JPH06104072B2 - 毒性酸素スカベンジャーを使用する微生物による△▲１▼―脱水素化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 コーチコステロイド類の最初の治療向け使用は1950年代
に慢性関節リウマチに対するコーチゾンアセテート処置
の導入によって立証された。その後の研究で、ハイドロ
コーチゾン及びコーチゾンの1,2−位置へ不飽和の挿入
により、生ずるステロイド類のプレドニソロンとプレド
ニソンがいっそう強い効力をもち、薬剤で誘発される塩
の滞留を減らすことが立証された。やがてコーチコイド
に応答する疾病の治療用に使われる他のほとんどのステ
ロイド類は、ステロイド分子の1.2−位置に二重結合を
含める形で合成されるようになった。1977年に、ステロ
ール前駆物質からのコーチコステロイド類の新しい合成
法を提示した２件の合衆国特許が発行された。合衆国特
許第4,035,236号はシトステロール、スチグマステロー
ル及びコレストロールの醗酵を経由する９α−ヒドロキ
シアンドロステンジオンの製法を包含している。合衆国
特許第4,041,055号はこのアンドロステンから医学的に
有用なコーチコステロイド類を合成する一般的方法を明
らかにしている。この化学的方法に含まれる中間体は３
−ケト−Δ^4,9(11)立体配置をもちうる。

医学的に有用なステロイド類の合成において重要な中間
体であるステロイド化合物のＡ環への1,2−不飽和結合
の微生物学的導入については、幾つかの方法が文献に記
述されている。合衆国特許第2,837,464号はアースロバ
クター・シンプレックス（Arthrobacter simplex）の醗
酵液へのステロイド基質の添加によるステロイド類の１
−脱水素化を記述している。しかし、この方法の全体的
有用性は限られている。この細菌や他の１−脱水素を行
なう微生物はあるステロイド分子を更に劣化させるた
め、最終的収率が低下し、また望んでいない副生物が生
ずる。

合衆国特許第3,091,575号は、ステロイド，電子キャリ
アー、それに低級アルカノール又はアセトンのような低
級アルカノンで前処理された細菌の菌体を混ぜ合せてス
テロイドの１−脱水素化を行なう改良法を明らかにして
いる。この前処理は、細胞内の望ましくない活性の一
つ、すなわち20−ケトリダクターゼ活性を減少させる。

合衆国特許第3,047,469号は、ノカルジア（Nocardi
a），コリネバクテリウム（Corynebacterium），ミコバ
クテリウム（Mycobacterium），及びシリンドロカルポ
ン（Cylindrocarpon）からなる群から選ばれる微生物の
エキスを含有する電子キャリヤーとステロイド−１−デ
ヒドロゲナーゼとの混合物に、1,2−位置が飽和された
ステロイドを暴露することからなる、異なるタイプの方
法を明らかにしている。この方法は、ステロイドの分解
に至る副反応の減少を含め、生物使用で出会う幾つかの
欠点を克服している。

合衆国特許第3,091,575号は、ステロイド基質の添加の
前に又はそれと同時にキノノイド型の化合物のような抑
制剤を醗酵液への添加することによって、望んでいる生
成物の破壊をなくす方法を立証している。

外部電子キャリヤーの有用性は酵素系に対して及ぼされ
る毒性効果によって限定されることがある［ジエイ・エ
ッチ・クァシール（J.H.Quasiel）,Methods in Enzymol
ogy.エス・ピー・コロウィッツ及びエヌ・オー・カプラ
ン編、アメリカンプレス社、ニューヨーク、第４巻、32
9−336頁、1957年］。ヤング（Yang）及びスチュードベ
ーカー（Studebaker）［Biotechnology and Bioenginee
ring.20巻17−25頁,1978年］は、超過酸化物及び過酸化
物の形成によって電子キャリヤーのフェナジンメトサル
フェート（PMS）がシュードモナス・テストステロニ（P
seudomonas testosteroni）のステロイド−１−デヒド
ロゲナーゼに及ぼす有力な毒性について考察した。しか
し、彼等は、１−デヒドロゲナーゼ活性がPMSの存在に
よって本質的に影響されないと結論した。彼等は、ステ
ロイド１−デヒドロゲナーゼの損傷が生ずる前に、生成
される超過酸化物と過酸化物を除くのに十分な超過酸化
物ディスミューターゼ及びカタラーゼ活性をこの完全な
好気菌がもっていると示唆した。

本発明方法は、先行技術では提案も開示もされていない
添加電子キャリヤーの存在下における改良されたステロ
イド１−脱水素化による生物転化を表わしている。

添加された電子キャリヤーの存在下に、一つ又はそれ以
上の過酸化物スカベンジャー、又は超過酸化物ディスミ
ューターゼ及び過酸化物スカベンジャーを微生物による
ステロイド−１−脱水素性物転化反応に加えると、これ
まで知られた先行技術の最もよい方法で得られるものよ
り能率的な、1,2−飽和ステロイドから対応する1,2−デ
ヒドロ誘導体への転化が生ずる。この添加は、細胞と電
子キャリヤーとの、又はステロイド−１−デヒドロゲナ
ーゼと電子キャリヤーとの相互作用によって発生する毒
性酸素種のステロイド−１−デヒドロゲナーゼ活性に対
する有害な影響を防ぐ。本方法のより高い能率は、次の
ように示される。１）細胞乾燥重量ｇ当りに１−脱水素
化されるステロイド基質の量が多くなる。２）先行技術
の方法で可能な水準より高水準のステロイド基質が使え
る。３）生物転化反応の終わりに未転化で残る基質の量
が減少する。４）転化速度がより早い。また５）任意の
ステロイド分解性酵素の活性を排除するために特定的に
処理される酵素調製剤で行われるものを除き、生物転化
の望ましくない副生物の形成が減少する。正味の効果
は、先行技術方法によって得られるより高い収率で望ん
でいる生成物が本方法で得られ、より経済的な方法とな
っていることである。

微生物 本方法に使用できる微生物は、ステロイド類を１−脱水
素化することが知られ、この目的で先行特許の文献に記
述されている周知の多くの微生物の任意のものである。
このような微生物はチャーニー・ダブリュー（Charney,
W.）及びハーゾク・エッチ（Herzog,H.）（1967年）
『微生物によるステロイド類の転化』（アカデミック・
プレス社、ニューヨーク）に列挙されている。

知られている１−脱水素化微生物の例は、アースロバク
ター、コリネバクテリウム、ノカルディア（Nocardi
a）、ミコバクテリウム、ストレプトミセス（Streptomy
ces）、バクテリウム（Bacterium）、シュードモナス
（Pseudomonas）、バチルス（Bacillus）、セプトミク
サ（Septomyxa）、ジディメラ（Didymella）及びシリン
ドロカルボンを含めた広範囲の原核生物及び真核生物の
属に属する種である。

ステロイド類の１−脱水素化に広く用いられる細菌は、
合衆国特許第2,837,464号で明らかにされているアース
ロバクター・シンプレックス、ATCC6946である。下記の
多くの部分は、本発明方法を例示するためにこの微生物
を使用している。しかし、本方法はまた、添加電子キャ
リヤーと、発生する毒性酸素種に対する一つ乃至それ以
上の添加抑制剤の存在下にステロイド生物転化用の微生
物１−デヒドロゲナーゼ調製剤の任意の形を使用するこ
とを包含している。

ステロイド−１−デヒドロゲナーゼ生体触媒の調製手順 以下を含有する水性栄養培地中で微生物を生育させる。

ａ）生育用に窒素を提供するための硝酸塩又はアンモニ
ウム塩のような無機化合物類又は有機窒素化合物類（酵
母エキス、ペプトン，コーンスチープリカー等） ｂ）炭素及びエネルギー源、例えば炭水化物と糖誘導体
類、油、脂肪酸とそのメチルエステル、アルコール類、
アミノ酸類又は有機酸類。

ｃ）水道水又は（コーンスチープリカーのような）精製
度の低い培地成分によって供給される水準のナトリウ
ム、カリウム、マグネシウム、ホスフェート、サルフェ
ート、マンガン、銅、コバルト、モリブデン等のような
イオン類と痕跡量の元素。

生物は生育のために酵素を必要とする。生育の温度範囲
はA.シンプレックスの場合10〜45℃で、最適範囲は28〜
37℃である。A.シンプレックスに最適のpHは、ほぼ中性
である。アンドロスタ−４−エン−3,17−ジオン又はコ
ーチゾンアセテートのような1,2−飽和３−ケト−ステ
ロイド化合物を培地の0.005％（W/V）の水準又はそれ以
上で添加することによって、細胞のステロイド−１−デ
ヒドロゲナーゼ活性を誘発する。誘発剤を生育サイクル
中のどの時点で加えてもよい。ラード油のような栄養で
生育する培養基は、普通はステロイド−１−デヒドロゲ
ナーゼの合成を急速に始めるが、グルコースで生育する
培養基は酵素合成が起きる前にグルコースの消耗を必要
とする。

誘発剤添加後、６時間以上にわたる培養を勧めたい。1,
2−デヒドロゲナーゼ活性を含有する微生物を幾つかの
形の任意の形に使用して、望んでいるステロイド基質の
１−脱水素化を触媒させる。微生物菌体全部を醗酵液中
に直接使用できる。遠心分離、凝集及びろ過、又は限外
ろ過のような慣用手段によって、これらの同じ菌体を栄
養培地から回収・濃縮後、使用できる。単離された細胞
は約60％ないし約85％の含水量をもつ湿潤状態で使用で
き、また約１％ないし約30％の範囲の含水量になるまで
低級アルコール又はアセトンのようなアルカノンでの処
理、加熱による真空乾燥、凍結乾燥、加熱による空気乾
燥、又は噴霧乾燥によって乾燥できる。約１％ないし約
10％の含水量が好ましい。細胞を生物転化に使用するま
で５℃に保存するのが好ましい。『酵素学の方法』（Me
thods in Enzymology）,XLIV巻,11−317頁（1976年）
（アカデミック・プレス社、ニューヨーク）に記述され
たとおり、ポリアクリルアミド・ゲル及びコラーゲン内
への閉込めや高分子電解質キャリヤーへの細胞の共有結
合のような標準技術によって乾燥細胞を固定することに
より、活性のある乾燥細胞をつくることもできる。細胞
が異なるタイプの生物転化手順に用いられる時に、異な
る方法で集められ乾燥されるこれらの細胞は、ステロイ
ド−１−デヒドロゲナーゼ活性に明白な相違が見られる
が、過酸化物スカベンジャーの添加によって、この相違
を排除できる。

溶液の又は固定された酵素しての、細胞を含まない形の
ステロイド−１−デヒドロゲナーゼ活性を使用して１−
脱水素化としても、同様な結果が得られる。『一般微生
物学方法便覧』（Manual of Methods for General Bact
eriology）.367−370頁（1981年）アメリカ微生物学会
（ワシントンD.C.）に記述されたとおり、音波処理又は
加圧による破壊のような慣用技術によって、又はこの技
術で知られた他の方法によって、活性を微生物細胞から
放出させることができる。放出された活性はこの形で粗
製エキスとして使用できる。そのほか『酵素学の方法』
（Methods in Enzymology）第XXII巻（1971年）アカデ
ミック・プレス社（ニューヨーク）に記述されたような
標準的な生化学的蛋白質精製手順を使用して、更に精製
を達成できる。これらには、遠心分離、硫酸アンモニウ
ム沈澱、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、等電
処理などの組合わせが含まれる。

生物転化方法 生物転化は、添加された電子キャリヤーと、過酸化物ス
カベンジャー、又は超過酸化物ディスミューターゼと過
酸化物スカベンジャーのような一つ又はそれ以上の添加
された毒性酸素種スカベンジャーの存在下に、ステロイ
ド−１−デヒドロゲナーゼ活性を含有する調製剤をステ
ロイド基質に暴露することによって達成される。生物転
化は水系で又はゼロより大きく100％に満たない水と混
ざらない有機溶媒、例えばトルエン、キシレン、ベンゼ
ン、ヘプタン、酢酸ブチル、塩化メチレン等を含有する
混合系で実施できる。ステロイド−１−脱水素化を刺激
するため、またステロイド分解活性が予め排除されなか
った場合に調製剤中にこれらの活性を予防するために、
外因性の電子キャリヤーを加えると有利である。

有用な外因電子キャリヤーの例はメナジオン（２−メチ
ル−1,4−ナフトキノン）、メナジオン重亜硫酸塩、1,4
−ナフトキノン、フェナジンメトサルフェート、フェナ
ジンエトサルフェート、ビタミンＫ型化合物類等であ
る。１−脱水素化反応を改良するために、触媒量例えば
約2.5×10^-4Ｍないし約5.0×10^-3Ｍの電子キャリヤーを
加えるのが有利である。毒性酸素種スカベンジャーの添
加はより高水準の添加電子キャリヤーを使用する時に有
益な効果をもたらす。これらの効果は、特定量のステロ
イドを転化する際のより少量のステロイド−１−デヒド
ロゲナーゼ使用、よりよい長期反応速度、より低い最終
残留物、より高水準の基質使用等を包含する。スカベン
ジャーを省略する場合、より高濃度の電子キャリヤーを
使用すると反応が有害な影響を受ける。

毒性酸素種スカベンジャーを反応開始時に生物転化混合
物に加えるのが有利である。スカベンジャーの作用の仕
方は、有害な酸素種を排除するか又は酸素種を安定化さ
せて酵素をあまり攻撃しないようにするものである。有
害な酸素種（即ち毒性酸素種）は過酸化水素、超過酸化
物アニオン、ヒドロキシルラジカル、１重項酸素（sing
let oxygen）等を包含する。スカベンジャーは有機性の
もの、例えば酵素カタラーゼ、ペルオキシターゼ及び超
過酸化物ディスミューターゼ、又は毒性酸素種安定化剤
のマンニトール、α−トコフェロール（ビタミンＥ）、
尿素及びキニンサルフェート；又は白金その他の金属触
媒のような無機性のものでありうる。使用のスカベンジ
ャーと好ましい使用水準は経済的配慮によって決定でき
る。カタラーゼは、転化されるステロイドのｇ当り約10
0ないし約10,000単位の範囲で使用できる。１単位はpH
7、25℃で毎分１μモルのH₂O₂を分解する酵素量として
記述される。一方、H₂O₂濃度は反応混合物ml当り10.3な
いし9.2μモルの範囲にある。

ステロイド類の１−脱水素化に使用される反応混合物は
５−45℃の温度範囲で０−７日間培養される。培養中、
混合物は分子状酸素に近付けるようにして、かきまぜる
のが好ましい。１−脱水素化の速度は、典型的には時間
と共に減少する。生物転化は約５ないし約60g/lの範囲
の基質水準を使用して２日に満たないうちに90−100％
まで進めることができる。基質：細胞水準は、細胞乾燥
重量ｇ当り基質約２ないし約25gの範囲でありうる。

本発明の実施に有用な化合物類は、３−ケト−Δ⁴−ア
ンドロステン及び３−ケト−Δ⁴−プレグネン系のステ
ロイド類に属する。１−デヒドロゲナーゼ用のステロイ
ド基質はＡ環のC1とC2との間に飽和をもち、Ａ環の３−
位置にヒドロキシル又はケト基をもつであろう。アンド
ロステン系の成員は以下を包含する。

１）アンドロスト−４−エン−3,17−ジオン、及び ２）アンドロスト−4,9（11）−ジエン−3,17−ジオ
ン、11−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−3,17−ジ
オン及びそれらの６α−フルオロ、６α−メチル又は16
−メチル誘導体類。

使用できる３−ケト−Δ⁴−プレグネン系のステロイド
類には次のものがある。

1.17α−ヒドロキシプレグナ−４−エン−20−イン−３
−オンとその16−メチル誘導体類。

2.11β,21−ジヒドロキシ−プレグナ−4,17（20）−ジ
エン−３−オン及びその６α−メチル誘導体 3.20−クロロ−プレグナ−4,9（11）,17（20）−トリエ
ン−21−アール−３−オン。

4.以下を含む3,20−ジケト−Δ⁴−プレグネン類の幾つ
かの群。

ａ）ハイドロコーチゾンとその６α−メチル誘導体類の
ような11,17,21−トリヒドロキシ化合物類 ｂ）９β,11β−エポキシ−17,21−ジヒドロキシ−16β
−メチル−プレグナ−４−エン−3,20−ジオンのような
９β,11β−エポキシ−17,21−ジヒドロキシ化合物類。

ｃ）17α,21−ジヒドロキシ−プレグナ−4,9（11）−ジ
エン−3,20−ジオンとその16α−メチル、16β−メチル
又は16α−ヒドロキシ誘導体類又は17α−アセテートエ
ステルのような3,20−ジケト−4,9（11）−プレグネジ
エン類。

ｄ）21−ヒドロキシ−プレグナ−4,9（11）,16−トリエ
ン−3,20−ジオンとその６α−フルオロ誘導体のような
3,20−ジケト−4,9（11）,16−プレグネトリエン類。

21−ヒドロキシル基（＃２と＃４）を含有するステロイ
ド類の21−エステル誘導体類も基質として役立つ。好ま
しい21−エステル類は、低級脂肪族酸類例えば酢酸と、
単環式カルボン酸類、例えば安息香酸のような低級アル
キル又はアリール基からなる。

生物転化に用いられる手順のタイプと酵素調製剤、ステ
ロイド基質、電子受容体及び過酸化物スカベンジャーの
妥当な水準は、脱水素化されるステロイドに分子の性質
によって変わり、当業者によって決定できる。以下は、
添加された電子キャリヤーと一つないしそれ以上の添加
された毒性酸素種スカベンジャーの存在下に、ステロイ
ド類を効率的に１−脱水素化するために使用できる種々
の生物転化手順の一般的な例として提供されている。

醗酵生物転化 実質的な細胞成長とステロイド−１−デヒドロゲナーゼ
の誘発が生じた後、毒性酸素種スカベンジャー、電子キ
ャリヤー及びステロイド基質を醗酵容器に加える。電子
キャリヤーは、１−デヒドロゲナーゼ活性を刺激し、又
はステロイドの分解を防ぐために添加でき、またステロ
イド−１−デヒドロゲナーゼ活性のためにキャリヤーを
必要としないような、生物転化に望ましくない生成物に
分解するのを防ぐために添加できる。ステロイド及び／
又は電子キャリヤーは、乾燥粉末として、水性スラリ
ー、水に混ざる溶媒、例えばエタノール、メタノール、
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセト
ン等中の溶液又はスラリーとして添加できる。A.シンプ
レックスで触媒された転化に好ましい電子キャリヤー
は、触媒量で添加されたナフトキノン、例えば２−メチ
ル−1,4−ナフトキノンである。ステロイド水準はリットル
当り約５ないし約50gの範囲で変わる。反応終了時の未
転化基質の率は、基質水準が上がるにつれて高くなる。
最適水準は、生成物を後続化学段階に使用する時に許容
できる出発材料の量によって部分的に決定される。ステ
ロイド混合物と醗酵ブロスの起泡性も最適基質濃度を決
定する助けになる。消泡剤又は脱泡剤、例えばラード
油、シリコーン及びポリアルキレングリコールを添加す
ると、泡の発生を調節でき、またステロイドを懸濁させ
る助けにもなる。

単離された調製剤を用いた水系での生物転化 ステロイド−１−デヒドロゲナーゼ活性をもつ調製剤、
ステロイド、電子キャリヤー及びスカベンジャーを、pH
6ないしpH10の範囲の約0.01Mないし約2Mの緩衝された水
溶液に懸濁させる。成分の添加順序は、反応に悪影響を
及ぼさずに変えることができる。活性調製剤は、単離さ
れた湿った細胞、乾燥細胞、固定された細胞、又は細胞
を含まない酵素系でありうる。細胞同等物の量はリットル当
り約0.1ないし約50g乾燥重量の範囲にある。ステロイド
を約0.05ないし約15の重量比（ステロイド：細胞）で加
える。約15−50g/リットルのステロイドで約2.0gないし約25
gの細胞水準が好ましい。ステロイド基質は、乾燥粉末
や水性スラリーとして添加でき、又はジメチルホルムア
ミド、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノー
ル、アセトン等のような水と混ざる有機溶媒中に溶解
（又は懸濁）させることができる（最終容量の５％ま
で）。ステロイド懸濁の助けとして、表面活性剤例えば
ツウィーン80を低濃度で、例えば約0.5ないし約５％で
添加できる。電子キャリヤーは、例えばメナディオン、
1,4−ナフトキノン、フェナジンメトサルフェートを粉
末か水性スラリーとして添加するか、又は水と混ざる有
機溶媒に溶解できる。毒性酸素種スカベンジャーは反応
開始時に添加されるのが好ましい。本方法に見られる改
良の程度は、使用酵素調製剤のタイプ、基質：細胞比
（好ましくは約2:1以上）及び／又は触媒として使用さ
れる電子キャリヤーの水準に著しく影響される。

水と混ざらない溶媒の存在下における生物転化 水と混ざらない溶媒は水和されたステロイド−１−デヒ
ドロゲナーゼ活性剤へステロイド基質や電子キャリヤ
ー、毒性酸素種スカベンジャーと一緒に添加できる。こ
の溶媒は、ステロイド基質と生成物の一部又は全部を溶
解するのに十分な量で添加できる。この変法は、単離さ
れた湿った細胞、固定された細胞、細胞を含まない酵素
又は固定された酵素と共に醗酵液中に使用できる。水と
混ざらない溶媒の存在下に行われる生物転化の反応速度
は、かきまぜ力の強力な関数である。従って、できるだ
け強いかきまぜ力で生物転化混合物を混ぜるべきであ
る。

生物転化生成物と未転化基質は既述の混合物から慣用手
段によって回収できる。ステロイド類は典型的にはろ過
に続いてフィルターケーキをアセトン又は塩化メチレン
のような有機溶媒で抽出することによって回収される。
その代わりに、全生物転化混合物を酢酸ブチルや塩化メ
チレンのような水と混ざらない溶媒と混合することによ
って抽出できる。次に生成物を有機溶媒から単離する。

1,2−デヒドロステロイド類の有用性はよく知られてい
る。例えば合衆国特許第3,284,447号は炭素16が置換さ
れた利尿性コーチコステロイド類の合成におけるΔ
^1,4,9,(11)プレグネトリエン類の有用性を明らかにして
いる。合衆国特許第4,041,055号は医学的に有用なステ
ロイド類の製造においてΔ^1,4−アンドロステンジオン
その他の重要な中間体からコーチコステロイドを合成す
る方法を明らかにしている。

以下は先行技術の方法に対する本発明方法の優秀性を示
す特定的な実施例である。

実施例１ A.シンプレックスによるアンドロスト−4.9（11）−ジ
エン−3,17−ジオンの醗酵生物転化。

ａ）生物触媒の調製：コーンスチープリカ−20g/l及び
ラード油＃２（pH7.0）15g/lを含有する培地中でアース
ロバクター・シンプレックス（ATCC 6946）を生育させ
る。回転振蕩機上で28℃、２日間培養後、コーチゾンア
セテート（0.15g/l）を加えて、ステロイド−１−デヒ
ドトゲナーゼ活性を誘発させる。

ｂ）生物転化：翌日、アンドロスト−4,9（11）−ジエ
ン−3,17−ジオンをフラスコに種々の水準で加える。あ
るフラスコにはメナジオン及び／又はカタラーゼを添加
する。生物転化は塩化メチレン抽出液の薄層クロマトグ
ラフィによって監視される。3.5g/lのステロイドのみを
含有する生物転化混合物は劣った１−脱水素化を示す。
１日の培養後、基質の約10％は1,2−デヒドロ生成物
へ、約５％は他の生成物へ転化されていた。第４日まで
に残った1,2−デヒドロ生成物は５％未満となり、ステ
ロイドの約10ないし20％は３種ないしそれ以上の望まし
くない極性ステロイド生成物として生じた。ステロイド
基質（3.5g/l）とメナジオン（５×10^-4Ｍ）を含有する
生物転化混合物は１−脱水素化生成物として存在する全
ステロイドの約50％を蓄積する。しかし反応はそれ以上
の培養によって完了まで進まず、程度は少ないがステロ
イドの分解が更に見られる。カタラーゼ（10mg/l,16,00
0単位／リットルに相当するシグマ生成物Ｃ−10）、メナジ
オン（５×10^-4Ｍ）及び基質（10g/l）を含有する生物
転化混合物に順調な転化が見られる。転化は22時間終了
で約83％、46時間終了で約95％である。この反応中、有
意の分解生成物は薄層クロマトグラフィによって検出で
きない。カタラーゼとステロイドを含有する対照群は、
醗酵液とステロイドからなる混合物のそれと同様な転化
率を示す。

実施例２ A.シンプレックスによる11β−ヒドロシキ−アンドロス
テンジオン（11βOH−AD）の醗酵生物転化 ａ）生物触媒の調製:pH7.0でそれぞれ6g/lのグルコー
ス、コーンスチープリカー及びバクトペプトン（ディフ
コ製）を含有する培地中で、アースロバクター・シンプ
レックス（ATCC 6946）を振蕩フラスコ内で生育させ
る。培養基を28℃の回転振蕩機上で、グルコースがなく
なるまで培養する。この時点で、ステロイド−１−デヒ
ドロゲナーゼ合成を誘発するためにコーチゾンアセテー
ト（0.1g/l）を加える。

ｂ）生物転化：一夜培養後、各フラスコにステロイド11
βOH−ADを10g/lの水準で加える。対照フラスコはそれ
以上の添加を受けない。実験フラスコには、メナジオン
（５×10^-4Ｍ）及びカタラーゼ（10mg/l、16,000単位／
リットルに相当するシグマ生成物Ｃ−10）を加える。生物転
化混合物を28℃の回転振蕩機上で培養する。既知量の試
料を２倍量の塩化メチレンで抽出することによって生物
転化を監視する。塩化メチレン抽出液の１試料を酢酸エ
チル：ヘプタン（1:1）系での薄層クロマトグラフィに
かける。転化の進行は適当なステロイド基準との比較に
よって推定される。

結果 実施例３ 乾燥細胞の調製：セレロース、ペプトン及びコーンスチ
ープリカー各6g/lの培地（pH7.0）を含有する振蕩フラ
スコにアースロバクター・シンプレックス（ATCC 694
6）を接種する。培養基を28℃の回転振蕩機上で、グル
コースがなくなるまで培養する。この時点でコーチゾン
・アセテート（0.5g/l）を加え、フラスコを更に16時間
培養する。遠心分離によって細胞を収穫し、水で２回洗
ってか、減圧下に45℃で乾燥するまで乾燥炉に入れた。

ハイドロコーチゾンからプレドニソロンへの生物転化 乾燥細胞を500ml三角フラスコ中の50mM燐酸緩衝液に0.0
5g/l濃度まで再懸濁する。基質をジメチルホルムアミド
（DMF）溶液（100mgハイドロコーチゾン/ml DMF）とし
て0.5g/lの最終生物転化濃度まで添加する。メナジオン
をエタノール溶液（8.6mg/mlエタノール）として、最終
反応混合物100ml当り0.5mlの水準でフラスコに添加す
る。全フラスコの反応混合物の全容量は100mlであり、5
0mM燐酸緩衝液の添加によって容量のすべての調整を行
なう。カタラーゼはシグマ・ケミカル・カンパニーから
購入でき、この調製剤の酵素活性は2300単位/mgであ
る。

カタラーゼ（2300単位）をフラスコＡに加え、この酵素
を含まないフラスコＢと比較する。これが二つの生物転
化の唯一の差である。混合物をかきまぜながら28℃で培
養する。23時間培養後、フラスコＡのハイドロコーチゾ
ンの約69％はプレドニソロンへ生物転化される。同じ時
間にフラスコＢのハイドロコーチゾンは約42％しかプレ
ドニソロンへ転化されない。この結果は、酵素カタラー
ゼ添加が生ずる生成物の約27％増加によって生物転化法
を改良することを示している。プレドニソロンは慣用方
法によって回収される。合衆国特許第3,065,146号で明
らかにされたバクテリウム・サイクロオキシダンス（Ba
cterium cyclooxydans）を本実施例のアースロバクター
・シンプレックスの代わりに使用して、比肩する結果が
得られる。

実施例４ 実施例１のとおりに細胞を生育させる。遠心分離又はフ
ィルター助剤の存在下におけるろ過によって活性細胞を
収穫する。湿った細胞ケーキを約３ないし約５％の含水
量まで加熱乾燥する。乾燥細胞を50mM燐酸カリウム緩衝
液（pH7.5）に再懸濁し、20分かきまぜてから500ml三角
フラスコ中の100ml量ずつ分配する。メナジオンをエタ
ノール溶液として５×10^-4Ｍの最終濃度まで加える。カ
タラーゼをフラスコの半数に10mg/l（約16,000単位／リッ
トル）の水準で加える。アンドロスト−4,9（11）−ジエ
ン−3,17−ジオン（10g/l）を乾燥粉末として加える。
フラスコを回転振蕩機上で28℃で培養する。生物転化混
合物の試料を塩化メチレンで抽出する。乾燥抽出液をガ
スクロマトグラフィで検定し、反応の進行を測定する。

結果 実施例５ A.シンプレックスの乾燥細胞を50mM燐酸カリウム緩衝液
（pH7.5）に乾燥遠心分離ケーキ5g/lの水準で20分間再
懸濁させる。細胞懸濁液100ml量を500ml三角フラスコに
入れる。次表に示すように、メナジオンとカタラーゼを
フラスコに加える。16β−メチル−アンドロスト−4,9
（11）−ジエン−3,17−ジオンを微粉末として15g/lの
水準で添加する。フラスコを回転振蕩機上で31℃で培養
する。試料を塩化メチレンで抽出する。これらの抽出液
をガスクロマトグラフィにより、ステロイド含有量につ
いて分析する。

結果 実施例６ A.シンプレックスの乾燥細胞を実施例４に記述されたと
おりに再懸濁しフラスコに分配する。最終細胞水準は、
乾燥細胞ケーキ約1.5g/lに等しい。各フラスコにカタラ
ーゼ5mg（8000単位）を加える。メナジオン８・6/10mg
をエタノール溶液として各フラスコに加える。基質（16
β−メチル−Δ^9,11−アンドロステンジオン）を乾燥粉
末で加え20g/lの水準とする。超過酸化物ディスミュー
ターゼ（蛋白質mg当り約3000単位をもつシグマ製品S825
4）を１フラスコに3mg/lの水準で加える。他のフラスコ
は超過酸化物ディスミューターゼを加えていない。フラ
スコを回転振蕩機上、31℃で培養する。試料を規則的間
隔で採取し、塩化メチレンで抽出し生物転化の進行につ
いて検定する。

結果 実施例７ 反応容器（１リットル基盤）に次の材料を一緒にする。

ａ）50mM KPO₄緩衝液（pH＝7.5）0.68リットル。

ｂ）A.シンプレックス乾燥細胞6.4g。

ｃ）メナジオン0.32g。

ｄ）牛肝臓カタラーゼ13mg（2000I.U./mg）。

ｅ）アンドロスト−4,9（11）−ジエン−3,17−ジオン3
2g。

ｆ）トルエン0.320リットル。

反応混合物を毎分リットル当り15カロリーでかきまぜる。反
応容器のガス空間で３％より高い酸素水準を維持するた
め、反応容器に空気を加える。温度を28℃±１℃に調節
する。反応を47時間行ない、この間にトルエン相を生物
転化混合物から集める。本実施例の場合、トルエン相の
ステロイド組成は約99.9％が生成物（アンドロスト1,4,
9（11）−トリエン−3,17−ジオン）であり、0.1％が未
転化基質（アンドロスト−4,9（11）−ジエン−3,17−
ジオン）である。

実施例８ 別個の振蕩フラスコ３本中で次の材料を一緒にする。

ａ）50mM KPO₄緩衝液（pH＝7.5）23ml。

ｂ）A.シンプレックス乾燥細胞0.04g。

ｃ）3Aアルコール中50mMメナジオン0.25ml。

これらの混合物に次の添加を行なった。

振蕩フラスコ＃１−添加なし。

振蕩フラスコ＃２−カタラーゼ（2000 I.U./mg） 0.167mg。

振蕩フラスコ＃３−炭素上の５％白金2mg。

各フラスコにアンドロスト−4,9（11）−ジエン−3,17
−ジオン（0.2g）とトルエン2mlを加える。フラスコを
室温で３日間かきまぜる。

３日間の培養後、各フラスコの内容物とトルエン23mlを
一緒にする。抽出液を集め、分析する。

実施例９ コーンスチープリカー20g/lとラード油15g/lを含む培地
（pH7.0）中でアースロバクター・シンプレックス細胞
を生育させる。培養基を28℃で約26時間培養しコーチゾ
ンアセテートを0.15g/lの水準で加える。培養を約18時
間続ける。遠心分離によって細胞を醗酵液から分離す
る。得られる細胞ペレットを0.05M燐酸カリウム緩衝液
（pH7.5）に、醗酵液中の元の濃度の２分の１まで再懸
濁する。ステロイド基質のアンドロスト−4,9（11）−
ジエン−3,20−ジオンをフラスコに乾燥粉末として10g/
lの水準で加える。一方のフラスコ（Ａ）には、それ以
上添加しない。他方（Ｂ）にはステロイドのほか、メナ
ジオン8.6gとカタラーゼ1600単位を加える。５時間培養
後、フラスコＡは1,2−デヒドロ生成物約５％を蓄積し
ていた。フラスコＢのステロイドは1,2−デヒドロ生成
物約95％と未転化基質約５％との混合物からなってい
る。フラスコＡの培養を続けると、1,2−デヒドロ生成
物約10％の蓄積及び他の望ましくない分解生成物の検出
可能な水準を生ずる。フラスコＢの培養を続けると、そ
れ以上の生成物を生じないが、検出可能な分解生成物は
観察されない。

実施例10 実施例３のハイドロコーチゾン、実施例１、７又は９の
アンドロスト−4,9（11）−ジエン−3,17−ジオン又は
実施例６の16β−メチル−Δ^4,9,11−アンドロステンジ
オンの代わりに次の一覧表の基質を使用して、対応する
一覧表の生成物が得られる。

基質 1.アンドロスト−４−エン−3,17−ジオン。

2.6α−フルオロ−アンドロスト−4,9（11）−ジエン−
3,17−ジオン。

3.6α−メチル−アンドロスト−4,9（11）−ジエン−3,
17−ジオン。

4.16α−メチル−アンドロスト−4,9（11）−ジエン−
3,17−ジオン。

5.17α−ヒドロキシプレグナ−４−エン−20−イン−３
−オン。

6.17α−ヒドロキシプレグナ−4,9（11）−ジエン−20
−イン３−オン。

7.17α−ヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−4,9（1
1）−ジエン−20−イン−３−オン。

8.11β,21−ジヒドロキシ−プレグナ−4,17（20）−ジ
エン−３−オン。

9.21−アセトキシ−11β−ヒドロキシ−プレグナ−4,17
（20）−ジエン−３−オン。

10.6α−メチル−11β,21−ジヒドロキシ−プレグナ−
4,17（20）−ジエン−３−オン。

11.20−クロロ−プレグナ−4,9（11）,17（20）−トリ
エン−21−アール−３−オン。

12.ハイドロコーチゾン。

13.6α−メチルハイドロコーチゾン。

14.21−アセトキシ−11β,17−ジヒドロキシ−16β−メ
チル−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン 15.21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β,17−ジヒド
ロキシ−16β−メチル−プレグナ−４−エン−3,20−ジ
オン。

16.21−アセトキシ−９β,11β−エポキシ−17−ヒドロ
キシ−16β−メチル−プレグナ−４−エン−3,20−ジオ
ン。

17.21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−プレグナ−4,9
（11）−ジエン−3,20−ジオン。

18.21−アセトキシ−16α,17−ヒドロキシ−プレグナ−
4,9（11）−ジエン−3,20−ジオン。

19.21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−16α−メチル−
プレグナ−4,9（11）−ジエン−3,20−ジオン 20.21−ベンゾイロキシ−17−ジヒドロキシ−16β−メ
チル−プレグナ−4,9（11）−ジエン−3,20−ジオン 21.21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−16β−メチル−
プレグナ−4,9（11）−ジエン−3,20−ジオン 22.21−アセトキシ−プレグナ−4,9（11）,16−トリエ
ン−3,20−ジオン。

23.21−アセトキシ−６α−フルオロ−プレグナ−4,9
（11）,16−トリエン−3,20−ジオン。

24.21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β,16α,17−
トリヒドロキシ−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン。

25.21−アセトキシ−６α,9α−ジフルオロ−11β,16
α,17−トリヒドロキシ−プレグナ−４−エン−3,20−
ジオン−16,17−アセトニド。

26.21−アセトキシ−６α−フルオロ−11β−ヒドロキ
シ−16α−メチル−プレグナ−４−エン−3,20−ジオ
ン。

27.21−アセトキシ−６α−フルオロ−11β,17−ジヒド
ロキシ−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン 28.21−アセトキシ−６α,9α−ジフルオロ−11β,17−
ジヒドロキシ−16α−メチル−プレグナ−４−エン−3,
20−ジオン。

29.21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β,16α,17−
トリヒドロキシ−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン−
16,17−アセトニド。

30.21−アセトキシ−９β,11β−エポキシ−６α−フル
オロ−16α,17−ジヒドロキシ−プレグナ−４−エン−
3,20−ジオン−16,17−アセトニド。

31.21−アセトキシ−９β,11β−エポキシ−16α−ヒド
ロキシ−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン。

32.21−アセトキシ−９β,11β−エポキシ−16α17−ジ
ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン−16,1
7−アセトニド。

生成物 1aアンドロスト−1,4−ジエン−3,17−ジオン。

2a6α−フルオロ−アンドロスト−1,4,9（11）−トリエ
ン−3,17−ジオン。

3a6α−メチル−アンドロスト−1,4,9（11）−トリエン
−3,17−ジオン。

4a16β−メチル−アンドロスト−1,4,9（11）−トリエ
ン−3,17−ジオン。

5a17α−ヒドロキシプレグナ−1,4−ジエン−20−イン
−３−オン。

6a17α−ヒドロキシプレグナ−1,4,9（11）−トリエン
−20−イン−３−オン。

7a17α−ヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−1,4,9
（11）−トリエン−20−イン−３−オン 8a11β,21−ジヒドロキシ−プレグナ−1,4,17（20）−
エン−３−オン。

9a21−アセトキシ−11β−ヒドロキシ−プレグナ−1,4,
17（20）−トリエン−３−オン及び11β,21−ジヒドロ
キシ−プレグナ−1,4,17（20）−トリエン−３−オン。

10a6α−メチル−11β,21−ジヒドロキシ−プレグナ−
1,4,17（20）−トリエン−３−オン。

11a20−クロロ−プレグナ−1,4,9（11）,17（20）−テ
トラエン−21−アール−３−オン。

12aプレドニソロン。

13a16α−メチル−プレドニソロン。

14a21−アセトキシ−11β,17−ジヒドロキシ−16β−メ
チル−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン及び 11β,17,21−トリヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ
−1,4−ジエン−3,20−ジオン。

15a21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β,17−ジヒド
ロキシ−16β−メチル−プレグナ−1,4−ジエン−3,20
−ジオン及び ９α−フルオロ−11β,17,21−トリヒドロキシ−16β−
メチル−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン。

16a21−アセトキシ−９β,11β−エポキシ−17−ヒドロ
キシ−16β−メチル−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−
ジオン及び ９β,11β−エポキシ−17,21−ジヒドロキシ−16β−メ
チル−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン。

17a21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−プレグナ−1,4,9
（11）−トリエン−3,20−ジオン及び 17,21−ジヒドロキシ−プレグナ−1,4,9（11）−トリエ
ン−3,20−ジオン。

18a21−アセトキシ−16α,17−ジヒドロキシ−プレグナ
−1,4,9（11）−トリエン−3,20−ジオン及び 16α,17,21−トリヒドロキシ−プレグナ−1,4,9（11）
−トリエン−3,20−ジオン。

19a21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−16α−メチル−
プレグナ−1,4,9（11）−トリエン−3,20−ジオン及び 17,21−ジヒドロキシ−16α−メチル−プレグナ−1,4,9
（11）−トリエン−3,20−ジオン。

20a21−ベンゾイロキシ−17−ヒドロキシ−16β−メチ
ル−プレグナ−1,4,9（11）−トリエン−3,20−ジオ
ン。

21a21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−16β−メチル−
プレグナ−1,4,9（11）−トリエン−3,20−ジオン及び 17,21−ジヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−1,4,9
（11）−トリエン−3,20−ジオン。

22a21−アセトキシ−プレグナ−1,4,9（11）,16−テト
ラエン−3,20−ジオン及び 21−ヒドロキシ−プレグナ−1,4,9（11）,16−テトラエ
ン−3,20−ジオン。

23a21−アセトキシ−６α−フルオロ−プレグナ−1,4,9
（11）,16−テトラエン−3,20−ジオン及び６α−フル
オロ−21−ヒドロキシ−プレグナ−1,4,9（11）,16−テ
トラエン−3,20−ジオン。

24a21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β,16α,17−
トリヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオ
ン及び ９α−フルオロ−11β,16α,17,21−テトラヒドロキシ
−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン。

25a21−アセトキシ−６α,9α−ジフルオロ−11β,16
α,17−トリヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20
−ジオン−16,17−アセトニド及び ６α,9α−フルオロ−11β,16α,17,21−テトラヒドロ
キシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン−16,17−
アセトニド 26a21−アセトキシ−６α−フルオロ−11β−ヒドロキ
シ−16α−メチル−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジ
オン及び６α−フルオロ−11β,21−ジヒドロキシ−16
α−メチル−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン 27a21−アセトキシ−６α−フルオロ−11β,17−ヒドロ
キシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン及び ６α−フルオロ−11β,17,21−トリヒドロキシ−1,4−
ジエン−3,20−ジオン。

28a21−アセトキシ−６α,9α−ジフルオロ−11β,17−
ジヒドロキシ−16α−メチル−プレグナ−1,4−ジエン
−3,20−ジオン及び ６α,9α−ジフルオロ−11β,17,21−トリヒドロキシ−
1,4−ジエン−3,20−ジオン。

29a21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β,16α,17−
トリヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオ
ン−16,17−アセトニド。

30a21−アセトキシ−９β,11β−エポキシ−６α−フル
オロ−16α,17−ジヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジエン
−3,20−ジオン−16,17−アセトニド。

31a21−アセトキシ−９β,11β−エポキシ−16−ヒドロ
キシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン及び ９β,11β−エポキシ−16α,21−ジヒドロキシ−プレグ
ナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン。

32a21−アセトキシ−９β,11β−エポキシ−16α,17−
ジヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン
−16,17−アセトニド。

その他の基質及び生成物は以下のとおりである。

基質→生成物 （１）11β−ヒドロキシ−16β−メチル−アンドロスト
−４−エン−3,17−ジオン→11β−ヒドロキシ−16β−
メチル−アンドロスト−1,4−ジエン−3,17−ジオン。

（２）11β−ヒドロキシ−16α−メチル−アンドロスト
−４−エン−3,17−ジオン→11β−ヒドロキシ−16α−
メチル−アンドロスト−1,4−ジエン−3,17−ジオン。

（３）６α−フルオロ−11β−ヒドロキシ−アンドロス
ト−４−エン−3,17−ジオン→６α−フルオロ−11β−
ヒドロキシ−アンドロスト−1,4−ジエン−3,17−ジオ
ン。

（４）６α−メチル−11β−ヒドロキシ−アンドロスト
−４−エン−3,17−ジオン→６α−メチル−11β−ヒド
ロキシ−アンドロスト−1,4−ジエン−3,17−ジオン。

（５）11α−ヒドロキシ−アンドロスト−４−エン−3,
17−ジオン→11α−ヒドロキシ−アンドロスト−1,4−
ジエン−3,17−ジオン。

（６）アンドロスト−４−エン−3,11,17−トリオン→
アンドロスト−1,4−ジエン−3,11,17−トリオン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シエリル・リン・ヘンダ−ソン アメリカ合衆国ミシガン州ポ−ルテ−ジ・ サイプレス6942 (56)参考文献 特開 昭57−170196（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−170197（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，20 （1978）Ｐ．17−25

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】添加された電子キャリアーと、カタラー
   ゼ、スーパーオキシドディスムターゼ及び白金からなる
   群から選択される一又はそれ以上の添加された毒性酸素
   種スカベンジャーとの存在下に、アルスロバクターシン
   プレックス又はバクテリウムシクロオキシダンスからの
   ステロイド−１−デヒドロゲナーゼ活性を含む調整剤
   に、1,2−飽和３−ケトステロイドを暴露することから
   なる、1,2−飽和３−ケトステロイド類を1,2−デヒドロ
   ３−ケトステロイド類へ転化する方法。
2. 【請求項２】添加された毒性酸素種のスカベンジャーが
   スーパーオキシドディスムターゼである第１項の方法。