JPH06502548A - 特にコリネバクテリア中で用いることのできる蛋白質の発現および分泌系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特にコリネバクテリア中で用いることのできる蛋白質の発現および分泌系 本発明は、特にコリネバクテリア中で使用することのできる蛋白質の発現および 分泌系、この系を使用する方法、およびこれら発現系に関連した新規な蛋白質に 関する。

コリネバクテリアとは、さまざまな菌株によって表示される不規則な形態の一部 のグラム陽性バクテリアのことである。

グラム陽性細胞は、外部培地への蛋白質の分泌を容易にする簡単な構造を有する という事実にもかかわらず、コリネバクテリアによる蛋白質の分泌は、今日迄あ まり広く研究されていない。毒性１の溶原性ファージ（Ｓｍｉｔｈ１９８０：　 Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ１ｏＩＳ１４１．１１４２頁；　Ｓｍ１ｔｈ等、１９８０　 ：Ｊ、　ＢＢＣｔｅｒｉｏｌ、１４１５１１１４頁；　Ｇｒａｅｎｆｌｅｌｄ等 、１９ｇ３　：ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８０．８８５３頁）に感染したｃｏｒｙ＋） ｅｂａｃｔｅｒｔｕｗｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの特定の菌株によって分泌された ジフテリア毒素およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｓ　ｇｌｕｔａａｉｃｕｓ 　（Ｖ、　Ｌｌｅｂｌ等・Ａ、Ｓ、　５ｌｎｋｓｅｙ、　１９８６　：バクテリ アの遺伝子学および生物工学、２巻、３１１３−３８８頁ンによるＤＮアーゼの 分泌に伴う遺伝子のヌクレオチド配列の研究が報告されているにすぎない。

米国特許第４，９６５．１９７号は、上記ＤＮアーゼの下でＣｏｒｙｎｅｂａｃ ｔｅｒｉｕｍに用いることのできる発現および分泌系について述べているが、こ の場合の蛋白質は主成分ではなく、またこれら条件の下では、対応する分泌系は あまり重要ではないように思われる。

従って、本発明は、特定のコリネバクテリアの培養液上澄み中に高い割合で存在 する二つの蛋白質の分泌のための要素を含むコリネバクテリア型のバクテリアに おける発現および分泌系に関する。

本発明は、特にコリネバクテリア菌株により所定のアミノ酸、ポリペプチドまた は蛋白質の発現および分泌のための系であって、上記アミノ酸、ポリペプチドま たは蛋白質をコードする配列が、染色体またはプラスミドＤＮＡの領域内に位置 しており、この領域内では上記配列が、蛋白質ＰＳＩまたはＰＳ２のシグナル配 列をコードする配列の少なくとも１つの部分とともに５′端部に向かって転写さ れ、上記部分は、系が上記コリネバクテリア菌株に取り込まれた時、翻訳後の上 記アミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白質の分泌が保証するものであることを特徴 とする系に関する。

さらに、本発明は、コリネバクテリアの発現および分泌系であって、 −コリネバクテリア菌株と、 −上記コリネバクテリア菌株中の発現のための第一機能性ＤＮＡ配列、アミノ酸 、ポリペプチドおよび／または蛋白質をコードする第二ＤＮＡ配列、および上記 第一および第二ＤＮＡ配列間に挿入された第三ＤＮＡ配列を含む分泌カセットと を含んでなり、上記第三ＤＮＡ配列は、上記コリネバクテリア菌株により上記ア ミノ酸、ポリペプチドおよび／または蛋白質の分泌を保証するＰＳｌまたはＰＳ ２から選ばれた蛋白質の要素をコードするもの、である系に関する。

まず、本発明の構成において、「コリネバクテリア」止はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ属の菌株のみならずＢｒｅｖｌｂａｃｔｅｒｉｕ＋１のような同属の バクテリアの菌株をも指すものと理解すべきである。

本発明の発現系はコリネバクテリア中で自動的に複製するプラスミド中に存在し 、この場合、プラスミドは、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｌｌの菌株中 で機能する複製起源、即ち複製起源ＰＢＬ１を含むが、また上記発現系は、染色 体組込み用に特別に設けられた複製不能なプラスミドに保持することもでき、こ の場合、プラスミドは染色体組換えおよび組込みを可能にする要素を含んでなる 。この組込みの場合、発現系は最終的に上記バクテリアの染色体中に存在する。

特に、染色体組込みの場合、ＰＳｌをコードする遺伝の異種ＤＮＡ配列の挿入は 、対応する菌株の成長に影響を及ぼさないことが実証されている。これらの条件 の下では、挿入したコード配列の発現による生成物を発現／分泌させるために、 Ｃ３ＰＩまたはＣ５Ｐ２の相の中でアミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白質をコー ドする配列を一体化することが可能である。

コリネバクテリア菌株中の発現のための機能性ＤＮＡ配列としては、相同発現用 要素および異種発現用要素の両方を挙げることができる。即ち、これら要素は宿 主のバクテリア中にすでに存在している要素、またはこれとは異なり、異なるバ クテリアから誘導される要素でもよい。

これら発現要素は、プロモーターおよびリポソーム結合部位を本質的に含んでい るが、他の要素、特に発現を調整するタイプの要素であることも可能である。

コリネバクテリア中で使用することのできる発現要素としては、強力なプロモー ターであるＰｔａｃプロモータ、ＩＰＴＧにより誘導され且つＥ、ｃｏｌｉのよ うなコリネバクテリア中で作用することが解っているｔｒｐ／　１　ａ　ｃハイ ブリッドが特に使用される。しかしながら、他のプロモータ、例えば下記のプロ モータ、またはコリネバクテリアの構造遺伝子発現のための他の要素、例えばｇ ｄｈＡプロモータを使用することが可能である。また、例えば、発現要素、特に 本発明の範囲内にあると認められる蛋白質ＰＳＩおよび／またはＰＳ２の一方の プロモータを使用することも可能である。

また、発現要素は遺伝子の下流領域の発現の調整を保証するＤＮＡ配列を含むこ ともできる。

良好な発現を保証する要素として、コード配列の末端に１つ以上の停止コドンの 形の翻訳停止要素、または転写停止要素を配置することが可能である。

分泌を保証する要素としては、上記したように、分泌特性を変更または喪失する ことなしに、蛋白質ＰＳＩまたはＰＳ２の一方のシグナル配列のすべてまたは一 部並びにこれら配列と等価の配列を挙げることができる。

最終的には、点突然変異のような公知の技術を用いて、同様の分泌特性を保持し ながら分泌配列を僅かに変更することが可能であり、従って、本発明はこれら等 価の配列をも含むものである。

結論として、本発明による発現系は他の要素、特に転写ターミネータ−１例えば 蛋白質ＰＳ１および／またはＰＳ２用、もしくはｇｄｈＡ用のターミネータ−の ような要素を含んでいてもよい。

場合によっては、発現および分泌配列に蛋白質ＰＳ１のすべてまたは一部を導入 して、これらの条件の下で分泌および発現レベルを改善することのできる融合蛋 白質を得ることも有利である。

本発明による発現系は、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ中で作用する上記のような複製起 源をコリネバクテリアと異なるバクテリア中で生成する異種要素、またＣｏｒｙ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ＋１への転移を容易にする標識遺伝子のような他の要素を 含んでいてもよい。

もちろん、マーカー遺伝子は、コリネバクテリア中で作用する限りにおいて、様 々な形のものであってよく、耐性のような正または負の選択用の遺伝子であって よい。

しかしながら、現在の研究状況の下では、これら遺伝子は容易に人手できない。

従って、ＣＭＣ＋ＭＣ型を与えも可能である。

マーカー遺伝子がｃｅｌＡである場合、Ｂｓ　ｔＸＩのような適切な制限部位へ のコード配列の挿入後、ＣＭ　Ｃ＋特性のために形質転移バクテリアが選択され る。

本発明の方法においては、特にマーカー遺伝子とコード配列との間に制限部位を 配置することにより、構造の点検後にマーカー遺伝子を容易に除去できることが 好ましい。

コード配列は自然のもの、合成のもの、またはこれらの混合したものでもよい。

本発明の発現および分泌系は、もちろん工業的に重要な生成物の生成を保証する ように特別に設計されている。

従って、コード配列は、工業的に重要なペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を 特別にコードする。しかじなから、このコード配列は、工業的に重要な蛋白質を 直接的にコードするのではなくて、工業的に重要なアミノ酸、ポリペプチドまた は蛋白質の成熟および／または生成を必要とする蛋白質をコードする配列であっ てもよい。

本発明の方法はアミノ酸配列、特に反復配列の発現のために特別に設計されてお り、従って、これらは主に合成配列である。

これら種々の生成物をコードするこの第二ＤＮＡは、また分泌生成物の成熟を保 証するように設計された特定の要素を含んでいてもよい。

合成配列の場合、コード配列を選択することにより次の構成が得られる。

−アミノ酸配列； （ａ　ａ　１・・・ａａＸ）ｎ型のｎ個の反復単位を有する反復アミノ酸配列； −Ｃ００Ｈ−末端位置ａａ　に正または負に帯電したアミノ酸を含む反復配列。

このアミノ酸は遺伝子発現を改善するが、次の事項を有利に達成し く１）著しいイオン性によりポリペプチドを単離すること； Ｈｉ）　特定の蛋白質によりポリペプチドを（ａ　ａｌ・・・・・・ａａ　）　 単位に切断すること； ｎ （ｉｌｉ）必要ならば、特定のカルボキシペプチダーゼにより末端アミノ酸ａａ 　を除去すること；−所望の利点を与えるアミノ酸をＮ　Ｈ２−またはＣ００Ｈ −末端部分ａａ１またはａ　ａ　Ｘに含有する反復配列。実施例において、発現 配列は構造（ａｌａ−ｇ　Ｉ　ｎ　）　２０および（ａ　ｌａ−ｇｉｎ−１ｙｓ ）　１ｏのポリペプチドをコードする。ａｌａ−ｇｌｎまたはａｌａ−ｇｌｎ− １ｙｓ配列はその後の酵素処理により放出することができる。酵素処理または化 学的処理により放出できるＡ　１　ａ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｔｙ　ｒまたはＡｌａ−Ｇ ｉｎ−Ｍｅｔのようなこの種の他のポリマーを生成することもできる。

コード配列のコドンの選択は、コリネバクテリア中の発現に影響を及ぼし、約５ ０−６０％のＧＣ含有量を有する配列を生成することが好ましい。

この例の場合、（ＡＱ）２ｏをコードする配列は、ＧＣＸ　ＣＡＧであり、ここ でＸはＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、実際これらコドンはアラニンに対して好まし くないが、一方ＣＡＧコドンはグルタミンに対して明らかに好ましい。この場合 、ＧＣの含有量は約７５％であり、これは限定的である。従って、含有量を５５ ％まで減少させるために、第３番目はＡおよびＴが豊富な３つのアミノ酸を含む ポリマーの使用が考えられる。

Ｔｙｒ、ＬｙｓおよびＭｅｔはこれらコドンの最初の２つの塩基中に２つのＡま たはＴを有しており、従って、ＧＣの含有量は７５％から約６０％に減少し、コ リネバクテリア中に見られるＧＣの含有量に接近する。さらに、もちろん、グル タミン（Ｑ）のＣ００Ｈ−末端位置における工業的に重要なこれら２つのアミノ 酸は、開発され且つ実在するものである。

本発明は、また上記発現および分泌系を含むコリネバクテリア菌株に関しており 、特に、この場合、上記菌株はＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓ特にＢｒｅｖｉ ｂａｃｔｅｒｉｓ　Ｉａｃｔｏｒｅｒｓｅｎｔｕｍ菌株である。

最後に、本発明は、アミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白質を生成する方法であっ て、上記コリネバクテリアの形質転換株を培養液中で培養することからなり、第 二ＤＮＡ配列が上記アミノ酸、ポリペプチドおよび／または蛋白質をコードし、 且つ上記生成物が培養後に培養液から任意に分離されることを特徴とする方法に 関する。

実際、この方法により、冑用な生成物が分泌された。従って、この生成物は、こ の生成物自体を公知の方法で単離することのできる培養液中に存在する。これら 公知の方法は例えばクロマトグラフィーまたは選択的沈殿のような分離方法であ り、この選択的沈殿は、生成する分子の特性に適応したものであることが明らか に必要である。

また、バクテリア濃縮液を分離し、つぎに、例えば表面活性剤を用いて、この濃 縮液からＰＳｌまたはＰＳ２と融合または別の方法で結合した所定の蛋白質を分 離することも可能である。実際、ＰＳｌおよびＰＳ２は壁量白質であり、このシ ステムにより分泌した蛋白質の一部は、壁に固定したままであり、このことは、 これら蛋白質の分離を容易にする。なぜならばバクテリアは特定の洗浄剤では溶 菌しないからである。

プラスミドによるコリネバクテリアの形質転換は、エレクトロポレーション（Ｂ ｏｎａＩＩｙ　Ｃ，、Ｇｕｙｏｎｖａｒｃｈ　Ａ、、Ｒｅｙｅｓ　、　０．、Ｄ ａｖｉｄ　Ｆ、およびＬｅｂｌｏｎ　Ｇ、　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ−１ｏ ｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　６６．２８３−２７０　、（１９９０））または他の 好適な方法により行なうことが好ましい。

アミノ酸、ペプチドおよび／または蛋白質の生成を可能にする発酵条件は、得ら れた生成物の種類並びに使用した特定の菌株に明らかに依存し、当業者の知識に 従って各菌株に対して明確に決定しなければならない要素がある。

また、本発明は、ｃｓｐｌ、Ｃ３ｐ２およびｇｄｈＡ。

これら３つの遺伝子のすべてまたは一部の発現用シグナルのすべてまたは一部を 含む発現系、並びにこの種の系を発現する菌株、特にコリネバクテリアの菌株に 関する。

上記構成物を使用する方法において、所定のアミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白 質の発現／分泌は、温度、培養液および／またはＳＰＩおよびＰＳ２用の糖分の 性質、ン酸塩）およびｇｄｈＡを有する系用の糖分（グルコース／フルクトース ）によって調整される。

また、本発明は、ＳＰＩまたはＰＳ２Ｓ２Ｏすべてまたは一部を含む蛋白質、特 にこれら蛋白質の１つ以上の抗原部位を含む蛋白質に関する。上記蛋白質は、ま た代表的な要素として、特に診断セットとして、対応する抗体と使用することが できる。

また、本発明は、所定の蛋白質が下記固定作用を行なうＳＰＩまたはＰＳ２部分 の壁に固定され、またＳＰＩまたはＰＳ２の抗原エピトープが壁上に露呈されて いるコリネバクテリア菌株に関する。

下記の実施例は本発明の他の特徴および利点を示すことを意図しており、これら 実施例はけっして本発明を制限するものではない。

第１図はプラスミドｐｃＧＬ６１２の図であり、このプラスミドは、蛋白１Ｐｓ １を合成する全ｃｓｐｌ遺伝子を含むＣ，１ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　Ａ　Ｔ　Ｃ Ｃ１７９６５の２．６−ｋｂフラグメントを含むｐ　Ｕ　Ｎ　１２１　（Ｎ１１ ｓｓｏｎ、　Ｂ、。

Ｕｈｌｅｎ、　Ｍ、、　Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ、　Ｓ、、　Ｇａｔｅｎｂｅｃｋ、 　Ｓ、、およびＰｈ１ｌｉｐｓｏｎ、　Ｌ、　（１９８３）、Ａｎ　ｉｍｐｒｏ ｖｅｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　５ｅｌｅｃ−Ｎｏｉ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏ ｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ｏｌｌｇｏｎｕｃｌｅｏｔｌｄｅｍｅｄｌ ａｔｅｄ　ｗｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　（オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発に より生成された改良した正の選択プラスミドベクター）　、Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１１：　８０１９−８０２９　）から誘導されたものである 。

第２図は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｇ＋　５ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　Ａ　 Ｔ　ＣＣ１７９６５と呼ばれているｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔ ａｌｌｅｕｌのｃｓｐｌ遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列 を示す。ヌクレオチドの番号は、図面の右側に記載されている。反復ヌクレオチ ド配列は四角で囲っである。予想されるＳＤ配列には下線が付しである。転写タ ーミネータ−におそらくは対応する２４−ｂｐパリンドロームは、向かい合う矢 印で示されている。この配列は、アクセス番号Ｘ６６０７８の下でＥＭＢＬヌク レオチド配列データバンクで見ることができる。

第３図はｃｓｐｌをを保有するＣ、　＊ｅｌａｓｓｅｃｏ！ａＡＴＣＣ１７９６ ５の配列ＤＮＡ領域の制限地図である。

第４図は、Ｃ，ｇｌｕｔａｌｌｉｃＬＩｌｌの蛋白質ＰＳＩおよびＭｙｃｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍの抗原８５複合体の蛋白質の配列の整列状態を示している。８５ ＢＭ、に、はＭ、　ｋａｎｓａｌｌ（ＭＩＰＳＧ１８２３５）の抗原８５−Ｂを 表わす。８５８　Ｍ。

ｂ、はＭ、　ｂｏｖｉｓ　（旧ＰＳＣ１１３１７９）の抗原８５−Ｂを表わす。

８５８　Ｍ、１．　はＭ、　１ｅｐｒａｅ　（ＥＭＢＬＸ８０９３４）の抗原８ ５−Ｂを表わす、８５ＣＭ、ｔ、はＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＥＭＢＬＸ ５７２２９）　ノ抗原８５−Ｃを表わす。８５Ａ　Ｍ。

ｂ、はＭ、　ｂｏｖｌｓ　（ＭＩＰＳＡ２８５４４）の抗原８５−Ａを表わす。

８５ＡＭ、ｔ　はＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　（ＭＩＰＳ１６００Ｂ２） の抗原８５−　Ａを表わす。配列はｒ　Ｇｅｎｅｎｔｉｃｓ　Ｃｏｌ１ｐｕｔｅ ｒＧｒｏｕｐ　Ｊ　（米国、ライスコンシン大学）のＦａｓｔＡプログラムを用 いて整列した。残基の数は各行の始めに各蛋白質に対して与えられている。異な る各蛋白質の間に見られる同様のアミノ酸残基は四角で囲っである。同様である と考えられる残基は次の通りである。酸またはアミド（Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ）；塩基 （ＨＳＫ、Ｒ１）；極性（Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ）；無極性（■、Ｌ、Ｍ％Ｖ）お よび芳香族（Ｆ、Ｗ、Ｙ）。７つの蛋白質の間の同じアミノ酸残基は、関係した 残基の上の星印によって表示されている。

注意：　各抗原に対して、アクセス番号は上記データーバンクの名前と一緒にカ ッコ内に表示されている。

第５図はｃｓｐｌ遺伝子の切断を示している。切断したｃｓｐｌ遺伝子の染色体 への組込み状態が示されている。ｐｃＧＬ６１３’　はＣ，ｇｌｕｔａｌｉｅｕ ｆｆｉ中で複製不可能であり、これはａｐｈＡ３遺伝子（Ｋ！ｌ）によって切断 されたｃｓｐｌ　（黒色領域）を含んでいる。ｗｔはＢ、　Ｉａｃｔｏｌ’ｅｒ ａｅｎｔｕｍ　１５野生型を表わし）Δｃｓｐｌは切断ｃｓｐｌを含む組み込み 体である。

第６図はプラスミドｐｃＧＬ６１６の構造を示している。プラスミドｐｃＧＬ６ １６は、Ｃ，ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｃｓｐｌ遺伝子を有するプラスミドｐｃＧ Ｌ１２５に対応する。

第７図は切形蛋白質ＰＳＩを合成することのできるプラスミドを示（２ている。

ここでは、ｐＣＧＩ−６１６から誘導したベクターの図、期待された蛋白質の大 きさの明細、および抗ＰＳＩポリクロ−ｊ−−ル抗体を使用］、ウェスタンプロ ットによる検出（＋）または非検出（−）を示している。

第８図はプラスミドｐｃＧＬ１０３０の構造を示しでいる。図の領域Ａはｅｓｐ ｌおよびこれに続＜　ＤＮＡ領域を含んでおり、このＤＮＡ領域はＰＳＩのシグ ナル配列およびその成熟配列の最初の３０個のアミノ酸に対応している。

第９図はプラスミド１０３１の構造を示している。領域Ａは第８図に説明されて いる。ｐＳｌおよびＥＧＡの間の結合領域は連続配列されており、この配列の詳 細が示されている。

第１０図はプラスミド１０３２の構造を示している。

領域Ａは第８図に説明されている。ＰＳＩ、（ＡＱＫ）１０およびＥＧＡの間の 結合領域は連続配列されており、この配列の詳細が示されている。

第１１図はプラスミド１０３３の構造を示している。

領域Ａは第８図に説明されている。ＰＳＩ、（ＡＱ）１９およびＥＧＡの間の結 合領域は連続配列されており、この配列の詳細が示されている。

第１２図は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｓ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　Ａ　 Ｔ　ＣＣ１７９６５と呼ばれているＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔ ａｍｉｅｕｓのｃｓｐ２遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列 を示す。ヌクレオチドの番号は、図面の右側に記載されている。予想されるＳＤ 配列には下線が付しである。転写ターミネータ−におそらくは対応する２２−ｂ ｐパリンドロームは、向かい合う矢印で示されて０る。

第１３図はｅｓｐ２を保有するＣ、　ｍｅｌａｓｓｅｅｏｌａＡＴＣＣ１７９６ ５の配列ＤＮＡ領域の制限地図である。

第１４図はｃ、　ｇｌＵｔａｌｉｃｕｌにおけるｃｓｐ２遺伝子の切断を示して いる。切断された遺伝子の染色体組込み状態が示されている。ｃ、　ｇｌｔ＋ｔ ａｌｉｃｔ＋ａ中で複製不可能であるプラスミドｐｃＧＬ８３０は、ａｐｈｍに より切断されたｃｓｐ２遺伝子を保有している。ａｐｈｍおよびｃｓｐ２遺伝子 の転写方向は、プラスミドｐＣＧＬ８３０上の矢印によって表わされている。Ｗ ｔはＢ、１ａｃｔｏ「ｅｒｍｅｎｔｕ＋＊　１５菌株を表わし、ｃｓｐ２：：ａ ｐｈＩＩＩは切断ｃｓｐ２遺伝子を有する組み連体である。

第１５図は温度の関数としてＰＳｌのトランスロケーションを示している。３４ ℃の指数増殖期（ＯＤ６５０−１）における培養液の１０１を１分間３５ｓメチ オニン（３７ＴＢｑ／ｍｓｏ！、１６ｎＭ最終濃度）で標識した。

パルスの終了時に、クロラムフェニコール（１００μｇ／ｌ）および次に３２８ メチオニン（最終濃度０．５ｍＭ）を加えた。アリコートの１１を除去し、所定 の温度まで速やかに冷却した。この温度で３０分間培養を続け、ＰＳＩの分泌璧 留分を抽出した。次に、この抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラ フにかけた（ａ）。バンドの強度は、デンシトメトリーにより決定され（ｂ、左 側の軸）且つ３４℃で１００を基準にして任意の単位で表わされている。トラン スロケーションは膜脂質の相転移の関数である。

第１６図はｇｄｈＡ遺伝子の制限地図である。

第１７図はＣ，ａｅｌａｓｓｅｃｏｌａのｇｄｈＡ遺伝子を含むＮｈｅｌ−Ｂ１ ｇＩフラグメントの完全な配列を示す。

第１８図はｐｃＧＬ１４１およびｐｃＧＬ１４２の構造、およびｇｄｈＡ遺伝子 のプロモータとｌ　ａｃＺ遺伝子との間を融合するベクターを示す。

第１９図は各構造において用いられるオリゴヌクレオチドを示す。

第２０図はｐ　Ｐ　ＲＯＫ　（Ａ　Ｑ　）　２０　Ｃｅ　ｌ　Ａの構造を示す。

第２１図はｐｔａｃとｃｅｌＡとの間に合成遺伝子が配置されている構造を詳細 に示しており、ａ）はｐｔａｃの指令下にｃｅＬＡを配置した構造であり、ｂ） はポリペプチドＡＱの導入後の予想できる構造である。

ｐｔａｃ：　ｔａｃプロモータ ＲＢＳ：　リポソーム結合部位 需：　ポリペプチドＡＧに等価な配列の導入および他の可能な遺伝子（ＤＧＦＩ 、ＤＧＦ２）との融合を可能にするｃｅｌＡ遺伝子の５末端における合成配列■ ：　ポリペプチドＡＱに等価なりｓ　ｔＸ１部位に導入したヌクレオチド（ＤＧ Ｆ５、ＤＧＦ６）口：ＥＧＡのシグナル配列の一部に等価なりＮＡの配列 ｍ：　ＥＧＡのコード配列に等価なりＮＡの配列Ｐ　：　ＥＧＡのシグナル配列 に属する最初のアミノ酸 第２２図はｐｃＧＬ１２５の構造を示す。

実施例１．　培養液上澄みおよびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｔｕｍｇｌｕｔａｍ ｉｃｕｍの璧におけるＰＳｌおよびＰＳ２の同定現在、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株（Ｊｏｎｅｓ、　Ｄ、。

およびＣｏｆｆ１ｎｓ、　Ｍ、Ｄ、　（１９８Ｂ）、Ｉｒｒ１３ｇｕｌａｒ　ｎ ｏｎｓｐｏｒｔｎｇＣｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｌｖｅ　ｒｏｄｓ、Ｉｎ　Ｂｅｒｇｅ ｙ’Ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍａ−ｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ ｇｙ、、Ｖｉｌｌｌａａｓおよび１１１ｋ１ｎｓ（ｅｄｓ）、Ｂａｌｔｉｍｏｒ ｅ　ｓ　２巻、１２６１−１４３４頁）と再定義されているＣｏｒｙｎｅｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　Ａ　Ｔ　ＣＣ１７９６５菌株の培養液 上澄みの変性条件（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｓａｌｉ、　Ｕ、に、　（１９ ７０）、Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄ ｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｂａ ｃｔｅ−ｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４　、Ｎａｔｕｒｅｓ　２２７：　８８０−６８ ５）の下におけるポリアクリルアミドゲル分析によれば、分子量がそれぞれ約６ ７０００および６３０００のＰＳＩおよびＰＳ２の２つの主要蛋白質が明示され る。ＰＳＩおよびＰＳ２の濃度は、バクテリアの成長曲線に従い、これらの定常 期−相において最大値に達する。これら蛋白質、特にＰＳ２の大部分の分泌留分 は、バクテリアの壁中にも存在している。壁からＰＳＩおよびＰＳ２を抽出する ためには、バクテリアを殆ど溶菌することのないバクテリアのＳＤＳ処理が使用 される。従って、ＰＳｌおよびＰＳ２の最大濃度を得るためには、２つの分泌留 分、培養液上澄みおよび細胞壁留分を蓄積し、ＰＳＩおよびＰＳ２が高い割合で 存在する最終標品を得ることができる。ポリクロナール抗体はＰＳＩおよびＰＳ ２に対して生成され、２つの蛋白質問に免疫交差反応は存在せず、このことは、 これら蛋白質が異なることを効果的に示している。

ＰＳＩおよびＰＳ２との強い免疫交差反応性を有する蛋白質は、Ｂｒｅｖｉｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　Ｉａｃｔｏｆｅｒｗｅｎｔｕｍ　１５（Ｂｏｎｎａｓｓｉｅ。

Ｓ、、　Ｏｒｅｇｌｉａ、　Ｊ、、　Ｔｒａｕｔｖｅｔｔｅｒ、＾−および５ｌ ｃａｒｄ。

Ａ、Ｍ、　（１９９０）、ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ ｚａｔｉｏｎ　ｏｆ’　ａｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｏｄｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ　ｄｅ４１ｃｉｅｎｔ　５ｕｔａｎｔ　ｏｒＢｒｅｖｌｂａｃｔｅｒｉ ｕｗ　Ｉａｃｔｏｆｅｒｗｅｎｔｕｍ　、　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｅ ｔｔｅｒ　７２：１４３−１４６）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｗ　１ａｃｔ ｏｆｅｒｓｅｎｔｕＩＩＡＴＣＣ２１０８６およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ ａ　ｆｌａｖｕｗＡＴＣＣ１４０６７菌株のようなＣ０ｒ）’ｎｅｂａｃｔｅｒ ｉｕ１ｗｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　Ａ　Ｔ　ＣＣ１７９６５に関するバクテリア菌 株の培養液上澄み中に見いだされた。ＰＳｌおよびＰＳ２は、インベルターゼ、 ペクチナーゼ、ヌクレアーゼ、コラゲナーゼ、アミラーゼ、バクテリオシン、エ ンドグルカナーゼおよび広域スペクトルプロテアーゼ活性を含む幾つかの酵素活 性についてテストされた。これらの酵素活性はＰＳｌまたはＰＳ２に包含されて いなかった。

プラスミドｐｃＧＬ６１２　（第１図）により保持されたｃｓｐｌ遺伝子Ｅ、ｃ ｏｌｉ　ＴＧＩ中で発現されると、抗ＰＳ１抗体とこの組換体の粗抽出物のウェ スタンプロット分析により、Ｃ，５ｅｌａｓｓｅｃｏｌａの培養液上澄み中に存 在する蛋白質ＰＳ１と同じ分子量を有する主要蛋白質の存在が明らかになる。わ ずかに大きな分子量を有する少量の蛋白質もまた検出される。実際、主要な蛋白 質バンドは、Ｐｓｉ　（シグナル配列を有せず）およびＰＳｌ（シグナル配列を 有する）の前駆体型に対する副次的蛋白質バンドに対応している。

実際、第１の実験において、浸漬ショック（Ｈｅｐｐｅｌ。

Ｌ、Ａ−（１９６７）、５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆ　ｅｎｚｙ ｍｅｓ　ｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉａ％５ｃｉｅｎｃｅ　１５６：　１４５１−１ ４５５）により組換え菌株Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ　ＴＧＩ　（ｐｃＧＬ６１２）のベ リブラズミック蛋白質（分泌した酵素）の放出および抗−ＰＳ１抗体使用のウェ スタンプロット法による放出蛋白質含有量の検出は、主要蛋白質のみを示す。こ の菌株のイソクエン酸塩デヒドロゲナーゼ活性（Ｓｈｌｉｏ、　！、、およびＵ ｊ１ｇａｉ＋ａ、Ｋ、（１９７８）、　Ｅｎａｚｙｓｅｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｇｌ ｕｔａｓａｔｅ　ａｎｄａｓｐａｒｔａｔｅ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗ ａｙｓ　Ｉｎ　ａ　ｇｌｕｔａｓａｔｅ−ｐｒｏｄｕｃｆｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ、　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｌｕｗ　ｒｌａｖｕ＊、　％　Ｊ、　Ｂｏｌｃ ｈｅｖ８４：　６４７−６５７　）は、溶菌をモニターする方法で測定した。

この実験において、この溶菌は１％未満であると見積もられた。このことにより 、結論として主要蛋白質バンドはＰＳＩの熟成型に対応し、且つこの蛋白質はＥ 、ｃｏｌｉの細胞膜を横切って放出される。

第２の実験において、組換え菌株Ｅ、ｃｏｌｉＴＧＩ　（ｐｃＧＬ６１２）の粗 抽出物は、蛋白質の合成を抑制するためにクロラムフェニコールの添加の前後に 抗−ＰＳＩ抗体使用のウェスタンプロット法により分析された。副次的バンドは 蛋白質合成の抑制後次第に消える。クロラムフェニコールＣＣＣＰ（ｍ−クロロ フェニルヒドラゾンシアン化カルボニル）の添加５分前に、細胞膜を横切る移動 力を消散させるプロトノフォア−（Ｐｒｏｔｏｎｏｐｈｏｒｅ）が加えられるな らば、この副次的ｐｓ１のバンドは消失しない。従って、副次的ＰＳＩのバンド の消失は、プロテアーゼによる分解の結果ではない。

蛋白Ｒ，９成の抑制後のその漸進的消失およびペリプラズムからのその不在は、 膜内に位置されているペプチダーゼシグナル配列および細胞膜を横切るそのトラ ンスロヶ−ンヨンによるこの前駆体形態の成熟の仮説に一致している。また、こ の結果は、Ｅ、ｃｏｌｉにおいて、ＰＳｌの成熟が生体内のプロトン移動力に依 存１７ていることも示している。

実施例３．　Ｐｓｉをコードするｃｓｐｌ遺伝子のヌクレオチド配列 上流領域のｃｓｐｌと呼ばれているＰＳｌ−コード遺伝子を含む２５４７塩基対 フラグメントの配列決定を行った。ヌクレオチド配列は第２図に示されている。

（配列番号＝１）。第３図はこの配列領域の制限地図を表している。

コンピュータ分析を行なうことにより　６５７個のアミノ酸に対応する１９７１ 個の塩基対の読み取り枠が確認された。

翻訳（ＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＧ）および転写（ＴＡＣＡＴＡ　（ −３５）およびＴＡＡＧＡＴ（−１０）を開始する推定シグナルが確認された。

上記リポソーム−結合部位から抽出したＡＧＡＡＧＧＡ配列は、ダラム陽性型バ クテリア、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓおよび５ｔｅｐｔｏＩ ｌｙｃｅｓ　１ｌｖｌｄａｎｓ（５’　−ＧＡＵＣＡＣＣＵＣＣＵＵＵＣＵＯＨ −３’　）のｒＲＮＡの３′端部に対して相補的である（アンダーライン）　（ ＭｃＬａｕｇｈｌｌｎ、　Ｊ、Ｒ，、Ｈｕｒｒａｙ、　Ｃ，Ｌ、、およびＲａｂ ｉｎｏｗｉｔｚ、　Ｊ、Ｃ，（１９８１）　、Ｕｎｌｑｕｅ　「ｅａｔｕｒｅｓ 　ｏｆ　ｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅ刊＋１ｎｄｉＢ　５ｉｔｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ 　ｏｒｔｈｅ　Ｇｒａｔｓ　ｐｏｓｊｔｉ−ｖ　ｅ　Ｓ　ｔ　ａ　ｐ　ｈ　ｙ　 ｌ　ｏ　ｃ　ｏ　ｃ　ｃ　ＩＪ　ｓ失μ工！ｙサ　β　−１ａＣｔａｌａＳｅ　 ｇｅｎｅ、、Ｊ、　Ｂｏｉｌ、　Ｃｈｅｅｒ、　２５６：　１１Ｈ３−１１２９ １）　（Ｂｆｂｂ、　Ｍ、Ｊ、およびＭｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　１８７：　 ２６５−２７７）　、翻訳開始コドンの前方の５′におけるＤＮＡ領域は、２つ のヌクレオチド配列ＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧおよびＡＴＴＧＡＡＡＡＡ を含んでおり、これら配列のそれぞれは、最初の場合２８〜４２および７０〜８ ４において、二度目の場合１００〜１０８および１７１〜１７９において二度繰 返されている。これら２つの配列はｃｓｐｌ遺伝子の転写の調節範囲内に含まれ る。

分泌シグナルの場合、蛋白質のＮ　Ｈ２末端における配列は、ダラム陽性型バク テリアのシグナル配列の特徴を表わしている（Ｖａｔｓｏｎｓ　Ｍ、Ｅ、Ｅ、（ １９８４）、Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ　ｏｒｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｓｉｇｎａｌ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　ｓ　１２：５１ ４５−５１６４　）。このシグナル配列は、ＮＨ２−末端位置における過剰の正 電荷（最初の１８個のアミノ酸中に正電荷を有する７個のアミノ酸）、それに続 いて過剰の無極性アミノ酸（次の２３個のアミノ酸中に１８個のアミノ酸）を有 する配列、さらにそれに続くシグナル配列切断部位の２つの推定アミノ酸配列（ ２８−３２の位置におけるｐｒｏ　ｔｈｒ　ａｌａ　ｉ　ｌａ　ａｌａ）（３９ −４３の位置におけるｐｒｏ　ｍｅｔ　ａｌａｓｅｒ　ａｌａ）を含んでいる。

シグナル配列切断部位のこれら推定アミノ酸配列の間で、後者の配列−３９−４ ３の位置におけるｐｒｏ　ｍｅｔ　ａｌａ　５ｅｒａｌａは、最も確立が高いよ うに思える。実際、蛋白質ＰＳＩは、２つの異なる方法（実施例５を参照）を用 いて電気泳動の結果が同じになるまで、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｌｕｍｇｌｕ ｔａｍ＋ｃｕｍの培養液上澄みから精製され、得られた標品は、エドマン分解法 によりアミノ−末端配列を決定するために用いられた。５　ｎｆｆ１ｏｌの純粋 な蛋白質を使用したが、シグナルは得られなかった。２つの精製方法が使用され たので、蛋白質ＰＳＩが生体内で遮断され、この遮断は使用した精製技術の結果 ではないと思われる。提案された第２の切断配列は、成熟配列の最初のアミノ酸 としてグルタミン（４４の位置）を明示していると思われ、このグルタミンはエ ドマン技術によりピログルタミン酸に容易に変換されて、蛋白質のアミノ−末端 配列化を不可能にする。

ｒｈｏ−依存型の推定ターミネータ一部位は、３つの停止コドンｏｃｈ−ａｍｂ −ｏｐａから５５個のヌクレオチドの遺伝子の３′領域中に見いだされる（Ｒｏ ｓｅｎｂｅｒｇ。

Ｍ８．およびＣｏｕｒｔ、　Ｄ、　（１９７９）、Ｒｅｑｕｌａｔｏｒｙ　５ｅ ｑｕｅｎＣｅＳｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ａｎｄ 　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌ？ＮＡｔｒａｎｓｃｒｌｐＬｉｏｎ、、　 Ａｎｎｕ　Ｒｅｖｅ　Ｇｅｎｅｔ　１３：　３１９−３５３　）　ｏ　このヘア ピン構造のΔＧは−３５、７ｋｃａｌ／ｓｏｌに等しい（Ｆｒｅｉｅｒ、　Ｓ、 Ｍ、、　Ｋｉｅｒｚｅｋ、　Ｒ，、Ｊａｅｇｅｒ、　Ｊ、＾、、　Ｓｕｇｉｓｏ ｔｏ。

Ｎ、、　ＣａｒｕＬｈｅｒｓ　Ｍ、Ｈ，、Ｎｅｊｌｓｏｎ　％Ｔ、およびＴｕｒ ｎｅｒ％Ｄ、Ｈ。

（１９１１６）　、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｆｒｅｅ−ｅｎｅｒｇｙ　ｐａｒａｓｅ ｔｅｒｓ　ｆ’ｏｒ　ｐｒｅ−ｄｉｃｔｌｏｎｓ　ｏｒ　ＲＮＡ　ｄｕｐｌｅｘ 　５ｔａｂｉｌｉｔｙ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄＳｃｉ　％ＵＳＡ　８ ３：　９３７３−９３７７　）。

読み取り枠中に含まれる６５７アミノ酸に対応する計算上の分子量は７０８７４ ゜しかしながら、最も可能性の高いシグナル配列（アミノ酸の４２と４３との間 の切断部位）の分子量は４４１１であり、このことは成熟蛋白質に対して６６４ ６３の計算上の分子量が与えられ、この値は、変性ポリアクリルアミドゲルに基 づいて計算された６７０００の値にかなり近似している。

配列の特徴をまとめると、次の通りである：２３９　〜２４４　ＴＡＣＡＴＡ　 （シグナル　−３５）２６９　〜２７４　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　（シグナル 　−１０）４０５〜４１４　ＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡ　リボソーム−結合部位） ４２０〜２３９０　コード配列 ４２０〜５４８　分泌蛋白のペプチドシグナル２４５５〜２５０６　へア′ピン 構造、ｒｈｏ−型のターミネータ−シグナル 実施例４゜　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｌｕｍ　ｇｌＵｔａｌｉｅｕｌのＰＳｌ とＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの抗原８５１合体の蛋白質との間の配列相同性（ 第４図） 蛋白質ＰＳＩのＮ　Ｈ２部分は、３つの分泌ミコバクテリア抗原８５−Ａ、８５ −Ｂおよび８５−Ｃにかなり類似している（Ｃｌｏｓｓ、　Ｏ，、Ｈａｒｂｏｅ 、　Ｍ、、　Ａｘｅｌｓｅｎ−Ｃｈｒｌｓ−ｔｅｎｓｅｎ、　Ｎ、Ｈ，、ａｎｄ 　Ｍａｇｎｕｓｓｅｎ、　Ｍ、（１９８０）　Ｔｈｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓｏｆ　 ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕＬｌｂｏｖｉｓ、　５ｔｒａｉｎ　ＢＣＧ、　５ｔｕ ｄｉｅｄ　ｂｙｃｒｏｓｓｅｄ　ｊｗｍｕｎｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ ｓ：　ａ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｙｓｔｅｍＳｃａｎｄ　Ｊ、　Ｉｓｍｕｎｏ ｌ　１２：　２４９−２６３．）（Ｗｉｋｅｒ、　Ｈ，Ｇ、、　Ｈａｒｂｏｅ。

Ｍ、、　ＮａｇａＬ、　Ｓ、、　ａｎｄ　Ｂｅｎｎｅｄｓｅｎ、　Ｊ、　（１９ ９０）Ｑｕａｎｔｉｔａ−ｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｑｕａｌｉｔａｔｌｖｅ　５ｔｕ ｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅＭａｊｏｒ　ｅＸｔｒａ−ｅｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｔｔ ｇｅｎ　ｏｒ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕｓｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７ Ｒｖ　ａｎｄ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕｍ　ｂｏｗｌｓ　ＢＣＧ。

Ａｓ　Ｒｅｖ　Ｒｅ５ｐｌｒ　Ｄｉｓ　１４１：　８３０−８３８．　）　ｏ異 なるミコバクテリア種類の３つの対応する遺伝子がクローン化され且つ配列され た０即ちｓ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　Ｂ　ＣＧ　１１７３Ｐ ２およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕｓ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの抗原８５− 　Ａ　（Ｂｏｒｒｅｓａｎｓ、　Ｍ、、　Ｄｅ　ｗｉｔ、　Ｌ、、　Ｖｏｌｃｋ ａｅｒｔ、　Ｇ、。

Ｏｏｍｓ、　Ｊ、、　Ｄｅ　Ｂｒｕｙｎ、Ｊ、、　）Ｉｕｙｇｅｎ、　Ｋ、、　 Ｖａｎ　Ｖｏｏｒｅｎ。

Ｊ、−Ｐ、、　５ｔｅｌａｎｄｒｅ、　Ｍ、、　Ｖｅｒｈｏｒｓｔａｄｔ、　Ｒ ，、ａｎｄ　Ｃｏｎｔｅｎｔ、Ｊ、（１９Ｈ）　Ｃｌｏｎｉｎｇ、５ｅｑｕｅｎ ｃｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ、ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ’　ａ 　３２−　ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｏｆＭｙｃｏｂ ａｃｔｅｒｌｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕ−ｌａｓｔｓ、　Ｉｎｆ’ｅｃｔ　Ｉｍｍｕ ｎ　５７：３１２３−３１３０．）　（Ｄｅ　Ｗｅｔ、Ｌ、、Ｄｅ　Ｉａ　Ｃｕ ｖｅｌｌｅｒｉｅ、＾、。

Ｏｏｗｓ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｃｏｎｔｅｎｔ、Ｊ、（１９９０）Ｎｕｃｌｅｏｔｌ ｄｅｓｅｑｔ＋ｅｎｅｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　３２　ｋＤａ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅ ｎｅ　（ａｎｔｉｇｅｎ　ｌ１５Ａ）ｏｆ’　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕｓ　ｂ ｏｖｌｓ　ＢＣＧ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１８：３９９５、） 、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｗ　ｂｏｖｌｓ　Ｔｏｋｙｏ　Ｓ　Ｍｙｃｏｂａｃ ｔｒｌｕｍｋａｎｓａｌｉおよびＭｙｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＊　Ｉｅｐｒａｅ の抗原８５−Ｂ（Ｍａｔｓｕｏ、に、、Ｙａｍａｇｕｃｈｌ、Ｒ，、Ｙａｓａｚ ａｋｉ、Ａ、、Ｔａ５ａｋａ。

Ｈ，、ａｎｄ　Ｙａｍａｄａ、Ｔ、（１９Ｈ）Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎｏｒ　ｔｈｅ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕ＋ｓ　ｂｏｖｉｓ　Ｂ ＣＧ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒｅＸｔｒａｃ８１１ｕｌａｒ　ａ　ａｎｔｉｇｅｎ、Ｊ 、Ｂａｃｔｅｒ１ｏ１１７０：　３８４７−３８５４、）　（Ｍａｔｓｕｏ、　 Ｋ、、　Ｙａｍａｇｕｃｈｌ、　Ｒ，、Ｙａｍａ−ｚａｋｉ、　Ａ、。

Ｔａ５ａｋａ、Ｈ，、Ｔｅｒａｓａｋａ、に、、ａｎｄ　Ｙａｍａｄａ、Ｔ、（ １９９０）ＣＩｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｑ ｅｎｅ　ｆ’ｏｒ　ｔｈｅ　ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ　ａ　ａｎｔｉｇｅ ｎ　ｏｆ’　Ｈｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｋａｎｓａｌＬＩｎｆ’ｅｃｔ　１ ａｓｕｎ　５８：　５５０−５５６．）　（Ｄｅ　Ｍｅｎｄｏｎｃａ　Ｌｆｍａ 、Ｌ、。

Ｃｏｎｔｅｎｔ、Ｊ、、Ｖａｎ　Ｈｅｕｖｅｒｓｖｙｎ、Ｈ，、ａｎｄ　Ｄｅｇ ｒａｖｅ、Ｉｆ。

（１９９１）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎ ｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒｔｈｅ　８５−Ｂ　ａｎｔｌｇｅｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｓ　Ｉｅｐｒａｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１ ９：　５７Ｈ）　、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕｓｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓの抗原８５−　Ｃ（Ｃｏｎｔｅｎｔ、　Ｊ、、　Ｄｅ　ＬａＣｕｖｅｌｌｅｒ ｉｅ、Ａ、、Ｄｅ　Ｗｌｔ、Ｌ、、Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｌｅｖｙ−Ｐｒｅｂａｕ！ ｔ。

Ｖ、、Ｏｏｍｓ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｄｅ　Ｂｒｕｙｎ、Ｊ、（１９９１）Ｔｈｅ　 ｇｅｎｅｓｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　Ｉａ５　ｃｏｍｐ ｌｅｘｅｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ−ａｒｅ　ｍｅｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ａ　 ｇｅｎｅ　ｒａｍ＋Ｉｙ：　ｃｌｏｎｌｎｇ、ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｒ−ｍ ｉｎａｔｉｏｎ、ａｎｄ　ｇｅｎｏ＊Ｉｃ　ｏｒｇａｎｆｚａｔｌｏｎ　ｏｒ　 ｔｈｅｇｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ａｎｔｌｇｅｎ　８５−Ｃｏｆ’　Ｍ 、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ。

Ｉｎｆ’ｅｃＬＩｍｉｕｎ　５９：　３２０５−３２１２．）ｏ　Ｃｏｒｙｎｅ ｂａｃｔｅｒ１ｕ＋＊ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの蛋白質ＳＰＩは、同じ残余ａ−１ ，１の約３３％を有する）および約３３０個のアミノ酸（＋／−５）の長さにわ たってこれら６個の蛋白質を有する同様の残部（σ−１，１）の約５２％。約３ ３０個のアミノ酸のこの長さは、ミコバクテリア抗原の場合、蛋白質の全長に対 応する。ちょうどＰＳｌのように、すべてのこれらミコバクテリア抗原は、ダラ ム陽性型バクテリア（約４２個アミノ酸、σ−２，４）中に見いだされる最も長 いシグナル配列に匹敵する長さのシグナル配列を含んでいる。ちょうどＰＳｌの ように、Ｍ、ｂｏｖｉｓの蛋白質８５−ＢおよびＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｌ ｓの蛋白質８５−Ｃは、大部分のシグナル配列より長い親水性ＮＨ２領域（５個 以上の正に荷電した残基）を有する。すべてのこれらのシグナル配列の他の重要 な特性は、グルタミン酸であるＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの抗原８５−Ｃ を除いて、酸残基、即ちアスパラギン酸の３または５の位置に存在する。酸性帯 電残基の存在は、Ｅｕｃａｒｙｏｔｌｃシグナル配列のＮＨ２端部に共通なもの であるが、原核シグナル配列のＮＨ２端部に対して全く例外的である。（Ｐｅｒ ｔ層ａｎ、　Ｄ、。

ａｎｄｆ（ａｌｖｏｒｓｏｎ、Ｈ，Ｏ，（１９１１３）Ａ　ｐｕｔａｔｌｖｅ　 ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄａｓｅｒｅｃｏｇｎｌｔｌｏｎ　５ｉｔｅ　ａｎｄ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｉｎ　ｅｕｃａｒｙｏｔｉｅ　ａｎｄｐｒｏｃａｒｙｏｔ ｌｃ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｌｏｔ　ｌ［ｉ７：　 ３９１−４０９、）（Ｗａｔｓｏｎ、Ｍ、Ｅ、Ｅ、（１９８４）Ｃｏｍｐｉｌａ ｔｉｏｎ　ｏｆ’　ｐｕｂｌｌ−ｓｈｅｄ　ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ 、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２：　５１４５−５１６４）。この 特徴の理由は知られていない。他の重要な類似点は、ＥＭＢＬ／ＭＩＰＳデータ ーバンクに存在するＰＳｌと他の蛋白質との間に見いだせない。

操作１： タンパク質ＰＳＩ及びＰＳ２をポリアクリルアミドゲルでの調製電気泳動及び電 気溶出によりＣ，グルタミクムＡＴＣＣ１７９６５の培養上澄から精製した。

３４℃において富ＬＢ培地２００１で培養された細菌を４℃で１５分間８０００ ｇで遠心することにより定常増殖期に収集した。次いで培養上澄のタンパク質を ６０％硫酸アンモニウムで沈降させ、４℃で１５分間１３０００ｇで遠心するこ とにより収集した。ペレットをｐＨ６，８の１１０ｌ１トリスＨＣＩ緩衝液４ｍ ｌに溶解し、しかる後溶液をこの同緩衝液中４℃で２４時間透析する。

硫酸アンモニウム沈降後に得られた透析タンパク質抽出液をフォーマット１６ｘ ２０ｘＯ，７５ｃｍの電気泳動ゲル上に沈着させる。電気泳動は４％濃縮用ゲル 及び７．５％分離用ゲルを用いてＬａｅＩｌｍｌｉ　（１９７０）により記載さ れた操作に従い行う。泳動は４０■Ａで１５時間にわたり行う。次いでゲルをＬ ｅｅら（１９８７）により記載された操作に従い塩化銅で染色する。タンパク質 ＰＳＩ及びＰＳ２に相当するタンパク質バンドを切出し、しかる後完全に脱染す る。次いでタンパク質を４８■Ａ、４℃で５時間かけてゲルから電気溶出し、し かる後ｐＨ６，８の１０ＩＩＭトリスＨＣＩ緩衝液で数回透析してから、いくつ かのアリコート分画に分け、−２０℃で凍結する。精製収率は９０％以上の純度 で２５％程度である。

操作２： タンパク質ＰＳＩ及びＰＳ２を限外濾過、電気泳動及びＰＶＤＦ膜りでの転写に よりＣ，グルタミクムＡＴＣＣ１，７９６５の培養上澄から精製する５、３４℃ において富ＬＢ培地で培養された細菌を４℃で１５分間８０００ｇで遠心するこ とにより定常増殖期に収集する。上澄４ｍｌをｐＨ７，０の５０ｍＭリン酸緩衝 液で５０倍希釈し、しかる後カットオフが３０ｋＤである限外濾過膜で遠心する 。このステップによれば８０ｇｇタンパク質抽出液を得ることが可能であり、し かる後これを４％濃縮用ゲル及び７．５％分離用ゲルからなる電気泳動ゲルに沈 着させる。電気泳動は下記修正を加えて１ｑｅＩｉｉにより記載された操作に従 い行う。ゲル及び泳動用緩衝液を調製するために用いられるすべての溶液を脱気 させ、これらに０，１Ｍチオグリコレートを含有させる。更に、分離用ゲルを使 用する前にプレランする。これらすべての予防処置はタンパク質のＮ末端を変え て、ひいてはこの末端をブロックする可能性があるラジカルの形成をできるたけ 避ける目的で行われる。電気泳動の終−ｒ後、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に転写 する。この操作はｐＨ８，０の５０＋ａＭトリス、５０ｍＭホウ酸緩衝液中５０ Ｖ、６０分間で行う。次いで膜を位置決定を可能にするアミドブラックで染色し 、タンパク１Ｐｓ１及びＰＳ２に相当するバンドを切出す。次いでそのタンパク 質バンドを脱染して、それらをＮ末端配列決定に用いた［ＬａｅｍＩ！ｌｉ、Ｕ 、に、１９７０．　Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅ ｉｒ＋ｓｄｕｒｉｎｇ　ａｓｓｅｌｌｂｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｒｂ ａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４（バクテリオファージＴ４の頭部のアセンブリ ー中における構造タンパク質の開裂）、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：８８０−８８５ 　；　Ｌｅｅ。

Ｃ，、Ｉ−ｅｖｉｎ、Ａ、、Ｂｒａｎｔｏｎ、Ｄ、１９８７．Ｃｏｐｐｅｒ　ｓ ｔａｉｎｉｎｇ：ａ　ｆｉｖｅｍｉｎｕｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｔａｉｎｆｏ ｒ　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕｌｆ’ａｔｅ　ｐｏｔｙａｃｒｙｌａ ｓｉｄｅ　ｇｅｔｓ（銅染色ニドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル 用の５分間タンパク質染色）＝Ａｎａ１、Ｂ＋ｏｃｈｅｍ、、１６６：３０ｇ− ３１２）。

ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖ１ｂａｅｔｅｒｆｕ＊　 ＩａｃｔｏＣｅｒｍｅｎｔｕｓ）　１５と称されるＣ。

グルタミクム株（Ｃ，ｇｌｕｔａｍｊｃｕｓ）は大腸菌に１２の改変ＤＮＡに対 して許容的であり［Ｂｏｎｎａｓｓｌｅ、Ｓ、、Ｏｒｅｇｌｊａ。

Ｊ、　、Ｔｒａｕｔｗｅｔｔｅｒ、＾、及び５ｉｃａｒｄ、＾、Ｍ、　（１９９ ０）　、１ｓｏｌａｔｌｏｒ。

ａｎｄ　ｃｈａｒａｅＬｐｒｊｚａｔｉｏｎ　ｏｒ　ａ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏ ｎ　ａｎｄ　ｍｏ＋Ｈｒ１ｃａｔｉｏｎ　ｄｅｒｉｃｉｅｎｔ　ＩＩｕｔａｎｔ 　ｏｒ　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｊｕ＊　Ｉａｃｔｏｆ’ｅｒＩｅｎｔｕｍ　（ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの制限及び修正欠失変異体の単離及 び特徴化）　、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｆａｔ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、７２：１４３ −１４ｆｉ）　、−万〇、メラツセコラ（Ｃ，ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　Ａ　 Ｔ　ＣＣ１７９６５と称されるＣ、グルタミクム株は大腸菌のＤＮＡに関して非 常に制限的な株である［Ｒｅｙｅｓ、０．、Ｇｕｙｏｎｖａｒｃｈ、＾、　、Ｂ ｏｎａｍｙ、Ｃ，，５ａｌｔｆ、Ｖ、　。

Ｄａｖ＋ｄ、Ｆ、及びＬｅｂｌｏｎ、Ｇ、（１９９１）、’Ｉｎｔｅｇｒｏｎ’ −ｂｅａｒｉｎｇ　ｗｅｅｔｏｒｓ：　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　５ｕＨａｂｌｅ　ｆ ｏｒ　５ｔａｂｌｅ　ｃｈｒｏｗｏｓｏｍａｌ　ｌｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｉｎ 　ｈｉｇｈ！ｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ（− インチグロン゛−保持ベクター：高制限コリネバクテリアにおける安定的染色体 組込みに適した方法）　、Ｇｅｎｅ、　１０７：８１−６８：ｌ。この理由から 、Ｂ、ラクトファーメンタム１５株をｃｓｐｌ遺伝子の遮断を実施するために選 択した。

ｃｓｐｌ遺伝子の物理的地図はＣ，メラツセコラＡＴＣＣ１７９６５及びＢ、ラ クトファーメンタム１５の場合で同一であることが確かめられた。

カナマイシン耐性（Ｋｍ　Ｊを付与するストレプトコッカスψファエ力リス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｌｓ）のａｐｈＡ３遺伝子を含むプラ スミドｐＡＴ２１の１．５ｋｂＣ１ａｌ断片（Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ、Ｐ、及び Ｃｏｕｒｖａｌ　ｉｎ、　Ｐ、　（１９８３）　。

Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏ「　ｔｈｅ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏ ｃｃｕｓ　ｒａｅｃａｌｉｓｐｌａｓｍｉｄ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔ ｈｅ　３°５−−ａｍｌｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｒ ｅｒａｓｅ　ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　（３−５’　−アミノグリコシドホスホトラン スフェラーゼタイプ■についてコードするストレプトコッカス・ファエカリスブ ラスミド遺伝子のヌクレオチド配列）　、Ｇｅｎｅ、２３：３３１−３４１）を プラスミド１）ＣＧＬ６１２中に存在するｃｓｐｌ遺伝子の独特なＫｐｎＩ部位 （Ａｓｐ７１８）に挿入して、プラスミドｐＣＧＬ６１３−を得た。プラスミド ｐＣＧＬ６１３−を保有する組換え大腸菌株が実際にＰＳＩ−表現型であること は抗ＰＳＩポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより示され た。このプラスミドはＣ。

グルタミクムではなく大腸菌で典型的に複製する。それを電気的形質転換により Ｂ、ラクトファーメンタム１５と称されるＣ、グルタミクムの株に導入しくＢｏ ｎａａｙ、Ｃ，。

Ｇｕｙｏｎｖａｒｃｈ、Ａ、　、Ｒｅｙｅｓ、Ｏ，、Ｄａｖｉｄ、Ｆ、及びＬｅ ｂｌｏｎ、Ｇ、　（１９９０）、１ｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ　ｅｌｅｃｔｒｏ− ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ（コリネ バクテリアにおける種間電気形質転換）、ＦＥＭＳ　Ｍｌｃｒｏｂｌａｌ　Ｌｅ ｔｔｅｒｓ、Ｂｅ：２８３−２７０〕、Ｋ　ｍ　形質転換株を選択した。Ｋｍ’ 形質転換株において、プラスミドｐＣＧＬ６１３−は宿主ゲノムのｃｓｐｌ領域 との相同的組換えによりＣ，グルタミクムの染色体中に組込まれると思われる。

形質転換株の２２．５％において二重乗換え現象が生じて、形質転換株プラスミ ドのｃｓｐｌ：ａｐｈＡ３組立体による野生型ｃｓｐｌ遺伝子の置換を起こし、 Ｋｍ’−Ｔｅｔｓ表現型を与えた（図５）。Ｂｇｉｌ＋又はＢａｍＨＩ及びＥｃ ｏＲＩのいずれかで切断された野生型株とＫｍ’−Ｔｅｔｓ形質転換株の１つと の全染色体ＤＮＡをｐＣＧＬ６１３−プローブとのサザンブロツティングにより 分析した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、及びＭａｎｉａ ｔｉｓ、Ｔ、（１９８９）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｌｎｇ：ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　（分子クローニング：実験マニュアル）、５ｅ ｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｖ　 Ｙｏｒｋ：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐ ｕｂｌｌｃａｔｉｏｎｓ）　ｏ　ｃ　ｓｐ１遺伝子は野生型株で約７．５ｋｂ断 片に含まれ、一方組連体ｐＣＧＬ６１３−はｃｓｐｌ遺伝子中に挿入された１、 ５ｋｂａｐｈＡ３遺伝子に相当する約９ｋｂ断片を含む。ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ Ｉ切断から図５で示された組込体の構造を確認する。

Ｋｍ’−ＴｅｔＳ組込体を抗Ｐｓｉポリクローナル抗体を用いてＰＳｌの産生に 関するウェスタンブロッティングでも分析した。この株の培養上澄又は粗製抽出 物のいずれにもタンパク質ＰＳＩはない。これはλｇｔｌｌに組込んでクローニ ングされたｃｓｐｌ遺伝子がＣ，グルタミクムで実際にＰＳＩをコードする独特 な遺伝子に相当することを確認させる。

二のＰｓｉ−Ｃ，グルタミクム株は完全に生存可能であり、その増殖速度は影響 をうけないようである。この結果は演鐸的にみて生存力に影響を与えることなく Ｃ、グルタミクム株中への相同的又は異種ＤＮＡの組込み用のターゲットとして ｃｓｐｌ遺伝子領域を使用できるここの一連の実験のために、プラスミドｐＣＧ Ｌ６１６を構築した。それは全ｃｓｐｌ遺伝子を含んでおり、プラスミドｐｃＧ Ｌ１２５から構築され、これはＣ，グルタミクムで複製でき、ストレプトコッカ ス・ファエカリスのａｐｈＡ３遺伝子を含むクローニングカセットを備えたプラ スミドｐ　Ｂ　Ｌ　１　［５ａｎｔａｓａｒｉａ、Ｒ，、Ｇ１１ｉ、Ａ、。

Ｍｅｓａｓ、Ｊ、Ｍ、及びＪ、Ｆ、Ｍａｒｔｉｎ　（１９ｇ４）、Ｃｈａｒａｃ ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ　ａｎ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｐｌａｓｍｉｄ　ａ ｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ’　ｅｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａ ｎｄ　ａ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｂｒｅｖｉｂ ａｃｔｅｒｌｕｍ　Ｉａｃｔｏｒｅｒｍｅｎｔｕｓ（ブレビバクテリウム・ラク トファーメンタムにおける内在プラスミドの特徴化とクローニングベクター及び 形質転換系の開発）、Ｊ、Ｇｅｎ、旧ｃｒｏｂｉ。

１、．１３０：２２３７−２２４８）　、及び大腸菌で複製でき、ｃｓｐｌ遺伝 子を含むプラスミドｐｃｓＰＩＧに相当する。この組立てから得られるプラスミ ドｐｃＧＬ６１６　（図６）はＣ，グルタミクムで複製できる。

Ｃ，グルタミクムＰＳ１−株におけるＰＳ１合成の回復ＰＳ１合成のいわゆるＢ 、ラクトファーメンタム１５ＰＳＩ−株における回復はプラスミドｐｃＧＬ６１ ６の後者への導入後に観察される。プラスミドｐｃＧＬ６１６を保有するこのＢ 、ラクトファーメンタム１５ＰＳ　１−株において、多量に分泌されたＰＳｌは 野生型Ｂ、ラクトファーメンタム１５株（天然ＰＳ１＋）との比較により検出さ れる。これはｃｓｐｌ遺伝子のコピー数を増加させることによりＣ，グルタミク ム株で分泌されるＰＳｌの濃度を増加させうろことを示す。

この結果はいわゆるＣ、メラツセコラＡＴＣＣ１７９６５株でも証明される。

端部切取りＰＳ１タンパク質の合成を可能にするｐＣＧＬ６１６に由来するプラ スミドの構築（図７）この実験は天然タンパク質に関する６　７０００　（Ｍｙ ）の代わりに約２３０００　（Ｍｙ）に相当する分子量の端部切取りＰＳ１タン パク質がＣ，グルタミクムでなお分泌されうることを示す。

７種の欠失をプラスミドｐｃＧＬ６１６から出発してｃｓｐｌ遺伝子領域で行い 、７種の異なるプラスミドを得た。これらすべての欠失はＰＳｌのシグナル配列 番；相当するＤＮＡ領域とｃｓｐｌ遺伝子の転写ターミネータ−を保存している 。。すべての場合にお０て、端部切取りＰＳＩタンパク質の合成及び分泌を抗Ｐ ＳＩポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。こ れらの結果はｃｓｐｌ遺伝子のほとんどを欠失しても、端部切取りタンパク質Ｐ ＳＩの合成及び分泌をなお可能であることを示している（図７）。この結果を許 容する最大欠失はｃｓｐｌ遺伝子の約１．３ｋｂのＮｃｏ　Ｉ　−Ｂｓ　ｐＥ　 Ｉ　（Ｂｓ　ｐＭＩＩ）断片の欠失に相当するが（ｐｃＧＬ１０４１）　、これ は分泌成熟形として約２９ｋＤ及び約２４　ｋＤのＰＳｌに関する前駆タンパク 質サイズを与える。約２３ｋＤのタンパク質はこのプラスミドｐＣＧＬ　１０４ 　］を保有するいわゆるＢ、ラクトファーメンタム１５ＰＳ１−株の培養上澄で 抗ＰＳ１抗体を用いてウェスタンブロッティングにより実際に検出される。

プラスミドｐｃＧＬ１０３０の構築（図８）Ｃ、グルタミクムで複製できるこの プラスミド（Ｃ。

グルタミクムのプラスミドｐＢＬ１を含む）は、Ｃ，グルタミクムのｃｓｐｌ遺 伝子のプロモーターとシグナル配列に成熟ＰＳＩ配列の最初の３０アミノ酸を加 えたものに相当するこの遺伝子のＤＮＡ領域を保持している。

マルチクローニング部位（図８におけるポリリンカー２）は、Ｃ，グルタミクム で発現されることを要するあらゆる非相同的遺伝子と同期し゛Ｃ容易にクローニ ングさせるため、成熟ＰＳＩ配列の３０番目のアミノ酸の＠後においた。結果的 に、このプラスミドは分泌に必要なＰＳ〕の諸要素を備えており、したがって発 現及び分泌双方の手段に対応している。

エンドグルカナーゼＡ又はＥＧＡと称されるエンドグルカナーゼについてコード するＣ、サーモセルムのｃｅＩＡ遺伝子（Ｃｏｒｎｅｔ、Ｐ、、Ｍｉｌｌｅｔ、 Ｊ、、Ｂｅｇｕｉｎ、Ｐ、及びＪ、Ｐ。

Ａｕｂｅｒｔ　（１９８３）、ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａＨｏｎ　ｏｒｔｗｏ　 ｃｅｌ　（ｃｅｌｌｕｌ。

ｓｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ’　ＣＩｏｓｔｒｉｄｌｕ ｍ　ｔｈｅｒｓｏｃｅｌｌｕｓｃｏｄｉｎｇ　ｆ’ｏｒ　ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎ ａｓｅｓ（エンドグルカナーゼについてコードするクロストリジウム・サーモセ ルムの２つのｅｅｌ　（セルロース分解）遺伝子の特徴化）　、Ｂｉｏ／Ｔｅｃ ｈｎ。

１ｏｇｙ、ｌ：５８９−５９４）をＳｍａ　１部位でベクターｐＣＧＬ１０３０ に組込んでクローニングし、プラスミドｐＣＧＬ１０３１を得た（図９）。この ｃｅｌＡ遺伝子は、キメラ構築の目的でタンパク質ＥＧＡの翻訳開始部位の非常 に近くにＢｓ　ｔＸＩ制限部位を人工的に導入したプラスミドＩ）ＣＧＬ１０６ ８に由来する（図１０．１］。

参照）。タンパク質ＥＧＡの合成はＣＭＣと称されるエンドグルカナーゼ基質カ ルボキシメチルセルロースを用いたディツシュにおける酵素活性に関する染色試 験により容易に検出できる［Ｃｏｒｎｃｔ、Ｐ、、旧１１ｅｔ、Ｊ、、Ｂｅｇｕ ｉｎ、Ｐ。

及びＪ、Ｐ、Ａｕｂｅｒｔ　（１９８３）、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ 　ｏｒｔｗｏ　ｅｅｌ（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）ｇｅｎ ｅｓ　ｏｒ　Ｃｌｏｓｔｒｌｄｉｕｍ　ｔｈｅｒＩＩｏｃｅｌｌｕｍ　ｃｏｄｉ ｎｇ　「ｏｒ　ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｓ、Ｂ［ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、１：５８９−５９４）。このＣＭＣ試験をＣ、グルタミクムにおけるＣ、サー モセルムのタンパク質ＥＧＡの合成を確認するために使用する。富培地〔ＬＢ− ルリアブロス又はＢＨＩ−脳心臓インフユージ３ン〕中全細胞又は培養上澄で実 施されるディツシュでの活性に関するＣＭＣ試験では、双方の場合においてプラ スミドｐｃＧＬ１０３１を保有するブレビバクテリウム中ラクトファーメンタム １５と称されるＣ、グルタミクム株のエンドグルカナーゼ活性を表す。より高い 活性はＬＢ＋フルクトース又は＋グルコース培地でみられ、これはｃｓｐｌプロ モーターの調節下でのｃｅｌＡの発現へのこれら２種の糖の刺激効果を示してい る。これはザイモグラム［Ｂｅｇｕｉｎ、Ｐ、（１９８３）、Ｄｅｔｅｃｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ａｃｔｌｖｌｔｙ　ｉｎ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌ ａｆｆｉｉｄｅ　ｇｅｌｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｃｏｎｇｏ　ｒｅｄ　５ｔａｉｎｅｄ 　ａｇａｒ　ｒｅｐｌｉｃａｓ（コンゴレッド染色寒天レプリカを用いたポリア クリルアミドゲルでのセルラーゼ活性の検出）　、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

、１３１：３３３−３３８）及び抗ＥＧＡポリクローナル抗体と共に培養上澄に ついて行われるウェスタンブロッティングで確認される。

合成ポリペプチド（ＡＱＫ）１０の発現及び分泌に関するｃｓｐ】系の使用（図 １０） １０回反復されるポリペプチドアラニン−グルタミン−リジンに対応する合成遺 伝子を化学的に合成し、プラスミドｐｃＧＬ１００８のＢｓ　ｔＸＩ部位に組込 んでクローニングし、プラスミドｐｃＧＬ１０１７を得た。プラスミドｐｃＧＬ １０１７のＥｃｏＲＩ断片を、シグナル配列のｃｓｐｌプロモーター及びＰＳｌ の最初の３０アミノ酸の下流（及びリポータ−遺伝子ｃｅｌＡの上流）に位置す るプラスミドｐｃＧＬ１０３０のＳｍａ　１部位に組込んでクローニングし、プ ラスミドｐｃＧＬ１０３２を得た（図１０）。キメラタンパク質ＰＳＩ−（ＡＱ Ｋ）１０−ＥＧＡの検出をディツシュ中でのＣＭＣ試験、ザイモグラム又はウェ スタンブロッティングにより前記されたように行う。

合成ポリペプチド（ＡＱ）１９の発現及び分泌に関するｃｓｐｌ系の使用（図１ １） ２０回反復されるポリペプチドアラニン−グルタミンに対応する合成遺伝子を化 学的に合成し、プラスミドｐＣＧＬ１００８のＢｓ　ｔＸＩ部位に組込んでクロ ーニングし、プラスミドｐｃＧＬ１００２を得た。プラスミドｐｃＧＬ１００２ のＥｃｏＲＩ断片を、シグナル配列のｃｓｐｌプロモーター及びＰＳｌの最初の ３０アミノ酸の下流（及びリポータ−遺伝子ｃｅｌＡの上流）に位置するプラス ミドｐｃＧＬ１０３ｃｌのＳｍａ　１部位に組込んでクローニングし、プラスミ ドｐｃＧＬ１０３３を得た（図１１）。キメラタンパク質ＰＳＩ−（ＡＱ）１９ −ＥＧＡの検出をディツシュ中でのＣＭＣ試験、ザイモグラム又はウェスタンブ ロッティングにより前記されたよつに行う。プラスミドｐｃＧＬ１０３３中Ｂ、 ラクトファーメンタムにおけるその配列はコード配列ＡＱの喪失を示し、た（Ｂ 、ラクトファーメンタムでクローニング中ＡＱ　からＡＱ１９への継代）。

この一連の実験ではｃｓｐｌ遺伝子のプロモーターがクロストリジウム・サーモ セルムの異種ｅｅｌＡ遺伝子とキメラ構築（ＡＱＫ）１０−ｅｅ）Ａ及び（ＡＱ ）１９−ｅｅｌＡをＣ、グルタミクム中で発現させることを示す。更に、これら の実験ではＰＳｌの諸要素、この場合ではそのシグナル配列とその後の異種遺伝 子の上流に位置する各成熟配列の最初の３０アミノ酸、が対応産物を分泌させる ことを示す。培地の効果とこの培地への糖、この場合ではグルコース又はフルク トース、の添加又は非添加は対応産物の生産に影響を与える。特に、ｃｓｐ１プ ロモーターの調節下Ｃ，グルタミクム中において、ＥＧＡ又はキメラタンパク質 （ＡＱＫ）１０−ＥＧＡも；１．＜は（ＡＱ）１９−ＥＧＡの産生はＢＨＩ培地 よりもＬＢ培地で高く、それはＬＢ培地においてグルコース又はフルクトースで 高度に刺激される。Ｃ，グルタミクムのｃｓｐｌプロモーターはＣ，サーモセル ムの天然ｃｅＩＡプロモーターよりも強いことがわかる；実際に、天然ｃｅｌＡ プロモーターを含むいわゆるプラスミドｐＣＧＬ６０２保有Ｂ、ラクトファーメ ンタム１５株は、Ｃｅ１ＡがＣ，グルタミクムのｃｓｐｌプロモーターの調節下 にある、プラスミドｐｃＧＬ１０３１を保有するこの同株よりも実質上小さなエ ンドグルカナーゼ活性を有する。

ｐｃＧＬ１０３２又はｐｃＧＬ１０３３を含む異なる株の培養上澄について行わ れたウェスタンプロ・スト実験では、いくつかのタンパク質バンドが抗ＥＧＡポ リクローナル抗体と反応することを示す。これらの異なるノくンドはエンドグル カナーゼＥＧＡに特異的であり（コントロールに不存在）、そのタンパク質及び キメラタンノくり質の分解産物におそらく相当する。しかしながら、それより高 い分子量のバンドも実際に（ＡＱＫ）１０−ＥＧｐ、（ｐｃＧＬ１０３２）及び （ＡＱ）１９−ＥＧＡ　（ｐＣＧＬ１０３Ｂ）で密集して（Ｍｙ（ＡＱ）１９− 　ＥＧＡ＞Ｍｙ（ＡＱＫ）１０−　ＥＧＡ）観察される。

１１九し−Ｈ＋７　＄　ｔＬヒーヒソピヱ’）Ｉｔ９”、９ＬＯ）９上王ムｌム Σ工臣１と二三ニヱエ玉土上上１１旦ユ旦ｌヱ上オチド配列（図１２．１３） ｃｓｐ２と称されるＰＳ２をコードする遺伝子を含む２７０２塩基対断片とその 上流領域の配列決定を行った。

ヌクレオチド配列は図１２に示される（配列番号Ｎｏ、２）。

図１３はこの配列決定された領域の制限地図を表す。

コンピューター解析を用いて、１５３２塩基対読取枠が５１０アミノ酸に対応す ることを確認した。

シャイン・ダルガルツタイブ配列ＡＡＧＧＡＧを翻訳開始コドンのすぐ上流で確 認したく−１２〜−１７）。

そのタンパク質のＮＨ２末端においてダラム陽性菌の非常にありふれたシグナル 配列が３０アミノ酸で存在する。シグナル配列開裂部位の推定アミノ酸配列１１ ｅ　ｐｒ。

ａｌａ　ｐｈｅ　ａｌａが発見された。コリネバクテリウム・グルタミクムの培 養上澄から精製されたエドマン分解技術によるタンパク質のアミノ末端配列の決 定では、５ｎｍｏｌの精製タンパク質を用いたけれども、シグナルが得られなか った。２つの精製操作を用いたため、タンノくり質ＰＳ２はＰＳＩと全く同様に インビボでブロックされるが、そのブロッキングは用いられた精製技術の結果で ないようである。３０アミノ酸に関して提案されたシグナル配列は成熟配列の最 初のアミノ酸としてグルタミン（３１位）を現すが、これはエドマン技術による タンノくり質のアミノ末端配列決定を不可能にするピログルタミン酸に容易に変 換される。このタンパク質ＰＳ２はその非常に酸性の特性（ｐｌ−４，１）、そ のシスティン残基欠如及びその非常に低いメチオニン残基含有率のような璧タン パク質の特徴を有する［５ｌｅｙｔｒ、υ、Ｂ、（１９７ｇ）、Ｒｅｇｕｌａｒ ａｒｒａｙｓ　ｏｆ　ｓａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ ｌ　ｃｅｌｌ　ｗａｌｌｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｃｈｃｗｉｓｔｒｙ、ａｓｓ ｃｍｂ＋ｙ　ａｎｄ　［’ｕｎｃｔｉｏｎ（細菌細胞壁における高分子の規則的 配列：構造、化学、アセンブリー及び機能）　、Ｉｎｔ、Ｒｅｖ、ｃｙｔｏｌ、 ５３：１−８４）　（Ｓｌｅｙｔｒ、Ｕ、Ｂ、及びＰ、Ｍｅｓｓｎｅｒ　（１９ ８３）、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ　５ｕｒｆａｃｅ　ｌａｙ’ｅｒｓｏｎ　ｂａ ｃｔｅｒｉａ（細菌上における結晶表面層）　、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、旧Ｃｒｏｂｉ ｏｌ　、　、　３７・３１１−３３９）。電子顕微鏡分析ではＰＳ２が実際に細 胞表面において組織化された六方晶構造で自ら配列できる壁タンパク質であるこ とが確認されている。

ρ非依存性タイプの推定ターミネータ一部位は停止コドンから７６ヌクレオチド でその遺伝子の３′領域においてみられる。

その配列の特徴は下記のとおりである：５６２〜５６７：リポソーム結合部位 ５７９〜２１０８：コード配列 ５７９〜６６８：分泌タンパク質のシグナル配列２１８８〜２２３３　：ヘアピ ン構造、ρ非依存性タイプの推定転写ターミネータ−シグナル （停止コドンから７６ヌクレオチドに存在）Ｃ８ｐ２遺伝子の遮断は、ａ　ｐ　 ｈ　ＩＩＩの挿入により不活化されたｃｓｐ２遺伝子のコピーを保持する、コリ ネバクテリアについての非複製的なベクター、ベクターｐＣＧＬ８３０（図１４ ）（プラスミドｐｃＧＬ８１１により保持されるｅｓｐ２の独特なＮｒｕ１部位 にａｐｈＩＩ＋遺伝子を組込んだクローニング）によりＢ、ラクトプアーメンタ ム〕５と称されるＣ、グルタミクムで行った。ＰＳ２シグナルはプラスミドｐ　 ＣＧ　Ｌ　８３０を保持した大腸菌ＴＧＩ株に由来する細胞抽出物についての抗 ＰＳ２ポリクローナル抗体での免疫学的検出により示されなかった。組込まれた クローンはＢ、ラクトファーメンタム１５株のエレクトロポレーション及びＫｍ に関する選択により選択した。これら組込体のうち、遮断遺伝子により野生型遺 伝子の置換を起こす二重乗換え現象を示すＴｅｔ　クローンを得た。

プローブｐｃＧＬ８１１を用いたＫｍ　Ｔｅｔ　のＸｈｏｌ及びＳａｃ　Ｉ切断 染色体ＤＮＡのサザンプロット分析は野生型味で得られる２、７ｋｂＸｈｏｌ及 び０．７ｋｂＳ　ａ　ｃ　Ｉの代わりに各々４．２ｋｂ及び２．２ｋｂで断片を 示すが、これはａ　ｐ　ｈ　ＩＩＩ遺伝子の存在と連関したサイズ増加を示す。

異なる分画において抗ＰＳ２ポリクローナル抗体でのウェスタンブロッティング によるＰＳ２の検出の欠如は、Ｂ、ラクトファーメンタムにおけるＣ３Ｔ）２遺 伝子の遮断を確認させる。このＰＳ２−株は完全に生存可能であり、決してその 増殖に関し影響をうけない。ｅｓｐｌ遺伝子を保持するＣ、グルタミクムの染色 体の領域と同様に、ｃｓｐ２遺伝子を保持するこのＤＮＡ領域も細菌の増殖に影 響を与えることなく外来ＤＮＡの組込み用ターゲットとして使用できる。

Ｂ、ラクトファーメンタム１５ＰＳ２−株におけるＰＳ２十表現型の回復 全ｃｓｐ２遺伝子とその上流のＤＮＡ領域を含む２゜３ｋｂＳｃａＩ−ＦｓｐＩ 断片をプラスミドｐＣＧＬ８２４に組込んでサブクローニングし、Ｂ、ラクトフ ァーメンタム１５ＰＳ２−株に再導入し、ＰＳ２＋表現型を回復させた。より多 量のＰＳ２はその遺伝子がマルチコピーで存在する場合に得られることに留意す べきである。

これらの結果はＣ，グルタミクムのｃｓｐ２遺伝子に由来する分泌産物の量がそ の遺伝子のコピー数に従い改変できることを示す。

クリオフラクチ−ｒ　−ｔ：ｃｒｙｏｒｒａｃｔｕｐｅ）により（前記技術によ り得られた）株ＰＳ２＋及びＰＳ２−のサンプルの電子顕微鏡分析は、タンパク 質ＰＳ２が細胞表面において組織化された六方晶構造で自ら効果的に配列できる 璧タンパク質であることを非常に明確に示す。

実施例］、１．ＰＳ１の分泌に関する温度の効果（図１５）指数増殖期（３４℃ ）における細菌を３５８メチオニンで１分間かけて標識した。次いでクロラムフ ェニコール（１００ｐｇ／ｍｌ）及び過剰量の冷メチオニン（３２Ｓ）を加えた （時間０）。次いで細胞懸濁液の温度を望ましい温度まで速やかに、、ｌ！Ｉ整 し、インキュベートを」二足温度で３０分間続ける。ＰＳＩの移動を５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ、オートラジオグラフィーにより調べ、密度計測により定量する（図１５ ）。ＰＳｌの移動は明らかに温度に依存している。移動は１０℃以下で起きず、 それはこの温度を超えて最大的３０℃に達するまで急速に増加する。移動は脂質 の相転移と相関している（図１５）。

Ｃ，メラッセコラの株ＡＴＣＣ１７９６５の染色体ＤＮＡ　をＡｕ５ｕｂｅ　ｌ 　、Ｆ、Ｍ、、Ｂｒｅｎｔ　、Ｒ，、Ｋｊｎｇｓｔｏｎ、Ｒ，Ｅ、、Ｍｏｏｒｅ 、Ｄ　。

Ｄ、、５ｅｉｄＩＩａｎ、Ｊ、Ｇ、、Ｓｍ１ｔｈ、Ｊ、Ａ、、５ｔｒｕｈ１．に 、（Ｅｄｓ）　［（１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現行プロトコール） 、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、ＮｅｖＹｏｒｋ）により記載され た方法に従い得た。制限エンドヌクレアーゼＭｂｏＩ（ベーリンガー（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ））による制御的切断をＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ 、Ｅ、Ｆ、　、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ。

（（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　１ａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験マニュアル）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ。

ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂ ｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）により記載された操作に従いこのＤＮＡ１０μｇで行 った。

ＤＮＡ断片をＡｕ５ｕｂｅｌら＜１９８７）で記載されたようにスクロース勾配 でそれらのサイズに従い分離した。サイズ６〜１５ｋｂの断片をライブラリー構 築用に選択した。

クローニングプラスミドｐＵ　Ｎ　１２１　ＣＮ１ｌｓｓｏ口、Ｂ、、Ｕｈｌｅ ｎ、Ｍ、、Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ、Ｓ、、Ｇａｔｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、、Ｐｈｉ　ｌ 　１ｐｓｏｎ、Ｌ、（１９８３）、Ａｎ　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ 　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｐｌａｓｌｄ　ｖｅｃｔｏｒ　ｅｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ 　ｂｙ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｔｄｅ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｕｔａｇｅｎ ｅｓｌｓ（オリゴヌクレオチド媒介変異誘発により組立てられた改良陽性選択プ ラスミドベクター）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１１：８０１９−８０３０）をＤｒ、Ｂ、Ｂａｃｈｓａｎｎから自由に入手でき る大腸菌の株ＧＭ２９２９からＢｉｒｎｂｏｌｓ、）１．Ｃ，、Ｄｏｌｙ、Ｊ。

［（１９７９）、Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　 ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐ ｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　（組換えプラスミドＤＮＡをスクリーニングするための 迅速なアルカリ抽出操作）　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７：１５ １３−１５２３）の方法により得た。そのプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ Ｂｃ１１（ベーリンガー）で直鎖化した。

ライブラリーはＢｃｌｌで直鎖化されたプラスミドｐＵＮ１２１　１μｇ及び前 記６〜１５ｋｂＤＮＡ断片２μｇのＡｕ５ｕｂｅｌら（１９８７）により記載さ れた条件下におけるＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）での結合により構築し た。結合混合物はＤｏｖｅｒＪｌ、、Ｍｌｌｌｅｒ、Ｊ、Ｆ、　、Ｒａｇｓｄａ ｌｅ、ＣＪ、　（（１９８ｇ）、Ｈｉｇｈ　ｅｆＮｃｌｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｆ ｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ’　Ｅ、ｃｏｌｉ　ｂｙ　ｈｉｇｈ　ｖｏｌｔａｇｅ　 ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ口（高電圧電気穿孔法による大腸菌の高効率形質 転換）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：６１２７−６１４５）に より記載された操作に従いエレクトロボレーションより大腸菌株ＤＨ５中に導入 した。組換えプラスミド保存大腸菌クローンをテトラサイクリン１０μｇ／ｍ　 ｌ含有ＬＢ培地上で増殖できるか否かにより直接選択した。全テトラサイクリン 耐性クローンのプラスミドをＢｌｒｎｂｏｌｍ及びＤｏｌｙ（１９７９）の方法 により得た。これらプラスミドの組合せはＤＮＡライブラリーに相当する。

グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を欠いた大腸菌株ＣＬ　Ｒ２０７ｒ　ｅ　ｃ 　Ａ　（Ｍａｔｔａｊ、１．Ｗ、、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｍ、Ｊ、Ｗ。

ｏｔｏｎ、Ｊ、Ｃ，（１９１１１２）、Ｌｏｃａｌｆｚａｔｌｏｎ　ｏｆ’　ａ 　ｓｔｒｏｎｇｌｙ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　５ｅＱｔＩＯｎ　ｏｆ　ｃｏｄｉｎ ｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　ｇｌｕｔａｌｌａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒ。

ｇｅｎａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子におけるコ ード配列の強く保存されたセクションの局在化）＝ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、 １４７：２ｌ−２５）をＣ，メラッセコラＡＴＣＣ１７９６５ＤＮＡライブラリ ーで形質転換した。アンピシリン１００μｇ／ａ　ｌ含有最少選択培地上で増殖 できる大腸菌ＣＬＲ２０７ｒｅｃＡの形質転換クローンを選択した。このクロー ンは組換えプラスミドｐｃＧＬ３１０を保持する。　Ｍｅｅｒｓ、Ｊ、Ｌ、、Ｔ ｅ５ｐｅｓｔ、Ｄ、Ｗ、、Ｂｒｏｗｎ、Ｃ，Ｍ、　Ｃ（、ｔ９７０）、Ｇｌｕｔ ａｍｉｎｅ（ａＩＩｉｄｅ）：２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ　ａｍｉｎｏ　ｔ ｒａｎｓｒｅｒａｓｅ　ｏｘｌｄｏ−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＮＡＤＰ）、ａｎ　 ｅｎｚｙＩｌｅ　１ｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ 　ｇｌｕｔａｉａｔｅ　ｂｙ　ｓｏｍｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　（グルタミン（ア ミド）：２−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼオキシドレダクターゼ （ＮＡＤＰ）　、一部細菌によるグルタミン酸の合成に関与する酵素）、Ｊ、Ｇ ｅｎ、Ｍｆｅｒｏｂｉｏｌ、８４：１８７−１９４：ｌの方法に従い測定される グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性は、プラスミドｐｃＧＬ３１０保持大腸菌株 ＣＬＲ２０７ｒｅｃＡで回復される。種々のサブクローニングによって、第一に 完全ｇｄｈＡ遺伝子を保持するＣ、メラッセコラのＤＮＡ断片をＥｃ。

Ｒ１及びＸｈｏｌ制限部位により範囲限定される３、８ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片にま で短縮することができた。このＥｃ。

Ｒ１−ＸｈｏＩ断片の正確な制限地図は図１６で表される。次のサブクローニン グによって更に正確にｇｄｈＡ遺伝子を２．　２ｋｂＮｈｅ　Ｉ　−Ｂｇ　Ｉ　 Ｉ断片にまで範囲限定することができたｏ　５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、［（１ ９７５）、Ｄｅｔｅｃｔｌｏｎ　ｏｒｓｐｅｃｉｆ’ｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ 　ａｍｏｎｇ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　５ｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｅ ｔ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｌｓ（ゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ断 片の中における特異的配列の検出）　、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９８：５０３− ５１７）の方法によるＤＮＡ　−ＤＮＡハイブリッド形成は、クローン化ＤＮＡ 断片が実際にＣ，メラッセコラの株ＡＴＣＣ１７９６５に由来することを示した 。

ｇｄｈＡ遺伝子のヌクレオチド配列の決定前記ＥｃｏＲ１−Ｘｈｏｌ　ＤＮＡ断 片のヌクレオチド配列の決定を実施するため、下記サブクローニングを行った： 　（１）ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで切断されたベクターＭ　１３　ｍ　ｐ　１８ 　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、Ｊ、、Ｋｅｍｐｅ、Ｔ、、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、（１ ９８３）、Ｃｏｎ５ｔｒｕｃＨｏｎ　ｏｆ’　ｆＩＩｐｒｏｖｅｄ　Ｍｆ３　ｖ ｅｃｔｏｒｓ　ｕｓｉｎｇ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｃ Ｎｒｅｃｔｅｄ　ａ＋ｕｔａｇｅｎｅｓｌｓ　（オリゴデオキシヌクレオチド指 向性変異誘発を用いる改良Ｍ１３ベクターの組立て）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、２６：１０１−１０６〕へのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ、（２）Ｘ ｂａ　Ｉ　−Ｐｓｔｌで切断されたベクターＭ１３ｍｐ１８へのＸｂａＩ−Ｐｓ ｔｌ、（３）Ｓａｉｌ−ＢａｍＨＩで切断されたベクターＭ１３ｍｐ１８へのＸ ｈｏｌ−Ｂｇｌｌｌ、（４）ＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉで切断されたベクターＭ １３ｍｐ１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、１９ｇ３）へのＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ 　Ｉ、このため、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片に含まれるＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ断 片の完全ヌクレオチド配列は、Ｓａｎｇｅｒ。

Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、、Ｃｏｕｌｓｏｎ、＾、Ｒ，［（１９７７）、ＤＮ Ａ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　１ ｎｈｌｂＨｏｒｓ（鎖終結阻害剤によるＤＮＡ配列決定）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４：５４Ｂ３−５４６７）の方法により２本 鎖で決定できる。ｇｄｈＡ遺伝子を含むＮｈｅＩ−Ｂｇｌｌ断片の完全配列は図 １７で表され、る（配列番号Ｎα３）。

ｇｄｈＡ遺伝子のヌクレオチド配列の分析ＮｈｅＩ−ＢｇｌＩ断片のヌクレオチ ド配列の分析から下記要素を確認することができる： ａ）プロモーター（ヌクレオチド１〜５７２）ｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターは それが下記構造要素を含むことで特徴付けられるニ ーヌクレオチド２５１〜２６６ ａ６０因子（Ｍｅｒｒｌｃｋ、Ｍ、Ｊ、（１９８３）、Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｃｏ ｎｔｒｏｌ　ｏ「ｔｈｅ　ｎｉｒ　ｒｅｇｕｌｏｎ　Ｉｎ　ＫＩｅｂｓｌｅｌｌ ａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：　Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｎｔｒ Ａ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ａｎａｌｏｇｉｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｎｔｒｃ　ａｎ ｄ　ｎ１ｒＡ（肺炎杆菌におけるｎｉｆレギユロンの窒素コントロール：ｎｔｒ Ａ遺伝子の関連性とｎｔｒＣ及びｎ１ｆＡ間の相似性）、ＥＭＢＯＪ、２：３９ −４４）により認識され及びアンモニウムにより調節されるプロモーターに特徴 的な配列ＴＧＧ　（Ｐｙ）Ａ　（Ｐｕ）ＮＮＮＮＴＴＧＣ＾と類似性を示すシグ ナルＴＧＧＴＣＡＴＡＴＣＴＧＴＧＣＧ。

一ヌクレオチド４３７〜４４２ ストレプトミセス種のプロモーターの一３５領域に特徴的な配列ＴＴＧＡＣ（Ｐ ｕ）と類似性を示すシグナルＴＴＣＡＣＡ　（Ｓｔｒｏｈｌ、Ｗ、Ｒ，（１９９ ２）、Ｃｏｆｆ１Ｉ）ｉｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｌｓ　ｏｆ　ＤＮ Ａ　５ｅｑｕｅｎｅｅｓ　ａｓｓｏｃｔａｔｅｄｗｉｔｈ　ａｐｐａｒｅｎｔ　 ５ｔｒｅｐｔｏｓｙｃｅｔｅ　ｐｒ。

ｍｏｔｅｒｓ　（見掛は上ス、トレブトミセス科のプロモーターに関連するＤＮ Ａ配列の編集及び分析）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、２０：９６１ −９７４） 一ヌクレオチド４６６〜４７１ ストレプトミセス種のプロモーターの一１０領域に特徴的な配列ＴＡＧ（Ｐｕ） 　（Ｐｕ）Ｔと類似性を示すシグナルＴＡＧＧＡＴ（Ｓｔｒｏｈｌ、１９９２） −ヌクレオチド５５８〜５７２ ストレプトミセス種におけるリポソーム結合配列ＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴ（１ ’と類似性を示すシグナルＧＧＧＡＡＣＧＡＧＧＡＡＡＴＣ（Ｓｔｒ。

旧、　１９９２） ｂ）コード配列（ヌクレオチド５７３〜１９１３）５７３〜１９１３位にわたる 読取枠は下記データからみてグルタミン酸デヒドロゲナーゼのそれに相当するニ ーこの読取枠からめられたタンパク質は４４７アミノ酸を含み、予想分子ｆｆ１ ４８９５７ドルトンである。この分子量はＣ、メラッセコラの株ＡＴＣＣ１７９ ６５のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ調製物の変性ゲル電気泳動後に観察される ポリペプチドの場合（４８３００Ｄ）と非常に近い。

−Ｃ，メラッセコラのｇｄｈＡ遺伝子のヌクレオチド配列からめられたグルタミ ン酸デヒドロゲナーゼの一次構造は、他の生物由来のグルタミン酸デヒドロゲナ ーゼの一次構造と強い類似性を有する［Ｔｅ１ｌｅｒ、Ｊ、に、、５ａｌｔｈ、 Ｒ，Ｊ　、　、　ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、　Ｍｌ　、　、Ｅｎｇｅｌ　、　Ｐ、Ｃ ，、Ｇｕｅｓｔ、　、　Ｊ　、Ｒ，（１９９２）　。

Ｔｈｅ　ｇｌｕｔａｉａｔ、ｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆ 　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｌｕｍ　ｓｙｍｂｏｓｉｕｍ：　ｃｌｏｎｌｎｇ　ｂｙ　ｐ ｏｌｙｌＩｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ、５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａ ｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｌａ　ｃｏｌｉ（クロストリジウム・シムボシウムのグルタミン酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子：ポリメラーゼ鎖反応によるクローニング、配列分析及び大 腸菌内過剰発現）　、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、２０６：１５１−１５９〕。

−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性にとり必須であるとし、てＢａｋｅｒ、　 Ｐ、　Ｊ　、　、　Ｂｒ１ｔｔ、ｏｎ　、　Ｋ、Ｌ、　、　Ｅｎｇｅｌ　、　Ｐ 、Ｃ，、Ｆａｒｒａｎｔｓ、Ｇ、Ｗ、、Ｉ、１ｌｌｅｙ、に、Ｓ、＋Ｒｉｃｅ、 Ｄ、Ｖ、、Ｓｔｉｌ１ｍａｎ、Ｔ、Ｊ、　［（１９９２）、５ｕｂｕｎｉｔ　ａ ｓｓｅｍｂｌｙ　ａｎｄ　ａｃｔｔｖｅ　５ｉｔｅ　１ｏｃａｔｉｏｎ　１ｎ　 ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎ ａｓｅ　（グルタミン酸デヒドロゲナーゼの構造中におけるサブユニットアセン ブリー及び活性部位位置）　、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１２ニア５−８８）により述 べられたアミノ酸は、Ｃ，メラッセコラのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ中に存 在し、これはＢａｋｅｒら（１９９２）により記載された場合に相当する位置で ある。

−前記一次配列からめられるＣ、メラッセコラのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ の二次構造は他の生物のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの二次構造と強い類似性 を示す（Ｔｅｌｌｅｒら、１９９２）。

Ｃ）ターミネータ−（ヌクレオチド１９３７〜ｇｄｈＡ遺伝子のターミネータ− はそれが下記構造要素を含むことで特徴付けられる： ΔＧ　−−１３、６ｋｃａｌ／ｓｏｌでＧＣベアリングに富むヘアピン構造を形 成できる配列ＣＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＡＧＧＴＣＡＧＧＧとその後のＴ に富む配列ＴＴＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＴ、このような構造はρ非依存性ターミ ネーターに特徴的である（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｍ、、Ｃｏｕｒｔ、Ｄ、（１９ ７９）、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　１ｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ 　ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｅｒｍｉｎａｔｌｏｎ　ｏｆ’　Ｒ ＮＡ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＲＮ　Ａ転写の促進及び終結に関与する調 節配列）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、１３：３１９−３５３）。

Ｃ，メラッセコラのｇｄｈＡ遺伝子の発現の調節Ｃ、メラッセコラＡ　Ｔ　ＣＣ １７９６５のｇｄｈＡ遺伝−「の発現の調節はこの株が培養される培地の性質の 関数としてグルタミン酸デヒドロゲナーゼ特異活性の変動をＭｌ定することによ り研究された。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性は超音波処理で得られたＣ、 メラッセコラの無細胞抽出物からＭｅｅｒｓら（１９７０）の方法により測定し た。

この研究に用いられた培地は、ベースがＬｉｅｂｌ、Ｗ、、ＫｌａＩＩｅｒ、Ｒ ，，５ｅｈｌｅｉｆ’ｅｒ、に、）！、（（１９８９）、Ｒｅｑｕｆｒｅｉｅｎ ｔ　ｏｆ　ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｃｏＩＩｐｏｕｎｄｓ　ｆ’ｏｒ　ｔｈｅ　ｇ ｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｉｉｃｕｉ　ｉ ｎ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｍｅｄｉａ（合成培地中コリネバクテリウム・グルタ ミクムの増殖に関するキレート化合物の要求）、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｊａｌ 、Ｂｊｏｔｅｃｈｎｏｌ、３２：２０５−２１０１により記載されたものである 合成培地である。下記改変を加えたニ ー炭素源は、最終１１ｇ／ｌでグルコース（培地１．２及び４）であるか又は１ ０ｇ／Ｉでフルクトース（培地３）である。

−ＮＨ＋イオンの濃度は培地１．３及び４で１２５１である。それは培地２で１ ．２５ａＭである（ＮＨ４＋を制限する）。

一培地４は最終５０ｇ／ｌのＬ−グルタミン酸を含有する。

前記の異なる培地で培養されたＣ、メラツセコラ株ＡＴ　ＣＣ１，７９６５のグ ルタミン酸デヒドロゲナーゼに関して測定された特異活性は下記表に示される。

その活性は形質転換されたＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ２μｓｏｌ／ｓｉｎ／ｍｇタンパ ク質で表されている。

培地　培地１　培地２　培地３　培地４ｇｄｈＡ４．４＋／−０，３２３，２＋ ／−１，１１８，２＋／−１，８２，８＋／−０，２特異活性 この表によってＣ，メラツセコラＡＴＣＣ１７９６５のｇｄｈＡ遺伝子の発現調 節の下記３タイプを確認することができる。

−グルタミン酸による発現の抑制（倍率１．５７）−過剰アンモニウムによる発 現の抑制（倍率５．２７）−グルコースによる異化抑制（フルクトースとグルコ ースとて倍率４．１３）。異化抑制のケースにおいて、イソクエン酸デヒドロゲ ナーゼ、アコニターゼ及びクエン酸シンターゼ酵素活性も影響をうけることに留 意すべきである。

ｇｄｈＡ−１ａｃＺ融合ベクターの構築グルタミン酸、過剰アンモニウム及びグ ルコースによるｇｄｈＡ遺伝子の調節の転写特性をＣ，メラツセコラで調節して 、これらの調節に付されないＣ，メラツセコラの変異株を簡単に選択しつる手段 を有するために、ｇｄｈＡ遺伝子の翻訳開始用プロモーター及びＡＴＧコドンと 、最初の５アミノ酸が１ａｃＺ遺伝子の領域から欠失された大腸菌のｌａｃオペ ロンとの構築体を作製した。

この融合は下記のように行ったニ ーｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを含むＥｃｏＲＩ　−ＢｓｐＨＩ断片の単離 −ＢｓｐＨＩ末端からプラント末端への変換−ＥｃｏＲＩ及びＳｍａ　Ｉで直鎖 化されたベクターｐＭ　Ｃ１４０３（Ｃａｓａｄａｂａｎ、Ｍ、Ｊ、、Ｃｈｏｕ 、Ｊ、、Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、（１９８０）、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｇｅｎｅ　ｆ ｕｓｉｏｎｓ　ｔｈａｔ　ｊｏｉｎ　ａｎ　ｅｎｚｙＩＩａｔｌｅａｌｌｙ　ａ ｃｔｉｖｅ　β　−ｇａｌａｅｔＯｓｉｄａｓｅ　Ｓｅｇ＋Ｉｅｎｔ　ｔｏ　ａ ｓｌｎｏ−ｔｅｒｓｉｎａｌ　ｆｒａｇｖｅｎｔｓ　ｏｆ’　ｅｘｏｇｅｎｏｕ ｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ。

１ｉ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆ’ｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏ ｎ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｌｎｇ　。

ｒ　ｔｒｅｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　１ｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌｓ　（ 酵素活性β−ガラクトシダーゼセグメントを外来タンパク質のアミノ末端断片に 結合させるインビトロ遺伝子融合：翻訳開始シグナルの検出及びクローニングに 関する大腸菌プラスミドベクター）　、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、１４３：９７ １−９８０）に組込まれて得られた断片のクローニングでプラスミドｐｃＧＬ１ ３３を得る ー前記ｇｄｈＡプロモーター−１ａｃオペロン融合体を含むｐｃＧＬ１３３のＮ ｈｅｌ−５ａｌＩ断片の単離とＳｐｅ　Ｉ及び５ａｌＩで直鎖化されたベクター ｐＣＧＬ　２４１　［Ｒｅｙｅｓ、０．、Ｇｕｙｏｎｖａｒｃｈ、Ａ、、Ｂｏｎ ａｍｙ、Ｃ，，５ａｌｔｉ、Ｖ、、Ｄａｖｌｄ、Ｆ、、Ｌｅｂｌｏｎ、Ｇ、（１ ９９１）、−１ｎｔｅｇｒｏｎ″　ｂｅａｒｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ：　ａ　ｍ ｅｔｈｏｄ　５ｕ１ｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　５ｔａｂｌｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｓａ ｌ　１ｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　Ｉｎ　ｈｉｇｈｌｙ　ｒｅｓｔｒｌｃｔｉｖｅ　 ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒＩａ　（“インチグロン”　−保持ベクター：高制限 コリネバクテリアにおける安定的染色体組込みに適した方法）、Ｇｅｎｅ、１０ ７：ｆｌｌ−６８）に組込んだクローニング、こうしてプラスミドｐＣＧＬ１４ ０を得る（図１８） −ｇｄｈＡ−１ａｃ融合体とカナマイシン耐性を付与するａ　ｐ　ｈ　ＩＩＩ遺 伝子を含むｐｃＧＬ１４０から単離されたインチグロンのベクターｐｃＧＬ１２ ５への導入ニよってｐｃＧＬ１４１及びｐｃＧＬ１４２を薄る（図１８）。プラ スミドｐｃＧＬ１４１及びｐｃＧＬ１４２を形質転換でＣ，メラッセコラ株ＡＴ ＣＣ１７９６５１；：導入した。ｇｄｈＡ−１ａｃ融合体の機能はｐｃＧＬ１４ １及びｐｃＧＬ１４２で形質転換されたＣ、メラッセコラの株ＡＴＣＣ１７９６ ５におけるβ−ガラクトシダーゼ活性、即ちｐｃＧＬ１２５で形質転換された同 法に存在しない活性の検出により示された。β−ガラクトシダーゼ活性は発色原 基質Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４〜クロロ−３−インドリル　β−Ｄ−ガラクト ピラノシド）を含有する完全固形化培地（ＢＨＩ、　ジフコ（Ｄｉｒｃｏ）　： １で細菌を培養することにより検出される。β−ガラクトシダーゼ活性を有する 細菌に由来するコロニーはこのような培地で青色になる。最終１５ｇ／Ｉ　まで 寒天を加えることで固形化され、最終２５Ｂ／Ｉまでカナマイシン及び最終１０ ０ｍｇ／ｌまでＸ−Ｇａ　ｌで補充された前記培地１．２．３及び４においてｐ ｃＧＬ１４１及びｐｃＧＬ１４２で形質転換された細菌を培養することにより、 我々はこれら異なる培地で得られる細菌コロニーが酵素測定で示される調節と適 合する着色勾配を有することからｇｄｈＡ遺伝子の調節が実際に転写タイプであ ることを示すことができた。実際に、培地４で得られるコロニーは強度増加類に 培地１．３及び２で得られる場合よりも薄い青色である。我々はこの差異が培地 １及び培地４においてｐｃＧＬ１４１で形質転換されたＣ、メラッセコラの培養 物に関するβ−ガラクトシダーゼ活性の酵素測定レベルで反映されることを示し た（グルタミン酸による抑制）。

培地　培地１　培地４ β−ｇａ＋特異活性　０．１１１１　０．０５２β−ガラクトシダーゼ活性はＣ ，メラッセコラの無細胞抽出物からＭｉｌｌｅｒ、Ｊ、Ｈ，（１９７２）（Ｅｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ａｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｌｃｓ（分子遺伝 学における実験）、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ） により記載されたように測定した。

異化抑制で欠失した変異株の選択 Ｃ，メラッセコラＡＴＣＣ１７９６５に由来する株のＮＴＧ変異誘発を実施した 。この変異誘発から、第一の選択をグルタミン酸アナログ、４−フルオログルタ ミン酸に対する耐性の基準に基づき適用した。このアナログに耐性の変異株は非 異化抑制種を含めた異なる種に属するかもしれない。実際に、このような変異株 において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの特異活性に関する増加は細胞内グル タミン酸の過剰産生とひいては毒性アナログの希釈、したがって耐性の現象を起 こすことが予想できる。４−フルオログルタミン酸耐性変異株を一緒に分類し、 細胞の組合せをｐｃＧＬ１４１での形質転換に付した。形質転換細菌をＸ−Ｇａ １及びカナマイシン含有固化培地１でプレート培養した。最も強度の青色を有す る細菌コロニーを単離し、カナマイシン含有液体培地１で培養した。グルタミン 酸デヒドロゲナーゼ活性を無細胞抽出物から測定し、β−ガラクトシダーゼ活性 を全トルエン処理細胞から測定した（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）。選択された変 異株の１つに関して得られた結果は以下で表される。

コントロール　６．３　１０．７９ 変異株９０　１２．１　２３．８８ したがって得られた結果は、構築された手段でｇｄｈＡ遺伝子調節に関する変異 株の表現型スクリーニングにより選択できることを実際に示す。単純にカナマイ シン選択圧の非存在下で培養することにより、選択後に細胞からｐｃＧＬ１４１ 及びｐｃＧＬ１４２を除去することが非常に容易であることに留意すべきである 。

この構築のため、ｃｅｌＡサブクローニングステップを実施した。プロモーター 領域、その遺伝子及びもう１つの未確認遺伝子の開始部分を含む３．　５ｋｂＨ ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１１００形で利用できるｃｅｌＡ遺伝子を、未知遺伝子断片か ら欠失された２、６ｋｂＨｉｎｄｌｌｌ　−ＥｃｏＲＩ断片の形で大腸菌の複製 ベクターｐＭＴＬ２３に組み込んでサブクローニングした（Ｃｈａｓｂｅｒｓ、 Ｓ、Ｐ、、Ｐｒ１ｏｒ、Ｓ、Ｅ。

、Ｂａｒｓｔｏｗ、Ｄ、Ａ、及びＭｉｎｔｏｎ、Ｎ、Ｐ、（１９８ｇ）、Ｔｈｅ 　ｐＭＴＬ　ｎｉｃ−ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ、１．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ 　ｐＵＣｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ　ｒｅｇｉｏｎｓｔｏ　Ｉ’ａｃｉｌｉｔａｔｅ 　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ’　５ｏｎｉｃａｔｅｄ　ＤＮＡ　ｒｏｒ　ｎｕｃｌｅ ｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（ｐ　Ｍ　Ｔ　Ｌ　ｎ　ｉ　ｃ−クローニ ングベクター、！、ヌクレオチド配列決定のために音波処理ＤＮＡの使用を容易 にする改良ｐＵＣポリリンカー領域）、Ｇｅｎｅ、６８：１３９−１４９）。

ＥｃｏＲ１部位をその遺伝子の転写ターミネータ−の直後に指向性変異誘発によ り導入した。この中間サブクローニングは、制限部位が導入されたとすれば、次 のクローニングステップに必要である；特に、ｐＭＴＬ２３ポリリンカーに組み 込むクローニングではＥｃｏＲ１部位置後にＮｃｏｌ制限部位を導入できるが、 これはＮａｅｌ−Ｎｃｏｌ断片の形でｃｅｌＡのコード領域を含む断片を除去す ることができる。このステップは３′で未確認配列を欠（ｃｅｌＡ遺伝子を有す ることも可能にする。

Ｈｉｎｄｌｌｌ　−ＥｃｏＲＩ断片の形におけるｃｅｌＡのクローニングを、大 腸菌ＴＧＩ保有株を用いてプラスミドｐＭＴＬ２３に組込み実施した。このプラ スミドを保有する大腸菌株は実際にＥＧＡの発現に関連するＣＭＣ十表現型を保 有する；得られた制限断片の分析は予想されたものと一致する。

ｐＰＲＯＫ−ｃｅｌＡの構築（図２０）は下記のとおりである： クロンチック・ラボラトリーズ社（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）　（バロアルト、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手できる４、６ｋ ｂプラスミドｐＰＲＯＫ−１１を用いる。

ｔａｃプロモーターを含む大腸菌で複製できるこのプラスミド（Ｂｒｏｓｓｌｕ ｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ、２７：１８１．１９８４）をＥｃ。

Ｒ１−ＮｃｏＩで加水分解する。

次いでこの制限中にＥｃｏＲＩプラントの形で図１９のアダプターＤＧＦＩ／Ｄ ＧＦ２を導入するが、これらのアダプターはＢｓ　ｔＸＩ部位を形成する。次い でｃｅＩＡを前記構築体からＮａｅＩ（プラント）−ＮｃｏＩの形で導入する。

こうして得られたプラスミドはｐＰＲＯＫ−ｃｅｌＡと称される。それはアダプ ターＤＧＦＩ／ＤＧＦ２により導入されたＢｓ　ｔＸＩ部位で分離されるｔａｃ プロモーターの調節下でｃｅｌＡ遺伝子を含む。

実施例１４．マルチＡＱ配列の発現を可能にするプラスミドの組立て ２０＾１ａ−Ｇｌｎ（ＡＱ）単位についてコードする配列の挿入を実施するため 、ＤＧＦ５／ＤＧＦ６と称される合成オリゴヌクレオチドの第二対を用いたが（ 図１９）、そのオリゴヌクレオチドは下記合成遺伝子に相当する：５°　ＣＡＧ 　［ＡＱコ２ｏＣＡＧＧＣＡ　３゜３°　ＣＣＧＴＧＴＣ［ＡＱコ２゜ＧＴ　５ 　。

［ＡＱ：ｌはＡ　ｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｎについてコードする配列を表す。

ＤＧＦ５及びＤＧＦ６配列の末端はＢｓ　ｔＸ１部位と適合し、したがってその 配列はこの部位でクローニングできる。

ＤＧＦ５及びＤＧＦ６末端の配列は、一方でそれらがそのクローニング方向に向 き、他方でそれらがクローニング後にＢｓ　ｔＸ１部位を壊すような配列である 。

非リン酸化アダプターの使用によれば直列ないくつかの合成遺伝子の導入をさけ ることができる。

Ｂｓ　ｔＸＩによるｐＰＲＯＫ−ｃｅ　ＩＡ　（図２０）の切断及び合成遺伝子 の結合後に、図２０で表される構造を存するｐ　Ｐ　ＲＯＫ　（Ａ　Ｑ　）　２ ０　Ｃｅ　Ｉ　Ａが得られる。

図２１はＡＱ／ＥＧＡ融合部位の構造を更に詳細に表し、用いられるＢｓ　ｔＸ １部位の重要性を示す。この部位の構造は以下である： ＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴＧＧ それはＡＴＧ開始コドンとアラニンコードコドンＧＣＡ及び決められたコード配 列の後にメチオニン挿入用の第二ＡＴＧコドンを含むことが観察できる。

アダプターＤＧＦ５／ＤＧＦ６の挿入は一方向のみで起き、関心ある対象にとり 外来である塩基を導入しな０゜このプラスミドをＢａｍＨＩで処理し、同酵素で 処理されたプラスミドｐｃＧＬ１２５の制限産物との結合１こより処理する。プ ラスミドｐｃＧＬ１２５　（図２２）ｉ！複製起源ｐＢＬ１を含むブレビｌくク テリウム・ラクトファーメンタム１５の機能的プラスミドである。

本発明による株はプラスミド（ｐＣＧＬ１２５−　（ＡＱ）　−ｃｅｌＡ）（ｐ ｃＧＬ１００２、図１１）での上記株の形質転換及び形質転換株の選択により得 られる。

実施されたすべての融合において、翻訳は（Ａ　Ｑ　）　２０直前のメチオニン で始まる；　（ＡＱ）　をＣ０ＯＨ末端でメチオニンと隣接させる予防処置も払 われる；タンノくり質ｃｅｌＡと融合された又はそうでな（１ポリペプチドＡＱ の検出は融合タンパク質の部分的精製と臭化シアン加水分解又はその逆の後に特 異性抗体により又Ｃよ分析検出により実施できる。反復ペプチドの特異的性質ｌ よ容易な分離を可能にする。

言及された株は下記起源である： 大腸菌 ・ＣＬＲ２０７ｒｅｃＡ　Ｂ、バックマン（Ｂ、Ｂａｃｈｍａｎ）・ＤＨ５α　 ギブコＢ　ＲＬ　（Ｇｉｂｃｏ　ＢＩ？Ｌ）・０Ｍ２９２９　Ｂ、バックマン −ＴＧＩ　パスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ）ブレビバク テリウム・フラブム ・ＡＴＣＣ１４０６７Ａ　Ｔ　ＣＣ −１５５，ボナシー（９，１３Ｈａｓｓｉｅ）・ＡＴＣＣ２１０８８Ａ　Ｔ　Ｃ Ｃ ・ＡＴＣＣ１７９６５Ａ　Ｔ　ＣＣ ＤＨ５α株はクロンチック・ラボラトリーズ（ｔｈｅ　ｃｌ。

ｎｔｅｃｈ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のカタログｋｃ１０２１−１（Ｐａｌ ｏ　Ａｌｔｏ　、ＣＡ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）から入手できる。

ＡＴＣＣ株は１２３０１バークローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ２０８５２ ．ＵＳＡのアメリカン・タイプ・カルチャー◆コレクションＣ１０セールズ・ア ンド・マーケラティング部門（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｎｎ　ｅｌｏ　５ａｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ　Ｄ ｅｐａｒｔｍｅｎｔ）から入手できる。

株を１９９１年７月２３日付でパスツール研究所（パリ）のコレクション・ナシ ョナル・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオーガニズムス（Ｃｏｌｌｅｃｔｌｏ ｎ　Ｎａｔｌｏｎａｌｅ　ｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｌｃｒｏｏｒｇａｎ ｌｓｍｅｓ）（ＣＮ　ＣＭ）に寄託した。

・ｋｌ−１１２６としてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム１５　［Ｃ ＧＬ２００５　（Ｂ１１５））配列番号、１ 配列の型：ヌクｌ／オチドと対応タンパク質配列の長さ：２５４７塩基対 鎖の数・５−−３一方向で一本鎖表示された二本鎖トポロジー：直鎖状 配列の種類：ケノムＤＮＡ 起源 生物名、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｎ 　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）法名：ＡＴＣＣ１７９６５ 直接の実験Ｒ：クローンｐｃｓＰＩＧ 配列の特徴 ２３９−２４４　ＴＡＣＡＴ＾（ｓｉｇｎａｌ　−３５）　（Ｓ）２６９−２７ ４　ＴＡＡＧＡＴ　（ｓｉｇｎａｌ　−１０）　（Ｓ）４０５−４１５　ＧＡＧ ＡＡＧＧＡＡＡＡリポソーム結合部位（Ｓ）４２０〜２３９０　コード配列　（ Ｓ）４２０−５４８分泌タンパク質ペプチド（Ｓ）２４５５−２５０６ヘアピン 構造ρ依存性ターミネータ−シグナル（Ｓ） 関連生物活性：コリネバクテリウム・メラツセコラ及びブレビバクテリウム・ラ クトファーメンタムの細胞外タンパク質ＰＳＩの前駆体 ミコバクテリウムの細胞外抗原８５複合体のタンパク質の前駆体のホモログ ＡＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴ１心ｕＡＧＴＴＡＴＣ ＣＡＣＡＧＬＴＣＣＧＡＡＧＴＧ　５２ＡＧＣＣαＣＧＴＧＴＧＴＴＴＧＴＣＧ ＧＧＣＣＧＧ晶αχｔＯ−λＣτττＣＧＧωＣＧ榔ＴＣＴＡ　３６４Ａｓｎ　 Ｇｌｙ　Ａｘｑ　エユａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＧＣＡＧＣＧＣＴＧ ＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＡＡＧＧＴＣＧＡＣ２５４７配列番号：２ 配列の型：ヌクレオチドと対応タンパク質配列の長さ：　２７０２塩基対 鎖の数；　５−−３一方向で一本鎖表示された二本鎖トポロジー：直鎖状 配列の種類ニゲツムＤＮＡ 起源 生物名：コリネバクテリウム拳メラッセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｅｔｅｒｉｕｔ ｓ　ｍｅｌａｓｓｅｅｏｌａ）法名：ＡＴＣＣ１７９６５ 直接の実験源：クローンｐｃＧＬＩｉ１５　、ｐｃＧＬ８２４配列の特徴 ５Ｂ２−５６７　ＡＡＧＧＡＧリポソーム結合部位（Ｓ）５７９−２１０８　コ ード配列（Ｓ） ５７９−６８８分泌タンパク質シグナルペプチド（Ｓ）２１８ｇ−２３３３ヘア ピン構造転写ターミネータ−シグナル（Ｓ） 関連生物活性二コリネバクテリウム・メラッセコラ及びブレビバクテリウム・ラ クトファーメンタムの壁の外部表面層を構成するタンパク質と細胞外抗原ＰＳ２ の前駆体 ＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＧＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＴＴＴＡＧＴＡＣＴＴＴＴＣＡＧ ＧＧＧＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＴＡＣ５２ＧＣＣＴＣＴ　ＡＴＧ　ττＴ　ＡＡＣ ＡＡＣＣ：ＧＴ　ＡＴＣｃＧｃ　ＡＣτＧＣＡＧＣＴＣＴＴ　６１１Ｍｅｔ　Ｅ ’ｈ＊　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｒｇ工１＠　ｋＸ：ｑ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　 ＬｅｕＧＣ？　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＡＴＣＧＣＡ　ＡＴＣＴＣＣＡＣＣＧＣＡ　Ｇ ＣＴ　ＴＣＣＧＧＣＧＴＴ　６５０Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ工１ｅ　ＡＩＪＬ工 １＠！　５ｅｒτｈｒ　Ａｌａ　Ａｈａ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　ＶａｌＧＣＴ　ＡＴ ＣＣＣＡ　ＧＣＡ　ＴＴＣＧＣＴ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＣＣ入入ＣＣＣＡ　ＡＣ ττＴＣ６８９Ａユａ　工１ａ　ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｈｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇ ｌｕ　Ｔｈｒ　ｋｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＰｈａλＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧ ＣＴＴＣＡＡＣＧＡＴ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣ入ＣＣ７２８Ａｓｎ　 工１＠Ｔｈｘ　Ａｇｎ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ａｇｎ　ｋｓｐ　ＡＬａ　Ｊｕｐ　Ｇ ｌｙ　Ｓａｒτｈ；Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇ工ｎＡユｔｉＬ　Ｓｅ ｒ　Ａｌａ　ＡＪＰ　ＧｌＹ　Ｐｈａ　ＪＬｓｐ　Ｅ’ｒ。

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ポリリンカー２　：　１．５３１／Ｃ１ａ１．５ａ１１．＾ａｔ１．旧ｕ１．Ｎ ｅｏｌ。

Ｂｇ、Ｉ　Ｉ　１．Ｘｈｏｌ、５ｔｕ１．Ｐｓｔｌ、５ｓａｌ　、Ｓａｗ旧、Ｓ ｐｅ！。

ポリリンカー３　：　Ｌ、５６１／Ｘｂａ１．Ｎｏｔｌ、５ａｃ１１．ＢｓｔＸ Ｉ。

Ｐｓｔｌ　Ｏ，００ ＡＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴ”ｊｌＡＡＡＡＧＴＴ ＡＴＣＣＡコ子ＴＣＣＧＡＡＧＴＧ　５２Ｍａｔ　Ｊｕｇ　Ａｓｐ　Ｔ！ｕ＋に 、ａ　Ｐｈｅ　虹ｑ　Ｓ＠’！：工１＊　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ＬｙｓＧＣＴ　ＣＡ Ｇ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＣＧＣＣにＴ　ＴＣＣＣτＣτＧＧＡττＧＣＡＧＣＡＧ ＧＣ４！１４Ａｌａ　Ｇ工ｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓｅｘ　Ｌｅ ｕτ印工１・に１に、ａ　ＧｌｙＣＣＴ　ＡＴＧ　ＧＯＴ　？ＣＧ　ＧＣＴ　Ｃ ＡＧ　ＴＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＴ　でＣＣ’ｌ”Ｃ’ｒＧＡＴ　５７２Ｘ）ｘＱ Ｍｔ　Ａｌａ　Ｓ＠ｘ：　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｓａｗ　Ｓｉｒ　ｋｓｎ　Ｌａｕ　 Ｓｅｘ　Ｓａｒ　ＡｓｐＧＣＣＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣＧ　Ｃ ＡＧ　ＧＧＣＧＴＣＡＣＣＧλτＧＧＣ６１Ｌ記、ａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ 　Ｓｅｘ：工Ｌ＠　Ａｎａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌτｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ ＣＴＧ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＴＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＣＧＣＧＴＣ０Ａ ＡＧＡＯＣＴＴ　ＣＣで　６５０Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌ＠ｕ　Ｌ ｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ｒ、＊ｕ　Ｐｒ。

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Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．コリネバクテリア菌株による所定のアミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白質の 発現および分泌のための系であって、上記アミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白質 をコードする配列が、染色体またはプラスミドＤＮＡの領域内に位置しており、 この領域内では該配列が、蛋白質ＰＳ１またはＰＳ２のシグナル配列をコードす る配列の少なくとも１つの部分とともに５′末端に向かって転写され、該部分は 、該系がコリネバクテリア菌株に取り込まれた時、翻訳後の上記蛋白質の分泌を 保証するものであることを特徴とする、系。
2. ２．次の構成から成るコリネバクテリアの発現および分泌系であって 一コリネバクテリア菌株と、 一上記コリネバクテリア菌株中の発現のための第一機能性ＤＮＡ配列、アミノ酸 、ポリペプチドおよび／または蛋白質をコードする第二ＤＮＡ配列、および上記 第一および第二ＤＮＡ配列の間に挿入された第三ＤＮＡ配列を含む分泌カセット とを含んでなり、上記第三ＤＮＡ配列は、上記コリネバクテリア菌株により上記 アミノ酸、ポリペプチドおよび／または蛋白質の分泌を保証するＰＳ１またはＰ Ｓ２から選ばれた蛋白質の要素をコードするものである、系。
3. ３．コリネバクテリアの菌株がＢｒｅｖｌｂａｃｔｅｒｌｕｍ属に属するもので ある、請求項１または２に記載の発現および分泌系。
4. ４．発現のための第一機能性ＤＮＡ配列がプロモーターおよびリボソーム結合部 位を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項記載の発現および分泌系。
5. ５．分泌カセットがコリネバクテリア菌株中で機能する複製起源を含む自律的に 複製するプラスミドにより保持されている、請求項１〜４のいずれか一項記載の 発現および分泌系。
6. ６．分泌カセットがコリネバクテリア菌株の染色体へのその組込みを保証するＤ ＮＡの要素を含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の発現および分泌系。
7. ７．上記第三ＤＮＡ配列がＰＳ１またはＰＳ２のシグナル配列のすべてまたは一 部を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項記載の発現および分泌系。
8. ８．コード配列の端部の翻訳停止配列、転写停止配列およびマーカー遺伝子をさ らに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項記載の発現および分泌系。
9. ９．所定のアミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白質をコードする配列が、同一相で ｃｓｐ１またはｃｓｐ２遺伝子に挿入されている、請求項１〜８のいずれか一項 記載の系。
10. １０．ＰＳ１またはＰＳ２配列が切形である、請求項１〜９のいずれか一項記載 の系。
11. １１．所定のアミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白質の発現および分泌が、温度、 培養液および糖の性質によって制御される、請求項１〜１０のいずれか一項記載 の系。
12. １２．コード配列が１つ以上の反復アミノ酸のポリマーをコードする配列である 、請求項１〜１１のいずれか一項記載の系。
13. １３．反復配列における反復単位が、ＣＯＯＨ末端部において正または負に荷電 したアミノ酸を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項記載の系。
14. １４．ポリペプチドのイオン特性がその単離を可能にする、請求項１〜１３のい ずれか一項記載の系。
15. １５．荷電したアミノ酸が、特定のプロテアーゼによりペプチドの切断をそのレ ベルで可能にする、請求項１〜１４のいずれか一項記載の系。
16. １６．荷電したアミノ酸が特定のカルボキシペプチダーゼにより除去できる、請 求項１〜１５のいずれか一項記載の系。
17. １７．マーカー遺伝子がｃｅｌＡ遺伝子である、請求項１〜１６のいずれか一項 記載の系。
18. １８．コード配列が、第１７図に対応するｇｄｈＡのすべてまたは一部を含んで なる、請求項１〜１７のいずれか一項記載の系。
19. １９．発現のための機能性ＤＮＡ配列が、ｃｓｐ１、ｃｓｐ２またはｇｄｈＡの 発現要素から選ばれるものである、請求項１〜１８のいずれか一項記載の系。
20. ２０．発現が塩、代謝産物および糖の濃度に依存する、請求項１〜１９のいずれ か一項記載の系。
21. ２１．コード配列の発現前において、プロモーターが、ｃｓｐ１、ｃｓｐ２また はｇｄｈＡプロモーターから選ばれるものである、請求項１〜２０のいずれか一 項記載の系。
22. ２２．マーカー遺伝子が１ａｃＺ遺伝子である、請求項１〜２１のいずれか一項 記載の系。
23. ２３．請求項１〜２２のいずれか一項記載の発現および分泌系を使用して得られ る、バクテリア菌株。
24. ２４．菌株がコリネバクテリアである、請求項２３に記載の菌株。
25. ２５．菌株がブレビバクテリアである、請求項２４に記載の菌株。
26. ２６．菌株がＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍで ある、請求項２５に記載のコリネバクテリア菌株。
27. ２７．所定の蛋白質が、その固定作用を有するＰＳ１またはＰＳ２部位により壁 上に固定されている、請求項２３〜２６のいずれか一項記載のコリネバクテリア 菌株。
28. ２８．菌株が、その壁上に固定されたＰＳ１またはＰＳ２の抗原エピトープを有 する、請求項２３〜２６のいずれか一項記載のコリネバクテリア菌株。
29. ２９．アミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白質を生成する方法であって、請求項２ ３〜２８のいずれか一項記載のコリネバクテリア菌株を培養液中で培養し、第二 ＤＮＡ配列が上記アミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白質をコードし、培養後、上 記生成物を、培養液および／またはバクテリア濃縮物から任意に分離することを 含んでなる、方法。
30. ３０．ＰＳ１またはＰＳ２と融合または別な方法で結合した所定の蛋白質が、表 面活性剤を使用してバクテリア細胞から分離される、請求項２９に記載の方法。
31. ３１．ＰＳ１またはＰＳ２配列のすべてまたは一部を含む、蛋白質。
32. ３２．ＰＳ１またはＰＳ２の抗原部位を含む、蛋白質。
33. ３３．抗原要素として、請求項３１または３２記載の蛋白質。
34. ３４．ＰＳ１またはＰＳ２に対する、抗体。