JPH06505562A

JPH06505562A - 組換えヒト組織因子及び精製された天然及び合成のリン脂質からのプロトロンビン時間試薬の製造

Info

Publication number: JPH06505562A
Application number: JP5507008A
Authority: JP
Inventors: ホーキンス，パメラ，エル; テジドール，リリアーナ; メイナード，ジェイムス; ジョンソン，ケビン，ビー
Original assignee: デイド、ベーリング、インコーポレイテッド
Priority date: 1991-10-04
Filing date: 1992-09-25
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2018-06-16
Also published as: NZ244597A; CA2097199C; DE69224622T2; JP3416778B2; WO1993007492A1; DE69224622D1; ES2115679T3; US5625036A; AU2769292A; EP0565665B1; ATE163768T1; AU663343B2; CA2097199A1; DK0565665T3; EP0565665A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組換えヒト組織因子及び精製された天然及び合成のリン脂質からのプロトロンビン時間試薬の製造発明の分野本発明は、一般的に、凝固系における機能障害を判定するためのプロトロンビン時間試薬の分野に関し、より具体的には、プロトロンビン時間試験のための、組換えヒト組織因子及び天然又は合成起源のリン脂質より作られる試薬に関する。

本発明はまた、組織因子とリン脂質とを組み合わせる方法をも含む。

先行技術の記述組織因子（トロンボプラスチンとも呼ばれる）は、血液凝固第■ｌｌ及びＶｌ［ａ因子と複合体を形成することによって機能する膜関連糖蛋白質である。これらの因子の複合体化は、第Ｖｌｌ及びＶｌｌａ因子の蛋白質分解活性を非常に高める。組織因子の機能的活性は、リン脂質の存在への絶対的依存性を有している。

Ｂａｃｈ、　Ｒｏｎａｌｄ　Ｒ，、１ｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ、ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９８８：　２３　（４）：ｐｐ、３３９−３６８．第Ｖｌｌ／ＶＩ［ａ因子／組織因子複合体は、凝固カスケードの外因性の及び共通の経路を構成する一連の特異的酵素を活性化し、最終的にはトロンビン、フィブリンの形成、血小板活性化を、そして最後に血餅形成をもたらす。Ｎｅｍｅｒｓｏｎ、　Ｙａｌｅ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、Ｂｌｏｏｄ　１９８８：　７１：ｌ］Ｐ、Ｉ−８゜プロトロンビン時間（ＰＴ）のような診断試験は、患者の血液凝固系における機能障害を診断するために、管理された条件下においてｉｎ　ｖｉｔｒｏでこの一連の酵素的事象を利用する。ＰＴ試験においては、血餅形成の起こるに要する時間がプロトロンビン時間すなわちＰＴ値である。

現在入手可能なＰＴ試験はいずれも、天然の源より抽出された粗製の組織因子を含んだＰＴ試薬を利用している。ＰＴ試薬は次の特性を有することが重要である。すなわち、異常なサンプルに対して鋭敏であり、正常血漿に対して十分に限定された正常ＰＴ値を与え、正確且つ再現性のある結果を与え、各ロフト間の均一性を有し、凍結乾燥状態において貯蔵のために安定てなければならず、そして再構成した後安定でなければならない。

現在、ＰＴ試薬において使用されている組織因子は、家兎の脳、家兎の脳／肺混合物、ヒトの胎盤又は牛の脳から抽出された粗製の組織因子調製物である。これらの源の各々は、それらを問題あるものとしている限界を有する。例えば、家兎の脳トロンボプラスチンは、いくらかの季節的変動性、ロット間変動性を示し、そして比較的供給が不足している。ヒト組織因子はＨＩＶ又は他のヒトウィルス性疾患の源であり得、牛の脳は他の通常の源からの組織因子を使用して観察されるよりもずっと長い正常ＰＴ値を与える。より長いＰＴ値は、試験室における一層少ない成果につながる。加えて、これらの一層長い時間は、牛の組織因子の、ヒト第ＶＩｌ因子に結合する能力における差異を反映するものであろう。更に、天然の源からの粗製の組織因子調製物は、他の凝固因子を不純物として含む。凝固因子による汚染は、凝固因子欠乏血漿に対する感受性の乏しい凝固因子アッセイ曲線をもたらす。従って、一層再現性のあるＰＴ試薬を生み出すために、これらの欠点を持たず且つロフト間変動性の改善された組織因子の源が必要とされている。最近、現在入手できるＰＴ試験において使用するための、組換え組織因子の使用が示唆７゜本発明においては、Ｅ、　ｃｏｌｉを含む数種のタイプの生物中においてごく最近クローン化され発現されたヒト組織因子が、これらの問題を解決するためにＰＴ試薬において使用される。Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ　Ｗ、Ｈ発明は、クローン化された組織因子の一部分をＰＴ試薬において使用することができる。例えば、クローン化された組織因子の細胞内（細胞質）ドメインの大部分は、機能的活性を失うことなしに切断されることができる。更に、Ｃｙｓ　２４５のセリンへの変換のような点突然変異は、機能的活性の喪失なしに達成できる。Ｐａｂｒｏｓｋｙ　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９８９：　２８　（２０）：ｐｐ、８０７２−８０７７゜先に述へたように、組織因子は機能的活性のためにリン脂質を絶対的に要求している。現在ＰＴ試薬中に見出されるリン脂質は、しかしながら、組織因子が動物源より抽出されるときにこれに接着する脂質である。例えば、家兎脳の抽出過程は、組織因子と、ｉｎ　ｖｉｖＯで該組織因子に結合して抽出工程をくぐり抜けた天然に存在するリン脂質との同時単離をもたらす。更なる脂質の添加はない。従って、ＰＴ試薬において使用されている脂質の性質、量及び質は、出発組織及び抽出工程に依存して変動する。この変動は、ＰＴ試薬のロット間変動を増大するであろう。Ｄａｄｅ■トロンボプラスチン試薬、トロンボプラスチンＣ，Ｃ＋、及び■ｓは、いずれも緩衝剤及び安定化剤のアセトン脱水混合物の抽出物に基づいている。該部分的に精製された組織因子抽出物は完全には脱脂されておらず、従って、脂質が抽出物へ加え戻されず、脂質の性質及び組成は満足に限定されずロフト間で変動し得る。

Ｉｎ　ｖｉｔｒｏの組織因子研究は、２０：８０乃至４０：６０の範囲のフォスファチジルセリン：フォスファチジルコリンが、アポ組織因子の活性を保存することを示している。Ｎｅｍｅｒｓｏｎ、　Ｙａｌｅ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　Ｂｌｏｏｄ　１９８８＋　７１＋ｐｐ、１０８．リン脂質の極性の先端基の性質は、組織因子の活性を劇的に変える。

Ｂａｃｈ、　Ｒｏｎａｌｄ。

Ｉｎ１ｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ、　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９８８：　２３　（４）：ｐｐ、３３９−３６８．　Ｌ／かじながら、一般的には、ＰＴ試薬において使用されている脂質は十分に特徴付けられていなかった。十分に限定された再現性のよいリン脂質組成物が、改良されたＰＴ試験を提供するために必要とされている。

発明の概要本発明は、精製された組換えヒト組織因子（ｒＴＦ）を使用して製造されるＰＴ試薬に関する。本発明はまた、該組換え又は天然の組織因子と組合せての、高度に精製され十分に限定された、合成の又は天然の脂質の使用をも記述している。

組織因子源及び純度を管理し、そして高度に精製された脂質を十分に限定された特定の緩衝剤及び安定剤と組み合わせて使用することにより、ＰＴ試薬における組織因子の性能の管理が改善される。

本発明は、次のものよりなるＰＴ試薬である。すなわち、組換え組織因子、リン脂質（合成又は天然のいずれか）、カルシウムイオン、及び緩衝剤組成物、並びに、グリシン又はデキストランのような安定化剤及びＮａＣ１のような塩類を有してもよい。

−８０７７、によって得られる組換え組織因子又はそれらの部分を使用する。本発明の好ましい具体例は、匹敵する活性を有するものである、切断されているか又は点突然変異を含んでいてよい約２０乃至４ｏ０ｎｇ／ｍＬの濃度のｒＴＦと、好ましくは精製された天然の又は合成のフォスファチジルセリン：フォスファチジルコリン及びそれらの合成誘導体を約３０　：　７０の比に含むリン脂質組成物とからなり、そして組織因子・リン脂質のモル比約１：２０００乃至ｌ：２００００を有し、並びに緩衝剤及び安定化剤を有する。該好ましい具体例における緩衝剤は、約２０乃至８０ｍＭの濃度においてＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯｌＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳ○、ＰＯＰＳＯｌ及びＴＲｌ５よりなる群より選ばれるが、他の緩衝剤を使用してもよい。該好ましい具体例の増量剤は、約Ｏ乃至１０％のグリシン及び約Ｏ乃至５％のデキストランを含むが、他の薬剤を使用してもよい。該好ましい具体例はまた、約９乃至１５ｍＭのカルシウムイオンをも含み、また約Ｏ乃至３００ｍＭのＮａＣ］を含んでもよい。

本発明はまた、組織因子をリン脂質と組み合わせる方法をも含んでなる。リン脂質は、その透析又はダイアフィルトレージョンを許容するに十分高い臨界ミセル濃度を有する界面活性剤中に可溶化される。組織因子もまた界面活性剤中に可溶化されリン脂質と組み合わされる。混合物は次いで、接線流システム中においてダイアフィルトレージョンを受け、膜の外面と接触する。ダイアフィルトレージョンは、本質的に全ての界面活性剤が除去されるまで続けられるこの発明によれば、ＰＴ値を決定するための高度の感受性及び再現性を有するＰＴ試薬が提供される。本発明の更なる目的は、凝固系の全体的機能に対して感受性のあるＰＴ試薬を提供することである。この発明の別の目的は、正常血漿サンプルに対する十分限定された凝固時間を有し且つ異常血漿サンプルの凝固時間を延長するＰＴ試薬を提供することである。本発明の更なる目的は、最小のロット間変動性と高められた安定性及び光学的透明性とを有するＰＴ試薬を提供することである。この発明の更なる目的は、現行の方法より能率的且つ再現性のある、ｒＴＦをリン脂質と組み合わせる方法を提供することである。

本発明の利点及び組成は、以下の詳細な説明及び実施例を参照することにより一層よく理解されるであろう。

図面の簡単な説明図１は、商業的に入手できる試薬に対する、再構成された凍結乾燥された本発明のＰＴ試薬の安定性の改善を示すグラフである。

図２は、商業的に入手できる試薬に対する、凍結乾燥された本発明のＰＴ試薬の安定性の改善を示すグラフである。

好ましい具体例の詳細な説明本発明の好ましい具体例が先行技術に対して有する利点は、それが、精製された十分に限定されたリン脂質との組合せにおいて、十分に限定された精製されたｒＴＦ蛋白質を使用することである。Ｎｅｍｅｒｓｏｎ及びＰａｂｒｏｓｋｙの各方法に従って、完全長の並びに切断した組換え分子を使用することができる。本発明はまた、ＰＴ試薬の機能的活性を減することのないアミノ酸の付加、削除及び置換を伴ったｒＴＦをも範囲に含む。ｒＴＦの好ましい修正は、アミノ酸残基２４３又はその付近において切断されたものである。ＰＴ試薬におけるｒＴＦの好ましい濃度は約２０乃至４００ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは約４０乃至２５０ｎｇ／ｍＬである。これらの原材料より作られたＰＴ試薬は、天然起源の材料の粗製抽出物に基づくＰＴ試薬中に見出される微細な析出物を有さす、光学的に透明である。原材料が高度に精製されていることから、化学分析は、それらの期待される性能の意味ある尺度を与える。化学分析は、機能的アッセイと組み合わせて、重要な臨床的考慮事項であるロット間均−性を提供する助けとなる。

表■は、ｒＴＦを使用して作ったＰＴ試薬の３つの異なるロットの比較を示す。

結果は、正常血漿、正常対照、異常対照及びワルファリン処理サンプルからのＰＴ値を比較することによって、これらのロットの均一性を実証している。

ロット間再現性１　１１．５　３３．９　１１．３　２８．１２　１＋、８　３２．４　１１．４　２５．９３　１２．０　３０．４　１１．２　３０．４表１組換えＴＦを含むＰＲ試験に使用される天然に存するリン脂質は、全リン脂質の約２５乃至３５％の範囲、最も好ましくは３０％の天然のフォスファチジルセリン（ＰＳ）と、全リン脂質の約６５乃至７５％の範囲、最も好ましくは７０％の天然のフォスファチジルコリン（ＰＣ）とを含む。使用されるフォスファチジルコリンは中性電荷であり、一方フォスファチジルセリンは負に荷電している。

好ましい具体例においては、脂質は全体で負の電荷を有する。本発明の他の具体例においては、他の脂質の組合せを使用することができる。組織因子ニリン脂質のモル比約１：２０００乃至１：２００００が必要であり、最も好ましい比は約１　：　１００００である。これは、約１乃至３００μＭの全リン脂質濃度を存するＰＴ試薬をもたらす。天然ＰＳの好ましい起源は、牛の脳からのものであり、天然ＰＣの好ましい起源は卵黄からのものである。

合成のリン脂質もまた本発明に使用できる。これらの合成化合物は種々あってよく、脂肪酸側鎖において天然に存在するリン脂質には見られない変種を有することができる。ＰＴ試薬の改善をもたらす側鎖の変種は、ＰＳ若しくはＰＣ又はこれらの双方についてのＣ１４、Ｃ１６又はＣ１８鎖長を存する不飽和脂肪酸側鎖である。好ましい具体例には、ジオレオイル（１８：　１）−ＰＳ、バルミトイル（１６：０）−才しオイル（１８：　１）−Ｐ、Ｓ、シミリストイル（１４：　０）−ＰＳ、ジパルミトレオイル（１６：　１）−ＰＣ，ジパルミトイル（１６：　０）−ＰＣ、ジオレオイル（１８：１）−ＰＣ、バルミトイル（１６：　０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣ１及びミリストイル（１４：Ｏ）−才しオイル（１８：　１）−ＰＣが構成要素として含まれるが、これらに限定はされない。

ＰＴ試薬の至適活性は、組織因子二合成リン脂質比が約ｌ：２０００乃至１　：　２００００、好ましい比としては、約ｉ　：　１ｏｏｏ。

のときに達成される。これは、全リン脂質の約１乃至３００μＭの最終濃度をもたらす。このように、これらｐｓ　：　ｐｃ及び全リン脂質に対するｒＴＦの比の双方が、至適な機能的活性を達成し維持するのに必須である。

天然のリン脂質及び側鎖に変更を伴う又は伴わない合成のリン脂質と組み合わせて、組換えの又は天然の精製された組織因子より作られたＰＴ試薬は、ＰＴ試薬の質及び感受性における改良を提供する。

合成リン脂質は、一層再現性のある最終製品という利益を与え、側鎖が変更されるとき、ＰＴ試薬の一層良好に管理された機能的活性という改良を提供する。

緩衝剤及び安定化剤の選択には広範囲の変化があり、やはりＰＴ試薬の安定性を補助することができる。最も好ましい具体例は、約９乃至１５ｍＭの濃度範囲のカルシウムイオン、約０乃至ｌＯ％の濃度範囲最も好ましくは約２乃至５％の範囲の濃度の塩化ナトリウム、約Ｏ乃至５％の範囲のデキストラン、及び適当な緩衝剤を含むものであろう。Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−アミノエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノコ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）　、Ｎ−）リス−（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−〔Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）−アミノコ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳｏ）、ピペラジン−Ｎ、　Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸＞（ＰＯＰＳＯ）　、Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′　−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）及びトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）のような緩衝剤が、ＰＴ試薬において好ましい。最も好ましい緩衝剤は、約２０乃至８０ｍＭの濃度範囲のＨＥＰＥＳ又はＴＡＰＳＯである。

本発明の好ましい具体例においては、原材料である組換えヒト組織因子は、Ｅ、　ｃｏｌｉ中においてｉｎ　ｖｉｔｒｏで増殖され、界面活性剤溶液によって抽出され、次いて、ヒト組織因子に対して指向性の固定化モノクローナル抗体上でのアフィニティークロマトグラフィー法８８：　２３　（４）・ｐｐ、　３３９ −３６８゜本発明の方法においては、精製された組織因子は、先に記述したように、精製された天然の又は特定の合成のリン脂質の混合物と組み合わされる。この工程は、オクチルグルコシド又は類似の界面活性剤のような界面活性剤中の組換え蛋白質を、やはり界面活性剤中にて可溶化されたリン脂質と混合することによって達成される。該界面活性剤は、ダイアフィルトレージョンを許容するに十分高い臨界ミセル濃度を有しなければならない。該界面活性剤は、次いで組織因子を含んだ脂質ミセルを形成するためのダイアフィルトレーション又は透析工程によって除去される。

ダイアフィルトレージョンは、次のようにして達成される。すなわち、本発明のリン脂質、例えば約７０：３０の比率の天然又は合成のフォスファチジルコリン：フォスファチジルセリンが、ダイアフィルトレージョンを許容するに十分高い臨界ミセル濃度を有する界面活性剤中において攪拌、混合、加熱及び／又は水浴超音波照射される。混合物のリン脂質は、約８乃至２０ｍＭであり好ましくは１０ｍＭである。界面活性剤の臨界ミセル濃度は、好ましくは約１ＸＩＯ−’ｍ／Ｌより大きく、約２．５ＸＩＯ−”ｍ／Ｌに最も好ましい濃度を有する。例えば、オクチルグルコシド又は他の類似の界面活性剤にあっては、好ましい脂質は、界面活性剤の濃度範囲約１１ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌ乃至２２０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約ｔ　１０ｍｇ／ｍＬにおいて可溶化される。脂質混合物は、約Ｏ０ｌ乃至１０％の範囲の界面活性剤、好ましくは約１％のオクチルグルコシド又は他の界面活性剤中に溶解されたｒＴＦと室温にて組み合わされる。本発明の他の界面活性剤としては、非イオン性グルコピラノシド、ポリオキシエチレン及び非変成性の両性イオン界面活性剤が含まれる。好ましい界面活性剤はオクチルグルコシドである。脂質／　ｒ　Ｔ　Ｆ混合物は、緩衝剤によって直ちに約ｌ＝１に希釈され、そしてＭｅｍｂｒｅｘ　Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ■ＧＸ　Ｂｉｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、又は他の接線流システムの容器へポンプで汲み入れられ、膜の外部と接触させられる。

膜の孔を通って界面活性剤が流れ出るとき、緩衝剤がポンプで汲み入れられる。

この工程の間サンプルは再循環され、そして生物濾過膜は、表面における脂質の堆積を防止して緩衝剤にフィルターを通過させるため、回転する。代わりに、脂質の堆積は、いかなる接線流濾過装置においても起こるように、フィルターに対して接線方向に材料を掃引することによって防止されよう。代わりに、膜は、Ｍｅｍｂｒｅｘ　Ｐａｃｅｓｅｔｔｅｒ＠ＶＦＰ　Ｓｙｓｔｅｍにおけるように、静止している。膜を掃引する渦は、膜の中心を走り下りるローターの運動によって発生される。代わりに、もしもｒＴＦ及びリン脂質を溶解するために使用される各面活性剤が、同じ濃度の同し界面活性剤であるならば、ｒＴＦ及びリン脂質は、−緒に加えてよい。

約２０乃至５０体積の緩衝剤の後、界面活性剤除去は完全であり、ｒＴＦを含有する脂質ミセルが形成される。界面活性剤の除去が完全であることを保証するために、正常の及び異常の対照血漿を使用してＰＴアッセイが実施される。ＰＴ時間の延長及び正常に対する異常のＰＴ値の高い比率は、残存界面活性剤が依然存在することを示す。サンプルは濃縮され、そして機能的活性につきアッセイされる。ダイアフィルトレージョン工程は、透析を用いる現行の工程に比し一層効率的且つ再現性がある。ダイアフィルトレージョン工程は、使用されている現行の透析工程に比して、必要とする体積がずっと少なく、時間の無駄が少ない。界面活性剤不含蛋白質ニリン脂質混合物は、次いで、緩衝剤及び安定化剤の溶液に添加される。

混合物は均一化を保証するために攪拌され、バイアルに小分けされ、次いて凍結されて凍結乾燥される。乾燥した試薬は、水の添加によりその活性な形態へと再構成される。

ＰＴ値は、機械的及び光−光学的機器を含む、通常使用されているいかなる終点検出方法によっても決定されることができる。この組成に基づ＜ＰＴ試薬の高められた透明性は、光−光学的機器にとって特に有利である。

本発明のＰＴ試薬は、商業的に入手できるＰＴ試薬に対して、再構成の前及び後における改善された安定性を示す。表１１は、商業的に入手できる試薬と比較して、再構成された切断ｒＴＦ試薬によって試験された正常対照を用いてＰＴ値の安定性の改善を示す。

再構成された安定性の比較３７°Ｃ２４時間　８時間２５°Ｃ５日　１日２−８°Ｃ１０日　５８表ＩＩ図１は、この安定性をグラフにより示す。切断されたｒＴＦによって調製された本発明の凍結乾燥されたＰＴ試薬及び商業的に入手できるＰＴ試薬は、再構成され３７°Ｃにて貯蔵された。種々の時間において、正常の対照を両方のタイプのＰＴ試薬によって試験した。得られたＰＴ値が、同じ正常対照について、新たに再構成された両方のタイプのＰＴ試薬を用いて得られるＰＴ値と比較された。本発明のＰＴ試薬は、商業的に入手できるＰＴ試薬に対して、改善された再構成安定性を示す。

図２は、３７°Ｃにおいて、切断ｒＴＦ凍結乾燥ＰＴ試薬の再構成前（乾燥の）安定性の、商業的に入手できる試薬と比較した場合における改善を実証している。データは、各タイプのＰＴ試薬の数個の再構成前のバイアルを３７°Ｃにて貯蔵し、示された日に両方のタイプのＰＴ試薬の新たなバイアルを再構成することによって得られた。両方のタイプのＰＴ試薬につき、２乃至８°Ｃにて貯蔵されたバイアルが、これら両方のタイプのＰＴ試薬のための対照として使用された。

正常対照はこれらの日に試験され、そして、両方のタイプのＰＴ試薬につき、３７℃にて貯蔵したバイアルを使用して得られたＰＴ値が、各日において２乃至８ °Ｃにて貯蔵されたバイアルについて得られたＰＴ値と比較された。これら２種の温度にて貯蔵されたバイアル間のＰＴ値における差が計算され、変化は、試験した日に対してプロットされた。本発明のＰＴ試薬は、商業的に入手できるＰＴ試薬に対して改善された再構成安定性を示す。

実施例　ｌ完全長組換えヒト組織因子及び天然リン脂質を使用して作られたＰＴ試薬−ｒＴＦの濃度を変化させることの効果種々の濃度の組換えヒト組織因子が、ｐｓ　：　ｐｃ比３０ニア０の精製中フォスファチジルセリン（ＰＳ）及び精製卵フォスファチジルコリン（ＰＣ）によって、且つ、モル比１　：　１００００のｒＴＦニリン脂質で脂質化された。処方はまた、５０ｍＭのＴＡＰＳＯｌｌｌｍＭのＣａＣｌ２．２．６％のグリシン、２．６％のデキストラン、ｐＨ７，４、を含んだ。結果は凝固時間として与えられ、ＭＬＡ　Ｅｌｅｃｔｒａ　８００光−光学的凝固タイマーを用いて測定された。家兎脳の組織因子に基づく２種の市販のＰＴ試薬であるトロンボプラスチンＣ十及びトロンボプラスチンＩＳが、比較のため含められている。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ｃ１−Ｔｒｏｌ　１　（ＣＯＬ　１）　、異常凍結乾燥対照、Ｃ１−Ｔｒｏｌ　ＩＩ　（ＣＯＬ　２）、新鮮正常血漿のプール（ＰＮＰ）、及びワルファリンを投与されている患者からの血漿の凍結乾燥プール（ＷＡＲＦＡＲＩＮ）である。ＷＡＲ／ＰＮＰの下の欄は、ワルファリン処理血漿プールのＰＴ値を正常血漿プールのＰＴ値で除した比である。この比は、試薬の感受性の尺度である。データ表１を参照のこと。

１２．５　１２．７　２８．４　１３．１　３１．６　２．４１２５．０　１１．５　２６．２　１１．８　２８．１　２．３１５０．０　＋０．８　２４．２　１０．６　２５．８　２．４３１００．０　９．５　２３．０　９．６　２４．５　２．５５１５０．０　９．＋　２３．１　９．２　２４．５　２．６６２００．０　８．９　２３．１　９．０　２４．８　２．７６３００．０　８．９　２３．８　８．８　２５．４　２．８９４００．０　８．９　２４．４　８．７　２６．４　３．０３トロンボプラスチン　Ｃ＋　１１．８　２２．９　１１．７　２４．４　２．０９トロンｆブラスチン　Ｉｓ　１４．３　３５．４　１３．４　３７．１　２．７７実施例　２完全長組換えヒト組織因子及び天然リン脂質を使用して作られたＰＴ試薬−ｒＴＦニリン脂質（凍結乾燥試薬）比を変化させることの効果１４５ｎｇ／ｍＬ又は２００ｎｇ／ｍＬの組換えヒト組織因子が、ＰＳ：ＰＣＣａＯ２：　７０の精製中フォスファチジルセリン（ＰＳ）及び精製卵フォスファチジルコリン（ＰＣ）の混合物と組み合わされた。示した実施例においては、ｒＴＦニリン脂質１　：　１００００及びｌ　：　２００００という、ｒＴＦニリン脂質の２種のモル比が用いられた。１４５ｎｇ／ｍＬのｒＴＦを有する第１の処方（１０Ｓ、２０ｓ）はまた、６８ｍＭのＴＡＰＳＯｌｌｌｍＭのＣａ−Ｃｌ１．１４０ｍＭのＮａＣ１，５，２％のグリシン、ｐＨ７，４、をも含んだ。該処方は、バイアルに小分けされて凍結乾燥された。結果は凝固時間として与えられ、ＭＬＡ　Ｅｌｅｃｔｒａ　７００光−光学的凝固タイマーを用いて測定された。比較として、市販のＰＴ試薬であるトロンボプラスチンＩｓを含めた。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ｃ１−Ｔｒｏｌ　１　（ＣＯＬ　ｌ）　、異常凍結乾燥対照、Ｃ１−Ｔｒｏｌ　ＩＩ　（ＣＯＬ　２）、新鮮正常血漿のプール（ＰＮＰ）、及びワルファリン投与を受けている患者の血漿の凍結乾燥プール（ＷＡＲＦＡＲＩＮ）である。ＷＡＲ／ＰＮＰの下の欄は、ワルファリン処理血漿プールのＰＴ値を正常血漿プールのＰＴ値で除した比である。この比は、試薬の感受性の尺度である。データ表２を参照のこと。

１０Ｓ（１：１００００）　１１．０　２８．５　９．９　３７．１　３．７５２Ｏ３（１：２００００）　１１．８　３０．８　１０．６　４０．１　３．７８１０Ｆ（１：１００００）　ｔｔ、ｏ　２８．７　９．９　３９．２　３．９６２０Ｆ（１：２００００）　１２．１　３１．９　１０．８　４４．５　４．１２トロンボプラスチン　［Ｓ　１５．０　４０．９　１４．０　４５．３　３．２４実施例３完全長組換えヒト組織因子及び合成リン脂質を使用して作られたＰＴ試薬−リン脂質の脂肪酸側鎖部分の性質を変えることの効果１００又は３００ｎｇ／ｍＬの精製組換えヒト組織因子が、ＰＳ・ＰＣＣａ０ニア０の合成フォスファチジルセリン（ＰＳ）及び合成フォスファチジルコリン（ＰＣ）の混合物と、且つ、ＴＦニリン脂質の比＋　：　１ｏｏｏｏにて組み合わされた。処方はまた、５０ｍＭのＴＡＰＳＯｌｌｌｍＭのＣａ　Ｃ１２，１００ｍＭのＮａＣ１゜ｐＨ７，４、も含んだ。結果は凝固時間として与えられ、ＭＬＡ　Ｅｌｅｃｔｒａ　８００光 −光学的凝固タイマーを用いて測定された。天然リン脂質（牛ＰＳ及び卵ＰＣ）によって脂質化された組換え組織因子が対照として使用された。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ｃ１Ｔｒｏｌ　１　（ＣＯＬ　１）、異常凍結乾燥対照、Ｃ１Ｔｒｏ　ＩＩ　（ＣＯＬ　２）、及びワルファリンの投与を受けている患者からの血漿の凍結乾燥プール（ＷＡＲＰＡＲＩＮ）である。ＲＡＴの下の欄は、ワルファリン処理血漿プールのＰＴ値をＣ０ＬｌのＰＴ値で除した比である。この比は、試薬の感受性の尺度である。データ表３を参照のこと。

ノミリストイル（１４：Ｏ）　ノラウロイル（１２：Ｏ）　１００　２４．３　５４．２　５３．１　２．１９３００　１９．１　４６．６　４４．６　２．３４ノミリストイル（１４・０）　ノミリストイル（１４：Ｏ）　１００　４０．４　＞１００　８２．７　２．０５３００　４１．１　＞１００　１００　２．４３ノミリストイル（１４：０）　ノパルミトイル（１６：Ｏ）　１００　９６．３　＞１００　＞２００３００　９３．２　＞１００　＞２００３００　１４．１　３３．５　２９．７　２．１１３００　１６．４　３７．８　３６．５　２．１７３００　１０．０　２２．６　１９．２　１．９２３００　１０．２　２４．１　１９．４　１．９０ノミＩＩＸトイル（１４：０）　′）オレオイル（１８：１）　１００　１１．２　２６．５　２２．７　２．０３３００　１０．４　２６．７　２２．４　２．１５３００　９．５　２５．４　２０．０　２．１１ノオレオイル（１８：１）　ノパルミトイル（１６：Ｏ）　ｉｏｏ　１２．８　２９．５　２３．８　１．８６３００　１１．０　２７．８　２１．８　１．９８３００　９．９　２６．８　２０．０　２．０２３００　１０．５　２４．４　１９．７　１．８８３００　１０．６　２９．５　２１．８　２．０６３００　９．９　２７．０　２０．６　２．０８ノオレオイル（１８：１）　ノオレオイル（１８：１）　＋００　１１．２　２６．１　２０．８　１．８６３００　１１．９　２７．６　２１．１　１．７７牛　卵　１００　１２．８　２７．６　２３．４　１．８３３００　１０．５　２２．９　１９．４　１．８５デ一タ表３実施例　４完全長組換えヒト組織因子及び合成リン脂質を用いて作られたＰＴ試薬−脂質凍結乾燥試薬の脂肪酸側鎖部分の性質を変えることの効果３００ｎｇ／ｍＬの精製組換えヒト組織因子が、ｐｓ　：　ｐｃ比３０ニア０の合成フォスファチジルセリン（ＰＳ）及び合成フオスファチジルコリン（ＰＣ）の混合物と、且つ、ｒＴＦ　ニリン脂質比ｌ・１００００で組み合わされた。処方はまた、３０ｍＭのＴＡＰＳＯｌｌｌｍＭのＣａＣＬ　、２１５ｍＭのＮａＣ１，３％のグリシン、ｐＨ７，４、をも含んだ。混合物は、バイアルに小分けされて凍結乾燥された。結果は凝固時間として与えられ、ＭＬＡ　Ｅｌｅｃｔｒａ　８００光−光学的凝固タイマーを使用して測定された。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ｃ１−Ｔｒｏｌ　１　（ＣＯＬ　１）　、異常凍結乾燥対照、Ｃ１− Ｔｒ。

１　［１（ＣＯＬ　２）、新鮮正常血漿のプール（ＰＮＰ）　、及びワルファリンを投与されている患者からの血漿の凍結乾燥プール（ＷＡＲＦＡＲＩＮ）である。ＲＡＴの下の欄は、ワルファリン処理血漿プールのＰＴ値を正常血漿プールのＰＴ値で除した比である。この比は、試薬の感受性の尺度である。２種の対照が試験に含められた。天然リン脂質である牛ＰＳ及び卵ＰＣによって脂質化したものであるＩＯＦ対照は、実施例２において与えられたｌＯＦ処方であった。他の対照であるトロンボプラスチンＩｓは、商業的に入手できる高感度の家兎箱に基づくトロンボプラスチン試薬、トロンボプラスチンＩｓである。データ表４を参照のこと。

ノミリストイル（１４：０）　ノオレオイル（１８：１）　１９．４　５４．２　１６．９　５３．０　３．１４ジオレオイル（１８：１）　ノパルミトイル（１６：０）　１７．１　４３．７　１５．６　３７．７　２．４２ジオレオイル（１８：１）　ノオレオイル（１８’：１）　１２．３　３３．６　１１．０　３１．０　２．８２牛脳　卵　１３．５　３５．９　１２．１　３４．２　２．８３１０Ｆ　１３．３　３８．２　１１．７　３４．５　３．０３ト０ンｆブラスチン　Ｉｓ　１４．２　３７．６　１３．５　２７．４　２．０３実施例５切断組換えヒト組織因子及び合成リン脂質を用いて作られたＰＴ試薬−リン脂質凍結乾燥試薬の脂肪酸側鎖部分の性質を変化させることの効果２４３個の残基を含み且つ分子の細胞質部分の殆どを失った精製組換えヒト組織因子が、ＰＳ：ＰＣ比３０ニア０の合成フオスファチジルセリン（ＰＳ）及び合成フオスファチジルコリン（ＰＣ）の混合物と、且つｒＴＦニリン脂質比１　：　１００００にて組み合わされた。処方は、３００ｎｇ／ｍＬのｒＴＦ、３０ｍＭのＴＡＰＳ○、１１ｍＭのＣａＣＬ、２１５ＭのＮａＣ１，３％のグリシン、ｐＨ７，４、を含んだ。混合物は、バイアルに小分けされて凍結乾燥された。結果は凝固時間として与えられ、ＭＬＡ　Ｅｌｅｃｔｒａ　８００光−光学的凝固タイマーを使用して測定された。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ｃ１−Ｔｒｏｌ　１　（ＣＯＬＩ）、異常凍結乾燥対照、Ｃ１−Ｔｒｏｔ　ＩＩ　（ＣＯＬ　２）、新鮮正常血漿のプール（ＰＮＰ）及びワルファリン投与を受けている患者からの血漿の凍結乾燥プール（ＷＡＲＦＡＲｔＮ）である。ＲＡＴの下の欄は、ワルファリン処理血漿プールのＰＴ値を正常血漿プールのＰＴ値で除した比である。この比は、試薬の感受性の尺度である。３つの対照を、試験に含めた。１つは先の実施例における完全長ｒＴＦ、第２は天然リン脂質（牛ＰＳ及び卵ＰＣ）によって脂質化した切断ｒＴＦ、そして第３は、商業的に入手できる高感度の家兎箱に基づくトロンボプラスチン試薬であるトロンボプラスチンＩｓである。データ表５を参照のこと。

ＰＳ　ＰＣタイプ　タイプ　Ｃ０ＬＩ　Ｃ０Ｌ２　ＦＮＰ　ＷＡＲＦ　ＲＡＴ切断（２４３アミノ酸）ｒＴＦ牛脳　卵　１２．０　３４．４　１１．３　３３．６　２．９７ノオレオイル（１８：１）　ノオレオイル（１８：ｌ）　１１．７　３４．２　１１．０　３７．１　３．３７完全長ｒＴＦ牛脳　卵　１２．６　３３．４　１２．５　３４．４　２．７５トロンボプラスチン　［Ｓ　＋３．２　３２．５　１３．５　２６．９　１．９９実施例６切断組換えヒト組織因子及び合成リン脂質を使用して作られたＰＴ試薬−ｒＴＦの濃度及び試薬の組成を変化させることの効果２４３個の残基を含み且つ分子の細胞質部分の大部分を失った精製組換えヒト組織因子が、合成リン脂質の３０ニア０混合物と、ｒＴＦニリン脂質比１　：　１００００にて組み合わされた。処方Ａは、合成１−バルミトイル−２−オレオイルフオスファチジルセリン（ＰＯＰＳ）及びジオレオイルフオスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、６０ｍＭのＨＥＰＥＳＳ　Ｉ　１ｍＭのＣａＣＬ、２００ｍＭのＮａＣｔ、４．６％のグリシン、５ｍｇ／ｍＬのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）、ｐＨ７，４、を含む。処方Ｂは、同じＰＯＰＳ及びＤＯＰＣ濃度、６０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１ｍＭのＣａＣＬ　、２１５ｍＭのＮａＣ１，４，６％のグリシン、５　ｍ　ｇ　／　Ｌのポリブレン、ｐＨ７，４、を含む。処方Ｃは、ジオレオイルフ中スファチジルセリン（ＤＯＰＳ）及びＤＯＰＣ１４０ｍＭのＴＡＰＳＯｌｌｌｍＭのＣａｃｌｔ、２２０ｍＭのＮａＣＬ　２．１％のグリシン、ｐＨ７゜４、を含む。混合物は、バイアルに小分けされて凍結乾燥された。

結果は凝固時間として与えられ、ＭＬＡ　Ｅｌｅｃｔｒａ　８００光−光学的凝固タイマーを使用して測定された。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ｃ１−Ｔｒｏｌ　ｌ　（ＣＯＬＩ）、異常凍結乾燥対照、Ｃ１−Ｔｒｏｌ　ＩＩ　（ＣＯＬ　２）、新鮮正常血漿のプール（ＰＮＰ）及びワルファリン投与を受けている患者からの血漿の凍結乾燥プール（ＷＡＲＦＡＲＩＮ）である。ＲＡＴＩＯの下の欄は、ワルファリン処理血漿プールのＰＴ値を正常血漿プールのＰＴ値で除した比である。この比は、試薬の感受性の尺度である。商業的に入手できる高感度の家兎脳に基づくトロンボプラスチン試薬であるトロンボプラスチンＩｓが対照として含まれている。データ表６を参照のこと。

処方ｒＴＦ　濃度（ｎｇ／ｍＬ）　ｃｏｔ、ｔ　Ｃ０Ｌ２　ＦＮＰ　ＷＡＲＦＡＲＩＮ　ＲＡＴＩＯＡ　＋００　１４．２　３２．１　１４．８　３５．２　２．３８１５０　１３．３　３１．５　１３．８　３３．２　２．４１１８０　１２．９　３１．４　１３．６　３３．０　２．４３２００　１２．７　３３．２　１３．３　３２．９　２．４７２４０　１２．７　３２．３　１３．３　３２．９　２．４７２６０　＋２．４　３３．５　１３．１　３３．１　２．５３Ａ　２２０　１１．９　２９．０　１２．５　３１．０　２．４８Ｂ　２４０　１３．０　３３．３　１３．７　３４．５　２．５２Ｃ＋６５　１３．３　２９．２　１３．９　３３．５　２．４１トロンボプラスチン　ｉｓ　１４．０　３５．３　１５．５　２９．２　１．８８デ一タ表６実施例７切断組換えヒト組織因子及び合成リン脂質を使用して作られたＰＴ試薬−ＰＯＰＳ　：ＤＯＰＣ比及び試薬組成を変化させることの効果２４３個の残基を含み且つ分子の細胞質部分の大部分が失われた精製組換えヒト組織因子が、合成の１−バルミトイル−２−才しオイルフォスファチジルセリン（ＰＯＰＳ）及びジオレオキシフオスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）の種々の混合物と、ｒＴＦニリン脂質比１：１００００にて組み合わされた。処方Ａは、種々の比率のＰＯＰＳ　：　ＤＯＰＣと２２０ｎｇ／ｍＬのｒＴＦ、６０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１ｍＭのＣａＣＬ　、２１５ｍＭのＮａＣｌ、４．６％のグリシン、５ｍｇ／Ｌのポリブレン、ｐ）（７，４、を含んだ。処方Ｂは、３０ニア０のＰＯＰＳ　：ＤＯＰＣと２’４０ｎｇ／ｍＬのｒＴＦ、６０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１ｍＭのＣａＣ１＊、２１５ｍＭのＮａＣ１，４，６％のグリシン、ｐＨ７，４、を含んだ。処方Ｃは、３０　：　７０のＰＯＰＳ　：ＤＯＰＣと１６５ｎｇ／ｍＬのｒＴＦ、４０ｍＭのＴＡＰＳＯｌｌｌｍＭのＣａＣＬ、２２０ｍＭのＮａｃｌ、２．１％のグリシン、ｐＨ７，４、を含んだ。混合物は、バイアルに小分けされて凍結乾燥された。結果は凝固時間として与えられ、ＭＬＡ　Ｅｌｅｃｔｒａ　８００光−光学的凝固タイマーを使用して測定した。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ｃ１−Ｔｒｏｔ　１　（Ｃ孔１）、異常凍結乾燥対照、Ｃ１−Ｔｒｏｔ　［［（ＣＯＬ　２）、新鮮正常血漿のプール（ＰＮＰ）及びワルファリン投与を受けている患者からの血漿の凍結乾燥プール（ＷＡＲＦＡＲＩＮ）である。ＲＡＴＩＯの下の欄は、ワルファリン処理血漿プールのＰＴ値を正常血漿プールのＰＴ値で除した比である。この比は、試薬の感受性の尺度である。商業的に入手できる高感度の家兎脳に基づくトロンボプラスチン試薬であるトロンボプラスチンＩＳが対照として含まれている。データ表７を参照のこと。

処方ｒＴＦ　ＰＳ：ＰＣＣ０ＬＩ　Ｃ０Ｌ２　ＦＮＰ　ＷＡＲＦＡＲＩＮ　ＲＡＴＩＯＡ　２５ニア５　１２．４　３１．１　１３．７　３３．３　２．４３３０ニア０　１１．５　２８．２　＋２．５　３０．４　２．４３３５：６５　１１．１　２４．８　１２．０　２６．７　２．４３Ａ　３０ニア０　１１．６　２７．７　＋２．５　３０．３　２．４２Ｂ　３０ニア０　１２．６　３１．４　１３．４　３４．４　２．５７Ｃ３０，７０１２，０２６，８１３，１３４，０２，６０トロンボプラスチン　Ｉｓ　１４．１　３５．５　１５．２　２９．８　１．９６デ一タ表７砂洲わ汝国際調査報告　Ｑｊ７／、ｊ（Ｑ７／ｌ’１Ｒ２Ｒ１寞、　Ｉｔ＠　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０８２８１フロントページの続き（７２）発明者　テジドール、リリアーナアメリカ合衆国３３１８５フロリダ、マイアミ、サウスウエスト・ワンハンドレッドアンド（７２）発明者　メイナード、ジェイムスアメリカ合衆国２８２６９ノースカロライナ、シャーロット、ハイグレンドライブ　３１０４エル（７２）発明者　ジョンソン、ケビン、ビーアメリカ合衆国３３１７３フロリダ、マイアミ、サウスウエスト１１６コート　６６０１、ナンバ

Claims

【特許請求の範囲】

１．プロトロンビン時間試薬であって、（ａ）ヒト組織因子のアミノ酸配列を実質的に有する組換え蛋白質と、（ｂ）前記蛋白質を活性化するに十分な量のリン脂質と、（ｃ）緩衝剤組成物と、そして（ｄ）該組換え蛋白質を活性化するに十分な量のカルシウムイオンとからなるものである、プロトロンビン時間試薬。
２．プロトロンビン時間試薬であって、（ａ）ヒト組織因子の細胞質部分に実質的に対応するアミノ酸配列を有する組換え蛋白質と、（ｂ）前記蛋白質を活性化するに十分な量のリン脂質と、（ｃ）緩衝剤組成物と、そして（ｄ）該組換え蛋白質を活性化するに十分な量のカルシウムイオンとからなるものである、プロトロンビン時間試薬。
３．プロトロンビン時間試薬であって、（ａ）ヒト組織因子のアミノ酸配列を実質的に有する組換え蛋白質と、（ｂ）前記蛋白質を活性化するに十分な量のリン脂質混合物と、（ｃ）緩衝剤組成物と、そして（ｄ）該組換え蛋白質を活性化するに十分な量のカルシウムイオンとからなるものである、プロトロンビン時間試薬。
４．該リン脂質がフォスファチジルコリン及びフォスファチジルセリンよりなる群より選ばれるものである、請求項１又は２に記載のプロトロンビン時間試薬。
５．リン脂質の該混合物がフォスファチジルコリン及びフォスファチジルセリンよりなる群より選ばれるものである、請求項３に記載のプロトロンビン時間試薬。
６．該リン脂質が合成のものである、請求項１又は２に記載のプロトロンビン時間試薬。
７．組織因子を含有する脂質ミセルを製造するための方法であって、（ａ）該リン脂質を界面活性剤中に溶解させ、（ｂ）組織因子を、該溶解させたリン脂質と組み合せ、（ｃ）組み合わされたリン脂質及び組織因子混合物を、接線流システム中に、前記混合物が前記システムの膜と接触するような方法で置き、そして（ｄ）該システムを緩衝液で洗い流すことよりなる方法。