JPH0570493A - ヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ）関連免疫調製物 - Google Patents
ヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ）関連免疫調製物Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）株の新しい
分類方法を提供し、この分類法に基づきＨＩＶ感染を予
防するワクチン等に有効なペプチド調製物、さらにＨＩ
Ｖ感染の予防・治療に有効な抗体調製物を提供する。 【構成】 ＨＩＶの持つＰＮＤアミノ酸配列からＧＯＲ
法（ロブソンらの蛋白質二次構造解析法）によって予測
されるＰＮＤ領域の蛋白質二次構造に基づき、数多いＨ
ＩＶ変異株の分類を行って６つのグループに分け、その
うち主要なグループＩからグループＶの中の少なくとも
２つのグループからＰＮＤペプチドもしくは抗ＰＮＤ特
異中和抗体を選択することにより、ＨＩＶ感染に有効な
免疫用抗原およびＨＩＶ感染予防用または治療用に有用
なペプチド調製物および中和抗体調製物を得る。
分類方法を提供し、この分類法に基づきＨＩＶ感染を予
防するワクチン等に有効なペプチド調製物、さらにＨＩ
Ｖ感染の予防・治療に有効な抗体調製物を提供する。 【構成】 ＨＩＶの持つＰＮＤアミノ酸配列からＧＯＲ
法（ロブソンらの蛋白質二次構造解析法）によって予測
されるＰＮＤ領域の蛋白質二次構造に基づき、数多いＨ
ＩＶ変異株の分類を行って６つのグループに分け、その
うち主要なグループＩからグループＶの中の少なくとも
２つのグループからＰＮＤペプチドもしくは抗ＰＮＤ特
異中和抗体を選択することにより、ＨＩＶ感染に有効な
免疫用抗原およびＨＩＶ感染予防用または治療用に有用
なペプチド調製物および中和抗体調製物を得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は一般にウイルス感染の予
防、治療及び診断に有効な免疫調製物、さらに詳しく
は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染に対する予防、
治療及び診断に有効な特異的抗体またはペプチドからな
る免疫調製物、ならびにＨＩＶ株の判別法に関する。
防、治療及び診断に有効な免疫調製物、さらに詳しく
は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染に対する予防、
治療及び診断に有効な特異的抗体またはペプチドからな
る免疫調製物、ならびにＨＩＶ株の判別法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、後天
性免疫不全症候群（AIDS:エイズ）及びエイズ関連症候
群（ARC）等の一連の疾患を引き起こすヒトレトロウイ
ルスであり、その感染地域はほぼ全世界におよんでい
る。一般的なウイルス感染症の免疫学的予防と治療にお
いて中心的な役割を果たすのは、それぞれウイルスの感
染防御領域を抗原とするワクチンであり、その領域を認
識する中和抗体である。しかしＨＩＶに関してはそのい
ずれも実用化の段階に至っていない。その原因は、ＨＩ
Ｖの感染防御領域（env、gp120等）が非常に変異を引き
起こしやすいことにある。そしてそれは、ＨＩＶのもつ
エラーを起こし易い逆転写酵素（RT,リバーストランス
クリプターゼ）に起因する。それ故にＨＩＶは、結果的
にヒトの免疫系による排除機構からうまく逃れ、感染を
持続すると考えられる。現在のエイズ治療の中心はＡＺ
Ｔ（アジドチミジン）に代表される抗ウイルス剤による
ものであるが、副作用及び薬剤耐性株出現が問題になり
つつある。そして非感染個体への感染を防御するワクチ
ンの開発及び治療薬としてのウイルス中和抗体、そして
それらの中和抗体を直接測定できる診断薬の開発が待ち
望まれている。
性免疫不全症候群（AIDS:エイズ）及びエイズ関連症候
群（ARC）等の一連の疾患を引き起こすヒトレトロウイ
ルスであり、その感染地域はほぼ全世界におよんでい
る。一般的なウイルス感染症の免疫学的予防と治療にお
いて中心的な役割を果たすのは、それぞれウイルスの感
染防御領域を抗原とするワクチンであり、その領域を認
識する中和抗体である。しかしＨＩＶに関してはそのい
ずれも実用化の段階に至っていない。その原因は、ＨＩ
Ｖの感染防御領域（env、gp120等）が非常に変異を引き
起こしやすいことにある。そしてそれは、ＨＩＶのもつ
エラーを起こし易い逆転写酵素（RT,リバーストランス
クリプターゼ）に起因する。それ故にＨＩＶは、結果的
にヒトの免疫系による排除機構からうまく逃れ、感染を
持続すると考えられる。現在のエイズ治療の中心はＡＺ
Ｔ（アジドチミジン）に代表される抗ウイルス剤による
ものであるが、副作用及び薬剤耐性株出現が問題になり
つつある。そして非感染個体への感染を防御するワクチ
ンの開発及び治療薬としてのウイルス中和抗体、そして
それらの中和抗体を直接測定できる診断薬の開発が待ち
望まれている。
【０００３】単クローン性抗体、又は合成ペプチド免疫
血清を用いた中和試験等によって決定された現在最も有
望なＨＩＶの感染防御領域は，ＰＮＤ（Principal Neut
ralizing determinant）と呼ばれるｅｎｖ蛋白（gp12
0）のアミノ酸配列303-338付近に相当するCys〜Cysに挟
まれた領域である［K.Javaherianら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 86, 6768-6772 (1989)］。１３３名のＨＩ
Ｖ感染者から単離された２４５のウイルス株について、
このＰＮＤ領域のアミノ酸配列を調べた結果、この領域
はやはり高度可変領域であることが示され、このgp120
内のＶ３領域に位置するＰＮＤ領域は、ｅｎｖ蛋白内の
他の領域にコードされるＣＤ４結合領域と同様に、ＨＩ
Ｖウイルスの標的細胞への吸着、侵入の際重要な役割を
果たす領域であるとの可能性が示唆されている［Gregor
y J.Larosaら、Science、249,932-935,(1990)］。ま
た、ラロサ(Larosa)らは、この２４５のＨＩＶ変異株の
ＰＮＤのアミノ酸配列を解析した結果、その二次構造に
アミノ酸配列から推定される構造上の拘束性が存在する
ことを見い出した。すなわち、βストランド−タイプII
βターン−βストランド−αヘリックスという構造上の
共通性を報告している。しかしながら、この領域を利用
してＨＩＶ感染に対する診断、治療及び予防を行う場
合、調べられたＰＮＤの種類だけ候補があることにな
り、何種の単クローン性抗体又はペプチドを用いれば十
分であるのかわからないことになる。更に１人のＨＩＶ
感染者が２種以上のＨＩＶウイルス株に感染しているこ
とも十分に考えられるので、有効なＰＮＤの組み合せ方
法は、実際にはさらに複雑となろう。このように、感染
防御抗原は明らかになったが、その領域は高度可変領域
であり、抗体の認識する領域もしくはワクチンおよび診
断薬の抗原として用いる領域の絞り込みができないこと
が問題となっている。
血清を用いた中和試験等によって決定された現在最も有
望なＨＩＶの感染防御領域は，ＰＮＤ（Principal Neut
ralizing determinant）と呼ばれるｅｎｖ蛋白（gp12
0）のアミノ酸配列303-338付近に相当するCys〜Cysに挟
まれた領域である［K.Javaherianら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 86, 6768-6772 (1989)］。１３３名のＨＩ
Ｖ感染者から単離された２４５のウイルス株について、
このＰＮＤ領域のアミノ酸配列を調べた結果、この領域
はやはり高度可変領域であることが示され、このgp120
内のＶ３領域に位置するＰＮＤ領域は、ｅｎｖ蛋白内の
他の領域にコードされるＣＤ４結合領域と同様に、ＨＩ
Ｖウイルスの標的細胞への吸着、侵入の際重要な役割を
果たす領域であるとの可能性が示唆されている［Gregor
y J.Larosaら、Science、249,932-935,(1990)］。ま
た、ラロサ(Larosa)らは、この２４５のＨＩＶ変異株の
ＰＮＤのアミノ酸配列を解析した結果、その二次構造に
アミノ酸配列から推定される構造上の拘束性が存在する
ことを見い出した。すなわち、βストランド−タイプII
βターン−βストランド−αヘリックスという構造上の
共通性を報告している。しかしながら、この領域を利用
してＨＩＶ感染に対する診断、治療及び予防を行う場
合、調べられたＰＮＤの種類だけ候補があることにな
り、何種の単クローン性抗体又はペプチドを用いれば十
分であるのかわからないことになる。更に１人のＨＩＶ
感染者が２種以上のＨＩＶウイルス株に感染しているこ
とも十分に考えられるので、有効なＰＮＤの組み合せ方
法は、実際にはさらに複雑となろう。このように、感染
防御抗原は明らかになったが、その領域は高度可変領域
であり、抗体の認識する領域もしくはワクチンおよび診
断薬の抗原として用いる領域の絞り込みができないこと
が問題となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＨＩＶ感染の治療や予
防を可能にするペプチドとして、ＨＩＶの高度可変領域
（ＰＮＤ）に大きな期待が寄せられているが、ＨＩＶ特
有の変異の問題から１種のＰＮＤをコードするペプチド
（以下、ＰＮＤペプチドと言う）のみでは全体を網羅で
きる有効な医薬品を開発することはできないと考えられ
る。しかしその数が数十種を越えるようなペプチドが必
要となるような調製物では、現実的にその開発は難しい
と考えられる。このような状況に於て、ＨＩＶ変異株全
体の反応性を網羅できるＰＮＤの組み合せ、且つそれが
必要最小限になるような組み合せが見い出されれば、こ
れらの予防薬、治療薬等の開発が大きく進展するもので
ある。本発明の目的は、ＨＩＶ変異株全体との反応性を
網羅できる中和抗体、ワクチン及び診断薬用の抗原とし
てのＰＮＤの全く新しい分類方法を開示し、これに基づ
いた最小限度の組み合せを提供することにある。
防を可能にするペプチドとして、ＨＩＶの高度可変領域
（ＰＮＤ）に大きな期待が寄せられているが、ＨＩＶ特
有の変異の問題から１種のＰＮＤをコードするペプチド
（以下、ＰＮＤペプチドと言う）のみでは全体を網羅で
きる有効な医薬品を開発することはできないと考えられ
る。しかしその数が数十種を越えるようなペプチドが必
要となるような調製物では、現実的にその開発は難しい
と考えられる。このような状況に於て、ＨＩＶ変異株全
体の反応性を網羅できるＰＮＤの組み合せ、且つそれが
必要最小限になるような組み合せが見い出されれば、こ
れらの予防薬、治療薬等の開発が大きく進展するもので
ある。本発明の目的は、ＨＩＶ変異株全体との反応性を
網羅できる中和抗体、ワクチン及び診断薬用の抗原とし
てのＰＮＤの全く新しい分類方法を開示し、これに基づ
いた最小限度の組み合せを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＩＶ−
ＭＮ株(ＨＴＬＶ−111 ＭＮ株とも称される。G．Gurgo
ら、Virology 164，P531-536，1988を参照)のＰＮＤと
特異的に結合する２種の中和抗体を作製し、そのエピト
ープマッピングを行った結果、中和抗体価の低い方の抗
体は一次構造を認識していたのに対し、中和抗体価の高
い方の抗体は二次構造以上の高次構造を認識しているこ
とを見い出した。
ＭＮ株(ＨＴＬＶ−111 ＭＮ株とも称される。G．Gurgo
ら、Virology 164，P531-536，1988を参照)のＰＮＤと
特異的に結合する２種の中和抗体を作製し、そのエピト
ープマッピングを行った結果、中和抗体価の低い方の抗
体は一次構造を認識していたのに対し、中和抗体価の高
い方の抗体は二次構造以上の高次構造を認識しているこ
とを見い出した。
【０００６】そこで種々のＰＮＤと強い中和活性をもつ
抗体との結合性を調べることにより、ＰＮＤのグループ
化を図った。種々の分離ウイルス株と抗体との中和反応
でその関係を調べる方が直接的であるが、分離ウイルス
株の中にもその変異株が存在している可能性があるの
で、厳密にＰＮＤと抗体との１対１との反応を調べる方
法をとった。すなわち我々は日本に於けるＨＩＶ感染者
由来の種々のＰＮＤペプチドを大腸菌を宿主とした系で
発現させ、この精製蛋白と中和抗体との結合活性を調べ
た。その結果、種々のＰＮＤは抗体と反応する群とそう
でない群に大別された、そして抗体と反応したＰＮＤの
アミノ配列を調べてみると、予想したようにアミノ酸の
一次構造における共通性を見いだすことはできなかっ
た。そこでロブソン(Robson)らの推定理論［ＧＯＲ法：
Garnier-Osguthorpe-Robson法（J. Mol. Biol. 120, 97
-120 (1978)）］に基づく二次構造解析プログラムを用
いて、抗体と反応したＰＮＤ群の二次構造の解析をおこ
なったところ、構造上の共通性が観察された。すなわ
ち、中和抗体と結合したＰＮＤは、前半部のβストラン
ド領域とＧＰＧＲ領域との位置との関係から見た二次構
造が全く一致していた。そしてその構造は、中和抗体と
反応しなかったＰＮＤ群の中には１例もみられなかっ
た。これらに加えて現在報告されている２４５のＨＩＶ
感染者のＰＮＤのアミノ酸配列についてもロブソンのプ
ログラムを用いて同様の解析をおこなってみると、ＰＮ
Ｄ前半部のβストランド−ＧＰＧＲ領域の構造パターン
が６種のグループに大別できることが確認された。しか
も、そのうち３種のグループだけで、これまでに報告さ
れているＨＩＶのＰＮＤアミノ酸配列を約90％をカバー
し、更にその内の５種のグループでほぼ100％近くカバ
ーすることを見い出した。尚、本発明で言うＧＰＧＲ領
域とは、Ｃｙｓ〜Ｃｙｓに挟まれるＰＮＤ領域のアミノ
酸順位でほぼ１５番目から始まるグリシン−プロリン−
グリシン−アルギニンのＨＩＶ各株間でよく保存された
配列を言う。まれにこの領域においても変異が認められ
るがその場合にはこの位置に相当するＧＰＧＲに相同性
（ホモロジー）のある領域を言う。また、βストランド
領域とは、ＰＮＤのアミノ酸をロブソンらの二次構造解
析方法に従ってその二次構造を予測した場合に、ＰＮＤ
の１０番目のアミノ酸付近の連続したβストランドとし
てその二次構造が予測されるアミノ酸配列の領域を言
う。
抗体との結合性を調べることにより、ＰＮＤのグループ
化を図った。種々の分離ウイルス株と抗体との中和反応
でその関係を調べる方が直接的であるが、分離ウイルス
株の中にもその変異株が存在している可能性があるの
で、厳密にＰＮＤと抗体との１対１との反応を調べる方
法をとった。すなわち我々は日本に於けるＨＩＶ感染者
由来の種々のＰＮＤペプチドを大腸菌を宿主とした系で
発現させ、この精製蛋白と中和抗体との結合活性を調べ
た。その結果、種々のＰＮＤは抗体と反応する群とそう
でない群に大別された、そして抗体と反応したＰＮＤの
アミノ配列を調べてみると、予想したようにアミノ酸の
一次構造における共通性を見いだすことはできなかっ
た。そこでロブソン(Robson)らの推定理論［ＧＯＲ法：
Garnier-Osguthorpe-Robson法（J. Mol. Biol. 120, 97
-120 (1978)）］に基づく二次構造解析プログラムを用
いて、抗体と反応したＰＮＤ群の二次構造の解析をおこ
なったところ、構造上の共通性が観察された。すなわ
ち、中和抗体と結合したＰＮＤは、前半部のβストラン
ド領域とＧＰＧＲ領域との位置との関係から見た二次構
造が全く一致していた。そしてその構造は、中和抗体と
反応しなかったＰＮＤ群の中には１例もみられなかっ
た。これらに加えて現在報告されている２４５のＨＩＶ
感染者のＰＮＤのアミノ酸配列についてもロブソンのプ
ログラムを用いて同様の解析をおこなってみると、ＰＮ
Ｄ前半部のβストランド−ＧＰＧＲ領域の構造パターン
が６種のグループに大別できることが確認された。しか
も、そのうち３種のグループだけで、これまでに報告さ
れているＨＩＶのＰＮＤアミノ酸配列を約90％をカバー
し、更にその内の５種のグループでほぼ100％近くカバ
ーすることを見い出した。尚、本発明で言うＧＰＧＲ領
域とは、Ｃｙｓ〜Ｃｙｓに挟まれるＰＮＤ領域のアミノ
酸順位でほぼ１５番目から始まるグリシン−プロリン−
グリシン−アルギニンのＨＩＶ各株間でよく保存された
配列を言う。まれにこの領域においても変異が認められ
るがその場合にはこの位置に相当するＧＰＧＲに相同性
（ホモロジー）のある領域を言う。また、βストランド
領域とは、ＰＮＤのアミノ酸をロブソンらの二次構造解
析方法に従ってその二次構造を予測した場合に、ＰＮＤ
の１０番目のアミノ酸付近の連続したβストランドとし
てその二次構造が予測されるアミノ酸配列の領域を言
う。
【０００７】上記を実証するために、各群を代表するペ
プチドを合成し、これを用いてモルモットの免疫血清を
作製した。この血清を用いてＨＩＶの臨床分離株の中和
試験を行った結果、各グループのペプチドにより作製し
た免疫血清は同一グループのクローン化ウイルスをそれ
ぞれ中和できた。一方、クローン化していない臨床分離
株は、そのすべてを中和することはできなかったが、こ
れらの臨床分離株も各グループの免疫血清を混合するこ
とで全て中和できた。以上のことをまとめると、ＨＩＶ
の主要な感染防御抗原をコードするＰＮＤは高度可変領
域であるが、その構造には構造上の拘束があり、ロブソ
ンの理論に基づく解析用プログラムを用いて解析した場
合に、ＰＮＤの１０番目のアミノ酸近傍のβストランド
の数とこのβストランドとＧＰＧＲ領域の初めのグルタ
ミン（ＧＰＧＲ）との距離に着目した二次構造の類似性
から６種のグループに大別できる。各グループのＰＮＤ
をもつＨＩＶ分離株は、ＰＮＤ前半部のβストランド−
ＧＰＧＲ領域の二次構造以上の高次構造を認識する中和
抗体によってグループ特異的に中和され又各グループの
代表ペプチドは、上述のグループ特異的な中和抗体を誘
起しうるし、もし血中にそのような中和抗体が存在すれ
ば、これを検出しうる。従って今回示したペプチドの選
択方法は、ＨＩＶを対象としたワクチン、中和抗体及び
診断薬の開発を可能ならしめるものである。
プチドを合成し、これを用いてモルモットの免疫血清を
作製した。この血清を用いてＨＩＶの臨床分離株の中和
試験を行った結果、各グループのペプチドにより作製し
た免疫血清は同一グループのクローン化ウイルスをそれ
ぞれ中和できた。一方、クローン化していない臨床分離
株は、そのすべてを中和することはできなかったが、こ
れらの臨床分離株も各グループの免疫血清を混合するこ
とで全て中和できた。以上のことをまとめると、ＨＩＶ
の主要な感染防御抗原をコードするＰＮＤは高度可変領
域であるが、その構造には構造上の拘束があり、ロブソ
ンの理論に基づく解析用プログラムを用いて解析した場
合に、ＰＮＤの１０番目のアミノ酸近傍のβストランド
の数とこのβストランドとＧＰＧＲ領域の初めのグルタ
ミン（ＧＰＧＲ）との距離に着目した二次構造の類似性
から６種のグループに大別できる。各グループのＰＮＤ
をもつＨＩＶ分離株は、ＰＮＤ前半部のβストランド−
ＧＰＧＲ領域の二次構造以上の高次構造を認識する中和
抗体によってグループ特異的に中和され又各グループの
代表ペプチドは、上述のグループ特異的な中和抗体を誘
起しうるし、もし血中にそのような中和抗体が存在すれ
ば、これを検出しうる。従って今回示したペプチドの選
択方法は、ＨＩＶを対象としたワクチン、中和抗体及び
診断薬の開発を可能ならしめるものである。
【０００８】以下、本発明により開示されるＨＩＶ−Ｐ
ＮＤペプチドの分類方法、この方法に基づいた抗体調製
物、抗原調製物これらを用いた治療薬、ワクチンおよび
検出試薬について説明する。
ＮＤペプチドの分類方法、この方法に基づいた抗体調製
物、抗原調製物これらを用いた治療薬、ワクチンおよび
検出試薬について説明する。
【０００９】(1) ＰＮＤペプチドの二次構造予測による
分類 本発明で言うＰＮＤ領域とは、ＨＩＶ-ｇＰ１２０のア
ミノ酸配列のうちｇＰ１２０ペプチドのＮ末端から数え
て３０３番目のアミノ酸から３３８番目のアミノ酸の領
域またはその近傍の領域のシステインとシステインに挟
まれるアミノ酸約３５個からなる領域を言う。ＨＩＶは
変異が激しく、時に遺伝子の切除(deletion)や挿入(ins
ertion)を伴うことからこの領域のアミノ酸順位は微妙
に変化することがあるが、この領域付近にはシステイン
に挟まれるアミノ酸約３５個からなる領域が存在し、そ
のような領域をＰＮＤ領域と言う。
分類 本発明で言うＰＮＤ領域とは、ＨＩＶ-ｇＰ１２０のア
ミノ酸配列のうちｇＰ１２０ペプチドのＮ末端から数え
て３０３番目のアミノ酸から３３８番目のアミノ酸の領
域またはその近傍の領域のシステインとシステインに挟
まれるアミノ酸約３５個からなる領域を言う。ＨＩＶは
変異が激しく、時に遺伝子の切除(deletion)や挿入(ins
ertion)を伴うことからこの領域のアミノ酸順位は微妙
に変化することがあるが、この領域付近にはシステイン
に挟まれるアミノ酸約３５個からなる領域が存在し、そ
のような領域をＰＮＤ領域と言う。
【００１０】本発明に従い、ワクチン、試薬または中和
抗体を調製する際に用いるペプチドを選択するには、既
にアミノ酸配列が判明しているＨＩＶ−ＰＮＤペプチド
のアミノ酸配列を、ロブソンらが確立したペプチドの高
次構造解析理論［ＧＯＲ法：J. Mol. Biol. 120, 97-12
0 (1987)］に従ってそのパターンを解析し、その結果に
おけるＰＮＤ（Ｃｙｓ−Ｃｙｓに挟まれる領域）のＮ末
端のＣｙｓを１番として１０番目から１５番目のアミノ
酸もしくはその近傍に相当する領域が示すβストランド
の数（通常は３〜５個のいずれか）と該βストランド領
域のＣ末端側に存在するＧＰＧＲ領域との距離により本
発明が提示するＰＮＤグループのいずれのグループに属
するかを判断する。尚、ロブソンらの方法に従い、アミ
ノ酸一次配列から二次構造を予測した場合に、それぞれ
のアミノ酸に対してαヘリックス、βシート、ターンま
たはコイルのいずれかの構造がその二次構造として予測
されるが、必ず本発明で言うβストランドとはこのうち
βシートとして予測されるものを言い、「図１」、「図
２」および「図３」に示すＰＮＤアミノ酸順位で１０番
目近傍にある上向きのひとつの三角のピークをひとつの
βストランドと言う。ロブソンの理論に従ったアミノ酸
配列からの高次構造解析手段としては、今日ではこれを
パソコン用の解析ソフト（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ）と
して市販されておりこれらを利用することにより容易に
解析することが可能である。
抗体を調製する際に用いるペプチドを選択するには、既
にアミノ酸配列が判明しているＨＩＶ−ＰＮＤペプチド
のアミノ酸配列を、ロブソンらが確立したペプチドの高
次構造解析理論［ＧＯＲ法：J. Mol. Biol. 120, 97-12
0 (1987)］に従ってそのパターンを解析し、その結果に
おけるＰＮＤ（Ｃｙｓ−Ｃｙｓに挟まれる領域）のＮ末
端のＣｙｓを１番として１０番目から１５番目のアミノ
酸もしくはその近傍に相当する領域が示すβストランド
の数（通常は３〜５個のいずれか）と該βストランド領
域のＣ末端側に存在するＧＰＧＲ領域との距離により本
発明が提示するＰＮＤグループのいずれのグループに属
するかを判断する。尚、ロブソンらの方法に従い、アミ
ノ酸一次配列から二次構造を予測した場合に、それぞれ
のアミノ酸に対してαヘリックス、βシート、ターンま
たはコイルのいずれかの構造がその二次構造として予測
されるが、必ず本発明で言うβストランドとはこのうち
βシートとして予測されるものを言い、「図１」、「図
２」および「図３」に示すＰＮＤアミノ酸順位で１０番
目近傍にある上向きのひとつの三角のピークをひとつの
βストランドと言う。ロブソンの理論に従ったアミノ酸
配列からの高次構造解析手段としては、今日ではこれを
パソコン用の解析ソフト（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ）と
して市販されておりこれらを利用することにより容易に
解析することが可能である。
【００１１】第２図に示した通り、本発明に従えば、こ
れらのグループはβストランドが３つのβストランド領
域を持つグループＩ、βストランドが４つのβストラン
ド領域でＧＰＧＲの最初のＧとの間にコイルまたはター
ン構造を取るアミノ酸が介在するグループII、βストラ
ンドが４つのβストランド領域とＧＰＧＲ領域が他のア
ミノ酸を介在せず近接しているグループIII、βストラ
ンドが５つのβストランド領域とＧＰＧＲ領域の間にコ
イルまたはターン構造を取るアミノ酸を介在せず近接し
たグループIV及びβストランドが５つのβストランド領
域とＧＰＧＲ領域との間にコイルまたはターン構造を取
るアミノ酸が介在するグループＶの５つのグループ、並
びに全くこれらのパターンとは異なるグループVI（その
他）に分類される。尚、各グループ特異的な二次構造パ
ターンを、ＧＰＧＲ領域の直前７個のアミノ酸配列が示
す二次構造予測結果として文章として示せば、下記のよ
うに示されよう。 (Ｉ) グループＩ：(Ｎ末側)XXXBBBX(Ｃ末側)と判別され
るアミノ酸配列を有するＰＮＤペプチド (II) グループII：XXBBBBXと判別されるアミノ酸配列を
有するＰＮＤペプチド (III)グループIII：XXXBBBBと判別されるアミノ酸配列
を有するＰＮＤペプチド (IV) グループIV：XXBBBBBと判別されるアミノ酸配列を
有するＰＮＤペプチド (Ｖ) グループＶ：XBBBBBXと判別されるアミノ酸配列を
有するＰＮＤペプチド （B：βストランド構造、X：ターンまたはコイル構造）
れらのグループはβストランドが３つのβストランド領
域を持つグループＩ、βストランドが４つのβストラン
ド領域でＧＰＧＲの最初のＧとの間にコイルまたはター
ン構造を取るアミノ酸が介在するグループII、βストラ
ンドが４つのβストランド領域とＧＰＧＲ領域が他のア
ミノ酸を介在せず近接しているグループIII、βストラ
ンドが５つのβストランド領域とＧＰＧＲ領域の間にコ
イルまたはターン構造を取るアミノ酸を介在せず近接し
たグループIV及びβストランドが５つのβストランド領
域とＧＰＧＲ領域との間にコイルまたはターン構造を取
るアミノ酸が介在するグループＶの５つのグループ、並
びに全くこれらのパターンとは異なるグループVI（その
他）に分類される。尚、各グループ特異的な二次構造パ
ターンを、ＧＰＧＲ領域の直前７個のアミノ酸配列が示
す二次構造予測結果として文章として示せば、下記のよ
うに示されよう。 (Ｉ) グループＩ：(Ｎ末側)XXXBBBX(Ｃ末側)と判別され
るアミノ酸配列を有するＰＮＤペプチド (II) グループII：XXBBBBXと判別されるアミノ酸配列を
有するＰＮＤペプチド (III)グループIII：XXXBBBBと判別されるアミノ酸配列
を有するＰＮＤペプチド (IV) グループIV：XXBBBBBと判別されるアミノ酸配列を
有するＰＮＤペプチド (Ｖ) グループＶ：XBBBBBXと判別されるアミノ酸配列を
有するＰＮＤペプチド （B：βストランド構造、X：ターンまたはコイル構造）
【００１２】本発明者らがクローニングした約２０種類
のＨＩＶ−ＰＮＤのアミノ酸配列、および先にラロサら
が報告した２４５種のＰＮＤアミノ酸配列とを、本発明
のＰＮＤ分類法に従い解析したところ、グループＩ、II
およびIIIの３つのグループだけでこれまでに知られる
ＨＩＶ変異株の約９０％をカバーすることが確認され、
さらにＩ〜Ｖの５つのグループによりほぼ１００％がカ
バーされることが確認された。
のＨＩＶ−ＰＮＤのアミノ酸配列、および先にラロサら
が報告した２４５種のＰＮＤアミノ酸配列とを、本発明
のＰＮＤ分類法に従い解析したところ、グループＩ、II
およびIIIの３つのグループだけでこれまでに知られる
ＨＩＶ変異株の約９０％をカバーすることが確認され、
さらにＩ〜Ｖの５つのグループによりほぼ１００％がカ
バーされることが確認された。
【００１３】(2) ペプチド調製物 本発明のペプチド調製物とは、本発明の分類に従ったＩ
〜Ｖのグループのうち少なくとも２つのグループにそれ
ぞれ属するＰＮＤペプチドを少なくとも含有するペプチ
ド調製物を言う。さらに好ましい本発明のペプチド調製
物の態様としては、グループＩ、IIおよびIIIにそれぞ
れ属する少なくとも各１種のペプチドを含有する調製
物、さらにはグループＩ〜グループＶのペプチドを少な
くとも１種づつ含有する調製物を言う。ここで用いられ
る各ペプチドとは、ＰＮＤ領域と呼ばれる約３５アミノ
酸のペプチド、またはこれを含むペプチドを言う。さら
にＰＮＤ領域のうち、Ｎ末および／またはＣ末を一部な
くした形の３５アミノ酸より小さいペプチドも用いるこ
とが可能である。そのような場合は、βストランド領域
およびＧＰＧＲ領域を含む最低約２０アミノ酸程度の長
さのペプチドが必要である。
〜Ｖのグループのうち少なくとも２つのグループにそれ
ぞれ属するＰＮＤペプチドを少なくとも含有するペプチ
ド調製物を言う。さらに好ましい本発明のペプチド調製
物の態様としては、グループＩ、IIおよびIIIにそれぞ
れ属する少なくとも各１種のペプチドを含有する調製
物、さらにはグループＩ〜グループＶのペプチドを少な
くとも１種づつ含有する調製物を言う。ここで用いられ
る各ペプチドとは、ＰＮＤ領域と呼ばれる約３５アミノ
酸のペプチド、またはこれを含むペプチドを言う。さら
にＰＮＤ領域のうち、Ｎ末および／またはＣ末を一部な
くした形の３５アミノ酸より小さいペプチドも用いるこ
とが可能である。そのような場合は、βストランド領域
およびＧＰＧＲ領域を含む最低約２０アミノ酸程度の長
さのペプチドが必要である。
【００１４】本発明に従う、各グループの代表的なＰＮ
Ｄペプチドのアミノ酸配列を下記に示す。ただし、下記
のアミノ酸配列は、各グループのＰＮＤペプチドの具体
的例を示すものであり、これらに限定されるものではな
い。なお、３文字記号によるアミノ酸配列を「図４」、
「図５」および「図６」に示す。
Ｄペプチドのアミノ酸配列を下記に示す。ただし、下記
のアミノ酸配列は、各グループのＰＮＤペプチドの具体
的例を示すものであり、これらに限定されるものではな
い。なお、３文字記号によるアミノ酸配列を「図４」、
「図５」および「図６」に示す。
【００１５】グループＩ： (8909C) CTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIRQAHC (8701C) CTRPSNNTRKSIHIGPGRAFYTTGDIIGDIRQAHC (8929C) CTRPNNNTRKSIHIGPGRAWYTTGEIIGNIRQAHC (8960C) CTRPNNNTRKGIHMGPGGAFYTTGEIIGDIRQAHC (8904C) CTRPGNNTRKGIHMGPGRTLYATGEIIGDIRQAHC
【００１６】グループII： (8923C) CTRPNNNTRKSIPIGPGRAFYTTGEIIGNIRQAHC (8985C) CTRPNNNTRKSINIGPGRAFYTTGDIIGDIRQAHC (8942C) CTRPNNNTRKSIPIGPGRAFYTTGDIIGDIRKAHC (8926C) CTRPNNNTRKSIPIGPGRAFYTTGDIIGDIRQAHC (8918C) CTRPNNNTRKRITTGPGRVYYTTGEIVGDVRKAHC (8966C) CTRPNNYTERKITLGPGRVLYTTGKIIGDIRRAHC (8817C) CTRPNTNKRKGITKGPGKVIYATGQIIGDIRKAHC
【００１７】グループIII： (8804C) CTRPNNNTRKGIRIGPGRAVYATEKIIGDIRQAHC (8986C) CTRPNNNTRKGIRIGPGRAVYTAEKIIGDIRQAHC (8703C) CTRPNNNTRKGIRIGPGRAVYATEKIIGDIRQAHC (8961C) CTRPNNNTRKGIRIGPGRAVYATGKIIGNIRQAHC (8962C) CTRPNNNTRKGIRIGPGRAVYATGKIIGDIRQAHC (8910C) CTRPNNNTRKGIRIGPGRAVYATGKITGDIRQAHC (8954C) CTRPNNNTRKGIRVGPGRAIYATEKIIGDIRQAHC (8801C) CTRPNNNTRKSIPMGPGKAIYTTGEIIGDIRQAHC (8936C) CTRPNNNTKKSIRMXGWGRAVYATGKIMGDIRQAHC
【００１８】グループIV： (8963C) CTRPNNNTRKRVTMGPGRVYYTTGEIVGDVRKAHC (8953C) CTRPNNNTRKAIRVGPGRTLYATRRIIGDIRQAHC
【００１９】グループＶ (IIIB) CTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC
【００２０】上記のペプチドとしては、化学的にペプチ
ド合成機により合成された合成ペプチドを用いることが
できる。また、遺伝子組換え技術を用いて、必要なＰＮ
Ｄペプチドをその一部に含む融合ペプチドを適当な宿主
細胞に発現させ、これを回収・精製することにより使用
することも可能である。本発明の分類法に従った各種Ｐ
ＮＤペプチドは、該調製物に必要なペプチドのいくつか
もしくは全部を融合させた形態で用いることも可能であ
る。
ド合成機により合成された合成ペプチドを用いることが
できる。また、遺伝子組換え技術を用いて、必要なＰＮ
Ｄペプチドをその一部に含む融合ペプチドを適当な宿主
細胞に発現させ、これを回収・精製することにより使用
することも可能である。本発明の分類法に従った各種Ｐ
ＮＤペプチドは、該調製物に必要なペプチドのいくつか
もしくは全部を融合させた形態で用いることも可能であ
る。
【００２１】このようなペプチド調製物は、ＨＩＶ感染
を防ぐ中和抗体を誘導するワクチンの中心的有効成分と
して用いることが可能である。実際にワクチンを調製す
る場合には、これまでに知られる一般的なワクチンの調
製方法に従い（例えばアジュバントが必要であればこれ
らを添加する等）調製することが可能である。
を防ぐ中和抗体を誘導するワクチンの中心的有効成分と
して用いることが可能である。実際にワクチンを調製す
る場合には、これまでに知られる一般的なワクチンの調
製方法に従い（例えばアジュバントが必要であればこれ
らを添加する等）調製することが可能である。
【００２２】(3) 抗体調製物 本発明の抗体調製物とは、本発明の分類法に基づく、グ
ループＩからグループＶのＰＮＤ（図３参照）を特異的
に認識する中和抗体からなる調製物である。すなわち、
前記グループＩからグループＶのＰＮＤペプチドを特異
的に認識する下記の中和抗体： (Ｉ) グループＩ′：前記に記載のグループＩに属する
ＰＮＤペプチドを特異的に認識する中和抗体、(II) グ
ループII′：前記に記載のグループIIに属するＰＮＤペ
プチドを特異的に認識する中和抗体、(III)グループII
I′：前記に記載のグループIIIに属するＰＮＤペプチド
を特異的に認識する中和抗体、(IV) グループIV′：前
記に記載のグループIVに属するＰＮＤペプチドを特異的
に認識する中和抗体、(Ｖ) グループＶ′：前記に記載
のグループＶに属するＰＮＤペプチドを特異的に認識す
る中和抗体の少なくとも２つのグループから中和抗体が
選択される中和抗体混合物を言う。好ましくは、グルー
プＩ′、II′およびIII′のＰＮＤをそれぞれ特異的に
認識する中和抗体を含む、少なくとも３種の中和抗体か
らなる抗体調製物を言う。さらに好ましくは、グループ
Ｉ′〜Ｖ′のＰＮＤをそれぞれ特異的に認識する５種の
中和抗体を含む抗体調製物を言う。このような本発明の
抗体調製物は、ＰＮＤペプチドのアミノ酸の一次配列に
特異的な抗体のみではなく、本発明のＰＮＤ各グループ
に共通した二次構造以上の高次構造を特異的に認識する
中和抗体を含むものを言う。
ループＩからグループＶのＰＮＤ（図３参照）を特異的
に認識する中和抗体からなる調製物である。すなわち、
前記グループＩからグループＶのＰＮＤペプチドを特異
的に認識する下記の中和抗体： (Ｉ) グループＩ′：前記に記載のグループＩに属する
ＰＮＤペプチドを特異的に認識する中和抗体、(II) グ
ループII′：前記に記載のグループIIに属するＰＮＤペ
プチドを特異的に認識する中和抗体、(III)グループII
I′：前記に記載のグループIIIに属するＰＮＤペプチド
を特異的に認識する中和抗体、(IV) グループIV′：前
記に記載のグループIVに属するＰＮＤペプチドを特異的
に認識する中和抗体、(Ｖ) グループＶ′：前記に記載
のグループＶに属するＰＮＤペプチドを特異的に認識す
る中和抗体の少なくとも２つのグループから中和抗体が
選択される中和抗体混合物を言う。好ましくは、グルー
プＩ′、II′およびIII′のＰＮＤをそれぞれ特異的に
認識する中和抗体を含む、少なくとも３種の中和抗体か
らなる抗体調製物を言う。さらに好ましくは、グループ
Ｉ′〜Ｖ′のＰＮＤをそれぞれ特異的に認識する５種の
中和抗体を含む抗体調製物を言う。このような本発明の
抗体調製物は、ＰＮＤペプチドのアミノ酸の一次配列に
特異的な抗体のみではなく、本発明のＰＮＤ各グループ
に共通した二次構造以上の高次構造を特異的に認識する
中和抗体を含むものを言う。
【００２３】このような中和抗体は、上記の各ＰＮＤペ
プチドを免疫することにより得られた各種動物の血清
や、各種ＰＮＤペプチドをマウスに免疫して通常のモノ
クローナル抗体調製方法に従い調製したモノクローナル
抗体が用いられる。中和抗体を調製する場合には、１つ
のグループに属するペプチドを免疫することにより、そ
のグループのＰＮＤに特異的な中和抗体をそれぞれ調製
するのが好ましい。その後このようにして得られた各グ
ループ特異的な中和抗体を混合することにより本発明の
抗体調製物を得ることが出来る。また、得られた抗体の
中から、本発明に従い、ＰＮＤの二次構造以上の高次構
造を認識する中和活性の高い抗体をスクリーニングする
には、免疫したペプチドと同一のグループに属する一次
配列の異なるＰＮＤペプチドを免疫したペプチドと併せ
て用いて、これらの双方に特異的に反応する抗体をスク
リーニングすることにより、本発明の分類方法に従っ
た、二次構造以上の高次構造を特異的に認識する中和抗
体を得ることが可能となる。
プチドを免疫することにより得られた各種動物の血清
や、各種ＰＮＤペプチドをマウスに免疫して通常のモノ
クローナル抗体調製方法に従い調製したモノクローナル
抗体が用いられる。中和抗体を調製する場合には、１つ
のグループに属するペプチドを免疫することにより、そ
のグループのＰＮＤに特異的な中和抗体をそれぞれ調製
するのが好ましい。その後このようにして得られた各グ
ループ特異的な中和抗体を混合することにより本発明の
抗体調製物を得ることが出来る。また、得られた抗体の
中から、本発明に従い、ＰＮＤの二次構造以上の高次構
造を認識する中和活性の高い抗体をスクリーニングする
には、免疫したペプチドと同一のグループに属する一次
配列の異なるＰＮＤペプチドを免疫したペプチドと併せ
て用いて、これらの双方に特異的に反応する抗体をスク
リーニングすることにより、本発明の分類方法に従っ
た、二次構造以上の高次構造を特異的に認識する中和抗
体を得ることが可能となる。
【００２４】ヒトへの治療剤としての抗体調製物を調製
する際には、ヒト型モノクローナル抗体を用いることが
好ましく、その手段としては、マウス×ヒト型モノクロ
ーナル抗体やヒト×ヒト型モノクローナル抗体を用いる
ことが出来る。さらには、遺伝子組換え技術を用いてマ
ウス×マウス型モノクローナル抗体の可変領域のみを利
用し、これにヒトの定常領域遺伝子を結合させることに
より目的の二次構造を認識するキメラ抗体を調製した
り、または、マウス×マウス型モノクローナル抗体の可
変領域の中でも超可変領域と呼ばれる領域（ＣＤＲドメ
イン）の遺伝子のみをヒト型抗体遺伝子に組み込むこと
により得られる改変抗体が用いられる。これらの特殊な
抗体の調製方法としては、これまでに報告され、広く知
られる技術全般が選択的に利用される。
する際には、ヒト型モノクローナル抗体を用いることが
好ましく、その手段としては、マウス×ヒト型モノクロ
ーナル抗体やヒト×ヒト型モノクローナル抗体を用いる
ことが出来る。さらには、遺伝子組換え技術を用いてマ
ウス×マウス型モノクローナル抗体の可変領域のみを利
用し、これにヒトの定常領域遺伝子を結合させることに
より目的の二次構造を認識するキメラ抗体を調製した
り、または、マウス×マウス型モノクローナル抗体の可
変領域の中でも超可変領域と呼ばれる領域（ＣＤＲドメ
イン）の遺伝子のみをヒト型抗体遺伝子に組み込むこと
により得られる改変抗体が用いられる。これらの特殊な
抗体の調製方法としては、これまでに報告され、広く知
られる技術全般が選択的に利用される。
【００２５】(4) ヒト免疫不全ウイルスの判別方法 本発明は、本ＰＮＤ分類法に基づくヒト免疫不全ウイル
スの判別方法を提供する。ＨＩＶ感染者から分離される
ＨＩＶ感染株を同定することは、該患者の抗体投与によ
る治療を行う際に、極めて有効な診断方法となる。すな
わち、本発明の分類方法に基づきそれぞれの感染者に感
染したＨＩＶ株を判別することで、該ＨＩＶ株に有効な
中和抗体を選択することが可能となり、それぞれの感染
者に最も有効な抗体治療方法を決定することが可能とな
る。
スの判別方法を提供する。ＨＩＶ感染者から分離される
ＨＩＶ感染株を同定することは、該患者の抗体投与によ
る治療を行う際に、極めて有効な診断方法となる。すな
わち、本発明の分類方法に基づきそれぞれの感染者に感
染したＨＩＶ株を判別することで、該ＨＩＶ株に有効な
中和抗体を選択することが可能となり、それぞれの感染
者に最も有効な抗体治療方法を決定することが可能とな
る。
【００２６】このようなＨＩＶの判別方法としては、ま
ず感染者の血液からＨＩＶ−ＤＮＡゲノムまたはその一
部の遺伝子を抽出し、これを大腸菌ベクターに組み込む
ことによりＨＩＶ−ＤＮＡをクローニングし、ＨＩＶ−
ｅｎｖｇＰ１２０のＰＮＤに相当する領域のＤＮＡ配列
を決定する。このようにして得られた塩基配列に基づく
ＰＮＤアミノ酸一次配列を、ロブソンらの蛋白質二次構
造解析法（ＧＯＲ法）により解析することにより、対象
のＨＩＶが有するＰＮＤが、本発明により開示されたグ
ループＩ〜Ｖのうちどのグループに属するＰＮＤペプチ
ドを有するかを調べることにより、そのウイルス株を判
別する。
ず感染者の血液からＨＩＶ−ＤＮＡゲノムまたはその一
部の遺伝子を抽出し、これを大腸菌ベクターに組み込む
ことによりＨＩＶ−ＤＮＡをクローニングし、ＨＩＶ−
ｅｎｖｇＰ１２０のＰＮＤに相当する領域のＤＮＡ配列
を決定する。このようにして得られた塩基配列に基づく
ＰＮＤアミノ酸一次配列を、ロブソンらの蛋白質二次構
造解析法（ＧＯＲ法）により解析することにより、対象
のＨＩＶが有するＰＮＤが、本発明により開示されたグ
ループＩ〜Ｖのうちどのグループに属するＰＮＤペプチ
ドを有するかを調べることにより、そのウイルス株を判
別する。
【００２７】(5) 診断薬への応用 本発明により、ＰＮＤペプチドの二次構造と抗体のウイ
ルス中和活性とが密接に関係していることが開示され
た。このような二次構造のグルーピングに基づいた各グ
ループ特異的なペプチドまたは抗体の存在を調べること
は、ＨＩＶ感染患者における将来のＡＩＤＳ発病を推測
するうえでは重要な手段と考えられる。従って、本発明
のＰＮＤペプチドのグルーピングに基づいた各グループ
特異的なｇＰ１２０抗原またはＰＮＤを認識する抗体の
測定を目的とした測定キットが本発明により提供される
ものである。抗原／抗体測定キットの具体的な形態とし
ては、通常の測定キットに使用されている技術が選択的
に用いられる。
ルス中和活性とが密接に関係していることが開示され
た。このような二次構造のグルーピングに基づいた各グ
ループ特異的なペプチドまたは抗体の存在を調べること
は、ＨＩＶ感染患者における将来のＡＩＤＳ発病を推測
するうえでは重要な手段と考えられる。従って、本発明
のＰＮＤペプチドのグルーピングに基づいた各グループ
特異的なｇＰ１２０抗原またはＰＮＤを認識する抗体の
測定を目的とした測定キットが本発明により提供される
ものである。抗原／抗体測定キットの具体的な形態とし
ては、通常の測定キットに使用されている技術が選択的
に用いられる。
【００２８】
【実施例】以下、本発明の理解を深めるために実施例に
沿って説明するが、本発明はこれらの実施例に限定され
るものではない。
沿って説明するが、本発明はこれらの実施例に限定され
るものではない。
【００２９】実施例１１) ＨＩＶ−ＰＮＤの大腸菌における発現 ＨＩＶ感染ＰＢＭＮＣ（抹消血単核球）は、ＲＴ活性陽
性のＨＩＶ感染者の血液からリンパ球分離液を用いて単
離した。ＨＩＶ感染者のＰＮＤをコードするＤＮＡフラ
グメントは、このＰＢＭＮＣから単離・精製されたゲノ
ムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（polymerase chain react
ion）法により増幅した。このＰＣＲに用いた増幅用の
プライマーは次のとうりである、5'primer:(5')6540-GG
ATCCACACATGGAATTAGGCCAGAT-6562(3')と3'primer:(3')6
892-AGTCCTCCCCTGGGTCTTTAAACTGACGTC-6913(5')、両端
の番号はＨＩＶゲノムに於けるプライマー位置を塩基の
番号で示した(L.Ratner et al., Nature 313, 277, 198
5)。増幅されたＤＮＡフラグメントは，制限酵素BamHＩ
とPstＩで消化した後，ｐＵＥＸ１プラスミド（Amersha
m社）の同じ制限酵素サイトに挿入した。得られたプラ
スミドを含む大腸菌形質転換体（宿主は大腸菌ＨＢ１０
１株，宝酒造株式会社より市販）を１０mlのＬ培地で２
時間培養し、その後培養温度を３７℃から４２℃へシフ
トし、その後更に２時間培養を続けることによって、目
的とするＰＮＤをβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白の
形で発現させた。
性のＨＩＶ感染者の血液からリンパ球分離液を用いて単
離した。ＨＩＶ感染者のＰＮＤをコードするＤＮＡフラ
グメントは、このＰＢＭＮＣから単離・精製されたゲノ
ムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（polymerase chain react
ion）法により増幅した。このＰＣＲに用いた増幅用の
プライマーは次のとうりである、5'primer:(5')6540-GG
ATCCACACATGGAATTAGGCCAGAT-6562(3')と3'primer:(3')6
892-AGTCCTCCCCTGGGTCTTTAAACTGACGTC-6913(5')、両端
の番号はＨＩＶゲノムに於けるプライマー位置を塩基の
番号で示した(L.Ratner et al., Nature 313, 277, 198
5)。増幅されたＤＮＡフラグメントは，制限酵素BamHＩ
とPstＩで消化した後，ｐＵＥＸ１プラスミド（Amersha
m社）の同じ制限酵素サイトに挿入した。得られたプラ
スミドを含む大腸菌形質転換体（宿主は大腸菌ＨＢ１０
１株，宝酒造株式会社より市販）を１０mlのＬ培地で２
時間培養し、その後培養温度を３７℃から４２℃へシフ
トし、その後更に２時間培養を続けることによって、目
的とするＰＮＤをβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白の
形で発現させた。
【００３０】２) ＨＩＶ−ＰＮＤのアミノ酸配列の決定 １)で得られた大腸菌形質転換体を１０mlのＬ培地に懸
濁した。３７℃で約１２時間培養した後、菌体を遠心に
より回収しアルカリ法を用いてプラスミドDNAを単離し
た。得られたプラスミドDNAをアルカリ変性し、シーケ
ンス用プライマー、(5')6569-CAACTCAACTGCTGTTAAATGG-
6589 (3')とアニールさせた後ダイデオキシ法によりそ
の塩基配列を決定した。
濁した。３７℃で約１２時間培養した後、菌体を遠心に
より回収しアルカリ法を用いてプラスミドDNAを単離し
た。得られたプラスミドDNAをアルカリ変性し、シーケ
ンス用プライマー、(5')6569-CAACTCAACTGCTGTTAAATGG-
6589 (3')とアニールさせた後ダイデオキシ法によりそ
の塩基配列を決定した。
【００３１】３) 発現ＰＮＤ蛋白の精製 ＰＮＤ融合蛋白の精製は、以下に示すような手順で行っ
た。温度インダクションの終了した培養液から菌体を回
収し、これに50 mMのリン酸バッファー（pH 7.5）1mlと
グラスビーズを１mlを加え激しく振とうして大腸菌体を
破壊した。10mMEDTAを含むリン酸バッファーで菌体を２
回洗浄した後、1mg/mlのリゾチームを含むリン酸バッフ
ァーに菌体を懸濁し、約２時間酵素による消化を行っ
た。菌体を更に0.5% トリトンX-100を含むリン酸バッファー
で２回、続いてリン酸バッファーで２回洗浄した後、8M
尿素で可溶化した。遠心により非可溶化画分を取り除
いて、その上清を精製画分として回収した。Bio-Rad社
製のブラッドフォードプロテイン測定キットを用いてそ
の蛋白濃度を決定した。
た。温度インダクションの終了した培養液から菌体を回
収し、これに50 mMのリン酸バッファー（pH 7.5）1mlと
グラスビーズを１mlを加え激しく振とうして大腸菌体を
破壊した。10mMEDTAを含むリン酸バッファーで菌体を２
回洗浄した後、1mg/mlのリゾチームを含むリン酸バッフ
ァーに菌体を懸濁し、約２時間酵素による消化を行っ
た。菌体を更に0.5% トリトンX-100を含むリン酸バッファー
で２回、続いてリン酸バッファーで２回洗浄した後、8M
尿素で可溶化した。遠心により非可溶化画分を取り除
いて、その上清を精製画分として回収した。Bio-Rad社
製のブラッドフォードプロテイン測定キットを用いてそ
の蛋白濃度を決定した。
【００３２】４) 発現ＰＮＤ蛋白と中和モノクローナル
抗体との結合活性 精製した抗原を約1000倍希釈（2μg/ml）の初期濃度で
２倍連続希釈し、９６ウェルプレート（マックスソー
プ：ヌンク社製）に100 μl/穴でコートした。２％ＢＳ
Ａ溶液でブロックした後、４μg/mlの中和モノクローナ
ル抗体（μ5.5：特願平2-188300号）を加えて、３７℃
で２時間インキュベートした。0.1%Tween20/ＰＢＳで３
回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロ
ブリン抗体溶液（カッペル社製、5,000倍希釈）を100
μl/穴加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、
0.1%Tween20/ＰＢＳで5回洗浄し、その後ＴＭＢＺ基質
溶液を加え、常法により発色させ、その吸光度を波長45
0nmにて測定した。こうして発現ＰＮＤ蛋白と中和モノ
クローナル抗体との反応性を調べた結果、HIV-MN株に対
する発現ＰＮＤ蛋白は、HIV-MN株に対する中和モノクロ
ーナル抗体μ5.5と強く反応し、又この中和モノクロー
ナル抗体は他の株（例えばHIV-IIIB=H9/HTLV-IIIB(ATCC
No. CRL8543)、HIV-RF）の発現ＰＮＤとは反応しなか
った。逆にHIV-IIIB株に対する中和モノクローナル抗体
（0.5β）は、HIV-IIIB株の発現ＰＮＤとは反応する
が、HIV-MN株の発現ＰＮＤとは反応しなかった。これら
の結果は、今回用いた検出系の特異性を示唆するもので
ある。同じ様な手法でＨＩＶ感染者由来の発現ＰＮＤに
対するHIV-MN株に対する中和モノクローナル抗体の結合
活性を調べた。その結果を表１に示した。
抗体との結合活性 精製した抗原を約1000倍希釈（2μg/ml）の初期濃度で
２倍連続希釈し、９６ウェルプレート（マックスソー
プ：ヌンク社製）に100 μl/穴でコートした。２％ＢＳ
Ａ溶液でブロックした後、４μg/mlの中和モノクローナ
ル抗体（μ5.5：特願平2-188300号）を加えて、３７℃
で２時間インキュベートした。0.1%Tween20/ＰＢＳで３
回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロ
ブリン抗体溶液（カッペル社製、5,000倍希釈）を100
μl/穴加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、
0.1%Tween20/ＰＢＳで5回洗浄し、その後ＴＭＢＺ基質
溶液を加え、常法により発色させ、その吸光度を波長45
0nmにて測定した。こうして発現ＰＮＤ蛋白と中和モノ
クローナル抗体との反応性を調べた結果、HIV-MN株に対
する発現ＰＮＤ蛋白は、HIV-MN株に対する中和モノクロ
ーナル抗体μ5.5と強く反応し、又この中和モノクロー
ナル抗体は他の株（例えばHIV-IIIB=H9/HTLV-IIIB(ATCC
No. CRL8543)、HIV-RF）の発現ＰＮＤとは反応しなか
った。逆にHIV-IIIB株に対する中和モノクローナル抗体
（0.5β）は、HIV-IIIB株の発現ＰＮＤとは反応する
が、HIV-MN株の発現ＰＮＤとは反応しなかった。これら
の結果は、今回用いた検出系の特異性を示唆するもので
ある。同じ様な手法でＨＩＶ感染者由来の発現ＰＮＤに
対するHIV-MN株に対する中和モノクローナル抗体の結合
活性を調べた。その結果を表１に示した。
【００３３】
【表１】
【００３４】５) 発現ＰＮＤ蛋白の二次構造の解析 HIV-MN株に対する中和モノクローナル抗体とＨＩＶ感染
者由来の発現ＰＮＤとの結合性を指標にして、グループ
分けしそれらのＰＮＤをコードするアミノ酸配列を明ら
かにした。得られたアミノ酸配列をロブソンの蛋白二次
構造解析プログラム［市販のパソコン用ソフト；ＧＥＮ
ＥＴＹＸ Ver.7、各種パラメータは出荷時の設定］
（一般には、Garnier-Osguthorpe-Robson法：ＧＯＲ法
として知られる［J. Mol. Biol. 120, 97-120 (197
8)］）を用いて処理した結果、抗体と反応する群のＰＮ
Ｄにアミノ酸の一次配列上の共通性はないが、二次構造
上の共通性があることが分かった。その領域は、ＰＮＤ
前半部のβストランド−ＧＰＧＲ領域に相当する領域で
ある。この領域の二次構造以上の高次構造を認識しうる
抗体が、グループ特異的にＨＩＶウイルスを中和しうる
抗体である可能性が示唆された。その結果を「図１」、
「図２」および「図３」に示した。ＰＮＤ前半部のβス
トランド−ＧＰＧＲ領域との距離から見た構造の種類か
ら、現在報告されているＰＮＤのアミノ酸配列は、６種
のグループに分類することができた。そして主要３グル
ープで全体の約９０％に達した。この結果を表２に示し
た。
者由来の発現ＰＮＤとの結合性を指標にして、グループ
分けしそれらのＰＮＤをコードするアミノ酸配列を明ら
かにした。得られたアミノ酸配列をロブソンの蛋白二次
構造解析プログラム［市販のパソコン用ソフト；ＧＥＮ
ＥＴＹＸ Ver.7、各種パラメータは出荷時の設定］
（一般には、Garnier-Osguthorpe-Robson法：ＧＯＲ法
として知られる［J. Mol. Biol. 120, 97-120 (197
8)］）を用いて処理した結果、抗体と反応する群のＰＮ
Ｄにアミノ酸の一次配列上の共通性はないが、二次構造
上の共通性があることが分かった。その領域は、ＰＮＤ
前半部のβストランド−ＧＰＧＲ領域に相当する領域で
ある。この領域の二次構造以上の高次構造を認識しうる
抗体が、グループ特異的にＨＩＶウイルスを中和しうる
抗体である可能性が示唆された。その結果を「図１」、
「図２」および「図３」に示した。ＰＮＤ前半部のβス
トランド−ＧＰＧＲ領域との距離から見た構造の種類か
ら、現在報告されているＰＮＤのアミノ酸配列は、６種
のグループに分類することができた。そして主要３グル
ープで全体の約９０％に達した。この結果を表２に示し
た。
【００３５】
【表２】
【００３６】実施例２１) 合成ペプチドのモルモット免疫 ５種のグループの各代表ＰＮＤペプチド（合計13個）を
ABI430Aペプチドシンセサイザー（アプライド・バイオ
システム社）を用いて化学合成した。そのアミノ酸配列
を表３に示した。これらの合成ペプチドをＫＬＨ（キー
ホールリンペットヘモシアニン）と結合させ、ペプチド
−ＫＬＨコンジュゲートを作製した。これらを100μg/d
oseとしてフロイントの完全アジュバント（初回免
疫）、フロイントの不完全アジュバント（２回目免疫）
と共に２週間間隔でモルモットに免疫した後、更に２週
間後、アジュバント無しで１日間隔２回の追加免疫を全
て皮内に行った。最終免疫から１週間後にモルモットを
全採し、血清としてハーベストした。これらの血清を40
％硫安にて部分精製し、以下の中和試験に用いた。
ABI430Aペプチドシンセサイザー（アプライド・バイオ
システム社）を用いて化学合成した。そのアミノ酸配列
を表３に示した。これらの合成ペプチドをＫＬＨ（キー
ホールリンペットヘモシアニン）と結合させ、ペプチド
−ＫＬＨコンジュゲートを作製した。これらを100μg/d
oseとしてフロイントの完全アジュバント（初回免
疫）、フロイントの不完全アジュバント（２回目免疫）
と共に２週間間隔でモルモットに免疫した後、更に２週
間後、アジュバント無しで１日間隔２回の追加免疫を全
て皮内に行った。最終免疫から１週間後にモルモットを
全採し、血清としてハーベストした。これらの血清を40
％硫安にて部分精製し、以下の中和試験に用いた。
【００３７】
【表３】
【００３８】２) 各モルモット免疫血清と各種ＰＮＤ合
成ペプチドとの結合試験 実施例１の３)で示したＥＩＡ法にて各部分精製モルモ
ット血清と各種ＰＮＤ合成ペプチドとの結合活性を調べ
た。結果を表４に示した。結合活性は、ＥＩＡにおける
ＯＤ280が0.5を示す血清の希釈倍数として表した。各グ
ループの血清は、同一グループ内のペプチド群と高く共
通に反応しており、充分にペプチド特異的抗体が誘導さ
れていることが判る。
成ペプチドとの結合試験 実施例１の３)で示したＥＩＡ法にて各部分精製モルモ
ット血清と各種ＰＮＤ合成ペプチドとの結合活性を調べ
た。結果を表４に示した。結合活性は、ＥＩＡにおける
ＯＤ280が0.5を示す血清の希釈倍数として表した。各グ
ループの血清は、同一グループ内のペプチド群と高く共
通に反応しており、充分にペプチド特異的抗体が誘導さ
れていることが判る。
【００３９】
【表４】
【００４０】３) 各モルモット免疫血清を用いた中和試
験 中和試験に用いたウイルスは、各ＰＮＤアミノ酸シーク
エンスを有する患者からの分離ウイルス及びそのクロー
ン化ウイルス（104-106 TCID50/ml）である。ウイルス
のクローニングは、限界希釈法、又は、CD4-Helaの細胞
でのプラーク法を用いた。分離ウイルス及びそのクロー
ン化ウイルスについて、実施例１の２)に示したＰＣＲ
−シークエンス法によりＰＮＤのアミノ酸配列を再度確
認した（表３に示した）。
験 中和試験に用いたウイルスは、各ＰＮＤアミノ酸シーク
エンスを有する患者からの分離ウイルス及びそのクロー
ン化ウイルス（104-106 TCID50/ml）である。ウイルス
のクローニングは、限界希釈法、又は、CD4-Helaの細胞
でのプラーク法を用いた。分離ウイルス及びそのクロー
ン化ウイルスについて、実施例１の２)に示したＰＣＲ
−シークエンス法によりＰＮＤのアミノ酸配列を再度確
認した（表３に示した）。
【００４１】まず、各分離ウイルス及びそのクローン化
ウイルスを10 TCID50/50μlに調製し、部分精製した免
疫血清50μl（10倍段階希釈したもの）とを96穴の平底
カルチャープレートに播種し、37℃で１時間インキュベ
ートした。その後、ＭＴ４細胞を104個/100μl/穴（10
％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、3.5-4.0g/l、ペニシリン50
U/ml及びストレプトマイシン50μg/mlを含むRPMI1640の
培地に浮遊したもの）で添加し、５-６日間培養した。
感染時に生じる合胞体形成（シンシチウムフォーメーシ
ョン）を抗体が抑制するか否かで中和活性を判定した。
また、中和活性は細胞非介在型ウイルス感染（Cell-fre
eウイルス感染）による合胞体形成を100％抑制する血清
の最高希釈倍数として表した。これらの結果を表５に示
した。
ウイルスを10 TCID50/50μlに調製し、部分精製した免
疫血清50μl（10倍段階希釈したもの）とを96穴の平底
カルチャープレートに播種し、37℃で１時間インキュベ
ートした。その後、ＭＴ４細胞を104個/100μl/穴（10
％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、3.5-4.0g/l、ペニシリン50
U/ml及びストレプトマイシン50μg/mlを含むRPMI1640の
培地に浮遊したもの）で添加し、５-６日間培養した。
感染時に生じる合胞体形成（シンシチウムフォーメーシ
ョン）を抗体が抑制するか否かで中和活性を判定した。
また、中和活性は細胞非介在型ウイルス感染（Cell-fre
eウイルス感染）による合胞体形成を100％抑制する血清
の最高希釈倍数として表した。これらの結果を表５に示
した。
【００４２】
【表５】
【００４３】グループＩの血清は、グループＩのクロー
ン化ウイルスを特異的に中和し、他のグループのクロー
ン化ウイルスは中和できなかった。同様に、グループI
I、III、IV、Ｖの血清についても、夫々、同一のグルー
プのクローン化ウイルスを特異的に中和し、異なるグル
ープのクローン化ウイルスは中和できなかった。また、
同一グループ内の血清は、同一グループ内の他のクロー
ン化ウイルスを共通に中和できた。グループＩに属する
中和モノクローナル抗体（μ5.5）及びグループＶに属
する中和モノクローナル抗体（0.5β）を用いても同様
の結果であった。これらの結果から、実施例１の５)で
指摘したＨＩＶの血清型分類（６種類のグループ分類）
が正しいことが中和活性を指標に証明できた。
ン化ウイルスを特異的に中和し、他のグループのクロー
ン化ウイルスは中和できなかった。同様に、グループI
I、III、IV、Ｖの血清についても、夫々、同一のグルー
プのクローン化ウイルスを特異的に中和し、異なるグル
ープのクローン化ウイルスは中和できなかった。また、
同一グループ内の血清は、同一グループ内の他のクロー
ン化ウイルスを共通に中和できた。グループＩに属する
中和モノクローナル抗体（μ5.5）及びグループＶに属
する中和モノクローナル抗体（0.5β）を用いても同様
の結果であった。これらの結果から、実施例１の５)で
指摘したＨＩＶの血清型分類（６種類のグループ分類）
が正しいことが中和活性を指標に証明できた。
【００４４】また、クローン化していない分離ウイルス
に対して、中和試験を試みた。その結果を表６に示した
（中和活性はCell-freeウイルス感染による合胞体形成
を100％抑制する血清の最高希釈倍数として表した）。
各グループの血清は、夫々同一のグループの分離ウイル
スを特異的に中和できるものもあるが、中和できないも
のも存在した。これは、分離ウイルスの中には、単独の
血清では中和できない別のグループのウイルスも混在し
ているためと考えられた。
に対して、中和試験を試みた。その結果を表６に示した
（中和活性はCell-freeウイルス感染による合胞体形成
を100％抑制する血清の最高希釈倍数として表した）。
各グループの血清は、夫々同一のグループの分離ウイル
スを特異的に中和できるものもあるが、中和できないも
のも存在した。これは、分離ウイルスの中には、単独の
血清では中和できない別のグループのウイルスも混在し
ているためと考えられた。
【００４５】
【表６】
【００４６】このことを立証するため、次に、全てのグ
ループの血清を混ぜた混合血清による各分離ウイルスの
中和試験を試みた。その結果を表７（中和活性はCell-f
reeウイルス感染による合胞体形成を100％抑制する血清
の最高希釈倍数として表した）に示した。表６で中和で
きなかった分離ウイルスも混合血清によって全て中和さ
れた。このことより、グループＩ、II、III、IV、Ｖの
混合PNDペプチド調製物(各グループの代表で構成される
合計5種PNDペプチド調整物)は、あらゆるタイプのHIV-1
感染を防御できる中和抗体を誘導し、ワクチンとして有
効であることが証明された。
ループの血清を混ぜた混合血清による各分離ウイルスの
中和試験を試みた。その結果を表７（中和活性はCell-f
reeウイルス感染による合胞体形成を100％抑制する血清
の最高希釈倍数として表した）に示した。表６で中和で
きなかった分離ウイルスも混合血清によって全て中和さ
れた。このことより、グループＩ、II、III、IV、Ｖの
混合PNDペプチド調製物(各グループの代表で構成される
合計5種PNDペプチド調整物)は、あらゆるタイプのHIV-1
感染を防御できる中和抗体を誘導し、ワクチンとして有
効であることが証明された。
【００４７】
【表７】
【００４８】実施例３ 中和モノクローナル抗体混合物
の調製法１) 各グループ特異的な中和モノクローナル抗体の作製 本発明者らは、既に松下らにより報告されている0.5β
モノクローナル抗体（特願昭63-131226号）がグループ
Ｖに特異的な中和モノクローナル抗体であることを見い
だした。さらに、グループＩに特異的な中和モノクロー
ナル抗体として、μ5.5モノクローナル抗体を確立して
いる(特願平2-188300号)。
の調製法１) 各グループ特異的な中和モノクローナル抗体の作製 本発明者らは、既に松下らにより報告されている0.5β
モノクローナル抗体（特願昭63-131226号）がグループ
Ｖに特異的な中和モノクローナル抗体であることを見い
だした。さらに、グループＩに特異的な中和モノクロー
ナル抗体として、μ5.5モノクローナル抗体を確立して
いる(特願平2-188300号)。
【００４９】μ5.5 MoAbの作製法を一例として要約する
と以下のようになる。HTLV-IIIMN株(グループＩ)外被膜
糖蛋白質gp120のアミノ酸配列第303-325番目に対応する
合成ペプチド［YNKRKRIHIGPGRAFYTTKN(C)］とKLH(キー
ホールリンペットヘモシアニン)のコンジュゲート抗原
混合物各100μgをフロイントアジュバントとともにBALB
/cマウスに免疫した。免疫は腹腔内経路で3回接種した
後、静脈内経路で1回行い、その3日後に脾臓を摘出し、
マウスミエローマ細胞P3ｘ63Ag8-U1と常法にて細胞融合
を行った。
と以下のようになる。HTLV-IIIMN株(グループＩ)外被膜
糖蛋白質gp120のアミノ酸配列第303-325番目に対応する
合成ペプチド［YNKRKRIHIGPGRAFYTTKN(C)］とKLH(キー
ホールリンペットヘモシアニン)のコンジュゲート抗原
混合物各100μgをフロイントアジュバントとともにBALB
/cマウスに免疫した。免疫は腹腔内経路で3回接種した
後、静脈内経路で1回行い、その3日後に脾臓を摘出し、
マウスミエローマ細胞P3ｘ63Ag8-U1と常法にて細胞融合
を行った。
【００５０】HAT培地[正常の10％牛胎児血清含有RPMI培
地に、ヒポキサンチン(1×10-4M)、チミジン(1.5×10-3
M)及びアミノプテリン(4×10-7M)を加えたもの]及びHT
培地(HAT培地からアミノプテリンを除いたもの)でハイ
ブリドーマを選択培養し、融合後10-14日後に特異中和
クローンをスクリーニングした。すなわち、前述の合成
ペプチドを固相にしたEIA法、Hg/HTLV-IIIMN細胞を用い
た蛍光抗体法、さらに、HTLV-IIIMN精製ウイルスを用い
たウエスタンブロッティング法にて陽性クローンを選別
した。
地に、ヒポキサンチン(1×10-4M)、チミジン(1.5×10-3
M)及びアミノプテリン(4×10-7M)を加えたもの]及びHT
培地(HAT培地からアミノプテリンを除いたもの)でハイ
ブリドーマを選択培養し、融合後10-14日後に特異中和
クローンをスクリーニングした。すなわち、前述の合成
ペプチドを固相にしたEIA法、Hg/HTLV-IIIMN細胞を用い
た蛍光抗体法、さらに、HTLV-IIIMN精製ウイルスを用い
たウエスタンブロッティング法にて陽性クローンを選別
した。
【００５１】これら陽性クローンの培養上清又はマウス
腹水調製物を用いて、常法により中和試験を行った。中
和活性は、HTLV-IIIMNウイルスのMT4細胞への感染時に
生ずる合胞体形成(シンシチウムフォーメーション)を抗
体が抑制するか否かで判定した。
腹水調製物を用いて、常法により中和試験を行った。中
和活性は、HTLV-IIIMNウイルスのMT4細胞への感染時に
生ずる合胞体形成(シンシチウムフォーメーション)を抗
体が抑制するか否かで判定した。
【００５２】このようにして、HTLV-IIIMN株(グループ
Ｉ)特異的な中和モノクローナル抗体産生のハイブリド
ーマμ5.5(工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号
第11594号(FERM P-11594)として寄託している)が得られ
た。
Ｉ)特異的な中和モノクローナル抗体産生のハイブリド
ーマμ5.5(工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号
第11594号(FERM P-11594)として寄託している)が得られ
た。
【００５３】性状解析の結果より、μ5.5 MoAbは、HTLV
-IIIMNの外被膜糖蛋白質gp120と特異的に結合し、ウイ
ルスの細胞非介在型ウイルス感染（cell-free ウイルス
感染）を僅か1μg/mlの抗体濃度で完全に阻害する。さ
らに細胞介在型ウイルス感染（cell to cell ウイルス
感染）を16μg/mlの抗体濃度で阻害する非常に強い中和
活性を有するモノクローナル抗体であることが判明し
た。また、今回の実験(表５、表６)で、同一グループ
(グループＩ)内の他の分離ウイルスも中和することので
きる有効な抗体であることも示された。
-IIIMNの外被膜糖蛋白質gp120と特異的に結合し、ウイ
ルスの細胞非介在型ウイルス感染（cell-free ウイルス
感染）を僅か1μg/mlの抗体濃度で完全に阻害する。さ
らに細胞介在型ウイルス感染（cell to cell ウイルス
感染）を16μg/mlの抗体濃度で阻害する非常に強い中和
活性を有するモノクローナル抗体であることが判明し
た。また、今回の実験(表５、表６)で、同一グループ
(グループＩ)内の他の分離ウイルスも中和することので
きる有効な抗体であることも示された。
【００５４】以上のようにして、グループＩ特異的な中
和モノクローナル抗体は確立されたのであるが、他のグ
ループの合成ペプチドを免疫原に用いることにより、同
様の手法で、グループII、グループIII、グループIV特
異的な中和モノクローナル抗体が確立され得る。従っ
て、前述した表５、６、７の実験で示されたように、全
グループの中和モノクローナル抗体を混合すること[各
グループの代表で構成される合計5種混合抗体；具体的
にはμ5.5 MoAb、0.5β MoAbにグループII、III、IVの
代表3種を加えたもの]により、あらゆるHIV-1の感染を
防御し(感染事故や母子間感染にも有効)、既感染者の感
染拡大防止等の治療にも有効であることが証明された。
和モノクローナル抗体は確立されたのであるが、他のグ
ループの合成ペプチドを免疫原に用いることにより、同
様の手法で、グループII、グループIII、グループIV特
異的な中和モノクローナル抗体が確立され得る。従っ
て、前述した表５、６、７の実験で示されたように、全
グループの中和モノクローナル抗体を混合すること[各
グループの代表で構成される合計5種混合抗体；具体的
にはμ5.5 MoAb、0.5β MoAbにグループII、III、IVの
代表3種を加えたもの]により、あらゆるHIV-1の感染を
防御し(感染事故や母子間感染にも有効)、既感染者の感
染拡大防止等の治療にも有効であることが証明された。
【００５５】さらに、これらのマウス型中和モノクロー
ナル抗体は、その可変領域とヒトIgG定常領域を遺伝子
組換えで結合させ、ヒト型キメラ中和モノクローナル抗
体として、副作用の少ない実際の臨床応用可能な抗体混
合物を提供し得るものである。このようなヒト型キメラ
抗体の作製法については、先の特願昭63-171385号等に
詳細に開示されている。
ナル抗体は、その可変領域とヒトIgG定常領域を遺伝子
組換えで結合させ、ヒト型キメラ中和モノクローナル抗
体として、副作用の少ない実際の臨床応用可能な抗体混
合物を提供し得るものである。このようなヒト型キメラ
抗体の作製法については、先の特願昭63-171385号等に
詳細に開示されている。
【００５６】
【発明の効果】本発明は、ＰＮＤの構造と中和との関係
を明かにし、グループ特異的な中和抗体によってＰＮＤ
をグループ化できることを初めて開示した。本発明のＰ
ＮＤの分類方法に従ってペプチドまたは中和抗体を少な
くとも２種以上選択すれば、数多いＨＩＶ変異株に対し
て有効なペプチド調製物および抗体調製物を効率よく調
製することが可能となる。特にグループＩ、IIおよびII
Iからそれぞれ選択される主な３種のペプチドもしくは
中和抗体を用いることで実用的には十分有効であると考
えられるＨＩＶ感染の９０％をカバーし、さらに主な５
種を用いることでＨＩＶ感染のほぼ１００％のカバーす
ることが可能な免疫調製物を得ることが可能となる。す
なわち、本発明は、新しいＰＮＤ分類法の開示によりＨ
ＩＶ感染を対象とした実用可能なワクチン、中和抗体及
び診断薬の開発を可能にするものである。
を明かにし、グループ特異的な中和抗体によってＰＮＤ
をグループ化できることを初めて開示した。本発明のＰ
ＮＤの分類方法に従ってペプチドまたは中和抗体を少な
くとも２種以上選択すれば、数多いＨＩＶ変異株に対し
て有効なペプチド調製物および抗体調製物を効率よく調
製することが可能となる。特にグループＩ、IIおよびII
Iからそれぞれ選択される主な３種のペプチドもしくは
中和抗体を用いることで実用的には十分有効であると考
えられるＨＩＶ感染の９０％をカバーし、さらに主な５
種を用いることでＨＩＶ感染のほぼ１００％のカバーす
ることが可能な免疫調製物を得ることが可能となる。す
なわち、本発明は、新しいＰＮＤ分類法の開示によりＨ
ＩＶ感染を対象とした実用可能なワクチン、中和抗体及
び診断薬の開発を可能にするものである。
【図１】 実施例１の５)における、各種ＰＮＤペプチ
ドをロブソンらの蛋白質二次構造解析プログラムにより
解析したチャートを示す。
ドをロブソンらの蛋白質二次構造解析プログラムにより
解析したチャートを示す。
【図２】 実施例１の５)における、各種ＰＮＤペプチ
ドをロブソンらの蛋白質二次構造解析プログラムにより
解析したチャートを示す(図１の続き)。
ドをロブソンらの蛋白質二次構造解析プログラムにより
解析したチャートを示す(図１の続き)。
【図３】 ＰＮＤ前半領域が示す理論上の二次構造を基
にＰＮＤを分類する本発明の方法に従った、分類の各グ
ループ（Ｉ〜VI）とそれぞれのグループに属するＰＮＤ
ペプチドの前半領域の二次構造のチャートを示す。
にＰＮＤを分類する本発明の方法に従った、分類の各グ
ループ（Ｉ〜VI）とそれぞれのグループに属するＰＮＤ
ペプチドの前半領域の二次構造のチャートを示す。
【図４】 種々のHIV分離株におけるPNDペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。
ノ酸配列を示す。
【図５】 種々のHIV分離株におけるPNDペプチドのアミ
ノ酸配列を示す(図４の続き)。
ノ酸配列を示す(図４の続き)。
【図６】 種々のHIV分離株におけるPNDペプチドのアミ
ノ酸配列を示す(図５の続き)。
ノ酸配列を示す(図５の続き)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ 8415−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/48 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (10)
- 【請求項１】 ＨＩＶ−ｇＰ１２０の少なくとも２種以
上のＰＮＤペプチドからなる免疫調製物であって、該Ｐ
ＮＤペプチドが下記のグループＩからＶのうち少なくと
も２つ以上のグループから選択されることを特徴とする
ペプチド調製物。ＰＮＤペプチドのアミノ酸配列をロブ
ソンのアミノ酸二次構造解析法（ＧＯＲ法）に従って解
析した場合に得られる、ＧＰＧＲ領域直前の７つのアミ
ノ酸配列の二次構造予測が、 (Ｉ) グループＩ：XXXBBBXと判別されるアミノ酸配列を
有するＰＮＤペプチド (II) グループII：XXBBBBXと判別されるアミノ酸配列を
有するＰＮＤペプチド (III)グループIII：XXXBBBBと判別されるアミノ酸配列
を有するＰＮＤペプチド (IV) グループIV：XXBBBBBと判別されるアミノ酸配列を
有するＰＮＤペプチド (Ｖ) グループＶ：XBBBBBXと判別されるアミノ酸配列を
有するＰＮＤペプチド （B：βストランド構造、X：ターンまたはコイル構造） - 【請求項２】 ＰＮＤペプチドが、少なくともグループ
Ｉ、グループIIおよびグループIIIからそれぞれ選択さ
れる請求項１に記載のペプチド調製物。 - 【請求項３】 ＰＮＤペプチドが、グループＩからグル
ープＶのいずれのグループからもそれぞれ選択される請
求項１に記載のペプチド調製物。 - 【請求項４】 ＨＩＶ−ｇＰ１２０のＰＮＤペプチドに
対する少なくとも２種以上の特異的中和抗体からなる免
疫調製物であって、該中和抗体が下記のグループＩ′か
らＶ′のうち少なくとも２つ以上のグループから選択さ
れることを特徴とする抗体調製物。 (Ｉ) グループＩ′：請求項１に記載のグループＩに属
するＰＮＤペプチドを特異的に認識する中和抗体、 (II) グループII′：請求項１に記載のグループIIに属
するＰＮＤペプチドを特異的に認識する中和抗体、 (III)グループIII′：請求項１に記載のグループIIIに
属するＰＮＤペプチドを特異的に認識する中和抗体、 (IV) グループIV′：請求項１に記載のグループIVに属
するＰＮＤペプチドを特異的に認識する中和抗体、 (Ｖ) グループＶ′：請求項１に記載のグループＶに属
するＰＮＤペプチドを特異的に認識する中和抗体 - 【請求項５】 該中和抗体が、少なくともグループ
Ｉ′、グループII′およびグループIII′からそれぞれ
選択される請求項４に記載の抗体調製物。 - 【請求項６】 該中和抗体が、グループＩ′からグルー
プＶ′のいずれのグループからもそれぞれ選択される請
求項４に記載の抗体調製物。 - 【請求項７】 いずれかのグループの中和抗体が、モノ
クローナル抗体である請求項４〜６のいずれかに記載の
抗体調製物。 - 【請求項８】 いずれのグループの中和抗体も、すべて
モノクローナル抗体である請求項４〜６のいずれかに記
載の抗体調製物。 - 【請求項９】 該モノクローナル抗体がＰＮＤペプチド
の二次構造以上の高次構造を認識する中和抗体である請
求項７または８に記載の抗体調製物。 - 【請求項１０】 ＨＩＶ−ＤＮＡゲノムまたはその一部
の遺伝子を抽出し、これを大腸菌ベクターに組み込むこ
とによりＨＩＶ−ＤＮＡをクローニングし、次にＨＩＶ
−ｅｎｖｇＰ１２０のＰＮＤに相当する領域のＤＮＡ配
列を決定し、得られた塩基配列に基づくＰＮＤアミノ酸
一次配列をロブソンらの蛋白質二次構造解析法（ＧＯＲ
法）により解析することにより、請求項１に記載のグル
ープＩ〜グループＶのいずれのグループに属するＰＮＤ
ペプチドを有するかを調べることを特徴とするヒト免疫
不全ウイルス株の判別方法。
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