JPH067150A - 新規なエクセロヒルム・ロストラツムの培養菌とそれを利用する方法 - Google Patents
新規なエクセロヒルム・ロストラツムの培養菌とそれを利用する方法Info
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- JPH067150A JPH067150A JP4169609A JP16960992A JPH067150A JP H067150 A JPH067150 A JP H067150A JP 4169609 A JP4169609 A JP 4169609A JP 16960992 A JP16960992 A JP 16960992A JP H067150 A JPH067150 A JP H067150A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】
【化５】
生産性の新規なエクセロヒルム・ロストラツム株を分離
した。 【効果】 上記化合物はスクワレンシンセターゼの阻害
剤であり、本発明のエクセロヒルム・ロストラツム株は
この物質の発酵生産に有用である。
した。 【効果】 上記化合物はスクワレンシンセターゼの阻害
剤であり、本発明のエクセロヒルム・ロストラツム株は
この物質の発酵生産に有用である。
Description
【０００１】高コレステロール血症は、動脈硬化症等の
虚血性心臓血管疾患の主要な危険因子の１つとして知ら
れる。胆汁酸金属イオン封鎖物がこの症状の治療に用い
られてきたが、これらは中程度に効果的であると思われ
るが、大量に、すなわち１回に数グラム用いる必要があ
り、あまり味がよくない。現在市販されているＭＥＶＡ
ＣＯＲ（商標）（ロバスタチン）は、酵素ＨＭＧ−Ｃｏ
Ａリダクターゼを阻害することでコレステロールの生体
内合成を抑制して作用する一群の非常に活性のある抗高
コレステロール血症剤の１つである。
虚血性心臓血管疾患の主要な危険因子の１つとして知ら
れる。胆汁酸金属イオン封鎖物がこの症状の治療に用い
られてきたが、これらは中程度に効果的であると思われ
るが、大量に、すなわち１回に数グラム用いる必要があ
り、あまり味がよくない。現在市販されているＭＥＶＡ
ＣＯＲ（商標）（ロバスタチン）は、酵素ＨＭＧ−Ｃｏ
Ａリダクターゼを阻害することでコレステロールの生体
内合成を抑制して作用する一群の非常に活性のある抗高
コレステロール血症剤の１つである。
【０００２】スクアレンシンセターゼは、デ ノボのコ
レステロール生体内合成経路の最初の関与反応にかかわ
る酵素である。この酵素は、２分子のファルネシルピロ
リン酸を還元二量体化してスクアレンを形成するのを触
媒する。コレステロールに向けたこの開始反応の阻害
は、ユビキノン、ドリコール及びイソペンテニル ｔ−
ＲＮＡへの経路を妨げてはならない。これまでのスクア
レンシンセターゼを阻害しようとする試みはＰ．Ortiz
de Montellano ら、Ｊ．Med.Chem. ２０、２４３（１９
７７）及びＥ．Ｊ．Corey とＲ．Volante,Ｊ．Am.Chem.
Soc., ９８、１２９１（１９７６）に述べられているよ
うな化合物を含んだピロリン酸又はピロリン酸類似体を
用いていた。Ｓ．Biller（米国特許第４，８７１，７２
１号）は、スクアレンシンセターゼの阻害剤としてイソ
プレノイド（ホスフィニルメチル）ホスホネートについ
て述べている。
レステロール生体内合成経路の最初の関与反応にかかわ
る酵素である。この酵素は、２分子のファルネシルピロ
リン酸を還元二量体化してスクアレンを形成するのを触
媒する。コレステロールに向けたこの開始反応の阻害
は、ユビキノン、ドリコール及びイソペンテニル ｔ−
ＲＮＡへの経路を妨げてはならない。これまでのスクア
レンシンセターゼを阻害しようとする試みはＰ．Ortiz
de Montellano ら、Ｊ．Med.Chem. ２０、２４３（１９
７７）及びＥ．Ｊ．Corey とＲ．Volante,Ｊ．Am.Chem.
Soc., ９８、１２９１（１９７６）に述べられているよ
うな化合物を含んだピロリン酸又はピロリン酸類似体を
用いていた。Ｓ．Biller（米国特許第４，８７１，７２
１号）は、スクアレンシンセターゼの阻害剤としてイソ
プレノイド（ホスフィニルメチル）ホスホネートについ
て述べている。
【０００３】要約すると、本発明は、リンを全く含まな
いスクアレンシンセターゼ阻害剤を生産するエクセロヒ
ルム・ロストラツム(Exserohilum rostratum) の株を提
供する。
いスクアレンシンセターゼ阻害剤を生産するエクセロヒ
ルム・ロストラツム(Exserohilum rostratum) の株を提
供する。
【０００４】以下本発明を詳細に説明する。本発明は、
スクアレンシンセターゼ阻害剤である構造式（Ｉ）；
スクアレンシンセターゼ阻害剤である構造式（Ｉ）；
【化４】 を有する化合物を生産する新奇な微生物を目的とする。
構造式（Ｉ）の化合物は、コレステロール降下剤及び抗
真菌剤として有用である。構造式（Ｉ）の化合物は、エ
クセロヒルム・ロストラツム(Exserohilum rostratum)
の好気発酵によって調製する。よりくわしくは、用いる
株をＭＦ５５６５又はその突然変異体とする。ＭＦ５５
６５培養菌はカカオノキ(Theobroma cacao) （フィリピ
ン）の樹皮から単離された。この培養株は、メリーラン
ド州Rockville,Parklawn Drive１２３０１にあるAmeric
an Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）に、ＡＴＣＣ
７４０６８として寄記されている。
構造式（Ｉ）の化合物は、コレステロール降下剤及び抗
真菌剤として有用である。構造式（Ｉ）の化合物は、エ
クセロヒルム・ロストラツム(Exserohilum rostratum)
の好気発酵によって調製する。よりくわしくは、用いる
株をＭＦ５５６５又はその突然変異体とする。ＭＦ５５
６５培養菌はカカオノキ(Theobroma cacao) （フィリピ
ン）の樹皮から単離された。この培養株は、メリーラン
ド州Rockville,Parklawn Drive１２３０１にあるAmeric
an Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）に、ＡＴＣＣ
７４０６８として寄記されている。
【０００５】本出願書で請求する生物学的に純粋なエク
セロヒルム・ロストラツムの培養菌とは、自然環境から
単離され、生存混入微生物が存在しないものと定義す
る。本出願書で請求するエクセロヒルム・ロストラツム
の培養とは、自然環境から単離され、構造式（Ｉ）の化
合物の発酵に有害な生存混入微生物が存在しないものと
定義する。本出願書で述べる微生物の活性を有する突然
変異体は１つ又はそれ以上の突然変異を持ち、構造式
（Ｉ）の化合物を生産し得る培養菌であると定義する。
セロヒルム・ロストラツムの培養菌とは、自然環境から
単離され、生存混入微生物が存在しないものと定義す
る。本出願書で請求するエクセロヒルム・ロストラツム
の培養とは、自然環境から単離され、構造式（Ｉ）の化
合物の発酵に有害な生存混入微生物が存在しないものと
定義する。本出願書で述べる微生物の活性を有する突然
変異体は１つ又はそれ以上の突然変異を持ち、構造式
（Ｉ）の化合物を生産し得る培養菌であると定義する。
【０００６】この株ＭＦ５５６５はフィリピンのLaguna
州のLos Banos で採集したカカオノキ(Theobroma caca
o) の樹皮から得られた。レザー・パンチ(no.２４５、
Ｃ．Ｓ．Osborue & Co.,Harrison, ＮＪ) を用いて樹皮
片(disc)を取った。樹皮片は直径およそ１cmであり、樹
皮の厚さやパンチを木に打ち込む時の力によって０．３
〜１．０cmの厚さであった。樹皮片は、維管束形成層、
そして時には外側木部の薄層にわたる樹皮の全断面を含
んでいた。各木からとった樹皮片は研究所に運ぶために
コイン用マニラ紙封筒に入れた。樹皮片は１０％家庭用
漂白剤に３分間ひたして、滅菌蒸留水ですすいで、分離
培地に入れる前にアルコールランプで短時間あぶった。
樹皮片は外側を下にして、直径１００mmのプラスチック
ペトリ皿内の寒天培地（麦芽エキス１０ｇ、イーストエ
キス２ｇ、プロピオン酸ナトリウム１ｇ、脱水ウシ胆汁
５ｇ、ベノミル１mg、硫酸ストレプトマイシン５０mg、
クロロテトラサイクリン５０mg、寒天２０ｇを１リット
ルの蒸留水中に含む）に置いた。ペトリ皿を２４℃でイ
ンキュベートして、樹皮片上と寒天上の真菌コロニーの
発育を見るために１ケ月にわたりほぼ毎日観察した。
州のLos Banos で採集したカカオノキ(Theobroma caca
o) の樹皮から得られた。レザー・パンチ(no.２４５、
Ｃ．Ｓ．Osborue & Co.,Harrison, ＮＪ) を用いて樹皮
片(disc)を取った。樹皮片は直径およそ１cmであり、樹
皮の厚さやパンチを木に打ち込む時の力によって０．３
〜１．０cmの厚さであった。樹皮片は、維管束形成層、
そして時には外側木部の薄層にわたる樹皮の全断面を含
んでいた。各木からとった樹皮片は研究所に運ぶために
コイン用マニラ紙封筒に入れた。樹皮片は１０％家庭用
漂白剤に３分間ひたして、滅菌蒸留水ですすいで、分離
培地に入れる前にアルコールランプで短時間あぶった。
樹皮片は外側を下にして、直径１００mmのプラスチック
ペトリ皿内の寒天培地（麦芽エキス１０ｇ、イーストエ
キス２ｇ、プロピオン酸ナトリウム１ｇ、脱水ウシ胆汁
５ｇ、ベノミル１mg、硫酸ストレプトマイシン５０mg、
クロロテトラサイクリン５０mg、寒天２０ｇを１リット
ルの蒸留水中に含む）に置いた。ペトリ皿を２４℃でイ
ンキュベートして、樹皮片上と寒天上の真菌コロニーの
発育を見るために１ケ月にわたりほぼ毎日観察した。
【０００７】ＭＦ５５６５株は以下のような形態学的特
徴を示す。コロニーは比較的速く成長し、１週間で：コ
ーンミール寒天(Difco Laboratories)上では５０mm；イ
ースト−麦芽エキス寒天（麦芽エキス１０ｇ、イースト
エキス２ｇ、寒天２０ｇを１リットルの蒸留水中に含
む）上では５０〜５２mm；Ｖ８ジュース寒天（Ｖ８ジュ
ース(Campbell Soup Co.) ２００ml、ＣａＣＯ3 ３ｇ、
寒天２０ｇを蒸留水で１リットルに希釈したもの）上で
は６０mm；の直径に達する。イースト−麦芽寒天では、
培地内及び気中どちらの菌糸体も見られ、培地内菌糸体
は時には放射状繊維を形成する。綿毛状から古くなるに
つれ綿状または羊毛状となる。縁辺はぺったり、または
わずかにふさ状からなめらかであり、縁辺は無色ないし
淡灰色であるが間もなく暗灰色又は濃いオリーブグレイ
になり、時間がたつと黒色になる。Dark Olive-Gray,Ir
on Gray,Dark Mouse Gray,DuskyGreen-Gray,Blackish G
reen-Gray,Olivaceous Black などを呈する（英文大文
字の色名は、Ridgway,Ｒ．１９１２，Color Standards
and Nomenclature（色見本と命名法）Washington, Ｄ．
Ｃ．より）が裏面もまた同様である。古い部分には、し
ばしば無色ないし淡灰色の斑点状又はふさ状の気中菌糸
が発育している。臭気、菌核、ストロマタ、又は偽被子
器は見られない。長さ６００μm で幅３〜４．５μm ま
での分生子柄が最上部の気中菌糸体より生じるが、これ
は直線状又はくねっている。ジグザグ状に頂点があっ
て、壁はなめらかであるか時には細かなかさぶた状であ
る。たいてい２〜１０の分生子を持っており、明るいオ
リーブグレイないしオリーブグレイである。分生子形成
細胞はポリトレト型で、一体となっており仮軸性で、不
明確であり、末端又は中間にあり、分生子形成部分の微
小孔をわずかに盛り上がって色の濃くなった分離痕がと
りまいている。分生子は４５〜２５０×７〜２０μm で
あり、ほとんどのものは長さが７５〜１８０μm であっ
て、形は様々であり、概して長だ円形、紡錘状、倒棍棒
状、又は先細の円筒状であり、直線状から屈曲状、又は
まれにＳ字型がある。概してまるい頂端を持っていて、
なめらかで５〜２２の隔壁があり、基部の隔壁がもっと
も厚くて色が濃く、また、末端の隔壁はしばしば中央の
細胞を区切っている隔壁より色が濃い。はっきりとした
円筒状のヘソ状付属体が１〜２．５μm 突出していて、
柄細胞のような延長は見られず、頂端及び基部細胞から
発芽しはじめる。３％ＫＯＨ中では淡灰色ないしオリー
ブグレイである。菌糸は隔壁を有し、分枝し、明るいオ
リーブグレイないしオリーブブラウンであって、通常は
なめらかであるが、時には細かなかさぶた状である。
徴を示す。コロニーは比較的速く成長し、１週間で：コ
ーンミール寒天(Difco Laboratories)上では５０mm；イ
ースト−麦芽エキス寒天（麦芽エキス１０ｇ、イースト
エキス２ｇ、寒天２０ｇを１リットルの蒸留水中に含
む）上では５０〜５２mm；Ｖ８ジュース寒天（Ｖ８ジュ
ース(Campbell Soup Co.) ２００ml、ＣａＣＯ3 ３ｇ、
寒天２０ｇを蒸留水で１リットルに希釈したもの）上で
は６０mm；の直径に達する。イースト−麦芽寒天では、
培地内及び気中どちらの菌糸体も見られ、培地内菌糸体
は時には放射状繊維を形成する。綿毛状から古くなるに
つれ綿状または羊毛状となる。縁辺はぺったり、または
わずかにふさ状からなめらかであり、縁辺は無色ないし
淡灰色であるが間もなく暗灰色又は濃いオリーブグレイ
になり、時間がたつと黒色になる。Dark Olive-Gray,Ir
on Gray,Dark Mouse Gray,DuskyGreen-Gray,Blackish G
reen-Gray,Olivaceous Black などを呈する（英文大文
字の色名は、Ridgway,Ｒ．１９１２，Color Standards
and Nomenclature（色見本と命名法）Washington, Ｄ．
Ｃ．より）が裏面もまた同様である。古い部分には、し
ばしば無色ないし淡灰色の斑点状又はふさ状の気中菌糸
が発育している。臭気、菌核、ストロマタ、又は偽被子
器は見られない。長さ６００μm で幅３〜４．５μm ま
での分生子柄が最上部の気中菌糸体より生じるが、これ
は直線状又はくねっている。ジグザグ状に頂点があっ
て、壁はなめらかであるか時には細かなかさぶた状であ
る。たいてい２〜１０の分生子を持っており、明るいオ
リーブグレイないしオリーブグレイである。分生子形成
細胞はポリトレト型で、一体となっており仮軸性で、不
明確であり、末端又は中間にあり、分生子形成部分の微
小孔をわずかに盛り上がって色の濃くなった分離痕がと
りまいている。分生子は４５〜２５０×７〜２０μm で
あり、ほとんどのものは長さが７５〜１８０μm であっ
て、形は様々であり、概して長だ円形、紡錘状、倒棍棒
状、又は先細の円筒状であり、直線状から屈曲状、又は
まれにＳ字型がある。概してまるい頂端を持っていて、
なめらかで５〜２２の隔壁があり、基部の隔壁がもっと
も厚くて色が濃く、また、末端の隔壁はしばしば中央の
細胞を区切っている隔壁より色が濃い。はっきりとした
円筒状のヘソ状付属体が１〜２．５μm 突出していて、
柄細胞のような延長は見られず、頂端及び基部細胞から
発芽しはじめる。３％ＫＯＨ中では淡灰色ないしオリー
ブグレイである。菌糸は隔壁を有し、分枝し、明るいオ
リーブグレイないしオリーブブラウンであって、通常は
なめらかであるが、時には細かなかさぶた状である。
【０００８】ＭＦ５５６５株は、主として複数個に区切
られたデマチウム科の隔壁分生子を生ずるポリトレト型
分生子形成細胞の組合せに基き、エクセロヒルム属に属
する。分生子の基部細胞は、厚くて色の濃い隔壁で区切
られており、突出したヘソ状付属体を持つ。ＭＦ５５６
５株は、直線状又は湾曲した分生子が主で、基底及び頂
端どちらの細胞も色の濃い隔壁で区切られ、そして比較
的長い分生子を有することに基づいて、エクセロヒルム
・ロストラツム(Exserohilum rostratum) と同定される
( Ａ．Sivanesan,１９８７Graminicolous Species of B
ipolaris,Curvularia,Drechslera,Exserohilum and the
ir telemorphs （イネ科植物に寄生するビポラリス、ク
ルブラリア、ドレクスレラ、エクセロヒルム及びそれら
の異形態）、ＣＭｌ Mycological Peper No.１５８）。
られたデマチウム科の隔壁分生子を生ずるポリトレト型
分生子形成細胞の組合せに基き、エクセロヒルム属に属
する。分生子の基部細胞は、厚くて色の濃い隔壁で区切
られており、突出したヘソ状付属体を持つ。ＭＦ５５６
５株は、直線状又は湾曲した分生子が主で、基底及び頂
端どちらの細胞も色の濃い隔壁で区切られ、そして比較
的長い分生子を有することに基づいて、エクセロヒルム
・ロストラツム(Exserohilum rostratum) と同定される
( Ａ．Sivanesan,１９８７Graminicolous Species of B
ipolaris,Curvularia,Drechslera,Exserohilum and the
ir telemorphs （イネ科植物に寄生するビポラリス、ク
ルブラリア、ドレクスレラ、エクセロヒルム及びそれら
の異形態）、ＣＭｌ Mycological Peper No.１５８）。
【０００９】構造式（Ｉ）の化合物を、資化性炭素及び
窒素源を含んだ液体栄養培地中で、好ましくは好気条件
下にこの微生物を培養することによって得ることができ
る。また、栄養培地は鉱物塩類と消泡剤を含んでもよ
い。
窒素源を含んだ液体栄養培地中で、好ましくは好気条件
下にこの微生物を培養することによって得ることができ
る。また、栄養培地は鉱物塩類と消泡剤を含んでもよ
い。
【００１０】栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコー
ス、グリセリン、デンプン、デキストリン、その他の炭
水化物である。含まれていてもよい他の炭素源は、マル
トース、マンノース、スクロース等である。さらに、オ
ート麦粉、コーンミール、キビ、トウモロコシ等の複合
栄養源も利用できる炭素を供給できる。培地に用いる炭
素源の正確な量は、一部分は、培地中の他の成分にもよ
るが、通常０．５ないし５重量パーセントの範囲にあ
る。これら炭素源は当該培地に単独で用いてもよいし、
同培地にいくつかの炭素源を組み合わせて用いることも
できる。
ス、グリセリン、デンプン、デキストリン、その他の炭
水化物である。含まれていてもよい他の炭素源は、マル
トース、マンノース、スクロース等である。さらに、オ
ート麦粉、コーンミール、キビ、トウモロコシ等の複合
栄養源も利用できる炭素を供給できる。培地に用いる炭
素源の正確な量は、一部分は、培地中の他の成分にもよ
るが、通常０．５ないし５重量パーセントの範囲にあ
る。これら炭素源は当該培地に単独で用いてもよいし、
同培地にいくつかの炭素源を組み合わせて用いることも
できる。
【００１１】好ましい窒素源は、グリシン、プロリン、
スレオニン、その他のアミノ酸、又同様に、イーストエ
キス（加水分解物、自己分解物）、乾燥イースト、トマ
トペースト、大豆ミール、ペプトン、コーンスティープ
リカー、ディスチラーズソルブルズ、麦芽エキスなどの
ような複合源である。アンモニウム塩（たとえば、硝酸
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等）等の無機窒素源を用いることもできる。種々の窒素
源は、培地中の０．２ないし９．０重量パーセントの範
囲の量で、単独に、又は組み合わせて用いることができ
る。炭素及び窒素源は、一般に組み合わせて用いるが、
純粋な形態である必要はない。微量の生育因子、ビタミ
ン及び鉱物栄養を含むより純度の低いものを用いてもよ
い。また、（これらに限定はされないが）炭酸カルシウ
ム、リン酸ナトリウム又はカリウム、塩化ナトリウム又
はカリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩、その
他のような鉱物塩類を培地に加えてもよい。又、マンガ
ン、鉄、モリブデン、亜鉛、その他の微量金属が含まれ
る。さらに、必要ならば、とくに培養培地がかなり泡立
つならば、ポリエチレングリコール又はシリコン等の消
泡剤を加えてもよい。
スレオニン、その他のアミノ酸、又同様に、イーストエ
キス（加水分解物、自己分解物）、乾燥イースト、トマ
トペースト、大豆ミール、ペプトン、コーンスティープ
リカー、ディスチラーズソルブルズ、麦芽エキスなどの
ような複合源である。アンモニウム塩（たとえば、硝酸
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等）等の無機窒素源を用いることもできる。種々の窒素
源は、培地中の０．２ないし９．０重量パーセントの範
囲の量で、単独に、又は組み合わせて用いることができ
る。炭素及び窒素源は、一般に組み合わせて用いるが、
純粋な形態である必要はない。微量の生育因子、ビタミ
ン及び鉱物栄養を含むより純度の低いものを用いてもよ
い。また、（これらに限定はされないが）炭酸カルシウ
ム、リン酸ナトリウム又はカリウム、塩化ナトリウム又
はカリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩、その
他のような鉱物塩類を培地に加えてもよい。又、マンガ
ン、鉄、モリブデン、亜鉛、その他の微量金属が含まれ
る。さらに、必要ならば、とくに培養培地がかなり泡立
つならば、ポリエチレングリコール又はシリコン等の消
泡剤を加えてもよい。
【００１２】この発明の化合物の好ましい生成方法は、
生産性微生物の胞子か菌糸体を適当な培地に接種した後
に好気条件下に培養することから成る。一般に発酵工程
は、まず保存しておいた培養源を栄養種菌培地に接種し
て、時には２段階を経て、活性化合物の生産の種菌とな
る微生物を生育させる。接種後、フラスコを振とうしな
がら２０ないし３０℃、好ましくは２５ないし２８℃の
範囲の温度でインキュベートする。振とう速度は、４０
０rpm までの範囲、好ましくは２００ないし２２０rpm
でよい。種フラスコは、２ないし１０日、好ましくは２
ないし４日間インキュベートする。通常は２ないし４日
であるが、生育が十分になったら、培養物を生産培地フ
ラスコに接種するのに用いる。第２段階の種菌培養は、
特により大きな容器に移すときに行ってもよい。その場
合は、培養増殖物の一部を、２番目の種フラスコに接種
して同様に培養するが、時間は短くする。
生産性微生物の胞子か菌糸体を適当な培地に接種した後
に好気条件下に培養することから成る。一般に発酵工程
は、まず保存しておいた培養源を栄養種菌培地に接種し
て、時には２段階を経て、活性化合物の生産の種菌とな
る微生物を生育させる。接種後、フラスコを振とうしな
がら２０ないし３０℃、好ましくは２５ないし２８℃の
範囲の温度でインキュベートする。振とう速度は、４０
０rpm までの範囲、好ましくは２００ないし２２０rpm
でよい。種フラスコは、２ないし１０日、好ましくは２
ないし４日間インキュベートする。通常は２ないし４日
であるが、生育が十分になったら、培養物を生産培地フ
ラスコに接種するのに用いる。第２段階の種菌培養は、
特により大きな容器に移すときに行ってもよい。その場
合は、培養増殖物の一部を、２番目の種フラスコに接種
して同様に培養するが、時間は短くする。
【００１３】接種後、発酵生産培地を３ないし５０日
間、好ましくは１４ないし３５日間、（液体又は固体ど
ちらの発酵培地を用いるかによって異るが）振とうする
か、あるいは振とうせずにインキュベートする。発酵は
２０ないし４０℃の温度範囲で好気的に行なう。振とう
する場合には、２００ないし４００rpm の速度でよい。
最適な結果を得るためには、温度は２２ないし２８℃、
もっとも好ましくは２４ないし２６℃の範囲である。活
性化合物を生産するのに適した栄養培地のpHは、３．５
ないし８．５、もっとも好ましくは４．５ないし７．０
の範囲である。所望の化合物の生成を適当な時間行なっ
た後に、発酵フラスコを回収して活性化合物を単離す
る。
間、好ましくは１４ないし３５日間、（液体又は固体ど
ちらの発酵培地を用いるかによって異るが）振とうする
か、あるいは振とうせずにインキュベートする。発酵は
２０ないし４０℃の温度範囲で好気的に行なう。振とう
する場合には、２００ないし４００rpm の速度でよい。
最適な結果を得るためには、温度は２２ないし２８℃、
もっとも好ましくは２４ないし２６℃の範囲である。活
性化合物を生産するのに適した栄養培地のpHは、３．５
ないし８．５、もっとも好ましくは４．５ないし７．０
の範囲である。所望の化合物の生成を適当な時間行なっ
た後に、発酵フラスコを回収して活性化合物を単離す
る。
【００１４】エステル又はケトン等の酸素化溶媒と混合
することもできるアルコール溶媒を用いて、固体発酵培
地から化合物（Ｉ）を抽出する。
することもできるアルコール溶媒を用いて、固体発酵培
地から化合物（Ｉ）を抽出する。
【００１５】菌糸体発酵液のpHは１ないし９の間に調整
して（好ましくは３ないし５）、好ましくはメタノール
等の水と混合できる溶媒と混合して、菌糸体を濾過す
る。その後、活性化合物を以下を含めたいくつかの方法
により水性濾液から単離する、すなわち：
して（好ましくは３ないし５）、好ましくはメタノール
等の水と混合できる溶媒と混合して、菌糸体を濾過す
る。その後、活性化合物を以下を含めたいくつかの方法
により水性濾液から単離する、すなわち：
【００１６】１．好ましくは水性濾液のpHを１．５ない
し２．５の間に調整した後、メチルエチルケトン、酢酸
エチル、ジエチルエーテル又はジクロロメタン等の水に
混和しない溶媒中へ、液相−液相抽出する。 ２．ＳＰ２０７又はＨＰ−２０等の有機マトリックス上
へ水性濾液を固相−液相抽出し、９０／１０メタノール
・水又は９０／１０アセトン・水等の（水性又は非水
性）有機溶媒により溶離する。 ３．Dowex １（Ｃｌ- ）等のイオン交換樹脂上へ水性濾
液の活性化合物を吸着させ、９０／１０メタノール・水
性３０％ＮＨ4 Ｃｌ等の高イオン強度有機／水性溶媒に
より溶離する。次にこの物質を前記１又は２の方法のい
ずれかを用いて脱塩することもできる。
し２．５の間に調整した後、メチルエチルケトン、酢酸
エチル、ジエチルエーテル又はジクロロメタン等の水に
混和しない溶媒中へ、液相−液相抽出する。 ２．ＳＰ２０７又はＨＰ−２０等の有機マトリックス上
へ水性濾液を固相−液相抽出し、９０／１０メタノール
・水又は９０／１０アセトン・水等の（水性又は非水
性）有機溶媒により溶離する。 ３．Dowex １（Ｃｌ- ）等のイオン交換樹脂上へ水性濾
液の活性化合物を吸着させ、９０／１０メタノール・水
性３０％ＮＨ4 Ｃｌ等の高イオン強度有機／水性溶媒に
より溶離する。次にこの物質を前記１又は２の方法のい
ずれかを用いて脱塩することもできる。
【００１７】又、これら３つの方法のそれぞれは、活性
化合物をさらに精製するのに用いてもよい。また、活性
化合物を水性濾液からBioRad ＡＧ４×４等のイオン交
換樹脂上に吸着して、６／４ＣＨ3 ＣＮ／Ｈ2 Ｏ中の
０．２ＮＨ2 ＳＯ4 溶液で溶離してもよい。前記の方法
を行なって得られた活性化合物を含むフラクションを、
次に減圧下に乾燥して、未精製活性化合物を得ることが
できる。その後、一般に、未精製化合物は、吸着及び分
配クロマトグラフィーと沈殿等のいくつかの分離工程に
かけられる。各分離工程で、アッセイ及び／又はＨＰＬ
Ｃ分析の結果にもとづいてフラクションを回収してひと
まとめにする。
化合物をさらに精製するのに用いてもよい。また、活性
化合物を水性濾液からBioRad ＡＧ４×４等のイオン交
換樹脂上に吸着して、６／４ＣＨ3 ＣＮ／Ｈ2 Ｏ中の
０．２ＮＨ2 ＳＯ4 溶液で溶離してもよい。前記の方法
を行なって得られた活性化合物を含むフラクションを、
次に減圧下に乾燥して、未精製活性化合物を得ることが
できる。その後、一般に、未精製化合物は、吸着及び分
配クロマトグラフィーと沈殿等のいくつかの分離工程に
かけられる。各分離工程で、アッセイ及び／又はＨＰＬ
Ｃ分析の結果にもとづいてフラクションを回収してひと
まとめにする。
【００１８】クロマトグラフィーによる分離はイオン性
又は非イオン性吸着剤を用いた従来のカラムクロマトグ
ラフィーを使って行なうことができる。シリカゲルが吸
着剤の場合、溶離液としてはメタノール／クロロホルム
／酢酸／水等のアルコール／塩素化炭化水素／有機酸混
合物が有用である。逆相クロマトグラフィーに好ましい
吸着剤は、Ｃ8 又はＣ18固定相シリカゲルである。逆相
クロマトグラフィーに好ましい溶離液は、０．１％リン
酸又はトリフルオロ酢酸等で低pHに緩衝した水とアセト
ニトリルの混合物である。活性化合物は、キニーネ塩と
して無極性溶媒から沈殿させることができる。沈殿に対
して好ましい溶媒はジエチルエーテルである。又、活性
化合物（Ｉ）をアンモニウム塩としてメタノール等の極
性溶媒から沈殿させることもできる。
又は非イオン性吸着剤を用いた従来のカラムクロマトグ
ラフィーを使って行なうことができる。シリカゲルが吸
着剤の場合、溶離液としてはメタノール／クロロホルム
／酢酸／水等のアルコール／塩素化炭化水素／有機酸混
合物が有用である。逆相クロマトグラフィーに好ましい
吸着剤は、Ｃ8 又はＣ18固定相シリカゲルである。逆相
クロマトグラフィーに好ましい溶離液は、０．１％リン
酸又はトリフルオロ酢酸等で低pHに緩衝した水とアセト
ニトリルの混合物である。活性化合物は、キニーネ塩と
して無極性溶媒から沈殿させることができる。沈殿に対
して好ましい溶媒はジエチルエーテルである。又、活性
化合物（Ｉ）をアンモニウム塩としてメタノール等の極
性溶媒から沈殿させることもできる。
【００１９】本発明の微生物の発酵で生成された化合物
の固有のスクアレンシンセターゼ阻害活性は、以下に述
べる標準的なインビトロのプロトコールで測定できる：ラット肝臓ミクロソームの調製 オスCharles River ＣＤラット（１２０ないし１５０
ｇ）を、０．１％ロバスタチンを含む規定食で４日間飼
育した。これらラットからの肝臓を５倍容量(ml/g)の氷
冷した５０mMＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸）、５mMＥＤ
ＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、pH７．５に加えて、
Potter−Elvehjem型ティシューグラインダーでホモジネ
ートにした。このホモジネートを２回、２０，０００xg
で１５分間４℃で遠心分離して、そのたびにペレットを
とりのぞいた。次に上澄みを１００，０００xgで１時間
４℃で遠心分離した。得られたミクロソームペレット
を、はじめのホモジネートの１／５容の前記ホモジネー
ト用バッファーに再懸濁した。このミクロソーム調製物
は約７mg／mlのタンパク質濃度を有している。ミクロソ
ーム懸濁液は、分注して−７０℃で保存した。これら分
注品のスクアレンシンセターゼ活性は、少なくとも数ヶ
月間安定である。
の固有のスクアレンシンセターゼ阻害活性は、以下に述
べる標準的なインビトロのプロトコールで測定できる：ラット肝臓ミクロソームの調製 オスCharles River ＣＤラット（１２０ないし１５０
ｇ）を、０．１％ロバスタチンを含む規定食で４日間飼
育した。これらラットからの肝臓を５倍容量(ml/g)の氷
冷した５０mMＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸）、５mMＥＤ
ＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、pH７．５に加えて、
Potter−Elvehjem型ティシューグラインダーでホモジネ
ートにした。このホモジネートを２回、２０，０００xg
で１５分間４℃で遠心分離して、そのたびにペレットを
とりのぞいた。次に上澄みを１００，０００xgで１時間
４℃で遠心分離した。得られたミクロソームペレット
を、はじめのホモジネートの１／５容の前記ホモジネー
ト用バッファーに再懸濁した。このミクロソーム調製物
は約７mg／mlのタンパク質濃度を有している。ミクロソ
ーム懸濁液は、分注して−７０℃で保存した。これら分
注品のスクアレンシンセターゼ活性は、少なくとも数ヶ
月間安定である。
【００２０】プレニルトランスフェラーゼの部分的精製 放射線でラベルしたピロリン酸ファルネシルを酵素合成
するのに用いるプレニルトランスフェラーゼを精製し
た。プレニルトランスフェラーゼは、Rilling(Method i
n Enzymology１１０、１２５〜１２９（１９８５））の
方法によりアッセイして、活性の単位は、標準的アッセ
イにおいて３０℃１分間で１μmol のピロリン酸ファル
ネシルを生成する酵素の量として定義した。５％コレス
チラミンに０．１％ロバスタチンを加えたもので飼育し
ておいた生後４０日のオスのラット２３匹の肝臓を、１
mlあたりアプロチニンを０．１トリプシン阻害剤単位含
んだpH７．０の１０mMメルカプトエタノール、２mMＥＤ
ＴＡ、２５mMロイペプチン、０．００５％フッ化フェニ
ルメチルスルホニル溶液１リットルに入れてWaringブレ
ンダーでホモジネートにした。ホモジネートは２０，０
００xgで２０分間遠心分離した。上澄みを６ＮＨＯＡｃ
でpH５．５に調整して、１００，０００xgで１時間遠心
分離した。この上澄みを３ＮＫＯＨでpH７．０に調整し
て、３５〜６０％硫酸アンモニウム沈殿画分をとった。
６０％ペレットを、１０mMリン酸カリウム、１０mMメル
カプトエタノール、１mMＥＤＴＡのpH７．０の溶液（バ
ッファーＡ）６０mlに再溶解して、バッファーＡ１リッ
トルに対し２回透析した。この透析したフラクション
を、バッファーＡで平衡化したＤＥＡＥ−Sepharose ４
Ｂの１２．５×５cmのカラムにかけた。このカラムを７
００mlのバッファーＡ、及びバッファーＡから１００mM
リン酸カリウム、１０mMメルカプトエタノール、１mMＥ
ＤＴＡ、pH７．０への勾配１リットルで洗浄した。０．
２単位／mgより大きな比活性を持つフラクションをいっ
しょにして、固体硫酸アンモニウムを加えて６０％で飽
和させてペレットにした。ペレットを１０mMトリス、１
０mMβ−メルカプトエタノールのpH７．０の溶液（バッ
ファーＢ）８mlに溶解した。バッファーＢ中飽和硫酸ア
ンモニウムを１．５倍容加えて、再溶解したペレットを
硫酸アンモニウム６０％飽和とした。この硫酸アンモニ
ウム懸濁液は比活性０．２３単位／mgで３．５単位／ml
を含み、ピロリン酸イソペンテニルイソメラーゼ活性は
なかった。この硫酸アンモニウム懸濁液を［４−14Ｃ］
ピロリン酸のファルネシルの合成に用いたが、活性は少
なくとも６ヶ月間４℃で保存していて安定であった。
するのに用いるプレニルトランスフェラーゼを精製し
た。プレニルトランスフェラーゼは、Rilling(Method i
n Enzymology１１０、１２５〜１２９（１９８５））の
方法によりアッセイして、活性の単位は、標準的アッセ
イにおいて３０℃１分間で１μmol のピロリン酸ファル
ネシルを生成する酵素の量として定義した。５％コレス
チラミンに０．１％ロバスタチンを加えたもので飼育し
ておいた生後４０日のオスのラット２３匹の肝臓を、１
mlあたりアプロチニンを０．１トリプシン阻害剤単位含
んだpH７．０の１０mMメルカプトエタノール、２mMＥＤ
ＴＡ、２５mMロイペプチン、０．００５％フッ化フェニ
ルメチルスルホニル溶液１リットルに入れてWaringブレ
ンダーでホモジネートにした。ホモジネートは２０，０
００xgで２０分間遠心分離した。上澄みを６ＮＨＯＡｃ
でpH５．５に調整して、１００，０００xgで１時間遠心
分離した。この上澄みを３ＮＫＯＨでpH７．０に調整し
て、３５〜６０％硫酸アンモニウム沈殿画分をとった。
６０％ペレットを、１０mMリン酸カリウム、１０mMメル
カプトエタノール、１mMＥＤＴＡのpH７．０の溶液（バ
ッファーＡ）６０mlに再溶解して、バッファーＡ１リッ
トルに対し２回透析した。この透析したフラクション
を、バッファーＡで平衡化したＤＥＡＥ−Sepharose ４
Ｂの１２．５×５cmのカラムにかけた。このカラムを７
００mlのバッファーＡ、及びバッファーＡから１００mM
リン酸カリウム、１０mMメルカプトエタノール、１mMＥ
ＤＴＡ、pH７．０への勾配１リットルで洗浄した。０．
２単位／mgより大きな比活性を持つフラクションをいっ
しょにして、固体硫酸アンモニウムを加えて６０％で飽
和させてペレットにした。ペレットを１０mMトリス、１
０mMβ−メルカプトエタノールのpH７．０の溶液（バッ
ファーＢ）８mlに溶解した。バッファーＢ中飽和硫酸ア
ンモニウムを１．５倍容加えて、再溶解したペレットを
硫酸アンモニウム６０％飽和とした。この硫酸アンモニ
ウム懸濁液は比活性０．２３単位／mgで３．５単位／ml
を含み、ピロリン酸イソペンテニルイソメラーゼ活性は
なかった。この硫酸アンモニウム懸濁液を［４−14Ｃ］
ピロリン酸のファルネシルの合成に用いたが、活性は少
なくとも６ヶ月間４℃で保存していて安定であった。
【００２１】［４−14Ｃ］ピロリン酸ファルネシルの酵
素的合成 ロータリーエバポレーターで５５ｍＣｉの［４−14Ｃ］
ピロリン酸イソペンテニル（４７．９ｍＣｉ／mmol）か
ら溶媒（エタノール・０．１５ＮＮＨ4 ＯＨ１：１）を
とりのぞいた。６００μｌの１００mMトリス、１０mMＭ
ｇＣｌ2 、４mMジチオトレイトールpH７．５を加えて、
溶液を１．５mlEppendorf 遠心用試験管に移した。ピロ
リン酸ゲラニル、２０mM溶液２５０μｌと、プレニルト
ランスフェラーゼの硫酸アンモニウム懸濁液５０μｌを
加えて、反応を開始させた。このインキュベーション液
は、体積９００μｌ中にピロリン酸ゲラニル５mmol、ピ
ロリン酸イソペンテニル１．１５mmol、ＭｇＣｌ2 ６mm
olそして０．１８単位のプレニルトランスフェラーゼを
含んでいた。インキュベーション中、混合物は、新たに
形成されたピロリン酸ファルネシルのマグネシウム錯体
が溶液から沈殿するにつれて白濁した。［４−14Ｃ］ピ
ロリン酸ファルネシルをEppendorf 遠心分離試験管中で
３分間１４，０００rpm で遠心分離して回収し、上澄を
とりのぞいて、ペレットはpH７．５で１．０mlの５０mM
ＨＥＰＥＳ、５mMＥＤＴＡに溶解した。収量は、［４−
14Ｃ］ピロリン酸ファルネシル５０．７ｍＣｉ（９２
％）であった。この［４−14Ｃ］ピロリン酸ファルネシ
ルを分注して−７０℃で保存した。
素的合成 ロータリーエバポレーターで５５ｍＣｉの［４−14Ｃ］
ピロリン酸イソペンテニル（４７．９ｍＣｉ／mmol）か
ら溶媒（エタノール・０．１５ＮＮＨ4 ＯＨ１：１）を
とりのぞいた。６００μｌの１００mMトリス、１０mMＭ
ｇＣｌ2 、４mMジチオトレイトールpH７．５を加えて、
溶液を１．５mlEppendorf 遠心用試験管に移した。ピロ
リン酸ゲラニル、２０mM溶液２５０μｌと、プレニルト
ランスフェラーゼの硫酸アンモニウム懸濁液５０μｌを
加えて、反応を開始させた。このインキュベーション液
は、体積９００μｌ中にピロリン酸ゲラニル５mmol、ピ
ロリン酸イソペンテニル１．１５mmol、ＭｇＣｌ2 ６mm
olそして０．１８単位のプレニルトランスフェラーゼを
含んでいた。インキュベーション中、混合物は、新たに
形成されたピロリン酸ファルネシルのマグネシウム錯体
が溶液から沈殿するにつれて白濁した。［４−14Ｃ］ピ
ロリン酸ファルネシルをEppendorf 遠心分離試験管中で
３分間１４，０００rpm で遠心分離して回収し、上澄を
とりのぞいて、ペレットはpH７．５で１．０mlの５０mM
ＨＥＰＥＳ、５mMＥＤＴＡに溶解した。収量は、［４−
14Ｃ］ピロリン酸ファルネシル５０．７ｍＣｉ（９２
％）であった。この［４−14Ｃ］ピロリン酸ファルネシ
ルを分注して−７０℃で保存した。
【００２２】スクアレンシンセターゼアッセイ 反応は１６×１２５mmねじぶた付試験管で行なった。バ
ッチアッセイ用混合物を以下の溶液から調製した： 各アッセイ ５０アッセイ につきμｌ 用の体積 １．２５０mM ＨＥＰＥＳpH７．５ ２０ １０００ ２．ＮａＦ １１０mM １０ ５００ ３．ＭｇＣｌ2 ５５mM １０ ５００ ４．ジチオトレイトール ３０mM １０ ５００ ５．ＮＡＤＰＨ １０mM（作ったばかりのもの）１０ ５００ ６．［４−14Ｃ」ピロリン酸ファルネシル ４７．９ｍＣｉ／mmole 、及び ０．０２５ｍＣｉ／３．０μL ３．０ １５０ ７．Ｈ2 Ｏ ２４ １２００ このアッセイ用混合物を減圧下に脱気してＮ2 を充填し
た。スクアレンシンセターゼ阻害剤の溶液をＤＭＳＯか
ＭｅＯＨのいずれかで調製して、最初のホモジネート用
バッファーでミクロソームタンパク質の１：１２０希釈
を作った。各反応に対して、３μｌの阻害剤溶液（コン
トロール中にはＤＭＳＯ又はＭｅＯＨ）といっしょに８
７μｌのアッセイ混合物を用いて、温浴中で３０℃にあ
たためた後、ミクロソームタンパク質の１：１２０希釈
（このアッセイで全量０．６mgのタンパク質）を１０μ
ｌ加えて反応を開始した。反応は、２０分後に４０％Ｋ
ＯＨと９５％ＥｔＯＨの１：１混合物を１００μｌ加え
て停止させた。反応が停止した混合物を、３０分間６５
℃に加熱して、冷却し、１０mlのヘプタンを加えて、こ
の混合物をかきまぜた。その後２ｇの活性アルミナを加
えて、再び混合物をかきまぜて、アルミナを沈降させ
て、５mlのヘプタン層をとり出した。１０mlのシンチレ
ーション用液をヘプタン溶液に加えて、放射能を液体シ
ンチレーションカウンターで決定した。 阻害の百分率は式： ［１−（試料−ブランク）／（コントロール−ブラン
ク）］×１００、 以下の実施例に用いた培地の組成を下記に揚げる：
ッチアッセイ用混合物を以下の溶液から調製した： 各アッセイ ５０アッセイ につきμｌ 用の体積 １．２５０mM ＨＥＰＥＳpH７．５ ２０ １０００ ２．ＮａＦ １１０mM １０ ５００ ３．ＭｇＣｌ2 ５５mM １０ ５００ ４．ジチオトレイトール ３０mM １０ ５００ ５．ＮＡＤＰＨ １０mM（作ったばかりのもの）１０ ５００ ６．［４−14Ｃ」ピロリン酸ファルネシル ４７．９ｍＣｉ／mmole 、及び ０．０２５ｍＣｉ／３．０μL ３．０ １５０ ７．Ｈ2 Ｏ ２４ １２００ このアッセイ用混合物を減圧下に脱気してＮ2 を充填し
た。スクアレンシンセターゼ阻害剤の溶液をＤＭＳＯか
ＭｅＯＨのいずれかで調製して、最初のホモジネート用
バッファーでミクロソームタンパク質の１：１２０希釈
を作った。各反応に対して、３μｌの阻害剤溶液（コン
トロール中にはＤＭＳＯ又はＭｅＯＨ）といっしょに８
７μｌのアッセイ混合物を用いて、温浴中で３０℃にあ
たためた後、ミクロソームタンパク質の１：１２０希釈
（このアッセイで全量０．６mgのタンパク質）を１０μ
ｌ加えて反応を開始した。反応は、２０分後に４０％Ｋ
ＯＨと９５％ＥｔＯＨの１：１混合物を１００μｌ加え
て停止させた。反応が停止した混合物を、３０分間６５
℃に加熱して、冷却し、１０mlのヘプタンを加えて、こ
の混合物をかきまぜた。その後２ｇの活性アルミナを加
えて、再び混合物をかきまぜて、アルミナを沈降させ
て、５mlのヘプタン層をとり出した。１０mlのシンチレ
ーション用液をヘプタン溶液に加えて、放射能を液体シ
ンチレーションカウンターで決定した。 阻害の百分率は式： ［１−（試料−ブランク）／（コントロール−ブラン
ク）］×１００、 以下の実施例に用いた培地の組成を下記に揚げる：
【表１】ＹＭＥ平板培地 成分 量 イースト抽出物 ４．０ｇ 麦芽抽出物 １０．０ｇ グルコース ４．０ｇ 蒸留Ｈ2 Ｏ １０００mL 寒天 ２５．０ｇＫＦ種培地 微量元素混合物 １リットルあたり g/L コーンスティープリカー 5g FeSO4・7H2O 1.0 トマトペースト 40g MnSO4・4H2O 1.0 オート麦粉 10g CuCl2・2H2O 0.025 グルコース 10g CaCl2・2H2O 0.1 微量元素混合物 10mL H3BO3 0.056 (NH4)6Mo7O24・4H2O 0.019 pHを6.8 に調整（あらかじめ滅菌） ZnSO4・7H2O 0.2 50mL／バッフルなしの250 ml容 １リットルの0.6NHCl に溶解 三角フラスコ オートクレーブ20分.(121 ℃，15psi)
【表２】 以下の実施例は、構造式（Ｉ）の化合物の調製を説明す
るものであり、本出願書の請求項に示す本発明を限定す
るものと考えてはならない。
るものであり、本出願書の請求項に示す本発明を限定す
るものと考えてはならない。
【００２３】
【実施例】実施例１ Ａ．ＭＦ５５６５の培養 ＭＦ５５６５培養物は、滅菌土壌中に保存しておいた胞
子と菌糸の混合物のガラスさじ一杯分を用いて、ＫＦ種
培地に接種した。このＫＦ種フラスコを、２５℃、２２
０rpm 、湿度８５％で７５時間インキュベートした。こ
のインキュベーション終了後に、２．０mlずつをとり、
１６個のＦ２０４固体生産培地フラスコにそれぞれ無菌
的に移した。その後、これらの生産フラスコを静置して
３３日間インキュベートした。収穫時に４５mlのメタノ
ールを各フラスコに加えて、固型培養物を手で小さなか
たまりになるまでほぐした。その後、フラスコを回転振
とう機に入れて、さらに菌糸塊が粉砕されて細胞と溶媒
の接触がよくなるように、２２０rpm で３０分間振とう
した。振とう後、各フラスコの内容物全部を１．５リッ
トルビーカーに移し入れてプールした。
子と菌糸の混合物のガラスさじ一杯分を用いて、ＫＦ種
培地に接種した。このＫＦ種フラスコを、２５℃、２２
０rpm 、湿度８５％で７５時間インキュベートした。こ
のインキュベーション終了後に、２．０mlずつをとり、
１６個のＦ２０４固体生産培地フラスコにそれぞれ無菌
的に移した。その後、これらの生産フラスコを静置して
３３日間インキュベートした。収穫時に４５mlのメタノ
ールを各フラスコに加えて、固型培養物を手で小さなか
たまりになるまでほぐした。その後、フラスコを回転振
とう機に入れて、さらに菌糸塊が粉砕されて細胞と溶媒
の接触がよくなるように、２２０rpm で３０分間振とう
した。振とう後、各フラスコの内容物全部を１．５リッ
トルビーカーに移し入れてプールした。
【００２４】Ｂ．化合物Ｉの単離 全ブロス８６mlに対応する実施例１のパートＡの発酵の
メタノール抽出物を、pH４．７の１．０Ｍ酢酸ナトリウ
ム溶液１０mlを加えて、５０mMＮａＯＡｃとなるよう調
整する。その後、緩衝した抽出物を氷酢酸でpH４．６に
調整した。BioRad ＡＧ４×４樹脂（２００〜４００メ
ッシュ、遊離塩基形態、１０ｇ）を加えて、溶液を室温
で４．５時間攪拌した。その後、樹脂をカラム（体積２
２ml、２．５cm×４．０cm）に移して、６／４ＣＨ3 Ｃ
Ｎ／Ｈ2 Ｏ溶液５０mlで洗浄した。その後、カラムを６
／４ＣＨ3 ＣＮ／Ｈ2 Ｏ中の０．１ＮＨ2 ＳＯ4 溶液で
溶出して、７．５mlずつのフラクションを集めた。ＨＰ
ＬＣ分析で決定したところ化合物Ｉを含んでいたフラク
ション２１〜５５をプールした。プールしたフラクショ
ン（２６０ml）を酢酸エチル１００mlで抽出し、この酢
酸エチル層をインビトロで濃縮した。
メタノール抽出物を、pH４．７の１．０Ｍ酢酸ナトリウ
ム溶液１０mlを加えて、５０mMＮａＯＡｃとなるよう調
整する。その後、緩衝した抽出物を氷酢酸でpH４．６に
調整した。BioRad ＡＧ４×４樹脂（２００〜４００メ
ッシュ、遊離塩基形態、１０ｇ）を加えて、溶液を室温
で４．５時間攪拌した。その後、樹脂をカラム（体積２
２ml、２．５cm×４．０cm）に移して、６／４ＣＨ3 Ｃ
Ｎ／Ｈ2 Ｏ溶液５０mlで洗浄した。その後、カラムを６
／４ＣＨ3 ＣＮ／Ｈ2 Ｏ中の０．１ＮＨ2 ＳＯ4 溶液で
溶出して、７．５mlずつのフラクションを集めた。ＨＰ
ＬＣ分析で決定したところ化合物Ｉを含んでいたフラク
ション２１〜５５をプールした。プールしたフラクショ
ン（２６０ml）を酢酸エチル１００mlで抽出し、この酢
酸エチル層をインビトロで濃縮した。
【００２５】前記脱塩したＡＧ４×４溶出液を８．３ml
のメタノールに溶解した。この溶液の１部を１mlとっ
て、０．５mlに濃縮して、ＨＰＬＣにかけて(Phenomene
x Ultracarb ５ ＯＤＳ ３０、９４mm×２５cm、３５
％から１００％の溶媒Ｂへの勾配溶出（溶媒Ａ＝４０％
ＣＨ3 ＣＮ／６０％Ｈ2 Ｏ＋０．１％Ｈ3 ＰＯ4 、溶媒
Ｂ＝７５％ＣＨ3 ＣＮ／Ｈ2 Ｏ＋０．１％Ｈ3 ＰＯ4 、
流速３．０ml／分）、ウォーターズ９９０＋ダイオード
アレイ検出）、３mlずつのフラクションを収集した。フ
ラクション３１は、分析ＨＰＬＣ(Phenomenex Ultracar
b ５ ＯＤＳ ３０、１５cm×４．６mm、６５／３５Ｃ
Ｈ3 ＣＮ／Ｈ2 Ｏ中の０．１％Ｈ3 ＰＯ4、流速１．０m
l／分、２１０nmでのＵＶ検出）の保持時間と標準との
ＵＶ比較によって決定すると、ほぼ純粋な化合物Ｉを含
んでいた。フラクション３１の半量（１．５ml）を窒素
を通気しながら０．７５mlに濃縮して、０．７５mlのＨ
2 Ｏを加えた後、混合物を１．５mlのＣＨ2 Ｃｌ2 で抽
出した。ＣＨ2 Ｃｌ2 層は、無水硫酸ナトリウム上で乾
燥させて、乾固するまで濃縮した。その後試料をエーテ
ル性ジアゾメタンで０℃で５分間処理して、化合物Ｉの
トリメチルエステルを形成した。反応混合物を窒素を通
気しながら濃縮乾固して、ＦＡＢＭＳ分析にかけた。化
合物Ｉのトリメチルエステルの分子イオンに対応する分
子量７３２が得られた。
のメタノールに溶解した。この溶液の１部を１mlとっ
て、０．５mlに濃縮して、ＨＰＬＣにかけて(Phenomene
x Ultracarb ５ ＯＤＳ ３０、９４mm×２５cm、３５
％から１００％の溶媒Ｂへの勾配溶出（溶媒Ａ＝４０％
ＣＨ3 ＣＮ／６０％Ｈ2 Ｏ＋０．１％Ｈ3 ＰＯ4 、溶媒
Ｂ＝７５％ＣＨ3 ＣＮ／Ｈ2 Ｏ＋０．１％Ｈ3 ＰＯ4 、
流速３．０ml／分）、ウォーターズ９９０＋ダイオード
アレイ検出）、３mlずつのフラクションを収集した。フ
ラクション３１は、分析ＨＰＬＣ(Phenomenex Ultracar
b ５ ＯＤＳ ３０、１５cm×４．６mm、６５／３５Ｃ
Ｈ3 ＣＮ／Ｈ2 Ｏ中の０．１％Ｈ3 ＰＯ4、流速１．０m
l／分、２１０nmでのＵＶ検出）の保持時間と標準との
ＵＶ比較によって決定すると、ほぼ純粋な化合物Ｉを含
んでいた。フラクション３１の半量（１．５ml）を窒素
を通気しながら０．７５mlに濃縮して、０．７５mlのＨ
2 Ｏを加えた後、混合物を１．５mlのＣＨ2 Ｃｌ2 で抽
出した。ＣＨ2 Ｃｌ2 層は、無水硫酸ナトリウム上で乾
燥させて、乾固するまで濃縮した。その後試料をエーテ
ル性ジアゾメタンで０℃で５分間処理して、化合物Ｉの
トリメチルエステルを形成した。反応混合物を窒素を通
気しながら濃縮乾固して、ＦＡＢＭＳ分析にかけた。化
合物Ｉのトリメチルエステルの分子イオンに対応する分
子量７３２が得られた。
【００２６】Ｃ．化合物Ｉの物理的特性質量分析データ この化合物は、ＥＩ−ＭＳによると分子量７３２を有
し、ジ（トリメチルシリル）誘導体を形成している。分
子式Ｃ38Ｈ52Ｏ14を、ＨＲ−ＥＩ測定（計算値７３２、
３３５７、実測値７３２、３３２９）から直接に決定し
た。 1 Ｈ ＮＭＲスペクトル （Ｃ6 Ｄ6 ，２２℃）：図１参
照 13ＣＮＭＲ化学シフト（Ｃ6 Ｄ6 ，７５ＭＨｚ） ：１
１．３，１４．０，１８．９，２０．２，２０．６，２
６．３，３０．０，３２．１，３４．６，３４．７，３
７．１，４０．２，４３．３，５１．９，５２．１，５
３．３，７５．３，７６．２，７８．８，８２．０，８
２．８，８９．８，１０６．２，１１１．８，１１８．
８，１２６．２，１２８．６（２ｘ），１２９．６（２
ｘ），１４０．９，１４６．６，１５７．２，１６６．
０，１６６．５，１６７．２，１６９．５，１７０．３
ppm ．
し、ジ（トリメチルシリル）誘導体を形成している。分
子式Ｃ38Ｈ52Ｏ14を、ＨＲ−ＥＩ測定（計算値７３２、
３３５７、実測値７３２、３３２９）から直接に決定し
た。 1 Ｈ ＮＭＲスペクトル （Ｃ6 Ｄ6 ，２２℃）：図１参
照 13ＣＮＭＲ化学シフト（Ｃ6 Ｄ6 ，７５ＭＨｚ） ：１
１．３，１４．０，１８．９，２０．２，２０．６，２
６．３，３０．０，３２．１，３４．６，３４．７，３
７．１，４０．２，４３．３，５１．９，５２．１，５
３．３，７５．３，７６．２，７８．８，８２．０，８
２．８，８９．８，１０６．２，１１１．８，１１８．
８，１２６．２，１２８．６（２ｘ），１２９．６（２
ｘ），１４０．９，１４６．６，１５７．２，１６６．
０，１６６．５，１６７．２，１６９．５，１７０．３
ppm ．
【図１】本化合物のＮＭＲスペクトルを示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 ジェラルド エフ．ビルス アメリカ合衆国，07203 ニュージャーシ ィ，ロゼール，アルデン ロード 402 (72)発明者 ユ リン コング アメリカ合衆国，08820 ニュージャーシ ィ，エジソン，ブライアント アヴェニュ ー 57 (72)発明者 メアリ ナリン オムステッド アメリカ合衆国，07934 ニュージャーシ ィ，グラッドストン，ディーア パス 13 (72)発明者 フェルナンド ペラエス スペイン，28038 マドリッド，シー／カ ミノ デヴァルデッリバス，10
Claims (8)
- 【請求項１】 スクアレンシンセターゼ活性を阻害する
下記式化合物 【化１】 を回収可能な量発酵ブロス中に生産することのできる、
エクセロヒルム・ロストラツム(Exserohilum rostratu
m) の生物学的に純粋な培養菌。 - 【請求項２】 スクアレンシンセターゼ活性を阻害する 【化２】 を回収可能な量発酵ブロス中に生産することのできるエ
クセロヒルム・ロストラツム(Exserohilum rostratum)
の培養。 - 【請求項３】 ＭＦ５５６５（ＡＴＣＣ７４０６８）又
はその活性を有する突然変異体である、請求項１の生物
学的に純粋な培養菌。 - 【請求項４】 ＭＦ５５６５（ＡＴＣＣ７４０６８）又
はその活性を有する突然変異体である、請求項２の培
養。 - 【請求項５】 当該化合物の発酵と当該化合物の回収に
適した条件下にエクセロヒルム・ロストラツム(Exseroh
ilum rostratum) を培養することから成る、構造： 【化３】 の化合物を作る方法。 - 【請求項６】 培養を１４〜３５日間行なう、請求項５
の方法。 - 【請求項７】 エクセロヒルム・ロストラツム(Exseroh
ilum rostratum) の株がＭＦ５５６５（ＡＴＣＣ７４０
６８）である、請求項５の方法。 - 【請求項８】 培養を１４〜３５日間行なう、請求項７
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72204991A | 1991-06-27 | 1991-06-27 | |
| US722049 | 1991-06-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH067150A true JPH067150A (ja) | 1994-01-18 |
Family
ID=24900308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4169609A Pending JPH067150A (ja) | 1991-06-27 | 1992-06-26 | 新規なエクセロヒルム・ロストラツムの培養菌とそれを利用する方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0524671A1 (ja) |
| JP (1) | JPH067150A (ja) |
| CA (1) | CA2071723A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5430055A (en) * | 1994-04-08 | 1995-07-04 | Pfizer Inc. | Inhibitor of squalene synthase |
| US6078568A (en) * | 1997-02-25 | 2000-06-20 | Telefonaktiebolaget Lm Ericsson | Multiple access communication network with dynamic access control |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL97535A0 (en) * | 1990-03-21 | 1992-06-21 | Merck & Co Inc | Squalene synthetase inhibitor dioxabicyclo(1,2,3)octanes,their production and pharmaceutical compositions containing them |
| US5026554A (en) * | 1990-09-13 | 1991-06-25 | Merck & Co., Inc. | Method of inhibiting fungal growth using squalene synthetase inhibitors |
-
1992
- 1992-06-19 CA CA002071723A patent/CA2071723A1/en not_active Abandoned
- 1992-06-19 EP EP19920201809 patent/EP0524671A1/en not_active Withdrawn
- 1992-06-26 JP JP4169609A patent/JPH067150A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0524671A1 (en) | 1993-01-27 |
| CA2071723A1 (en) | 1992-12-28 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 19950215 |