JPH062052B2 - 遺伝子組換え大腸菌及びそれを用いるｌ‐フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents
遺伝子組換え大腸菌及びそれを用いるｌ‐フエニルアラニンの製造方法Info
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- JPH062052B2 JPH062052B2 JP63069928A JP6992888A JPH062052B2 JP H062052 B2 JPH062052 B2 JP H062052B2 JP 63069928 A JP63069928 A JP 63069928A JP 6992888 A JP6992888 A JP 6992888A JP H062052 B2 JPH062052 B2 JP H062052B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換え大腸菌（エスシエリキア・コリEscheric
hia coli）菌株を用いてL−フェニルアラニンを製造す
る方法に関する。より詳しくは、本発明はL−フェニル
アラニン生産遺伝子を含有する新規な大腸菌菌株、なら
びにこの新菌株を用いてL−フェニルアラニンを製造す
る方法に関する。
hia coli）菌株を用いてL−フェニルアラニンを製造す
る方法に関する。より詳しくは、本発明はL−フェニル
アラニン生産遺伝子を含有する新規な大腸菌菌株、なら
びにこの新菌株を用いてL−フェニルアラニンを製造す
る方法に関する。
L−フェニルアラニンは必須アミノ酸の一種であり、甘
味剤であるアスパルテーム（登録商標）の合成に使用さ
れる。各種の微生物を使用することによりL−フェニル
アラニンを製造する方法は既に多く知られている。例え
ば特開昭37-6345、同60-160890号公報にはチロシン要求
株であるブレビバクテリュウム(Brevibacterium)属の菌
株又はコリネバクテリュウム(Corynebacterium)属の菌
株を使用してL−フェニルアラニンを製造する方法が記
載されている。特開昭５５−１６５７９７号公報には、
同様な方法としてチロシン要求株であり、かつトリプト
ファン類縁化合物に対して耐性を示す大腸菌菌株を用い
る方法が示されている。
味剤であるアスパルテーム（登録商標）の合成に使用さ
れる。各種の微生物を使用することによりL−フェニル
アラニンを製造する方法は既に多く知られている。例え
ば特開昭37-6345、同60-160890号公報にはチロシン要求
株であるブレビバクテリュウム(Brevibacterium)属の菌
株又はコリネバクテリュウム(Corynebacterium)属の菌
株を使用してL−フェニルアラニンを製造する方法が記
載されている。特開昭５５−１６５７９７号公報には、
同様な方法としてチロシン要求株であり、かつトリプト
ファン類縁化合物に対して耐性を示す大腸菌菌株を用い
る方法が示されている。
しかし、以上挙げた従来技術における各方法はL−フェ
ニルアラニンを工業的規模で製造するには適した方法と
は云えなかった。さらに、これらの方法でのL−フェニ
ルアラニンの生産収率はいずれも低かった。
ニルアラニンを工業的規模で製造するには適した方法と
は云えなかった。さらに、これらの方法でのL−フェニ
ルアラニンの生産収率はいずれも低かった。
そのため、或る一つの生成物を製造する従来技術の方法
においては、遺伝子工学による特定な方法で、これに関
与する律速酵素（rate-limiting酵素）をコードする遺
伝子のコピー数を増幅させる手段が採られていることが
知られている。しかし、細胞中で遺伝子が過剰に発現さ
れて、プラスミド中の遺伝子の欠失や、細胞死滅をきた
す細胞の溶解が起る場合が多かった。プラスミドの発現
を制御する方法としては、多くの手段がある、例えば、
IPTG（イソプロピルチオーガラクトシッド）のような誘
導物質がlacオペレーター系において用いられ、lacオペ
ロンやアルカリホスファターゼ遺伝子の制御に利用され
ている〔Ａ．イタクマら、「Science」198巻、1056頁
（1977）；及びA.ミヤノハラら、「Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.,」80巻、１頁(1983)；参照〕 ファージの温度感受性レプレッサーcI857を用いる温度
シフト(shift)法も知られている。該レプレッサーは普
通、37℃以下で働くものであり、そしてオペレーターを
阻害するので、RNAポリメラーゼによる転写が起らない
が、37℃より高い温度では、該レプレッサーはその働き
を失なうので阻害作用を発揮することができなくなり、
このためにレプレッサーの制御下で遺伝子の発現が行わ
れることになる。
においては、遺伝子工学による特定な方法で、これに関
与する律速酵素（rate-limiting酵素）をコードする遺
伝子のコピー数を増幅させる手段が採られていることが
知られている。しかし、細胞中で遺伝子が過剰に発現さ
れて、プラスミド中の遺伝子の欠失や、細胞死滅をきた
す細胞の溶解が起る場合が多かった。プラスミドの発現
を制御する方法としては、多くの手段がある、例えば、
IPTG（イソプロピルチオーガラクトシッド）のような誘
導物質がlacオペレーター系において用いられ、lacオペ
ロンやアルカリホスファターゼ遺伝子の制御に利用され
ている〔Ａ．イタクマら、「Science」198巻、1056頁
（1977）；及びA.ミヤノハラら、「Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.,」80巻、１頁(1983)；参照〕 ファージの温度感受性レプレッサーcI857を用いる温度
シフト(shift)法も知られている。該レプレッサーは普
通、37℃以下で働くものであり、そしてオペレーターを
阻害するので、RNAポリメラーゼによる転写が起らない
が、37℃より高い温度では、該レプレッサーはその働き
を失なうので阻害作用を発揮することができなくなり、
このためにレプレッサーの制御下で遺伝子の発現が行わ
れることになる。
従って、本発明の要旨の一つは、phe A遺伝子、aro F遺
伝子、これら２つの遺伝子の発現を制御するプロモータ
ー及び温度感受性レプレッサーcI857-10を含有する大腸
菌菌株であってフェニルアラニンを生産でき且つそのフ
ェニルアラニンの生産能が30℃〜35℃、特に30℃〜32℃
の温度で最適になるようなフエニルアラニン生産性の新
規な大腸菌形質転換株を提供することにある。この大腸
菌はL−フェニルアラニンの生合成経路における酵素を
生産する遺伝子を含有するプラスミドにより形質転換で
きるものである。そのような形質転換に用いるプラスミ
ドは温度感受性のレプレッサーを含有することができ、
しかもそのレプレッサーは、該レプレッサーにより前記
プラスミドの最適発現が、従来法でのものが38℃より高
い温度下のものであったのに比べ、30〜35℃の温度下で
達成することのできるものである。このプラスミドは、
カナマイシン耐性遺伝子と、phe A遺伝子と、aro F遺伝
子とを含有するプラスミドPMW11でありうる。このプラ
スミドの調製には、制限酵素Pst I，EcoR I及びHind II
Iが使用できる。その他の制限酵素，Afl II，Hae II，B
am HI，Bgl II、Dra IIIなども、前記プラスミドの調製
に使用できる。本発明における好ましい大腸菌菌株とし
ては、大腸菌K-12，MWPEC13-60株（韓国の寄託所「KAIS
T」に1987年３月25日、「KCTC8237P」として寄託し；ま
た米国のアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
ンに1987年７月９日に「ATCC67459」として寄託済）又
はその変異株が挙げられ、これらはいずれも本発明の好
ましいフェニルアラニン生産株である。この大腸菌K-1
2，MWPEC13-60株の形態学性性状は通常の大腸菌のそれ
と同じであるが、遺伝子学的性質が異なるものである。
伝子、これら２つの遺伝子の発現を制御するプロモータ
ー及び温度感受性レプレッサーcI857-10を含有する大腸
菌菌株であってフェニルアラニンを生産でき且つそのフ
ェニルアラニンの生産能が30℃〜35℃、特に30℃〜32℃
の温度で最適になるようなフエニルアラニン生産性の新
規な大腸菌形質転換株を提供することにある。この大腸
菌はL−フェニルアラニンの生合成経路における酵素を
生産する遺伝子を含有するプラスミドにより形質転換で
きるものである。そのような形質転換に用いるプラスミ
ドは温度感受性のレプレッサーを含有することができ、
しかもそのレプレッサーは、該レプレッサーにより前記
プラスミドの最適発現が、従来法でのものが38℃より高
い温度下のものであったのに比べ、30〜35℃の温度下で
達成することのできるものである。このプラスミドは、
カナマイシン耐性遺伝子と、phe A遺伝子と、aro F遺伝
子とを含有するプラスミドPMW11でありうる。このプラ
スミドの調製には、制限酵素Pst I，EcoR I及びHind II
Iが使用できる。その他の制限酵素，Afl II，Hae II，B
am HI，Bgl II、Dra IIIなども、前記プラスミドの調製
に使用できる。本発明における好ましい大腸菌菌株とし
ては、大腸菌K-12，MWPEC13-60株（韓国の寄託所「KAIS
T」に1987年３月25日、「KCTC8237P」として寄託し；ま
た米国のアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
ンに1987年７月９日に「ATCC67459」として寄託済）又
はその変異株が挙げられ、これらはいずれも本発明の好
ましいフェニルアラニン生産株である。この大腸菌K-1
2，MWPEC13-60株の形態学性性状は通常の大腸菌のそれ
と同じであるが、遺伝子学的性質が異なるものである。
更に、本発明は、大腸菌を形質転換するのに使用する
と、phe A遺伝子、aro F遺伝子、これら２つの遺伝子の
発現を制御するプロモーター及び温度感受性レプレッサ
ーcI857-10を含有し且つ温度30℃〜35℃で最適なフェニ
ルアラニン生産能を示す大腸菌形質転換菌株を作成でき
るような複製可能な組換えプラスミドも要旨の一つとす
る。この発明のプラスミドは、好ましくはphe A遺伝子
と、aro F遺伝子と、これらの遺伝子の発現を制御する
プロモーターとを含有するものである。
と、phe A遺伝子、aro F遺伝子、これら２つの遺伝子の
発現を制御するプロモーター及び温度感受性レプレッサ
ーcI857-10を含有し且つ温度30℃〜35℃で最適なフェニ
ルアラニン生産能を示す大腸菌形質転換菌株を作成でき
るような複製可能な組換えプラスミドも要旨の一つとす
る。この発明のプラスミドは、好ましくはphe A遺伝子
と、aro F遺伝子と、これらの遺伝子の発現を制御する
プロモーターとを含有するものである。
また更に、本発明は、本発明に係る前記のフェニルアラ
ニン生産能を有する大腸菌菌株を培地中に培養してフェ
ニルアラニンを製造する方法をも要旨の一つとする。
ニン生産能を有する大腸菌菌株を培地中に培養してフェ
ニルアラニンを製造する方法をも要旨の一つとする。
この本発明の方法における大腸菌の培養は30℃〜35℃、
好ましくは30℃〜32℃の温度下にて行なうのがよい。こ
の培地には第一次栄養源として糖及びその他の主要な栄
養源を含有させる。この糖としてはブドウ糖（グルコー
ス）であることができ、あるいはグルコース、果糖及び
蔗糖を含む加水分解混合物であることができる。本発明
の方法には、さらに、培地の通気，撹拌工程や、培養液
からのフェニルアラニンの回収工程を含めることができ
る。このフェニルアラニンの精製工程を含めてもよい。
好ましくは30℃〜32℃の温度下にて行なうのがよい。こ
の培地には第一次栄養源として糖及びその他の主要な栄
養源を含有させる。この糖としてはブドウ糖（グルコー
ス）であることができ、あるいはグルコース、果糖及び
蔗糖を含む加水分解混合物であることができる。本発明
の方法には、さらに、培地の通気，撹拌工程や、培養液
からのフェニルアラニンの回収工程を含めることができ
る。このフェニルアラニンの精製工程を含めてもよい。
以下に更に詳細な説明を行って、本発明のその他の目的
やその適用の範囲を明らかにする。以下の詳細な説明な
らびに具体的な実施例は、本発明の好ましい態様に関す
るものであるが、これらはあくまで例示的なものであ
り、本発明の要旨を変更しない範囲で、多くの変形や修
飾のあり得ることは当業者にとって自明なことである。
すなわち、本発明は後記の説明と、添付図面によりさら
によく理解できるであろう。添付図面において；第１図
は、本発明の大腸菌K-12,MWPEC 13-60株を調製するため
に、大腸菌MWEC 101-6株に組込まれるプラスミドpMW 13
pMW 12の調製方法を示す図式図と、各種プラスミドの制
限酵素地図を示し、また第２図は同様に用いられる組換
えプラスミドpMW13の調製方法を示す図式図と、各種プ
ラスミドの制限酵素地図を示す。
やその適用の範囲を明らかにする。以下の詳細な説明な
らびに具体的な実施例は、本発明の好ましい態様に関す
るものであるが、これらはあくまで例示的なものであ
り、本発明の要旨を変更しない範囲で、多くの変形や修
飾のあり得ることは当業者にとって自明なことである。
すなわち、本発明は後記の説明と、添付図面によりさら
によく理解できるであろう。添付図面において；第１図
は、本発明の大腸菌K-12,MWPEC 13-60株を調製するため
に、大腸菌MWEC 101-6株に組込まれるプラスミドpMW 13
pMW 12の調製方法を示す図式図と、各種プラスミドの制
限酵素地図を示し、また第２図は同様に用いられる組換
えプラスミドpMW13の調製方法を示す図式図と、各種プ
ラスミドの制限酵素地図を示す。
L−フェニルアラニンの製造に用いられる本発明の大腸
菌形質転換株の作成のため形質転換に使用される前記ar
o F遺伝子及びphe A遺伝子は大腸菌MWEC 101-5（韓国の
「KAIST」に1987年３月25日、「KCTC 8234p」として寄
託）からショットガン法により調製される。この際に
は、大腸菌MWEC 101-5は、生合成代謝の制御から解除さ
れている。また、この際、ラムダ(Lambda)ファージのPR
−PＬプロモーターはプラスミドの発現増大のプロセス
に利用される。
菌形質転換株の作成のため形質転換に使用される前記ar
o F遺伝子及びphe A遺伝子は大腸菌MWEC 101-5（韓国の
「KAIST」に1987年３月25日、「KCTC 8234p」として寄
託）からショットガン法により調製される。この際に
は、大腸菌MWEC 101-5は、生合成代謝の制御から解除さ
れている。また、この際、ラムダ(Lambda)ファージのPR
−PＬプロモーターはプラスミドの発現増大のプロセス
に利用される。
次に、本発明を説明するに関連して、生物体、特に大腸
菌におけるフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸の生合
成の代謝経路及び及び機構を図式的に表示する生合成経
路チャートを以下に示す。
菌におけるフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸の生合
成の代謝経路及び及び機構を図式的に表示する生合成経
路チャートを以下に示す。
上記チャートにおいて、記号（Ｉ）〜（Ｖ）は次の意
味を示す：− （Ｉ）はaro F遺伝子（チロシン 抑制）によりコード
されるDAHPシンターゼイソ酵素（isoenzyme）を表わ
す。
味を示す：− （Ｉ）はaro F遺伝子（チロシン 抑制）によりコード
されるDAHPシンターゼイソ酵素（isoenzyme）を表わ
す。
（II）はaro G遺伝子（フェニルアラニン抑制）により
コードされるDAHPシンターゼイソ酵素を表わす。
コードされるDAHPシンターゼイソ酵素を表わす。
（III）はaro H遺伝子（トリプトファン抑制）によりコ
ードされるDAHPシンターゼイソ酵素を表わす。
ードされるDAHPシンターゼイソ酵素を表わす。
（IV）はコリスミ酸ムターゼP-プレフェン酸デヒドラタ
ーゼを表わす。
ーゼを表わす。
（Ｖ）はコリスミ酸ムターゼT-プレフェン酸デヒドラタ
ーゼを表わす。
ーゼを表わす。
………○はフィードバック阻害， ………●はフィードバック抑制 上記のチャートについて、組換えプラスミドを用いる場
合にL−フェニルアラニンの生成行程は、大腸菌菌株の
細胞中の酵素の作用で制御される。その反応を制御する
酵素の一つとして挙げられるものは、コリスミ酸ムター
ゼP-プレフェン酸デヒドラターゼである。また、反応を
制御するその他の酵素の一つとしては、３−デオキシ−
Ｄ−アラビノヘプツロソン酸7-リン酸シンターゼ（DAHP
シンターゼ）が挙げられる。このDAHPシンターゼはar
o F，aro G及びaro H遺伝子によってそれぞれコードさ
れる３種のイソ酵素(isoenzyme)として存在する。
合にL−フェニルアラニンの生成行程は、大腸菌菌株の
細胞中の酵素の作用で制御される。その反応を制御する
酵素の一つとして挙げられるものは、コリスミ酸ムター
ゼP-プレフェン酸デヒドラターゼである。また、反応を
制御するその他の酵素の一つとしては、３−デオキシ−
Ｄ−アラビノヘプツロソン酸7-リン酸シンターゼ（DAHP
シンターゼ）が挙げられる。このDAHPシンターゼはar
o F，aro G及びaro H遺伝子によってそれぞれコードさ
れる３種のイソ酵素(isoenzyme)として存在する。
プラスミドの調製法の具体的な手法は、文献「Recombin
ant DNA Methodology」(Jo-Anne,R.Dillion,Anwar Nasi
m,Earle R.Nestmann)及び「Molecular Cloning」（T.Ma
niatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook）の記載に従って行わ
れた。
ant DNA Methodology」(Jo-Anne,R.Dillion,Anwar Nasi
m,Earle R.Nestmann)及び「Molecular Cloning」（T.Ma
niatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook）の記載に従って行わ
れた。
本発明のフェニルアラニン生産能を有する大腸菌形質転
換株の一例である新菌株大腸菌K-12,MWPEC13-60(ATCC67
459)は次の通り調製されたものである。
換株の一例である新菌株大腸菌K-12,MWPEC13-60(ATCC67
459)は次の通り調製されたものである。
大腸菌K-12MWEC 101-5株（韓国の「KAIST」にKCTC 8234
Pとして寄託）をLB培地（バクトトリプトン１％、バク
トイーストエキストラクト0.5％、塩化ナトリウム１
％、pH7.4）中で37℃、15時間培養してから、この菌株
の細胞を採取する。染色体(chromosomal)DNA(cDNA)をCs
Cl密度勾配遠心法により単離する。次いでこのcDNAをブ
タノール処理と透析により精製する（添付図面第１図参
照）。
Pとして寄託）をLB培地（バクトトリプトン１％、バク
トイーストエキストラクト0.5％、塩化ナトリウム１
％、pH7.4）中で37℃、15時間培養してから、この菌株
の細胞を採取する。染色体(chromosomal)DNA(cDNA)をCs
Cl密度勾配遠心法により単離する。次いでこのcDNAをブ
タノール処理と透析により精製する（添付図面第１図参
照）。
他方、第１図第２図に示されて本発明で組換えプラスミ
ドの作成に使用される大腸菌HB101由来のプラスミドpBR
322、大腸菌由来のプラスミドpPLC2833、大腸菌HB101由
来のプラスミドpTR262及び大腸菌HB 101由来のプラスミ
ドpMK20の各プラスミドDNAも、上述の方法にて採取、精
製する。なお大腸菌MWEC 101-5株から得られた前記の染
色体cDNAは、制限酵素を含む緩衝液（塩化ナトリウム50
mM、トリス（pH7.5)10mM、塩化マグネシウム10mM、ジチ
オスレイトール１mM）中で制限酵素EcoR Iを用いて、37
℃、１時間かけて消化、切断する。通常の方法で制限酵
素を不活性化し、さらにEcoR I切断后のcDNAを制限酵素
Pst Iで切断する。その反応液から４〜７kbの大きさの
フラグメントを回収（0.7％（重量）、アガロースゲル
を使用）し、このフラグメントをターゲットとして採取
すべき遺伝子とする。前記のプラスミドpBR322も上記の
制限酵素EcoR IとPst Iで切断する。この切断后のプラ
スミドpBR322と、大腸菌MWEC 101-5株から得られた前述
の４−７kb遺伝子のフラグメントとを１：３の量比で混
合する。切断后のプラスミドpBR322の断片と大腸菌MWEC
101-5接触体遺伝子DNAの切断フラグメントとをT4DNAリ
ガーゼ緩衝液〔トリス(pH7.4)0.5M、塩化マグネシウム
０．１Ｍ、ジチオースレイトール0.1M、スペルヘミジン
10mM、ATP 10mM、ウシ血清アルブミン１mg／ml〕中で、
12−14℃で12時間連結反応にかける。
ドの作成に使用される大腸菌HB101由来のプラスミドpBR
322、大腸菌由来のプラスミドpPLC2833、大腸菌HB101由
来のプラスミドpTR262及び大腸菌HB 101由来のプラスミ
ドpMK20の各プラスミドDNAも、上述の方法にて採取、精
製する。なお大腸菌MWEC 101-5株から得られた前記の染
色体cDNAは、制限酵素を含む緩衝液（塩化ナトリウム50
mM、トリス（pH7.5)10mM、塩化マグネシウム10mM、ジチ
オスレイトール１mM）中で制限酵素EcoR Iを用いて、37
℃、１時間かけて消化、切断する。通常の方法で制限酵
素を不活性化し、さらにEcoR I切断后のcDNAを制限酵素
Pst Iで切断する。その反応液から４〜７kbの大きさの
フラグメントを回収（0.7％（重量）、アガロースゲル
を使用）し、このフラグメントをターゲットとして採取
すべき遺伝子とする。前記のプラスミドpBR322も上記の
制限酵素EcoR IとPst Iで切断する。この切断后のプラ
スミドpBR322と、大腸菌MWEC 101-5株から得られた前述
の４−７kb遺伝子のフラグメントとを１：３の量比で混
合する。切断后のプラスミドpBR322の断片と大腸菌MWEC
101-5接触体遺伝子DNAの切断フラグメントとをT4DNAリ
ガーゼ緩衝液〔トリス(pH7.4)0.5M、塩化マグネシウム
０．１Ｍ、ジチオースレイトール0.1M、スペルヘミジン
10mM、ATP 10mM、ウシ血清アルブミン１mg／ml〕中で、
12−14℃で12時間連結反応にかける。
こうして連結された組換えプラスミドを含有する連結反
応混合物（ligation mixture)を用いて、Nogardの塩化
カルシウム法で大腸菌フェニルアラニン栄養要求変異株
(auxotroph)(phe A−欠失株）MWEC203−７株を形質転換
する。こうして得られた形質転換株を、MM培地（グルコ
ース10ｇ、硫酸アンモニウム４ｇ、リン酸カリウム２
ｇ、硫酸マグネシウム0.5ｇ、塩化第一鉄20mg、塩化マ
ンガン10mg、チアミン塩酸塩１mg、フマール酸0.5ｇ、
蒸溜水１、pH7.4)中で、37℃、１時間保持する。この
ように処理された菌株を、テトラサイクリン（15μｇ／
ml）を含有する寒天MM培地に塗沫、植菌し、10日間培養
する。MM培地で生育できた組換え菌株を、選択、採取す
る。この選択された菌株から、次にプラスミドpMW 10を
単離し、これを制限酵素Hind IIIで切断し、さらに、制
限酵素Pst Iで部分的に切断してから、この制限酵素を
不活性化する。その反応混合物から、目的とするphe A
遺伝子及びaro F遺伝子含有の遺伝子フラグメントを、
電気泳動法(0.7％ アガロース ゲル使用）で分離して
回収する。
応混合物（ligation mixture)を用いて、Nogardの塩化
カルシウム法で大腸菌フェニルアラニン栄養要求変異株
(auxotroph)(phe A−欠失株）MWEC203−７株を形質転換
する。こうして得られた形質転換株を、MM培地（グルコ
ース10ｇ、硫酸アンモニウム４ｇ、リン酸カリウム２
ｇ、硫酸マグネシウム0.5ｇ、塩化第一鉄20mg、塩化マ
ンガン10mg、チアミン塩酸塩１mg、フマール酸0.5ｇ、
蒸溜水１、pH7.4)中で、37℃、１時間保持する。この
ように処理された菌株を、テトラサイクリン（15μｇ／
ml）を含有する寒天MM培地に塗沫、植菌し、10日間培養
する。MM培地で生育できた組換え菌株を、選択、採取す
る。この選択された菌株から、次にプラスミドpMW 10を
単離し、これを制限酵素Hind IIIで切断し、さらに、制
限酵素Pst Iで部分的に切断してから、この制限酵素を
不活性化する。その反応混合物から、目的とするphe A
遺伝子及びaro F遺伝子含有の遺伝子フラグメントを、
電気泳動法(0.7％ アガロース ゲル使用）で分離して
回収する。
このようにして得られた組換えプラスミドに対しT4DNA
ポリメラーゼとdNTPとの混合溶液（dATP25mM、dGTP25m
M、dCTP25mM及びdTTP25mMを含有）を加えてプラスミド
の付着末端をプラント末端（平滑末端ともいう）に変換
する。第１図及び第２図には、この過程を“fill-in”
という用語で表示した。
ポリメラーゼとdNTPとの混合溶液（dATP25mM、dGTP25m
M、dCTP25mM及びdTTP25mMを含有）を加えてプラスミド
の付着末端をプラント末端（平滑末端ともいう）に変換
する。第１図及び第２図には、この過程を“fill-in”
という用語で表示した。
他方、カナマイシン耐性遺伝子（Km）を含有するプラス
ミドpMK 20をPst Iで処理し、その切断反応液を上記のT
4DNAポリメラーゼとdNTPとの混合溶液に加えて、そのプ
ラスミドの付着末端をプラント末端に変える。
ミドpMK 20をPst Iで処理し、その切断反応液を上記のT
4DNAポリメラーゼとdNTPとの混合溶液に加えて、そのプ
ラスミドの付着末端をプラント末端に変える。
前述のphe A欠失菌株である大腸菌MWE203-7株は、これ
を上述と同様にして形質転換する。得られた組変えプラ
スミドPMW 11は、カナマイシン50μｇ／ml含有するMM−
寒天培地中でMWEC 203-7株を増殖させた細胞株から前記
と同様にして分離して回収される。
を上述と同様にして形質転換する。得られた組変えプラ
スミドPMW 11は、カナマイシン50μｇ／ml含有するMM−
寒天培地中でMWEC 203-7株を増殖させた細胞株から前記
と同様にして分離して回収される。
前記のプラスミドpPLc2833は、pLプロモーターを含有す
るものであるが、このプラスミドpPLc2833は制限酵素Ba
m HI、Hae IIで処理し、その切断反応混合物から0.2kbの
大きさのPLフラグメントを２％アガロースゲル泳動法で
分離、回収する。
るものであるが、このプラスミドpPLc2833は制限酵素Ba
m HI、Hae IIで処理し、その切断反応混合物から0.2kbの
大きさのPLフラグメントを２％アガロースゲル泳動法で
分離、回収する。
前記の如く得られた組換えプラスミドpMW 11は、これを
酵素Afl IIで切断し、次いでDNAポリメラーゼで処理し
て両端にプラント末端を形成する。このように処理した
後のプラスミドpMW 11に前記のPLフラグメントを加え、
連結(ligate)反応を行って、別の組換えプラスミドを作
る。このようにして作られた組換えプラスミドを用いて
大腸菌phe A欠失株のMWEC 203-7株を形質転換する。
酵素Afl IIで切断し、次いでDNAポリメラーゼで処理し
て両端にプラント末端を形成する。このように処理した
後のプラスミドpMW 11に前記のPLフラグメントを加え、
連結(ligate)反応を行って、別の組換えプラスミドを作
る。このようにして作られた組換えプラスミドを用いて
大腸菌phe A欠失株のMWEC 203-7株を形質転換する。
この形質転換された株から、組換えプラスミドpMW 12を
分離、回収する。この組換えプラスミドpMW 12の大きさ
は、プラスミドpMW 11に比べ0.2kbだけ大きい。
分離、回収する。この組換えプラスミドpMW 12の大きさ
は、プラスミドpMW 11に比べ0.2kbだけ大きい。
別途、温度感受性レプレッサー(cI857)とプロモーター
（PR）を含有するプラスミドを有するアクテリアpTR262
を、第２図に図式的に示されるように、ヒドロキシルア
ミン塩酸塩処理(HA)と紫外線(UV)照射により遺伝学的に
変異させる。この処理された菌株から、温度感受性菌株
のみを単離、回収する。このように処理した后に回収さ
れたプラスミドを用いて、大腸菌MWEC 101-6株（韓国の
「KAIST」にKCTC 8235Pとして寄託済）を形質転換す
る。
（PR）を含有するプラスミドを有するアクテリアpTR262
を、第２図に図式的に示されるように、ヒドロキシルア
ミン塩酸塩処理(HA)と紫外線(UV)照射により遺伝学的に
変異させる。この処理された菌株から、温度感受性菌株
のみを単離、回収する。このように処理した后に回収さ
れたプラスミドを用いて、大腸菌MWEC 101-6株（韓国の
「KAIST」にKCTC 8235Pとして寄託済）を形質転換す
る。
このように形質転換された菌株を、テトラサイクリン15
μｇ／mlを含有するLB寒天培地中で、33℃で培養する。
増殖したコロニーを選別し、LB寒天培地に移し、28℃で
24時間培養する。これで増殖しなかった大腸菌菌株か
ら、次いで、温度感受性レプレッサー（cI857-10）を含
有するプラスミドpTR262-10を分離、回収する。
μｇ／mlを含有するLB寒天培地中で、33℃で培養する。
増殖したコロニーを選別し、LB寒天培地に移し、28℃で
24時間培養する。これで増殖しなかった大腸菌菌株か
ら、次いで、温度感受性レプレッサー（cI857-10）を含
有するプラスミドpTR262-10を分離、回収する。
次に、第２図に図式的に示されるように、前記の組換え
プラスミドpMW12は、これを酵素Dra IIIで切断して、次
に、T4DNAポリメラーゼを作用させてブラント末端を形
成する。また前記のプラスミドpTR262-10を酵素Pst Iと
Bgl IIで切断して温度感受性レプレッサー（cI857-10）
とプロモーター(PR)をもつフラグメントを得る。
プラスミドpMW12は、これを酵素Dra IIIで切断して、次
に、T4DNAポリメラーゼを作用させてブラント末端を形
成する。また前記のプラスミドpTR262-10を酵素Pst Iと
Bgl IIで切断して温度感受性レプレッサー（cI857-10）
とプロモーター(PR)をもつフラグメントを得る。
このcI857-10とPRを含むフラグメントを、0.9％（重
量）アガロース ゲル泳動法で回収してから、DNAポリ
メラーゼ処理により両端にプラント末端を形成する（大
腸菌のクレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントの生成）
このようにポリメラーゼ処理した上記フラグメントにT4
DNAリガーゼを加えると、組換えプラスミドpMW13が生成
される。このプラスミドpMW 13を用いてNorgard法で宿
主菌、大腸菌MWEC 101-6株を形質転換する。かくして得
られた形質転換菌株をカナマイシン（50μｇ／ml）を含
有するLB寒天培地で培養すると、増殖したコロニーから
新菌株として大腸菌K-12，MWPEC 13-60(ATCC 67459)が
分離、選別できる。この新菌株はL−フェニルアラニン
の生産能を有し本発明でフェニルアラニンの製造に使用
できる。この新菌株、大腸菌K-12，MWPEC 13-60株はア
メリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(America
n Type Culture Collection)にブタベスト条約にもとず
いて1987年７月14日に寄託し、寄託番号ATCC 67459号が
付された。
量）アガロース ゲル泳動法で回収してから、DNAポリ
メラーゼ処理により両端にプラント末端を形成する（大
腸菌のクレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントの生成）
このようにポリメラーゼ処理した上記フラグメントにT4
DNAリガーゼを加えると、組換えプラスミドpMW13が生成
される。このプラスミドpMW 13を用いてNorgard法で宿
主菌、大腸菌MWEC 101-6株を形質転換する。かくして得
られた形質転換菌株をカナマイシン（50μｇ／ml）を含
有するLB寒天培地で培養すると、増殖したコロニーから
新菌株として大腸菌K-12，MWPEC 13-60(ATCC 67459)が
分離、選別できる。この新菌株はL−フェニルアラニン
の生産能を有し本発明でフェニルアラニンの製造に使用
できる。この新菌株、大腸菌K-12，MWPEC 13-60株はア
メリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(America
n Type Culture Collection)にブタベスト条約にもとず
いて1987年７月14日に寄託し、寄託番号ATCC 67459号が
付された。
大腸菌K-12，MWPEC 13-60株の菌学的性状は宿主菌株の
大腸菌MWEC 101-6株のそれと同じである。しかし、宿主
菌株MWEC 101-6に比較して、変異株MWEPC 13-60のL−フ
ェニルアラニンの生産収量と、その安定性は下記の通り
高い値を示す（後記の表１及びII参照）。
大腸菌MWEC 101-6株のそれと同じである。しかし、宿主
菌株MWEC 101-6に比較して、変異株MWEPC 13-60のL−フ
ェニルアラニンの生産収量と、その安定性は下記の通り
高い値を示す（後記の表１及びII参照）。
上記データーは実施例２の手順に従って得た。
夫々の供試大腸菌菌株をLB培地にて培養してから、試料
を採取し、それぞれLB寒天培地及びカナマイシン（カナ
マイシン50μｇ／ml）含有LB寒天培地上に植菌し、24時
間培養後にコロニー数を数えて生存率を算定した。
を採取し、それぞれLB寒天培地及びカナマイシン（カナ
マイシン50μｇ／ml）含有LB寒天培地上に植菌し、24時
間培養後にコロニー数を数えて生存率を算定した。
次に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、
これらの実施例はあくまで例示的なものであつて本発明
を何ら限定するものではない。
これらの実施例はあくまで例示的なものであつて本発明
を何ら限定するものではない。
実施例Ｉ (A) 使用菌株 大腸菌 K-12，MWPEC 13-60 （本発明の一菌株例） (B) 種培地の組成 グルコース ５ ％ バクト−トリプトン １ ％ バクト−酵母抽出物 １ ％ 塩化ナトリウム 0.1％ カナマイシン 10mg／ pH 7.0 (C) 発酵生産培地の組成 グルコース ６ ％ 硫酸カルシウム 0.04 ％ 硫酸アンモニウム ２ ％ クエン酸ナトリウム 0.05 ％ フマル酸 0.05 ％ 塩化マグネシウム 0.05 ％ リン酸カリウム（一塩基） 0.1％ ／リン酸カリウム（二塩基） バクト酵母抽出物 0.1％ グルタミン酸 0.05％ 塩化コバルト 0.1mg／ 硫酸亜鉛 1 mg／ 塩化マンガン 2 mg／ 塩化カルシウム 5 mg／ チアミン塩酸塩 10 mg／ ニコチン酸 10 mg／ pH 7.0 (D) 発酵によるL−フェニルアラニンの生産試験。
５００ml容試験フラスコに種培地(B)の50mlを入れ、１
２０℃で２０分間加熱した。本発明による新菌株、大腸
菌K-12，MWPEC13-60(ATCC No.67459)をこのフラスコに
入れ、３０℃で120rpmの回転速度で16時間培養して種培
養物を得た。他方、発酵生産培地(C)を上述の組成で調
製した。
２０℃で２０分間加熱した。本発明による新菌株、大腸
菌K-12，MWPEC13-60(ATCC No.67459)をこのフラスコに
入れ、３０℃で120rpmの回転速度で16時間培養して種培
養物を得た。他方、発酵生産培地(C)を上述の組成で調
製した。
炭酸カルシウム（５％）を、上記の発酵生産培地(C)に
入れ、これに上記の種培養物２mlを加え、32℃で35時間
撹拌培養させた。発酵終了後、L−フェニルアラニンの
収量は測定すると12.46g／であった。
入れ、これに上記の種培養物２mlを加え、32℃で35時間
撹拌培養させた。発酵終了後、L−フェニルアラニンの
収量は測定すると12.46g／であった。
実施例２ 使用される大腸菌菌株(A)、種培地(B)及び発酵生産培地
(C)は実施例１と同じである。
(C)は実施例１と同じである。
発酵によるL−フェニルアラニンの生産試験を次の通り
に行った。
に行った。
500ｍ容のフラスコに種培地(B)の５０mlを入れ、120℃
で20分間加熱した。新菌株の大腸菌K-12,MWPEC13-60(AT
CC67459)をこのフラスコに入れ、30℃で16時間培養して
種培養物を得た。発酵生産培地(C)の20を発酵槽に入
れた。上記の種培養液をこれに接種して32℃で55時間培
養した。(400rpmで撹拌；0.75vvm酸素供給率）。
で20分間加熱した。新菌株の大腸菌K-12,MWPEC13-60(AT
CC67459)をこのフラスコに入れ、30℃で16時間培養して
種培養物を得た。発酵生産培地(C)の20を発酵槽に入
れた。上記の種培養液をこれに接種して32℃で55時間培
養した。(400rpmで撹拌；0.75vvm酸素供給率）。
培養中は、グルコース濃度が１％以下に下ったら発酵槽
に水酸化アンモニウムと60％グルコース溶液をフィード
し（２回）、pHを7.0〜7.2に保った。
に水酸化アンモニウムと60％グルコース溶液をフィード
し（２回）、pHを7.0〜7.2に保った。
培養中に用いられるグルコースの総量は160g／ｇであっ
た。かくしてL−フェニルアラニンが収量として42.8g／
の濃度で得られた。発酵液１を通常の方法、即ちイ
オン交換樹脂で吸着処理し、水酸化アンモニウムでの抽
出により精製を行うと、L−フェニルアラニンが粗結晶
（38.52g／）として得られた。
た。かくしてL−フェニルアラニンが収量として42.8g／
の濃度で得られた。発酵液１を通常の方法、即ちイ
オン交換樹脂で吸着処理し、水酸化アンモニウムでの抽
出により精製を行うと、L−フェニルアラニンが粗結晶
（38.52g／）として得られた。
実施例３ グルコースの代りに、蔗糖のインベルターゼ加水分解
物、すなわちグルコース、果糖、蔗糖を含有する糖混合
物を用いる以外は実施例１と同様に培養を行なった。L
−フェニルアラニンの収量は43.7g／であった。
物、すなわちグルコース、果糖、蔗糖を含有する糖混合
物を用いる以外は実施例１と同様に培養を行なった。L
−フェニルアラニンの収量は43.7g／であった。
第１図及び第２図は夫々に、本発明の親菌株、大腸菌K-
12，MWPEC13-60株に調製するために、大腸菌MWEC 101-6
株に組込まれるプラスミドpMW 13の作成に用いられる組
換えプラスミドpMW 12及びプラスミドpMW 13の調製方法
を示す図式図と、各種プラスミドの制限酵素地図を示
す。
12，MWPEC13-60株に調製するために、大腸菌MWEC 101-6
株に組込まれるプラスミドpMW 13の作成に用いられる組
換えプラスミドpMW 12及びプラスミドpMW 13の調製方法
を示す図式図と、各種プラスミドの制限酵素地図を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 林 繁三 大韓民国ソウル特別市江南区清潭洞 三益 アパートメント１―303 (56)参考文献 特開 昭61−141881（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−247392（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−149390（ＪＰ，Ａ) バイオテクノロジー事典 福井三郎監修 （株）シーエムシー（1986．10．９） Ｐ．234−235
Claims (16)
- 【請求項１】phe A遺伝子、aro F遺伝子、これら２つの
遺伝子の発現を制御するプロモーター及び温度感受性レ
プレッサーcI857-10を含有すること、及びフェニルアラ
ニン生産能を有し、かつそのフェニルアラニン産生最適
温度が30℃〜35℃であることを特徴とする大腸菌菌株。 - 【請求項２】フェニルアラニンの生合成経路に関与する
酸素を生産する遺伝子を含有するプラスミドで形質転換
された請求項１記載の大腸菌菌株。 - 【請求項３】フェニルアラニン産生最適温度が30℃〜32
℃である請求項１記載の大腸菌菌株。 - 【請求項４】大腸菌K-12、MWPEC13-60株(ATCC67459)又
はその変異株である請求項１記載の大腸菌菌株。 - 【請求項５】請求項２記載のプラスミドがカナマイシン
耐性遺伝子、phe A遺伝子及びaro F遺伝子を含有するプ
ラスミドpMW 11である請求項２記載の大腸菌菌株。 - 【請求項６】請求項２記載のプラスミドは制限酵素Pst
I、EcoR I及びHind IIIを用いて調製されたものである
請求項２記載の大腸菌菌株。 - 【請求項７】請求項２記載のプラスミドは制限酵素Afl
II、Hae II、Bam HI、Bgl II及びDra IIIを用いて調製
されたものである請求項２記載の大腸菌菌株。 - 【請求項８】大腸菌を形質転換するのに用いると、 phe A遺伝子、aro F遺伝子、これら２つの遺伝子の発現
を制御するプロモーター及び温度感受性レプレッサーcI
857-10を含有し且つフェニルアラニン産生最適温度が30
℃〜35℃であるフェニルアラニン産生能を有する大腸菌
形質転換株を作成できる複製可能な組換えプラスミド。 - 【請求項９】請求項１記載の大腸菌菌株を培地中で培養
することを特徴とする、フェニルアラニンの製造方法。 - 【請求項１０】大腸菌菌株を温度30℃〜35℃で培養する
請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】培養温度が30℃〜32℃である請求項９記
載の方法。 - 【請求項１２】糖の存在下で培養を行なう請求項９記載
の方法。 - 【請求項１３】請求項12記載の糖がブドウ糖、果糖、庶
糖からなる加水分解混合物である請求項12記載の方法。 - 【請求項１４】培養物からL−フェニルアラニンを回収
する工程を含む請求項９記載の方法。 - 【請求項１５】培地の通気、撹拌を行なう請求項９記載
の方法。 - 【請求項１６】回収されたフェニルアラニンを精製する
工程を含む請求項15記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019870002816A KR890003714B1 (ko) | 1987-03-26 | 1987-03-26 | 유전자 조작 미생물에 의한 l-페닐알라닌 제조방법 |
| KR87-2816 | 1987-03-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01104160A JPH01104160A (ja) | 1989-04-21 |
| JPH062052B2 true JPH062052B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=19260316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63069928A Expired - Lifetime JPH062052B2 (ja) | 1987-03-26 | 1988-03-25 | 遺伝子組換え大腸菌及びそれを用いるｌ‐フエニルアラニンの製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5008190A (ja) |
| EP (1) | EP0284185B1 (ja) |
| JP (1) | JPH062052B2 (ja) |
| KR (1) | KR890003714B1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0623605B2 (ja) * | 1987-05-26 | 1994-03-30 | 日本ファーネス工業株式会社 | ラジアントチューブバーナ |
| KR940011838B1 (ko) * | 1991-09-12 | 1994-12-26 | 주식회사 미원 | 유전자 조작 미생물 발효에 의한 l-페닐알라닌의 제조방법 |
| US6210937B1 (en) | 1997-04-22 | 2001-04-03 | Bechtel Bwxt Idaho, Llc | Development of genetically engineered bacteria for production of selected aromatic compounds |
| US8715957B2 (en) | 2010-07-26 | 2014-05-06 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the biosynthesis of aromatics, 2,4-pentadienoate and 1,3-butadiene |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57170184A (en) * | 1980-07-18 | 1982-10-20 | Unisearch Ltd | Mutant of e. coli and production of phenylalanine |
| AU3187984A (en) * | 1983-08-16 | 1985-02-21 | Genentech Inc. | Recombinant process for preparing l-amino acids |
| US4839286A (en) * | 1983-10-07 | 1989-06-13 | Biotechnica International, Inc. | Method of biosynthesis and cells therefor |
| GB8333797D0 (en) * | 1983-12-19 | 1984-01-25 | Searle & Co | Starch utilization |
| JPS6192565A (ja) * | 1984-09-24 | 1986-05-10 | バイオテクニカ・インターナシヨナル・インコーポレーテツド | 生合成方法およびそのための細胞 |
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| EP0190921A3 (en) * | 1985-02-04 | 1988-01-13 | Engenics, Inc. | Method for the overproduction of amino acids |
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1987
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- 1988-03-25 JP JP63069928A patent/JPH062052B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| バイオテクノロジー事典福井三郎監修（株）シーエムシー（１９８６．１０．９）Ｐ．２３４−２３５ |
Also Published As
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|---|---|
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| US5008190A (en) | 1991-04-16 |
| KR880011334A (ko) | 1988-10-27 |
| KR890003714B1 (ko) | 1989-09-30 |
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| EP0284185B1 (en) | 1994-04-20 |
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