％H₂O₂ 1ml。

PBS 100ml。

PGT−20−緩衝液（0.2％ゼラチン及び0.05％トゥイー
ン20を含有するPBS）200ml。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＥ Ｕ 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/20 15/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (72)発明者 ラヨス ターツアイ ドイツ連邦共和国，7889 グレンザツハ― ビーレン，ムテンザーシユトラーセ 25 (72)発明者 バルター ビーゼンダンガー スイス国，4142 ミユンヘンシユタイン, スタイングリユベンベグ 12 (56)参考文献 ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＩＭＭ ＵＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．112，Ｎｏ．２, （1974）Ｐ．675〜682

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の性質：（１）ヒト−MIFに対する抗体
   により認識されそしてそれに結合されるエピトープを有
   するヒト−由来の蛋白質のみを含有し、（２）マクロフ
   ァージの遊走が測定される標準的試験方法において活性
   であり、そして（３）分子量が約8kg/Mol、約14kg/Mo
   l、約28kg/Mol及び約45kg/Molの少なくとも４種類の個
   々の蛋白質、並びに場合によってはさらに、約45kg/Mol
   より高い分子量を有する個々の蛋白質又はオリゴマー蛋
   白質凝集体から成る、ことを特徴とする精製されたヒト
   −マクロファージ遊走阻止因子（ヒト−MIF）。
2. 【請求項２】前記の分子量約14kg/Molの蛋白質のＮ−端
   アミノ酸配列が （ここで、アミノ酸X₁は特定されない）で表わされる特
   許請求の範囲第１項記載のヒト−マクロファージ遊走阻
   止因子。
3. 【請求項３】前記の分子量的8kg/Molの蛋白質のＮ−端
   アミノ酸配列が （ここで、アミノ酸X₄₂,X₆₂,X₆₃及びX₆₄は特定されず、
   しかしX₄₂はSer又はCysのみを意味することができる）
   で表わされる特許請求の範囲第１項に記載のヒト−マク
   ロファージ遊走阻止因子。
4. 【請求項４】次の性質：（１）ヒト−MIFに対する抗体
   により認識されそしてそれに結合されるエピトープを有
   するヒト−由来の蛋白質のみを含有し、（２）マクロフ
   ァージの遊走が測定される標準的試験方法において活性
   であり、そして（３）分子量が約8kg/Mol、約14kg/Mo
   l、約28kg/Mol及び約45kg/Molの少なくとも４種類の個
   々の蛋白質、並びに場合によってはさらに、約45kg/Mol
   より高い分子量を有する個々の蛋白質又はオリゴマー蛋
   白質凝集体から成る、ことを特徴とする精製されたヒト
   −マクロファージ遊走阻止因子（ヒト−MIF）の製造方
   法であって、所望によりそれ自体公知の精製段階の後
   に、ヒト−MIFを含有する溶液を、ヒト−MIFに対して特
   異的なモノクローナル抗体を有する支持体と接触せし
   め、非結合蛋白質及び他の外来性物質を除去し、前記抗
   体に結合したヒト−MIFを選択的に切り離しそして単離
   する、ことを特徴とする方法。
5. 【請求項５】次の性質：（１）ヒト−MIFに対する抗体
   により認識されそしてそれに結合されるエピトープを有
   するヒト−由来の蛋白質のみを含有し、（２）マクロフ
   ァージの遊走が測定される標準的試験方法において活性
   であり、そして（３）分子量が約8kg/Mol、約14kg/Mo
   l、約28kg/Mol及び約45kg/Molの少なくとも４種類の個
   々の蛋白質、並びに場合によってはさらに、約45kg/Mol
   より高い分子量を有する個々の蛋白質又はオリゴマー蛋
   白質凝集体から成る、ことを特徴とする精製されたヒト
   −マクロファージ遊走阻止因子（ヒト−MIF）をリポゾ
   ーム中に含んで成る、マクロファージ遊走阻止剤。
6. 【請求項６】合成ホスファチジルセリン及びホスファチ
   ジルコリンの混合物から成るリポゾームの水性分散体の
   形である特許請求の範囲第５項記載のヒト−マクロファ
   ージ遊走阻止剤。