JPH05502998A - 望ましい細胞接着効果をもつ表面 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７６、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポ リ（エチロキサプリン）、またはポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）である、請求項 ６７の物質の構成または請求項６８の細胞培養基質。

７７、水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオ キシド）である、請求項６７の物質の構成または請求項６８の細胞培養基質。

７８、水溶性ポリマーは、５０００より大きく、１０００００より小さな分子量 をもつ、請求項７７の構成または基質。

７９、水溶性ポリマーは、分子量が５０００より大きく、１０００００より小さ い、請求項６７の物質の構成または請求項６８の細胞培養基質。

８０、水溶性ポリマーは、約１８５００の分子量をもつ、請求項６７の物質の構 成または請求項６８の細胞培養基質。

８１、ベースポリマー及び水溶性ポリマーは、少なくとも１つの共通の溶媒をも つ、請求項６７の物質の構成または請求項６８の細胞培養基質。

８２、ベース重合基質の少なくとも一部を溶解しつる溶媒で、水溶性ポリマーの 溶液を作る工程、ベース重合基質の表面の重合成分をゆるめる溶液で、ベース重 合基質を処理する工程：及びゆるめた表面ポリマー成分を元の位置にもどし、そ れによって水溶性ポリマーの内部に入り込んだ鎖か補集されるように、処理した ベース重合基質を停止溶媒にさらす工程からなる、水溶性ポリマー鎖か内部に入 り込むネットワークを備えた表面をもっベース重合基質を作成する方法。

８３、ベース重合基質は、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ウレタン） 、ポリ（スチレン）またはポリ（メチルメタクリレート）、及び水溶性ポリマー は、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルピ ロリドン）、またはポリ（エチロキサプリン）である、請求項８２の方法。

８４、溶媒は、トリフルオロ酢酸水溶液、テトラヒドロフラン水溶液またはアセ トン水溶液である、請求項８２の方法。

８５、重合基質はポリ（エチレンテレフタレート）である請求項８２の方法。

８６、重合基質はポリ（エチレンテレフタレート）であり、水溶性ポリマーはポ リ（エチレンオキシド）またはポリ（エチレングリコール）である請求項８２の 方法。

８７、ベース重合基質は、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ウレタン） またはポリ（メチルメタクリレート）である請求項８２の方法。

８８、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシ ド）、ポリ（ビニルピロリドン）、またはポリ（エチルオキサゾリン）である請 求項８２の方法。

８９、水溶性ポリマーは、５０００より大きく、１０００００より小さな分子量 をもつ、請求項８２または８６の方法。

９０、水溶性ポリマーは約１８５００の分子量をもつ、請求項８２または８６の 方法。

９１、水溶性ポリマーは単独重合体である、請求項８２または８６の方法。

９２、停止ポリマーは水溶性ポリマーを溶解するが、重合基質は溶解しない、請 求項８２の方法。

９３、停止溶媒は水である請求項８２の方法。

９４、停止溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミド 、テトラヒドロフランまたはベンゼンである、請求項８２の方法。

９５、停止溶媒は、重合基質及び水溶性重合基質に対、し非溶媒であり、最終工 程には、請求項９２に述べた停止溶媒のすすぎが加えられる、請求項８２の方法 。

浄書（内容に変更なし） 明　細　書 望ましい細胞接着効果をもつ表面 これは、１９８９年９月２８日に提出されたユナイテドステーツ出願番号Ｎｏ、 ４１４．１４４の一部継続出願である。Ｕ、Ｓ政府は、関連の開発内容は、国立 科学財団認可ＣＢＴ−８８１０２０２６８、及び国立衛生研究所認可ＨＬ−３９ ７１４により支持されたものとして本発明に権利を育するものである。

望ましい細胞接着効果をもつ表面 本発明の分野は、一般的には、表面への生物特有の細胞の付着に関係する。さら に特性的には、本発明は、細胞付着を促進するために表面の化学修飾と、そこへ 共有結合で付着する小さなペプチドに関係する。さらに特徴的であるのは、表面 がセラミック、金属またはポリマーからなることであろう。小さなペプチドは、 細胞付着を促進し、色々な細胞付着分子に共通している最小の細胞受容体認識ア ミノ酸配列を含んでいる。本発明の表面及び方法は、かくして、培養基血清組成 にも吸着表面タンパク質にも無関係な細胞付着技術に関するものである。

さらに、本発明の分野は、表面を極度に細胞に接着させないようにする溶液加工 技術による重合材料の修飾に関する。このような表面は、生体医療及び生物工学 の分野で重要な応用性をもっている。さらに、本分野は、細胞付着型で、またあ る細胞型には特に付着するが他の細胞型には付着しない特別の利点をもった表面 を得るために、これらの付着しない表面に細胞付着ペプチドを付着することに関 するものである。

Ｉｎ　ｖｉｖｏにおける細胞と細胞外マトリックスとの相互作用は、たとえば細 胞成長調節、細胞の移動また分化のような重要な多くの生物過程に包含される。

培養における真核細胞の付着の役割りは、特別な細胞培養の努力や試みを大いに 成功に導いている。固体物質の付着、伸展及び収縮は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞 に依存する、正常な足場依存性細胞の成長のため予め必要なものである（１．２ ）。

この細胞の生物付着は、特殊な細胞の型、使用される細胞培養基、培養される細 胞の特別な表面を含む色々の要因によって影響される。

多くの哺乳動物細胞は、ポリマー表面で培養される。

合成ポリマー表面に付着するほとんどすべての哺乳動物細胞は、吸着されたタン パク質に制御され、受容体へ仲介される。

ある種のトリ及び哺乳動物細胞型の細胞外基質への付着の際に含まれていること か示された最初の細胞付着分子（ＣＡＭ）は、フィブロネクチン（ＦＮ）であっ た（３．４）。ＦＮは、通常血清の付加によって低温不溶性のグロブリン（Ｃ１ ｇ）として知られた形態で環境に与えられている。正常な細胞の付着及び伸展が 生ずるためには、ＣＩｇか培地表面に吸着されなければならないことか見出され た（５．６）。

ＦＮはいくつかのプロテアーゼ−抵抗性ドメインから成り、それぞれか他の細胞 外分子及び細胞表面と結合する特別な部位をもっている（７）。細胞付着活性は 、トリペプチド配列（ＲＧＤ）に局在化し、いくつかの他のＣＡＭ　（８）にお ける場合と同様に、ＦＮの細胞結合ドメインに位置してきた。直接基質に吸着さ れた基質−結合のＲＧＤ−含有ペプチド、あるいは、吸着アルブミンまたは［ｇ Ｇに交差結合したペプチドは、繊維芽細胞の付着及び伸展を促進することが発見 された。この付着及び伸展活性は、培地に可溶性ＲＧＤ含有ペプチドを添加する ことによって容易に阻害されることが発見された（８）。

合成ＲＧＤ含有ペプチドを利用して特別な溶出と結合した細胞付着−促進ＦＮフ ラグメントにおける細胞抽出の親和性クロマトグラフ法により、２つの１４０Ｋ Ｄサブユニツトをもつ受容体が生成された（９）。哺乳動物ＦＮ受容体とその他 のＲＧＤ指向型受容体は、２つの基質、アルファ及びベーターの典型的な異種二 量体である（１０）。これらの受容体の科は、同じようなベーターサブユニット のメンバーからなるが、アルファサブユニットは、もっと異なっており、一つま たはいくつかのＣＡＭに対する受容体の親和性が制限されている（１１）。まと めて、これらの構造的また機能的に関係のある受容体群は、インテグリン　スー パーファミリーとして知られている（１２．１３）。

細胞付着の過程の基になっている分子機構の基礎的な理解により、細胞付着を促 進する上での細胞培養基質と他の表面の役割りに関して研究か進められてきた。

基本的に、タンパク質溶液が培養基質に加えられた後、タンパク質は直ちに表面 に吸着される。もし、細胞表面にこれらの吸着されたタンパク質の受容体かあり 、もしも吸着されたタンパク質の形態が高い配位子−受容体の親和性を破壊する 程吸着によって広範囲に変らなければ、培養基質への細胞の付着と細胞の伸展が 結果的に生ずるはずである。

もしも、吸着されるタンパク質がない基質上に細胞が種をまかれれば、そこで細 胞表面のタンパク質が直接表面に吸着し、もし良い條件が与えられれば、細胞は それ自体のタンパク質を、細胞外マトリックスを形成している表面へ向けて分泌 するだろう。しかしながら、もしも、基質がタンパク質の吸着を支えないか、ま たは、高い親和性のタンパク質の吸着を支えても、細胞−表面受容体がなければ 、そこで基質は細胞吸着を支えないだろう。

培養基内の細胞は、これらの媒介となる吸着されるタンパク質を経由する以外、 どんな場合でも実際に表面に接触することはなかった。

短期間の細胞付着を研究しているある研究者らは、ポリマー表面に特殊なペプチ ドが吸着されるような細胞付着を促進する基質処理方式の使用を提唱した。たと えば、Ｓｔｉｎｇｅｒらは、細胞付着を促進するために、ポリマー基質上に、Ｒ ＧＤ配列を含む１３−ｍａｒペプチドの吸着を提案した（１４）。しかしながら 、この長さのペプチドは、高温で分解されやすく、また、培養された細胞自体の タンパク質加水分解作用に大いに影響されやすいことが発見された。さらに、表 面に吸着されたペプチドは、繰返し使用で脱離されやすくなる。従って長いアミ ノ酸残基ペプチドと表面の吸着物は不安定であり、再使用できる細胞培養基質を 作るには不適当なことが判明した。

細胞付着を促進するもう一方の方法は、タンパク質とペプチドの基質への吸着と 付着を容易にするように表面を化学的に修飾する方法である。しかしながら、基 質の化学的修飾に関する現在の技術は、特に非特性的でかつ経験的である。たと えば、各種のラジオ周波数プラズマ放出によるポリマー表面処理か、重合化及び 非重合化の両方の場合について提案された。表面酸処理または電荷グループの表 面融合のような別の方法もまた発表された。

しかしなから、これら色々の表面処理は、単に培養表面のタンパク質吸着のパタ ーンを変え、細胞の特徴的な付着と伸展の挙動を修飾するために機能しているに 過ぎない。従って、タンパク質とペプチド表面の吸着と脱離の問題は依然として 残り、処理された培養プレートと他の表面の再使用は制限される。

細胞付着を促進するためのペプチドの表面吸着への別法は、代りに、化学的にペ プチドを表面に付着することであった。たとえば、ポリマー表面の化学的な修飾 方法が、Ｂｒａｎｄｌｅｙらによって用いられ（１９８８）　（Ａｎａｌｙｔ− Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７２　：　２７０）　、彼等は、細胞付着を促進するために ポリマー基質に９−ｍｅｒのペプチドの封入を提案した（Ｉｄ、）。強化された 細胞付着は、Ｂｒａｎｄｌｅｙ技術を用いて達成されたが、この方法は、吸着さ れたペプチド系に観察される細胞付着の程度を同じように促進するために、同じ 濃度のペプチドを必要とした。たとえば、法が単にポリマー表面へのペプチドの 封入を制御しないばかりでなく、ポリマーのバルクにペプチドを結合させてしま うことが示唆される。この合成ペプチドの値かダラム当りおよそ５．０００＄と いうことなので、この方法は実用的に、細胞培養基質の経済的製造法を助長する ことにはならないだろう。

そこで、繰返し使用による脱離現象や細胞除去のため添加される細胞プロテアー ゼまたはプロテアーゼによるタンパク質の加水分解に抵抗する特性を促進し、熱 に安定な、細胞付着でペプチドを被覆した表面を製造する経済的な技術の必要性 が依然として存在している。より商業的に実用化可能で経済的な系は、細胞培養 とポリマー化学の分野で、Ｂｒａｎｄｌｅｙ及びその他の人々により提案された 技術よりも本質的に、よりペプチドの効率的な方法になるだろう。

血液接触を含めて、現在使用されている特許申請中の生体医療ポリマーは、小さ な径の血管移植片に作用であるべき十分な血栓非形成性が証明されなかった。血 小板及びその他の血液細胞の付着が、小径移植片が普及しない主要な原因であり 、現在の具体的な状況は、血液成分と生体医療ポリマーの相互作用を減少するこ とである。

血小板、白血球細胞、繊維芽細胞などの付着は、タンパク質のポリマー表面への 吸着か媒介となってもたらされるので、これらのポリマーとタンパク質交互作用 を少なくする方策が取り上げられた。

ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）表面は、それらの強い親水性、鎖移動度及びイ オン荷電の欠除の結果として、血漿タンパク質の吸着に抵抗することか観察され た。いくつかのグループが、生物適合性または非付着性表面を得るための模索を 行い、修飾剤として、ＰＥＯまたはＰＥＧ　（、ポリエチレングリコール）を利 用した。ＰＥＯでポリマー表面を修飾するために異なった研究方法が用いられた 。それらの中には、たとえばＰＥＴ、ポリウレタンまたはポリビニルアルコール のようなベースポリマーへのＰＥＯの共育架橋結合、附属のＰＥＯ連鎖をもつモ ノマーの重合、ブロック共重合による塩基ポリマーへのＰＥＯの結合、あるいは 、ブロックの１つがＰＥＯであるＡＢまたはＡＢＡ型の典型的なブロック共重合 のＰＥ０−含有界面活性剤の直接吸着などの技術が含まれている。これらの技術 の大部分は、比較的低分子量（５，０００ドルトン以下）のＰＥＯを用い、はん のわずかが、著るしく高い分子量を用いた。

上記の技術のあるものは、修飾したポリマーの表面で細胞の相互作用を少なくす るのに合理的に作用したか、大部分のものは必要な表面瘍飾を得るのに何段階も 必要とした。さらに、それらはベースポリマー表面における不安定な化学成分の 構造と利用度によって限定され、多くの場合、ベースポリマーの修飾には特異的 である。

本発明は、ＰＥＯ及びその他の水溶性ポリマー（ＷＳＰ）を、ベースポリマー（ Ｂ、Ｐ、）の表面に結合させる技術に関する。

特許明細書全般に、次の略字が出願人によって用いられる： Ａ　＝　Ａｌａ（アラニン） Ｃ＝　Ｃｙｅ（システィン） Ｄ　＝　Ａｓｐ（アスパラギン酸） Ｅ　＝　Ｇｌｕ（グルタミン酸） Ｆ　＝　Ｐｈｅ（フェニルアラニン） Ｇ　＝　Ｇｌｙ（グリシン） Ｉ　＝　１ｉｅ（イソロイシン） Ｋ　＝　Ｌｙｓ（リジン） Ｐ　＝　Ｐｒｏ（プロリン） Ｒ＝　Ａｒｇ（アルギニン） Ｓ　＝　５ｅｒ（セリン） Ｖ　＝　Ｖａｌ（バリン） ＣＡＮ　＝　細胞付着分子 ＣＦＮ　＝　細胞フィブロネクチン Ｃｉｇ　＝　低温−不溶性グロプリ：ノＤ　Ｉ　ＦＷ＝　イオン交換濾過水 ＦＣ＝　フすカルコンタクト ＦＥＰ　＝　弗化エチレンポリマー ｆｇ　＝　フィブリノーゲン ＦＮ　＝　フィブロネクチン ＧＲＥＤＶ＝グリシン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、バリンま たはＧ　＋ｙ−Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｓｐ　−Ｖ　ａｌＧＲＧＤ＝　ア ミノ酸配列グリシン、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸：またはｃ　ｔｙ −Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　５ｐ ＨＦＦ　＝　ヒト包皮繊維芽細胞 ＨＶＳＭＣ＝ヒト血管平滑筋細胞 ＫＤ　＝　牛ロドルトン ｍｅ「＝　アミノ酸残基 ａｍ　＝　ナノモル ＰＡＥ　＝　ブタ大動脈内皮（細胞） ＰＢＳ　＝　リン酸緩衝溶液 ＰＤＭＳ−ポリ（ジメチルシロキサン）ＰＥＧ　＝　ポリエチレングリコール ＰＥＬＬ＝　ポリウレタン（ベレタン）ＰＥＯ＝　ポリエチレンオキシド ＰＥ０Ｘ＝　ポリエチロキサゾリン ＰＥＴ　＝　ポリエチレンテレフタレートＰＦＮ　＝　血漿フィブロネクチン ＰＨＥＭＡ＝ポリ（ヒドロキシエチルメタアクリレート） ＰＩＰＮ＝　物理的に内部に入り込んだネットワークＰＩｔ　＝　ヒト血小板 ＰＭＭＡ＝　ポリメチルメタアクリレートＰ　ｒｅｓｔｉｍ　Ｐ　ｌｔ＝　５　 μｍアデノシンジホスフェートにより予め刺激されたヒト血小板 ＰＴＴＥ＝　ポリ（テトラフロロエチレン）ＰＶＰ　：　ポリビニルピロリドン ＲＥＤＶ＝　アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、バリンまたはＡ　ｒ ｇ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　Ｓｐ−Ｖａｌ ＲＧＤ　＝　アミノ酸配列アルギニン、グリシン、アスパラギン酸、またはＡ　 ｒｇ　−Ｇ　ＩＹ　−Ａ　ＳｐＳＡＭ　＝　表面（または基質）付着分子ＴＦＡ Ａ＝　トリフロロ酢酸 ＴＨＦ　＝　テトラヒドロフラン μｇ　＝　マイクログラム μ】　＝　マイクロリットル ＷＳＰ　＝　水溶性ポリマー ＹＩＧＳＲ＝チロシン、イソロイシン、グリシン、セリン、アルギニン、または Ｔ　ｙｒ　−ｒ　Ｉｅ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｒｇ本発明は、細胞付 着を仲介する受容体の量を促進し、程度を強化する、タンパク質加水分解に対し 安定で再使用できる表面を生産するように表面を修飾する新しい方法を特徴とす る。ここに開示される、特に方向性をもち、制御された化学的方法は、処理され る材料の大きさ全体にペプチドを拡散することなく、フラスコまたはその他の装 置の表面におけるペプチドの化学的な付着方法を提供する。ここに、明らかにさ れる方法は、驚くべきことに、以前に提案された方法によって要求されるペプチ ドのほんの１部分の使用で表面への細胞付着を強化促進する。ペプチドは、化学 的に表面に付着し、これによって、これまで悩まされてきた表面ペプチド吸着系 の脱離問題を避けることができる。これらの利点は、基質のほんの表面に、たと えば１２アミノ酸残基より小さなペプチドの化学的な付着によって達成される。

本発明につけ加えられる特徴は、本方法か全表面付着分子（ＳＡＭ）タンパク質 ではなくて、細胞付着分子断片を使用する点にある。かしら文字語ＳＡＭ及びＣ ＡＭを、表面、基質または細胞付着分子を表すため交互に用いているが、これら は、特別な結合領域で細胞外マトリクス成分と交互に作用し、細胞受容体（すな わち細胞）の特別な領域媒介型付着を促進する。ＳＡＭは、フィブロネクチン、 ビブロネクチン、スロンボスボンジン、ラミニン及びその他のタンパク質を含む タンパク質の科である。微小ペプチド断片の移植は、より一層の利点を表面にも たらし、全タンパク質またはより大きなペプチドで移植された表面よりも、変性 やタンパク質の加水分解の問題か少なくなる。

本発明のさらに特徴とする点は、より効率的な表面修飾系を与えることである。

たとえば、申請者らは、正式に提案された化学移植法によるペプチドの量のわず か５００分のＩを使用して最大の細胞付着性を備えた表面を生産することができ る。たとえば、Ｂｒａｎｄｌｅｙらは、平均６ナノモル／ｃｍ”　（６，０００ ピコモル／ｃ＋ｎ”）のペプチド表面濃度による生産方法を用いた（Ｂｒａｎｄ ｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｇ、２７４、表１）。逆に、申請者らは、表面ペプチド濃度０．００１ナノモ ル／ｃｍ”以下（６００万倍の改良）で細胞付着の強化か表示された。申請者ら は、ペプチドを表面に化学的に結合する過程で、表面ペプチドの著るしい量を省 略することができ、細胞付着促進活性面で損失なく達成することができた。

明らかにされた表面修飾技術のさらに追加される特徴は、吸着された血清成分と 独立に、受容体−媒介型細胞付着を促進する新らしい方法を提供する点にある。

本発明は、たとえば、豚、鼠、ヒトの細胞を含めてどのような属や型の細胞の付 着の促進にも有効な表面処理の方法を提供する。処理表面に培養がすでに成功し た細胞の型は、大動脈、包皮の繊維芽細胞及び３Ｔ３繊維芽細胞（ＡＴＣＣ＃Ｃ ＲＬ　ｌ　６５８）及び血管内皮細胞を含んでいる。

本発明はまた、広範囲の各種の小ペプチドの使用の適応性を特徴とする。本発明 に関連して数多くの小ペプチドを使用することかできるが、最も好ましい小ペプ チドは、１２アミノ酸残基（１２ｍｅｒ）ＪＪ下のものを含む。

さらに好ましくは、これらのペプチドが３−９アミノ酸残基（３−９ｍｅｒ）を 含むことである。最も好ましいペプチドは、６アミノ酸残基（６ｍｅｒ）かまた は４アミノ酸残基（４ｍｅｒ）である。ペプチド内のアミノ酸残基の数は、ここ ではしばしば、このような用語（たとえば、６　ｍｅｒ、４　ｍｅｒ等）で表示 される。

これらの小ペプチドは、さらに、最小細胞表面受容体認識配列を含めて、たとえ ば、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲまたはＲＥＤＶのように記述される。この配列が、処理 表面に細胞か支えられるよう細胞受容体に伝達させている。

例として、最小細胞表面受容体認識配列を含む好ましいペプチドは；　ＧＲＧＤ 　（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）　。

ＧＹ　Ｉ　ＧＳＲＹ　（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ　−１１ｅ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ａｒｇ− Ｔｙｒ）　、ＧＹ　Ｉ　ＧＳＲ（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ　−１１ｅ−Ｇｌｙ　−３ｅｒ −Ａｒｇ）　、ＧＲＧＤＹ　（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　−Ｔｙｒ）　 、Ｙ　ＩＧＳＲ（Ｔｙｒ　−１１ｅ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ａｒｇ）、ＲＧＤ　（Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ−Ａｓｐ）　、ＲＥＤＶ　（Ａｒｇ−Ｇｌｕ　−Ａｓｐ−Ｖａｔ） 　、ＧＲＥＤＶ　（Ｇｌ）’−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　−Ｖａｌ）　、ＧＲＥ ＤＶＹ　（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｔ−Ｔｒｙ）　、ＲＧＤＳ　 （Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−３ｅｒ）　、ＧＲＧＤＳ　（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌ ｙ−Ａｓｐ−３ｅｒ）、ＲＧＤＦ　（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ）　、Ｇ ＲＧＤＦ（ＧＩＹ−Ａｒｇ−ｃｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ）　、ＰＤＳＧＲ（Ｐｒ。

−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）　、ＧＰＤＳＧＲ（Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ−Ａ ｓｐ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）　、ＧＰＤＳＧＲＹ（Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ−Ａｓ ｐ　−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）、Ｉ　ＫＶＡＶＣ（Ｉ　ｌｅ　−Ｌｙ ｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ　−Ｃｙｓ）、Ｇ　Ｉ　ＫＶＡＶ　（Ｇｌｙ　−１ １ｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｔ）、Ｉ　ＫＶＡＶＹ　（Ｉ　ｌｅ　−Ｌ ｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ）、Ｇ　Ｉ　ＫＶＡＶＹ　（Ｇｌｙ　− Ｉ　ｌｅ　−Ｌｙｓ−Ｖａｔ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ）アミノ酸配列を含んで いる。これらの断片は、多くの表面付着分子の細胞付着配列（ＲＧＤ）か、また は、ラミニンの細胞付着配列（ＹｒＧＳＲ及びＰＤＳＧＲ）　、特殊な表面付着 タンパク質、または細胞付着分子フィブロネクチン（ＲＥＤＶ）を含んでいる。

ラミニンからのＩＫＶＡＶペプチドもまた、特別な細胞にとって育用である。こ れらの最も好ましいペプチドとしてさらに、標識ヨウ素化用のＣ末端Ｙか含まれ る。Ｎ末端Ｇは、付着ペプチドと表面の間の特別なペプチドのスペーサーとして 用いられる。小ペプチドは、処理表面の細胞付着に必要な、細胞受容体認識部位 を与えるのに使用される。

少なくともｏ、ｏｏｔピコモル／ｃｍ”のペプチドの表面濃度か、表面の細胞付 着特性を強化するのに十分であるか、好ましいペプチド表面濃度の範囲は、およ そ０．００１から１００ピコモル／ｃｍ”である。より好ましいペプチド表面濃 度の範囲は、０．５から２．０ピコモル／ｃｍ２である。本発明の最も好ましい ペプチド表面濃度はおよそ１２ピコモル／ａｍ”である。

通例の方法は、ＣＡＭまたはペプチドの、表面への直接吸着か、あるいは非−Ｃ ＡＭタンパク質の吸着後、吸着タンパク質へのペプチドの交差連結に頼っており 、従ってこれらの成分の培養基中への脱離を余儀なくされた。

本発明は、望んだ基質の水酸基または他の反応成分へペプチドか共有結合で化学 的に結合することにより、このタンパク質脱離の問題を避ける一層の利点を与え ている。

生体医療的移植の使用には多くの立場かみられるか、望ましいのは、組織内の周 囲の細胞が移植表面に付着して広がる（組み込まれて）ことである。本発明は、 宿主内にこのように望ましい移植の組込みを可能にする表面修飾の方法を提供す る。本発明はさらに、ｉｎ　ｖｉｖｏの移植に随伴する生体医療用具の感染の発 生を減少する方法を特徴としている。生体医療用具の移植に関係した主なリスク は感染であった。用具と生物組織間の連続的な保護層の欠除からバクアリアその 他の伝染剤に組織内部への侵入の機会を与える。用具の一部として、強化された 細胞付着促進表面によって、連続的な保護細胞被覆材か与えられ、伝染源の侵入 の可能性をなくして、このような望ましくない副作用は最少限に抑えられるだろ う。

さらに、生体医療的移植の使用には、周囲の組織から特別な細胞だけか移植表面 に付着するような状態が多くみられる。たとえば、血管移植技術で、内皮細胞が 移植に付着し、内皮細胞に並んで、自然の血管壁のように見えることが望ましい 。しかしなから、血小板もまた付着して凝固するようになり、繊維芽細胞と平滑 筋細胞もまた、組織から浸潤し、血管移植内に極めて有害な厚い組織層を形成す るようになる。そこで、血小板は付着させず、内皮細胞だけを付着させる材料を 使用できれば好都合である。本発明は、ペプチドの細胞への吸着による驚くべき 利点として、細胞−型特異性の特徴を与える。

さらに加えて、開示された表面処理方法による長期の安定性は、長期間の身体定 置において、各種の生体医療的移植の製造上理想的である。たとえば、神経生長 ガイド及び内在カテーテルなど。本発明の表面修飾系はまた、哺乳動物細胞生体 反応器のデザインに新しい手段を与える。すなわち、それは、媒質ＣＡＭとは独 立に細胞付着を支える安定した必須表面成分を与えるからである。このような基 質は、細胞付着分子に欠けている無血清培地の使用を可能にして、一層の利点を 与えるものである。

本発明の薬品は、表面水酸基成分または、このような成分を付加できる他の表面 反応成分をもついかなる材料にも直接適用できる。細胞付着を強化するほとんと の他の表面処理は、タンパク質の吸着の強化によって行われている。本発明のペ プチド移植方法は、細胞か、表面−共役合成ペプチドとして受容体をもつので、 吸収されるタンパク質の必要性は完全になくなる。これらの共有的に結合した最 少の配列は、脱離がなくなり、活性群（たとえばＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ，ＰＤＳＧ Ｒ，ＩＫＶＡＶまたはＲＥＤＶ配列）が可溶性プロテアーゼにさらされないため に、吸着した細胞付着タンパク質または付着ペプチドに結合した吸着タンパク質 よりも、細胞タンパク質の加水分解及び熱分解に対してはるかに安定である。

本表面を製造する色々な化学的方法があるけれども、各種の方法は、表面活性化 の一般的な方法、すなわちアミンまたは水酸基のような核試薬のペプチドへの共 役による修飾経由、アミンまたは水酸基またはチオール（２３）経由になる。例 としては、表面水酸基群の活性化は、たとえば塩化トレシル、グルタルアルデヒ ド、塩化シアヌル、塩化スルホニル、臭化ソアンによる処理で達成されるだろう 。また、表面水酸基は、ジメチルスルホキシド中でのターシャリーブトキンドカ リウムとベンゾイン経由で加えられるだろう。これらの特別な表面活性剤による 処理後ペプチドか水酸基群に共有的に連結される。さらに、本発明は、たとえば 無水コハク酸のような活性カルボキシル群を用いても行うことかできる。曝露さ れた表面はそれから洗浄し、ペプチドで結合される。

本表面ペプチド処理の参入で有利になるてあろう生体医療的移植の例としては、 陰茎、心臓、膣、股間接部の移植：カテーテル；人工静脈または動脈、人工腿及 び、靭帯：人工骨ねじ、骨板、骨片及び骨関節：人工皮膚：神経成長カイト：及 び眼内のレンズ及び類似品を含む。

この表面ペプチド処理を利用できる細胞及び組織培養基に用の材料の例としては 、培養フラスコ、ベトリ皿、微粒子担体ビーズ、ポーラス大粒子担体、繊維、穴 あき繊維、単一材料からなる支持体、及び回転瓶が含まれる。

開示した方法は、強化された細胞付着が望まれるすべての表面の誘導に使用する ことかできる。例としては、またそれに限定されないか、これらの表面として、 金属、セラミックまたはポリマー表面を含む。発明の好ましい具体例は、ポリマ ー表面の誘導に向けられる。提案した方法を用いてどのようなポリマー表面も誘 導されるだろうか、特に好適な好ましいポリマー表面として、ポリ（ヒドロキシ エチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（エチレンテレフタレート）（Ｐ ＥＴ）、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）及び他のシリコンラバー表面 か含まれる。ＰＥＴ、さもなければダクロンとして知られる、は生体医療用移植 にしばしば用いられるポリエステルである。ＰＴＦＥは別にテフロンとして知ら れる。本発明の最も好ましいポリマーマトリックスはポリ（ヒドロキシエチルメ タクリレート）（ＰＨＥＭＡ）から成る。

ＰＨＥＭＡポリメリックマトリクスは、およそ４５％の水分をもつゲル状からな り、本発明の開示前には、細胞付着を支持できなかった。

他の高含水ポリアクリルアミドゲル混合物との連結にペプチドを用いた場合は、 低含水ポリマーと比較してペプチドの有効性は極めて低い。高い水和性ゲルは、 ペプチドの滲透性か高く、従って、小さなペプチドはポリマーのバルクの中に本 質的な見境いのない拡散かしやすくなっている。これらの高い水和性ポリマーは 、非常に大きな分子をもつ全タンパク質にさえ透過性を示して、タンパク質電気 泳動に用いられてきた（２１）。ポリアクリルアミドからなるポリマーゲルは、 通常少なくともおよそ９０％の水を含み、従って、本発明の適用には不適当てあ ろう。

本発明の他の好ましい具体例は、特別なセラミック、グリコフェーズグラス（グ リセロルブロピルシランの結合したガラス）の誘導を指向している。例として、 拳法で用いられた好ましい金属はチタニウムである。

本発明はまた、最初に表面を活性化し、ペプチドを活性化表面に共役結合し、そ れからペプチドか誘導された表面に哺乳動物の細胞を置き、そこで好ましいペプ チドは１２ｍｅｒよりも小さいことからなる、表面への細胞付着を強化する方法 を含む。ペプチドか活性化された表面に共役結合される工程は、最も好ましくは 、上に述へた（細胞付着特性をもつ）ペプチドの十分な量を含む溶液に活性化さ れた表面を曝露することからなる。すくなくともおよそ１０ｎｇ／ｍｌのペプチ ドの溶液の濃度であれば、この結合工程では同じ結果を生ずるだろうか、およそ １０ｎｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌの間のペプチドの溶液かまた適当である。最 も好ましくは、本プロセスか、ｌｏｎｇ／ｍｌペプチドの濃度をもつペプチド溶 液を含むことである。本発明の好ましい具体例の一つとして、ペプチド溶液のペ プチドはアミノ酸配列アルギニン−グリシン−アスパラギン（ＲＧＤ）を含む。

本発明の他の好ましい具体例として、ペプチド溶液のペプチドは、ＹＩＧＳＲを 含む。本発明のさらに好ましい具体例では、ペプチド溶液のペプチドは、ＰＤＳ ＧＲ，ＩＫＶＡＶ、ＲＥＤＶまたはＲＧＤＦを含む。本発明の方法で用いられる べき最も好ましいペプチドはＧＲＧＤ、ＲＧＤＹ、ＧＲＧＤＹ、ＧＹＩＧＳＲＳ ＧＹＩＧＳＲＹ、ＹＩＧＳＲ，ＲＧＤＳ、ＲＥＤＶ、ＧＲＥＤＶ、ＧＲＥＤＶＹ 、ＲＧＤＦ。

ＧＲＧＤＦ、ＰＤＳＧＲ，ＧＰＤＳＧＲ，ＧＰＤＳＧＲＹ、ＩＫＡＶＡＶＳＧ　 ＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＹ、　及びＧＩＫＶＡＶＹからなる群から選ばれたペプ チド配列からなる。これらのペプチドは、たとえばＰＥＴポリマー及びＰＨＥＭ Ａポリマーのようなポリマー表面、またはグリコフェーズグラスのようなガラス 表面への誘導に最も好ましく用いられる。しかしながら、細胞受容体認識を支え る能力のあるアミノ酸配列を含むどのペプチドも、本発明の結合に用いられるだ ろう。

細胞付着を強化するための生物活性細胞付着ペプチド移植方法の申請は、次の使 用方法を含む。

１．　足場依存性細胞及び細胞系の実験室規模の組織及び細胞培養として。この 方法は、細胞培養基質として用いられる実験室ガラス製品及びプラスチック製品 、たとえば組織培養フラスコ及びペトリ皿の処理に有益であろう。

それは、付着にすべて本質的には同じ分子生態学を利用するので、動物、昆虫そ して植物細胞そして組織に有益であろう。

２、　大規模な組織及び培養細胞として。

本法は、微粒子担体、ポーラスな大粒子担体、穴あき繊維、単一の材料からなる 支持体及び回転瓶の処理に有益であろう。

３、　これら表面の内皮化を促進するため、うめこめられる人工血管移植の内部 用として、 ４、　組織内の融和を促進するため、移植血管の外部と吻合部分（末端）のため に ５、　組織との融和が望まれるその他の移植用具として、たとえば、人工麿、靭 帯、骨ねし及び板、骨片、関節及び皮膚、 ６、　付着及び組織への融和を促進する縫合の処理として。

７、　細胞または組織の方向性をもった生長または移動の促進のために、本法は 、表面濃度に勾配のある表面へペプチドか移植される時に有益であろう。これか 有用な例は、末梢神経再生用の神経成長ガイドの場合である。

８、　研究用として。本系は、タンパク質吸着の影響の混乱なしに、血清の存在 下で細胞付着の試験が可能である。

そこで、試験系におけるバックグランドのレベルが低くなる。さらに、本法は、 表面に共役結合するペプチドの量を調節し、これはまた、細胞付着の試験で重要 である。

本発明によって作られた細胞付着に抵抗するように修飾された表面は有用であろ う： １、　細胞付着が有害であるような生体医学の立場、たとえば、カテーテル、血 液透析膜、血液濾過器、眼内レンズ、コクタクトレンズ、及び ２、　タンパク質吸着か有害であるような生物工学における立場、たとえば、ク ロマトグラフィー支持カラム。

図１は請求電子性芳香族置換経由でのＰＥＴフィルムのヒドロキシメチレーショ ンを示す。反応は、室温で、１８．５％ホルムアルデヒド（Ｖ／Ｖ）及び１Ｍ酢 酸によって行われた。

図２は、ヒドロキシメチル化ＰＥＴフィルムへのトレシル活性化とＧＲＧＤ共役 結合を示す。

図３は、（ａ）ＧＲＧＤ共役結合上の及び（ｂ）無処理のＰＥＴフィルム上での 付着と伸展した３Ｔ３繊維芽細胞を示す。

図４は、無血清培養基中でのＧＲＧＤ共役結合及び無処理のＰＨＥＭＡフィルム 上の３Ｔ３繊維芽細胞の伸展を示す。

図５は、ＧＲＧＤ共役結合ＰＥＴ　（実線カーブ、由緒型マーク）対ＧＲＧＤ吸 着ＰＥＴ（破線カーブ、黒菱形マーク）及び無処理ＰＥＴ　（点−破線カーブ、 由緒形マーク）における３Ｔ３伸展の比較を示す。

図６は、無血清及び完全培地における修飾した（実線捧）及び非修飾（破線棒） フィルム上の３Ｔ３伸展の量を示す。細胞伸展の程度は、各フィルム上で接種２ 時間後に測定された。細胞は、１０．０００細胞／ｃｍ２の密度で植えつけられ た。

図７は、無血清培養基内で、ＰＥＴフィルムに誘導されたＧＲＧＤ上の３Ｔ３細 胞の伸展に対する可溶性ＲＧＤの効果を示す。細胞はフィルムへの植えつけ前Ｒ ＧＤＳにより３０分間予備培養された。細胞付着の程度は、植えつけ３時間後に 測定された。ＲＧＤＳで予備培養された細胞（破線棒）。無処理対照細胞（実線 捧）。

図８は、誘導ＧＲＧＤ上（白、四角）及び無処理（黒、菱形）ＰＥ７表面の３． Ｔ３細胞の増殖運動を示す。これらの試験は完全培地で行われた。

図９は、結合緩衝液（０，２Ｍ重炭酸ソーダｐＨ１０）に加えられたグリコフェ ーズガラスに移植され、トレシル活性化ガラス上、室温で培養されたＧＲＧＤＹ −”５１の表面濃度を示す。投入した濃度は、ガラス表面の単位面積当り可溶性 ペプチドか反応に利用することかできた。

表面濃度は、ガラスの単位面積当り、結合するペプチドのモルとして定められ、 ガンマ計測器内でガラス試料か洗浄され、標識ペプチドを基に値が計算された。

各点は、・　ミロ測定表面濃度の平均であり、プラトー濃度は１２．１ｐｉｃｏ ｍｏｌｅｓ　／　ｃｍ２であった。

図１０は、ＧＲＧＤＹによるグリコフェーズガラス上のＨＦＦ細胞面積の集積ヒ ストグラムを示す。細胞は、アルブミン（Ｃ）、（Ｄ）を含む完全培地（Ａ）の どれかに懸濁され、基質上に植えつけられた。Ａ及びＣは、ＲＧＤ−誘導ガラス に集められたデータを表し、一方（Ｂ）及び（Ｃ）は、非付着対象表面を表す。

個別の細胞の面積は、デジタル画像解析装置に連結したビデオ顕微鏡によって測 定された。細胞伸展か血清のない場合でさえ、ペプチド結合表面に観察され：血 清か存在してさえ、非結合表面には細胞伸展かみられず；そしてこれらの細胞の 大部分は付着されなかった。積算データをとるため各時間点て少なくとも１００ 細胞か分析された。

線＝　（実線）１５分： 線：　（実線）１５分：　（点線）３０分＝　（重ダッシュ線）６０分；及び（ 軽ダッシュ線）１２０分。

各時間毎の上５０％及び下５０％の中間点（順次）：Ａ：１５分、２６５μｍ２ ；３０分、９０６μｍ２；６０分、１１１３μｍ２；１２０分、２１３０μｍ” ；Ｂ：３８５゜３９７．４４８，４５３；Ｃ：２４８，９５０，８６４゜１２０ ７：Ｄ：３７７．３２５，３８８，３８８゜図１１は、ＧＤＧＤＹ−誘導のグリ コフェーズガラス（白四角）及びｌＯ％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ中の無 処理プロシリケートガラス（黒四角）上のＨＦＦの増殖を示す。細胞は１００× 位相差顕徽鏡で可視化された。増殖表面の単位面積当りの細胞数は、時間点当り １０視野の試料サイズから、視野面積当りの平均細胞数を基に計算された。同じ ような増殖速度であることは、細胞かペプチド−結合表面から集められ、その後 分けられることを示している。

図１２は、ＧＹ　Ｉ　ＧＳＲＹで誘導されたグリコフェーズガラス上のＨＦＦの 細胞面積を示すヒストグラムの集積図である。細胞は完全培地（Ａ）、（Ｂ）、 またはアルブミン含有の無血清培地（Ｃ）（Ｄ）のどれかに懸濁され、基質に植 えつけられた。（Ａ）及び（Ｃ）は、ＹＩＧＳＲ−誘導ガラスに集められたデー タを示し、一方、（Ｂ）及び（Ｄ）は、非付着対照表面上で集められたデータを 表している。個別の細胞の面積は、デジタル画像解析装置に連結した位相差ビデ オ顕微鏡で観察された（１２）。細胞伸展は、血清のない場合でさえ、ペプチド −結合表面に観察され；血清があっても非結合表面での細胞伸展はみられず、か つこれらの細胞は付着されていなかった。（集積データをめるため各時間点にお いて少なくとも１００細胞を分析した）。

線＝　（実線）０時間：　（点線）：Ａ：０時間、５０５μｍ２；３時間、２２ ００μｍ２．６時間、２３３３μｍ２：９時間、３３７５μｍ”：Ｂ：３４０， ５２０，４８６゜５１７；Ｃ：５１７，１０４５，１０３３，１４００：Ｄ：２ ４５．３０６，３６２，５１４゜図１３は、ＲＧＤ−結合ガラス上の伸展ＨＦＦ の位相差（１３Ａ、Ｃ）とＩＢＭ（１３Ｂ、Ｄ）の顕微鏡写真を示す。細胞は、 無血清培地（１３Ａ、Ｂ）で、または完全培地（１３Ｃ，Ｄ）で４時間培養され た。スケール棒＝１０μｍ。

図１４は、ＹＩＧＳＲ−結合ガラス上の伸展ＨＦＦの位相差（１４Ａ、Ｃ）とＩ ＲＭ　（１４Ｂ、Ｄ）ｌｊｌ微鏡耳鏡写真す。細胞は、無血清培地（１４Ａ、Ｂ ）または完全培地（１４ｃ、Ｄ）で８時間培養された。スケール棒＝１０μｍ。

図１５は、Ｆ−アクチンで染色されたＨＦＦのけい光顕微鏡写真図を示す。ＨＦ Ｆは無血清培地（１５Ａ）と完全培地（１５Ｂ）のＲＧＤ−誘導基質上で４時間 培養された。１５Ｃと１５Ｄは、無血清培地（Ｃ）と完全（Ｄ）培地で８時間培 養後ＹＩＧＳＲ−誘導基質上の伸展細胞である。スケール捧＝１０μｍ。

図１６は、ＰＥＴまたはＣ；ＲＧＤペプチド誘導のＰＥＴ表面のどちらかに樹立 された細胞培養基に伸展しつつあるブタ大動脈内皮細胞に関する血清の存在、非 存在の影響を示す。

図１７は、ペプチド誘導ＰＥＴ　（ポリマー）表面対無処理ＰＥＴ　（ポリマー ）表面上に観察された細胞伸展の速度を示す。

図１８は、細胞伸展（ＨＦＦ）におけるＲＧＤ−ペプチドの密度の影響を示す。

図１９は、物理的に内部に入り込んだネットワーク（ＰＩＰＮ）の提案された表 面構造の模型図である。

図２０は、修飾ポリマー表面への血小板付着の１ｎＶｉｔｒｏのオンライン可視 化方式の連続装置の分解図である。

図２１は、修飾ＰＥＴ表面への■１２５アルブミン吸着を示し、ＰＥ０１８５０ ０で修飾された表面への吸着か僅かなことを示している。

図２２は、けい光ビデオ顕微鏡で得られたＰＥＴｐｒｐＮの血小板付着を示す。

１００％の対照地は、ポリマー表面の４６．２５血小板／１０００μ１Ｉ１２に 相当する。

図２３は、培養３０日以上のＰＥＴ　ＰＩＰＮ上の細胞伸展解析を示す。細胞は ３００００／ａｍ’の濃度で植えつけられた。ＰＥ０１８５００修飾表面は最初 の植えつけ後９日目及び１５５日目再度植えつけられた。

図２４は、ベレテンＰＩＰＮ’ｓ上の細胞伸展解析を示す。細胞は７００００／ ｃｍ”の濃度で植えつけられた。

これらの表面は単にＰＥＯ１８５００のみて修飾された。

括弧内の数字は、修飾に用いたＴＨＦの力価を示す。

図２５は、ＰＭＭＡ　ＰＩＰＮ’ｓでの細胞伸展の解析を示す。細胞は７０００ ０／Ｃｍ”の濃度で植えつけられた。これらの表面はＰＥ０１８５００のみで修 飾された。

括弧内の数字は修飾過程で用いられたアセトンの力価を示す。

本発明は独自の自己付着性の性質をもつ表面、及びペプチドと可溶性培地成分が 、別々に無関係に吸着されて、細胞−表面付着性が特に強化された処理表面か製 造される、その方法に関係している。この方法は、培養系の最適化を単純化し、 また各種の材料表面に付着させる細胞の量と割合を制御する各種の型の基質を製 造する技術を提供する。さらに、特別な細胞非付着性をもつ材料と、細胞付着と タンパク質吸着を減少するような表面を製造する方法か開示される。これらの材 料は、非付着性表面として重要な用途かありまた付着促進ペプチドで修飾すれば 特別な利点をもちつる。

さらに特別に、表面修飾技術は、表面にペプチドを化学的に結合することを特徴 とし、そのペプチドは、細胞（表面）付着分子内に含まれる少なくとも最小のア ミノ酸配列からなり、たとえば、フィブロネクチンの中のＲＧＤ、あるいはラミ ニンの中のＹＩＧＳＲｌＩ　ＫＶＡＶまたはＰＤＳＧＲであり、フィブロネクチ ンのある形の中のＲＥＤＶであり、あるいはまた細胞表面または細胞−細胞付着 に含まれるタンパク質の配列に関係するまたはそれから引き出されたいくつかの 他の短いペプチド配列である。“細胞付着分子”　（ＣＡＭ）及び“基質付着分 子“　（ＳＡＭ）の言葉は、細胞受容体の仲介付着または表面付着を容易にする ことが発見されたタンパク質とペプチドの科を述べる際に交換して用いられる。

この表面処理方法は、反応群に曝露する表面を化学的に活性化し、活性化された 表面を水洗し、次に、小さなペプチド、たとえば、ＲＧＤ、ＲＤＳＧＲ，ＩＫＶ ＡＶ。

ＹＩＧＳＲ，ＲＥＤＶ、または全部で１２アミノ酸残基（１２ｍｅｒ）より少な くて受容体仲介の細胞付着を容易にする他のアミノ酸配列を含む溶液に表面を曝 露することからなる。処理される表面の反応成分に、ペプチドの末端基が共有化 学的に結合する。反応グループに曝露するために表面を活性化する色々な化学的 方法がある。これらの方法の１つはトレシル活性化法である。本発明の実施に用 いられる他の化学方法の例には以下のものが含まれる。

（１）グルタルアルデヒドによる表面活性・０°Ｃから８０°Ｃの間で、５％か ら３７％のグルタルアルデヒドの水溶液でおよそ１時間表面を処理する。グルタ ルアルデヒドは、曝露された核性群、たとえばアミン及び水酸基と共有結合する だろう。表面を水洗後、１０ｎｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの間のペプチド溶液で表 面を処理する。ペプチド上の核性群、たとえばチオール、アミン及び水酸基は、 表面−結合グルタルアルデヒド機能に結合するだろう。

（２）塩化シアヌルによる表面活性 ０℃と８０°Ｃの間で、およそ５％の塩化シアヌルの非水溶液で表面を約１時間 処理する。塩化シアヌルは、曝露された核性群たとえばアミン及び水酸基と結合 するだろう。表面を乾燥溶媒て洗い、次に、非水溶媒、たとえばアセトニトリル 中のペプチド濃度か１０ｎｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの間のペプチド溶液で表面を 処理する。ペプチド上の核性群、たとえばチオール、アミン及び水酸基のどれで も表面−結合塩化シアニル機能に結合するだろう。

（３）他の塩化スルホニルによる表面活性：塩化トシルのような塩化スルホニル 科の他の物質を使って、例３の概略の方法に準する。

（４）臭化シアンによる表面の活性化法：２０°Ｃ以下で、ｐＨ１ｏ−１１の臭 化シアン水溶液におよそ１時間表面を曝露する。臭化シアンは共存的に結合し、 表面の水酸基群を活性化する。表面をｐＨ１Ｏ−１１で水洗し、同じ溶液で濃度 かｌＯｎｇ／ｍｌと１［ｎｇ／ｍｌの間のペプチド溶液で約１時間処理してペプ チドを結合させる。ペプチドは、ペプチド上のアミン機能により臭化シアン群と 結合する。

（５）活性カルボニル関係エステルを生産するための表面の活性化、たとえば無 水こはく酸： 約２０°Ｃ温度で、無水こはく酸溶液に表面を曝露する、そこでこの化合物は、 表面の水酸基及びアミンと反応し、それぞれエステルとアミドを生成する。表面 を洗い、１０ｎｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの間のペプチド溶液と１時間処理して結 合する。ペプチドは、アミンまたは水酸基群経由で活性化した表面と反応するだ ろう。

（６）ベンゾインジメチルスルホキシドを用い、水酸基か添加されるポリマーの 予備活性化 水酸基の機能は、ポリ（テトラフルオロエチレン）（ＰＴＦＥ）に添加されるこ とか、Ｃｏ５ｔｅｌｌｏ及びＭｃＣａｒｔｈｙのポリ（テトラフルオロエチレン ）に対する特殊機能の表面−選択的導入、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２０ ２８１９−２８２８　（１９８７）に述へられている。ターンヤルプトキシドカ リウムのジメチルスルホキシド溶液にベンゾインを添加し、ＰＴＦＥ表面か接触 するように置かれる。反応は５０°Ｃ１１時間で進行する。材料を取出してテト ラヒドロフラン（ＴＨＦ）で洗滌する。この中間体の表面は次にＴＨＦ中のＩＭ のボランにより室温で１２時間処理される。次にその表面は、１０％過酸化水素 を含むＩＭの苛性ソーダによりＯ″Ｃて３時間処理され、その後稀釈苛性ソーダ 、水、稀釈塩酸、水、ＴＨＦ及びヘプタンで逐次洗滌する。これによって水酸基 の豊富な表面か生じ、上に述べた化学物質のとれによってもこの後活性化させら れる。

ペプチドを表面に付着させる最も好ましい方法は、Ｎｉ　１ｓｓｏｎ及びＭｏ５ ｂａｅｈ　（１９８１）によって述へられたように（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｎｍｕｎ：　ｌ　Ｏ２：４４９−４５７）、トレ シル固定化法による、表面の表面活性化からなる。特に、トレシル活性化法は、 およそ４０μｍの２．２．２−トリフルオロエタンスルホニルクロライド（塩化 トレシル）及びおよそ２ｍｌのトリエチルアミンを含む２０ｍ１の乾燥エーテル 中に、室温で約１５分間表面を沈めることから始められる。これらの活性化され た表面は次に、０．２Ｍ重炭酸ソーダ、ｐＨ１Ｏの緩衝液で洗滌された。次いで 表面は、およそ６０−１００　ｎｇ／ｍｌのペプチドを含む同じ緩衝液中で室温 で約２０時間おかれた。最も好ましくは、ペプチド溶液の濃度はおよそｔｏｎｇ ／ｍｌである。この培養時間は表面の水酸基群とペプチドの結合に必要である。

本発明のこの特別な具体例は、ＧＲＧＤペプチドによって良好な状態で用いられ ている。

望まれる適量のペプチドを含む溶液に、活性化した表面をさらすことによって、 ペプチドは最も好ましい状態で活性化表面に結合する。少なくともおよそ１０ｎ ｇ／ｍｌのペプチド溶液の濃度であれば、同し様に満足な結果か得られるだろう が、およそ１０ｎｇ／＋ｎｌペプチドと１００μｇ／ｍｌペプチドの間のペプチ ド溶液が好ましく、およそ１０ｎｇ／ｍｌのペプチド溶液か結合プロセスに用い られるのか最も好ましい。

開示された方法により生産される処理表面は、少なくとも０．００１　ｐｉｃｏ ｍｏｌｅｓ　／ａｍ”のペプチドの表面濃度によって特徴づけられる。少なくと も０．００１　ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２のペプチドの表面濃度は、表面の細 胞付着特性を強化するには十分であると期待される。より好ましいペプチド表面 濃度の範囲は、およそ０．５から１００ｐｉ１００ｐｉｃｏ　／　ｃｍ２の間で ある。最も好ましい範囲のペプチドの表面濃度は、およそ０．５から２０　ｐｉ ｅｏｍｏｌｅｓ　／ｃｍ２の間である。最も好ましい表面ペプチド濃度はおよそ １２　ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ　／ｃｍ２である。

処理されるべき表面に、表面水酸基成分が存在しない場合は、表面は前処理が行 われた。この前処理法は、好ましくは、ヒドロキシアルキル群を表面に加えるた めに、求電子性芳香族の置換が用いられる表面ヒドロキシル化の方法からなる。

この前処理法の特に好ましい方法は、表面を約１８．５％（Ｖ／Ｖ）のホルムア ルデヒド溶液／ＩＭの酢酸に室温で約４時量比めることからなる。この方法は、 本発明の特別に好ましい具体的な例として、ＰＥＴポリマー表面からなるハイド ロメチレーションの中で用いられた。

ヒドロキシメチル化された表面は、それから、上で述べたようにペプチドの付着 によりトレシル活性化がなされた。最も好ましいものとしてここに開示された前 処理法は、ＧＲＧＤまたはＧＹＩＧＳＲペプチドにより、ポリマー表面、特にＰ ＥＴポリマー表面を作るのに用いられる。色々な他の表面ヒドロキシル化法は、 他のポリマーまたは物質と結合して使用すれば同じように有用である。

色々な他の結合特性もまた用いられるだろう。すなわちペプチド上のＮ末端アミ ンまたは他の反応群、多分いくつかの結合剤の使用により、表面上の群と反応す るだろう。

本発明の実施でとんな表面でも使用される。例として、本発明の実施に使用され る特に適当な表面は、セラミック、金属、またはポリマー表面である。最も好ま しいものとして、本発明は、ポリマー表面及びセラミック（ガラス）表面の処理 に用いられる。例として、ポリマー表面は、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレ ート）（ＰＨＥＭＡ）　、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリ（ テトラフルオロエチレン）（ＴＰＦＥ）、弗化エチレン（ＦＥＰ）　、ポリ（ジ メチルシロキサン’）（ＰＤＭＳ）及び他のシリコンゴムからなる。色々なガラ ス表面は、提案した方法で処理することかできるけれども、最も好ましいガラス 表面は、グリセロルブロピルシランの結合したガラス（グリコフェーズガラス） からなる。特に好ましい重合物の表面は、ペプチド置換することなしに、細胞付 着に抵抗する、水溶性ポリマーの物理的な内部に入り込んだネットワークをもっ たものである。

多くの細胞付着分子に含まれる最小のアミノ酸配列は、ＲＧＤ　（アルギニン− グリシン−アスパラギン酸アミノ酸配列）、またはＹＩＧＳＲ（チロシン−イソ ロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）またはＲＥＤＶ　（アルギニン−グ ルタミン酸−アスパラギン酸−バリン）である。細胞付着に活性のある最小アミ ノ酸配列を含むペプチドはどれでも本発明の実施に用いられるけれとも、最も好 ましい配列は、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ，ＧＲＧＤ。

ＧＹｒＧＳＲ，ＰＤＳＧＲ，ＩＫＶＡＶ、ＧＲＧＤＹ。

ＧＹＩＧＳＲＹ、ＲＧＤＹ、ＹＴＧＳＲＹ、ＲＥＤＶ。

ＧＲＥＤＶ、ＲＧＤＦ及びＧＲＧＤＦである。

本発明の特に好ましい具体例で、ペプチドＧＲＧＤＹとＧＹＩＧＳＲＹは、特別 な型のセラミックであるグリセロルブロビルシランの結合したガラスの表面に化 学的にグラフトされる。これらの好ましいペプチドのＣ末端Ｙは、放射性標識ヨ ウ素化として含まれ、Ｎ末端Ｇ（グリシン）は、接着性ペプチドと表面の間の特 別なペプチドによりスペーサーとして使用するために与えられる。

小さなペプチドは、処理配列上に細胞を付着するのに必要な、細胞受容体認識部 位を与えるのに用いられる。

本発明の特に好ましい他の実施例においてＧＲＧＤ及びＧＹＩＧＳＲペプチドは 、ポリマー表面の化学的な誘導に用いられる。本発明の最も好ましい実施例は、 ＧＲＧＤまたはＧＹＩＧＳＲＹペプチドに誘導されたＰＨＥＭＡまたはＰＥＴポ リマー表面からなる。本発明の最も好ましい他の実施例は、ＧＸＩＧＳＲＹペプ チドにより誘導されたＰＨＥＭＡまたはＰＥＴポリマー表面からなる。

共育結合したペプチドを含むように処理された表面は、哺乳動物細胞受容体認識 部位を与え、それによって細胞が基質に堅くくっつき、含まれている媒質の血清 及び表面に吸着されたタンパク質とは独立に増殖するようになる。このようにし て、開示された本発明法には、中間的などんな吸着タンパク質も存在しない状態 で、受容体が媒介する細胞付着、すなわち、完全な自己機能による細胞付着と伸 展を支持する表面を与える方法である。

細胞付着分子の最小のアミノ酸配列を含むペプチド断片はどれでも本発明の実施 に用いることができるか、少な（とも１２アミノ酸残基（ｍａｒ）を含むペプチ ド断片が好ましい。およそ３から９の間のアミノ酸残基がさらに好ましい。最も 好ましいペプチドは、４または６個のアミノ酸残基を含む。ペプチド断片の長さ は、分解するペプチドの感受性に影響し、従って、断片か短くなればなる程ペプ チド表面の分解はより少なくなることが予想される。

本発明はさらに、表面処理を施された生体医療移植用具と、同じものを製造する 方法を含んでいる。このような処理表面を備えた用具は、細胞付着の量と割合、 従ってｉｎ　ｖｉｖｏでの用具の組織融和の割合を強化する。強化された細胞付 着と組織融和は、感染を最小限にするように作用する。能力ある組織通関港は、 細胞の保護層によって“封印閉じられからである。

開示されたペプチドが化学的に移植されるどの用具表面でも、開示した方法で処 理することができる。例として、これらの用具表面は、陰茎、膣、心臓、股関節 部の移植または交換物：カテーテル；人工皮膚；血管及び動脈：人工層及び靭帯 ；人工骨ねじ、骨板、骨片及び骨関節：神経成長ガイド：眼内レンズ及び類似物 を含む。

ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）表面は、タンパク質の吸着を阻害することが示 されてきたので、ＰＥＯが通常用いられる生体医療ポリマー、たとえばポリエチ レンテレフタレート（ＰＥＴ）、ベレタン（ポリウレタン而品、ＰＥＬＬ）及び ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の表面に結合させた。ＰＥＯ及びポリビ ニルピロリドン（ＰＶＰ）やポリエチルオキサゾリン（ＰＥＯＸ）のような他の 水溶性ポリマー（ＷＳＰ）を組み込むために新しい溶液技術か用いられた。これ らの表面のＰＥＯ，ＰＶＰ及びＰＥ０Ｘは、接触角分析及びＥＳＣＡを用いて証 明された。修飾ポリマー上の短期間の血液適合性は、ポリマー表面における付着 血小板の定量に用いられるエピけい光ビデオ顕微鏡と連結して使用できるｉｎ　 ｖｉｔｒｏの平行板フロ一方式で試験された。

ＰＥＯで修飾した表面は、それぞれの対照表面より血栓形成が低下することか示 され、分子量１８５００のＰＥＯは５０００よりも著るしく低い細胞応答を示し 、あるいはまた、ｔｏｏｏｏｏ分子量のＰＥＯは他の水溶性ポリマーと同様であ った。電子顕微鏡の走査は、血液か流れた後これらの表面で行われ、これらの試 験はビデオ顕微鏡分析と同じ結果を示した。修飾した表面でのヒトの包皮繊維芽 細胞の付着と伸展を用いて、細胞付着の防止効果をＰＥＯ，ＰＶＰ及びＰＥ０Ｘ について試験した。ＰＥＯ１８５００修飾表面で劇的な反応か得られ、ＰＥＯ１ ８５００修飾表面では、これらの細胞の植えつけ後３０日以上も極端に低い付着 結果か得られた。他のすべての剤は５から１０日以内に融合した。ＰＥ０１８５ ００修飾表面だけが吸着されるタンパク質の顕著な低下を示したタンパク質吸着 試験とあわせて、これらの結果は、この分子量がタンパク質の吸着防止、従って 修飾ポリマーの表面における細胞の相互作用の防止に適していると思われる。Ｐ Ｅ０５０００分子量は、この機能の有効な遂行のためには短かすぎ、またＰＥ０ １００００は、ベースポリマー表面に有効に組み込まれるには余りに長いかまた は大きすぎるよってある。

ＰＶＰとＰＥ０Ｘは、それらの反復単位にアミドをもち、これがタンパク質吸着 と細胞付着へ導く潜在的な相互作用部位として作用しているかも知れない。従っ て、５０００より太きく１０００００より小さいＰＥＯ分子量が、裸のポリマー へのタンパク質と細胞の付着を防止するために有効である。

これらの細胞非付着物質は、それら自身の効用をもっているけれども、それらは また、付着促進ペプチドが付属した基本物質として用いられると特に作用である 。この立場で、タンパク質は表面に吸着せず、そして表面の付着促進物質だけが ペプチドの形で化学的に添加される。

これは、組み込まれる特別なペプチドを調節することで表面に構策される細胞型 特性として、ペプチドを表面に付着させる結合アームの調整またペプチド表面密 度の調整を可能にすることができる。このような特性は、ペプチドか表面に吸着 される時はタンパク質もまた吸着されて多数の接着信号が生ずるため不可能であ る。

開示されたペプチドにより処理された表面に与えられた細胞付着性と、このよう な処理表面を作りまた使用する方法を示しなから、証拠となる物質を、ここに記 載する。処理表面は、たとえばブタ、ネズミ、昆虫及びヒトの細胞を含む細胞の 種や型の培養に適している。申請者らは、本発明を証明するために色々な細胞を 使用したか、それらの例としては、ヒトの包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）、ブタの大 動脈内皮（ＰＡＥ）細胞、胚及び新生組繊細胞を含むか、その例に限定はされな い。しかしながら、本発明は、細胞のどの種または組織源とも結合して用いるこ とができ、細胞のとのような特別な型によっても、その使用は限定されない。灰 量は、本発明を実証するのに用いた特別な細胞量を培養するある好ましい方法に ついてあらましを述べる。

スイスマウス胚から樹立された不滅胚細胞系、ＮＩＨ／３Ｔ３は、Ａ＋＋＋ｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎの細胞貯蔵所（Ａ ＴＣＣ＃ＣＲＬ　ｌ　６５８）から入手した。培養は、ＩＯ％ウシ胎児血清か補 充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’　ｓ培地に維 持され、湿った５％ＣＯ２雰囲気中で３７°Ｃで培養された。細胞の集密的細胞 単層は、燐酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に０．５％トリプシン及び０．５３ｄ　ＥＤ ＴＡを含む溶液中で３７℃で１５分培養して取り入れられた。細胞は新鮮な培地 に再懸濁され、細胞を新らしい培養皿に付着させ成長させることによって継代培 養した。

ヒト包皮繊維芽細胞 ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦｓ）は、テキサス、オースチン、セトン病院の新生 児病棟の新生児の包皮組織から分離された初代細胞系である。およそ５−ＩＯ新 生児包皮か無菌的に無菌ＰＢＳに集められ、５ｍｍ２の片に細かくきざまれ、ト リプシンー・ＥＤＴＡ中で４時間培養された。ＨＦＦｓは２００ｇで５分間遠心 分離によって集められ、１０％のウシ胎児血清（Ｇ　ｒＢｃｏ）　、４００μ／ ｍｌペニシリン（［ｒｖｉｎｅ）及び４００　ｕ　ｇ／ｍｌストレプトマイシン （［ｒｖｉｎｅ）が補充されたεａｇｌｅ’　ｓ培地（ＤＭＥＭ　、　Ｍｅｄｉ ａｔｏｃｈ）のＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾培地に再懸濁され、湿った５％ＣＯ□雰囲 気中で３７°Ｃで培養された。

細胞は、集密細胞単層をトリプシン処理し、新鮮培地に細胞を懸濁し、新しいフ ラスコに細胞を植えつけて継代培養を行った。ＨＦＦｓは廃棄される前に２０継 代まで培養基に維持された。

ブタ大動脈内皮細胞 ブタ内皮細胞は、犠牲にした小型のブタから得られた。

内皮細胞はＪａｆｆｅ　ｅｔ　（１９７３）　、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　（ｎｖｅ ｓｔ。

５２　：　２７４５−２７５６）の方法で分離された。特に、犠牲にした小型の ブタからのブタ大動脈組織部分は、血を除くため、あたたかい（３７℃）ＰＢＳ で洗滌し、１０ｃｃの注射器内におかれた。切片の管腔を、次にシグマ型■［の コラーゲンの１００μＩ／ｍｌ溶液で満した。組織は、次に３７°Ｃで３０分間 培養された。大動脈の管腔は、次にＰＢＳで洗滌され、細胞は２００ｇで５分間 遠心分離され、２０％ウシ胎児血清と抗生物質を補充した培地１９９に再懸濁さ れた。懸濁液は培養フラスコに添加され、培養は、湿った５％のＣＯ□雰囲気中 で３７°Ｃて維持された。

ヒトのＩ！ｌｌ＃脈内皮細胞 ヒトの屓静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳ）は、テキサス、オースチン、セトン病院 の分娩室の分娩後の調帯から、Ｊａｆｆｅ等の方法（１９７３，Ｊ、　Ｃｌ１ｎ 、　Ｉｎｖｅｓｔ、、５２　：２７４５−２７５６）により分離される初代細胞 系である。分娩後の慣帯は、５−１２インチの部分にクランプで締められ、胎盤 の組織から切断され、無菌的に無菌ＰＢＳに集められた。クランプは切断した線 帯から取り除かれ、慣静脈内の血塊は、ゆるやかな圧力を調帯に加えて押し出さ れる。血液は、無菌のピペットで静脈の一端から内部に貫通し、また静脈管腔に 無菌のＰＢＳをゆるやかに流して、静脈から洗滌される。静脈の開いた端は次に 静脈を密封するため止血鉗子で外部から締められ、２４０Ｕ／ｍｌの１１型のコ ラーゲン（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳかカニユーレを通して静脈か完全に酵素溶 液で満されるまで加えられた。カニユーレか取り除かれ、静脈の開いた端は、ク ランプで締められ、調帯はこの溶液と共に３０分間３７°Ｃて培養された。３０ 分の培養期間後止血鉗子が除かれ、ＨＵＶＥＣｓを含む溶液は無菌の遠心分離管 に排出された。追加の２０ｍ１の無菌ＰＢＳか静脈の管腔を通して無菌の遠心分 離管に集められた。２００ｇで５分間の遠心分離によってＨＵＶＥＣｓが集めら れ、２０％のウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）、　４００　Ｕ／ｍｌのペニシリン、 ４００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、１００μｇ／ｌｎｌの 内皮細胞成長補助剤（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）及び１ ００μｇ／ｍｌのブタのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）を補充された培地＋９９（Ｍ１ ９９゜ＧＴＢＣＯ）に再懸濁され、湿った５％のＣＯ２雰囲気で３７°Ｃで培養 された。細胞は、集密細胞単層をトリプシン処理し、新鮮な培地に細胞を懸濁し 、新ら°しいフラスコに細胞を植えつけることによって継代培養された。

ＨＵＶＥＣｓは、廃棄される前に５継代まで培養基に維持された。

ヒト血管平滑筋細胞 ヒト血管平滑筋細胞（ＨＶＳＭＣ３）は、テキサス、オースチン、セトン病院の 分娩室の分娩後の慣帯から、Ｊａｆｆｅ等の方法（１９７３、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、 　Ｉｎｖｅｒｓｔ、、　５２　：２７４５−２７５６）によって分離される初代 細胞培養である。ＨＵＶＥＣｓが分離された分娩後の慣帯は、鉗子で外部から慣 帯を繰返し押しつぶしたため外傷を起こしていた。Ｌ１型のコラーゲン（Ｓｉｇ ｍａ）　２４０　Ｕ／ｍｌを含むＰＢＳが静脈の管腔に添加され、静脈が完全に 酵素溶液で満された。慣帯は締められ、この酵素溶液と共に３７°Ｃで３０分間 培養することか出来た。３０分の培養期間後、止血鉗子が取り除かれ、ＨＶＳＭ Ｃｓを含む酵素溶液は無菌の遠心分離管に流し込まれた。無菌のＰＢ３２０ｍｌ を追加して静脈管腔を流し、無菌の遠心分離管に集められた。この管内のＨＶＳ ＭＣｓは２００ｇで５分間遠心分離によって集められ、２０％のウソ胎児血清（ Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ）　、４００　Ｕ／［１１１のペニシリン、４００　ｕ　ｇ／ｍ ｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、１００　ｕ　ｇ／ｍｌの内皮細胞増殖 補助剤（Ｃａｌ（ａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ）及び１００μｇ／ｍｌ のブタのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）を補充された培地＋　９９　（Ｍ１９９．ＧＩ ＢＣＯ）に再懸濁され、湿った５％ＣＯ２雰囲気中　３７°Ｃで培養された。細 胞は、集密細胞単層のトリプシン処理、新鮮培地への細胞の懸濁及び新らしいフ ラスコでの細胞の植えつけによって継代培養された。ＨＶＳＭＣＳは、それらが 廃棄される前に５継代まで培養基に維持された。

ヒトの血小板（ＰＩＴ） ヒトの血小板は、多血小板血漿（ＰＲＰ）を得るために、ヘパリン化した全血（ ４Ｕ／ｍｌ）を２５０ｇで！５分間遠心分離して得られた。血液は、健康な煙草 を吸わない男性か２ら集められた。ＰＲＰは遠心分離した血液から除かれ、血小 板拡散分析に用いられた。あらかじめ刺戟された血小板（Ｐｒｅｓｔｉｍ、　Ｐ ｉｔ）は、血小板拡散を測定する前に５μＭ　ＡＤＰで処理された。

次の例は、好ましい実施例と本発明の有効性を述へるために紹介するが、ここに つけ加えられた請求の中で、特に別に指示がない限り、本発明か限定されること を意味しない。

例１は、特に好ましいペプチド断片か合成される方法を述べる。

例２は、ＰＨＨＭＡポリマー表面の誘導について述べる。

例３は、ＰＥＴポリマー表面の誘導について述べる。

例４は、包皮細胞組織からの初代細胞培養を準備する好ましい方法を述べる。

例５は、誘導したＰＨＥＭＡ及びＰＥＴポリマー表面への細胞付着について述べ る。

例６，７及び８は、ガラス表面の誘導、このような誘導ガラス表面の細胞付着と 支持特性及び非誘導ガラス表面に対比して、色々なペプチドにより誘導ガラス表 面に与えられた比較的細胞支持型の特性について述べる。

例９は、熱及びタンパク質の加水分解に対する誘導ＰＥＴポリマーとグリコフェ ーズガラス表面の相対的安定性を述べる。

例１０は、非前処理ＰＥＴポリマー表面に対比して前処理した場合の細胞支持特 性に関する比較試験を紹介する。

例１１及び１２は、生体医療移植（例Ｉｆ−内在内在−チーチル５例１２−神経 成長ガイドついて当該表面誘導工程を用いる提案方法を実証する。

例１３は、色々な程度のペプチド置換により処理された表面におけるＨＦＦ細胞 付着と伸展について述べる。

例１４は、グリコフェーズガラス−ペプチドを結合することができる細胞非付着 基質の型について述べる。

例Ｉ５は、繊維芽細胞と内皮細胞の付着を支持するか、血小板はしない、ＲＧＤ 物質と結合したグリコフェーズガラスについて述べる。

例１６は、繊維芽細胞と内皮細胞の付着を支持するが、血小板はしない、ＹＩＧ ＳＲ物質と結合したグリコフェーズガラスについて述へる。

例１７は、繊維芽細胞と内皮細胞の付着を支持するか、血小板はしない、ＰＤＳ ＧＲ物質と結合したグリコフェーズガラスについて述べる。

例１８は、内皮細胞の付着は支持するか、繊維芽細胞または血小板は支持しない 、ＲＥＤＶ−物質と結合したグリコフェーズガラスについて述へる。

例１９は、ＨＵＶＥＣまたは血小板伸展を支持しないか、神経突起の成長を支持 すべきＩＫＶＡＶ物質と結合したグリコフェーズガラスについて述へる。

例２０は、ペプチドを付着することがてきる重合性細胞非付着基質であるポリエ チレングリコールか固定されたポリエチレンテレフタレートについて述へる（Ｐ ＥＴ／ＰＥＧに省略） 例２■は、繊維芽細胞と内皮細胞の付着を支持するか血小板または血管平滑筋細 胞の付着を支持しないＲＧＤ−物質と結合したＰＥＴ／ＰＥＧについて述へる。

例２２は、内皮細胞の付着を支持するか、繊維芽細胞または血小板または血管平 滑筋細胞について支持しないＲＥＤＶ−物質と結合したＰＥＴ／ＰＥＧについて 述へる。

例２３は、ＨＵＶＥＣまたは血小板の振展を支持しないか、ＨＦＦ伸展を支持し 、軸索成長を支持すると思われる、ＩＫＶＡＶ−物質と結合したＰＥＴ／ＰＥＧ １：ついて述べる。

例２４は、ポリエチレンオキシドとその他の水溶性ポリマーを重合性生体物質の 表面に組み込む溶液技術につ本例は、１２アミノ酸残基より少なく、少なくとも アミノ酸配列アルギニン−グリシン−アスパラ銀酸（ＲＧＤ）を含むペプチドの 特に好ましい合成方法を証明する。

これらの試験に用いられたペプチドは、ＧＰＤＳＧＲＹ、ＧＩＫＶＡＶＹ、ＧＲ ＥＤＶＹ。

ＧＲＧＤ、ＧＲＧＥ、ＧＹＩＧＳＲ，ＧＲＧＤＹ。

ＧＲＧＥＹ、及びＧＹＩＧＳＲＹを含み、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｔｅｘａ ｓ　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌのペプチド合成 研究所でよく知られた方法で合成され、あるいはまたＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 、［ｎｃ、、Ｄｅｎｔｏｎ　Ｔｅｘａｓから入手した。

例２−ＰＨＥＭＡポリマー表面の製造 この実験は、小さなペプチド断片か兵役的に結合したポリマー表面を作る特に好 ましい１つの方法を述べるへく企画された。ＰＨＨＭＡ　（ポリ（ヒドロキシエ チルメタクリレート））、は、その無処理状態では細胞付着を支持しないことか 判明したヒドロゲルである。

特に好ましいペプチドＧＲＧＤ及びＧＹＩＧＳＲか、ＰＨＥＭＡ表面水酸表面水 酸基化トレシル活性剤を用いたペプチドのグリシン結合アームの末端第一アミン を用いて、ポリマー表面に移植された。各それぞれのペプチドの末端におけるＧ グループは、表面−活性ペプチド（ＧＲＧＤ）とポリマー表面の間の距離を長く するのに用いられた。

さらに特徴的には、結合方法は、反応成分にとっては有機溶媒、しかしポリマー にとっては非溶媒である塩化トレシルによるＰＨＥＭＡ表面ヒドロキシル成分の 活性化を利用した。ＰＨＥＭＡフィルムは、その表面はヒドロキシエチル群によ り十分に供給されるので前処理は必要ではなかった。この修飾表面の細胞付着促 進活性は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞の付着と伸展分析か行なわれた例４に略記し た方法で測定された。トレシルの浅化は、ペプチドＧＲＧＤまたはＧＹＩＧＳＲ の末端アミンによって水溶性溶媒中に移された。

非修飾ＰＨＨＭＡフィルムは、２０μｍの２．２．２＝トリフルオロエタンスル ホニルクロライド（塩化トレシル）及び２ｍｌのトリエチルアミンを含む２０ｍ １の乾燥エーテル中で室温で１５分間トレシル活性化された。活性化したフィル ムは、次に０．２Ｍの重炭酸ソーダｐＨｌ０の緩衝液で洗滌され、ペプチドを結 合するために、８０ｎｇ／　ｍｌのＧＲＧＤを含む同じ緩衝溶液中に室温でおよ そ２０時間放置された。

本実験は、細胞付着を促進する小ペプチドの封入を容易にするように水酸基成分 を欠いた表面を製造する特に好ましい方法の１つを述へるように企画された。

ＰＥ７表面は水酸基成分の欠除したポリマーてあり、従ってその表面は、ペプチ ドでその後修飾される前に、前処理されていなければならない。特に、ＰＥＴフ ィルム表面は請求電子性芳香族置換によって修飾され、ヒドロキシメチルグルー プか表面に付加された。反応は室温で大気圧下で行われた。次にフィルムは１８ ．５％（Ｖ／Ｖ）ホルムアルデヒドと１Ｍ酢酸におよそ４時間浸された。

前処理されたＰＥ７表面は次に、例２に略記したＰＨＥＭＡ表面について述べた ように正確に修飾された。

次の記載は、水酸基成分を含まないＰＥＴマトリックスのようなポリマー表面を 前処理する最も好ましい方法の紹介である。ヒドロキシル成分とそこへのペプチ ド断片の付着の表面修飾は、次の計画に従って行われた。

１、表面ヒドロキシメチル成分の付加−表面グループまたはポリマー表面の電子 芳香族置換の遂行によるＰＥＴポリマー表面に対し、そこではＰＥＴポリマーは １８．５％（Ｖ／Ｖ）ホルムアルデヒドと１Ｍ酢酸に室温で約４時ｒｗｉ浸され る。

２．トレシル活性化−表面ヒドロキシル成分に対し、そこでは、前処理されたＰ ＥＴフィルムは、２，２．２−トリフルオロエタンスルホニルクロライド（塩化 トレシル）４０μｌ及びトリエチルアミン２ｍｌを含む２０ｍ１の乾燥エーテル 中に室温で１５分間浸される。

３、洗滌−ｉ性化ＰＥＴフィルムは次に、ペプチドを結合するために、０．２Ｍ 重炭酸ソーダ、ｐＨ１０の緩衝溶液により室温で洗滌された。

４、表面へのペプチド結合−洗滌したＰＥＴフィルムは次に、８０ｎｇ／ｍｌの ＧＲＧＤまたはＧＹｒＧＳＲペプチドを含む同じ緩衝溶液に２０時Ｗｉ装かれた 。

例４−ヒト包皮組織からの初代細胞培養ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦｓ）は、テ キサス、オースチン、セトン病院の新生児病棟の新生児の包皮組織から分離され た初代細胞系である。これらの組織から初代細胞系を樹立するために次の方法が 用いられた　５−１０新生児包皮か無菌的に無菌ＰＢＳに集められ、５ｍｍ２の 片に細かくきざまれ、トリプシン−ＥＤＴＡ中で４時間培養された。ＨＦＦｓは ２００ｇで５分間の遠心分離によって集められ、１０％のウソ胎児血清を補充さ れたεｎｇｌｅの培地のＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾培地に再懸濁された。

細胞は集密細胞単層をトリプシン処理し、新鮮培地に細胞を懸濁し、新らしいフ ラスコに細胞を植えつけて継代培養された。ＨＦＦｓは廃棄される前に２０継代 まで培養基に維持された。

例５−派生ＰＨＥＭＡ及びＰＥＴポリマー表面の細胞付着試験 本実験は、中間的に吸着されたタンパク質かない状態で、受容体−媒介の細胞付 着か支持されるようなポリマー表面が設計され、合成されるかどうか−すなわち 細胞付着と伸展を支持する完全に自己機能的な表面を製造することかできるかを 決定するために計画された。たとえば、コラーゲンまたはフィブロネクチンのよ うな完全なタンパク質の固定化は行うことができるがしかし、タンパク質の加水 分解、タンパク質分解及びタンパク質の変性などの困難さをともなっている。こ れをうまくやるために、大部分のＣＡＭｓ、アルギニン−グリシン−アスパラギ ン酸（ＲＧＤ）の小さな：熱安定性のペプチド領域か、グリシン−アルギニン− グリシン−アスパラギン酸（ＧＲＧＤ）の形の中のグリシンＮ−末端連結部位に よりポリマーフィルムの表面に共有結合された。これは本質的に生体付着された 安定な表面、すなわち：その材料表面は、培地からの吸着されたＣＡＭｓとは完 全に独立に細胞表面受容体と高い親和性をもつグループを含んでいる表面を生産 した。この表面修飾は、培養系の最も効果的な活用を単純化するよく特徴づけら れた基質を開発する体系的な方法を与える。マウスＮＩＨ−３７３（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ　ｌ　６５８）繊維芽細胞は、洗滌され、処理及び無処理のＰＨＥＭＡ基 質の両方の無血清培地に植えつけられた。処理したＰＨＥＭＡ基質は、例２に略 記したように作られた。

培養方法 ＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５８　、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ　ＭＤ）は、ウシ胎児血清ヲ補充されたＤＭＥＭ中で、湿った５％炭酸ガス雰 囲気中３７°Ｃて培養された。ブタ大動脈は、犠牲にした小型のブタから得られ た。内皮細胞は、Ｊａｆｆ等の方法Ｎ９７３゜Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　［ｎｖｅｓｔ 、　５２　：　２７４５−２７５６　）で；コラーゲナーセによって血管の内腔 表面を豊かにする助けとなるよう修飾された方法で分離された。ブタ大動脈内皮 細胞（ＰＡＥ）は、ｌＯ％ウシ胎児血清で補充されたＤＭＥＭ中に上記と同じ培 養條件て維持された。

表面修飾方法 ＧＲＧＤはＮｉ　１ｓｓｏｎ及びＭｏ５ｆａｃｈ及び例３及び４に述べられたよ うな塩化トレシル固定化法を用いてグリシル末端アミン経由でポリマー表面に移 植される。２種類のポリマー表面が修飾された。すなわちポリ（ヒドロキシエチ ルメタクリレート）（省略してＰＨＨＭＡ）及びポリ（エチレンテレフタレート ）（略してＰＥＴ）である。

結合方法は、ポリマーにとって非溶媒であるが、反応成分にとって有機溶媒の塩 化トレシルによる表面水酸基成分の活性を利用した。

残ったトレシルグループは、ペプチドの末端アミンにより、水溶液溶媒に移され た。

ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）は塩化トレシル活性のための水酸基 群を利用できず、そのため表面ヒドロキシル化法が開発された。ヒドロキシメチ ル群をＰＥＴフィルムに付加する電子性芳香族置換か用いられた（図１）。特に 、商業的に利用できるＰＥＴフィルムは、特に例３で限定したように、１８．５ ％（Ｖ／Ｖ）ホルムアルデヒド及び１Ｍ酢酸に室温で４時間浸された。

ＰＨＥＭＡフィルムは、それらの表面に十分にヒドロキシエチル群が与えられる ので、前処理の必要はなかった。

修飾ＰＥＴと無修飾ＰＨＥＭＡフィルムは、４０μｍの２．２．２−トルフルオ ロエタンスルホニルクロライド（塩化トレシル）と２ｍｌのトリエチルアミンを 含む２０ｍ１の乾燥エーテル中で１５分間室温でトレシルにより活性化された。

活性化フィルムは次に０．２　Ｍの重炭酸ソーダでｐＨ１０の緩衝溶液で洗滌さ れ、およそ８０ｎｇ／［１１１のＧＲＧＤを含む同じ緩衝溶液中に室温で２０時 間放置してペプチドを結合させた。ヒドロキシメチル成分によるＰＥＴフィルム の修飾及びトレシル活性化とＧＲＧＤ結合を含む次の段階を図２に模式的に表し ている。

細胞伸展分析 ＮＩＨ／３Ｔ３及びＰＡＥ細胞は、トリプシン処理により培養フラスコから分離 し、無血清培地（１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ）に懸濁し た。細胞は、溶媒を含むＢＳＡ中で遠心分離によって２回洗滌し、別に記載のな い限り、無血清培地に３０００細胞／フイルムＣＤＩ”の密度で植えつけ、通常 の培養條件で培養した。

伸展細胞は、たとえば明瞭な核、原形質突起及び多角形フのような形態的な型に よって点数を数えた（図３）。

細胞は、Ｌｅｉｔｚ　Ｆｌｕｏｖｅｒｔの倒立顕微鏡でＨｏｆｆｍａｎ調整対照 光学法を用いて２００Ｘの培率で可視化した。細胞の増殖はまた、ｌＯ％ウシ胎 児血清を付加した培地で培養した細胞について、色々な時間点で伸展細胞を測定 することによって評価された。

アクチン緊張繊維可視化 修飾表面に付着した細胞内のアクチン緊張細胞とミクロフィラメント束の可視化 のために、ＮＢＤファラシジン（７−ニドロベンズー２−才キサ−１，３−ジア プリルファラシジン）（分子プローブ、Ｉｎｃ、　Ｅｕｇｅｎｅ、　ＯＲ）が用 いられた。試料は製造会社の方法で作られ、ＬｅｉｔｚＥ３励起フィルター及び 紫外イルミネーションの装備されたＦｌｕｏｖｅｒｔＢ微鏡を利用して観察され た。

可溶性ペプチド競争試験 競争試験で、３Ｔ３繊維芽細胞は、およそ９０μｇ／ｍｌのＲＧＤＳを含むまた はペプチドなしの無血清培地のどちらかで３０分間前培養された。細胞は次に、 ＧＲＧＤ誘導のＰＥＴ上におよそ３０００細胞／ｃｍ２の密度て植えつけられ、 通常の培養條件て３時間培養後に伸展か測定された。

ＧＲＧＤ誘導基質は、それらの表面に細胞の活性付着を支持する能力で特徴づけ られた。ＰＥＴ前処理は、色色な時間帯でヒドロキシル化された塩化トレシル活 性化フィルムへのＧＲＧＤ結合により効果的に活用された。

ＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞を用いる細胞伸展分析は、最大の反応か維持された條 件で測定するように行われた。

４時間の前処理は、最大の細胞付着と伸展に適当であるように思われた。ＰＨＥ ＭＡフィルムは、低濃度のペプチド（８０ｎｇ１０＋ｌ）を利用してＧＲＧＤが 誘導され、１０００倍量の細胞付着の増加結果を生じた（図４）。

ＧＲＧＤ結合ＰＥＴフィルムと、通常の結合條件でＧＲＧＤと共に培養した前処 理ずみのトレシー処理で活性化されなかったフィルムとの比較では、後者のフィ ルムにはわずかのペプチドしか付着せず、あるいはまた吸着されたペプチドは、 受容体−媒介付着反応に利用することか出来なかった（図５）。ＧＲＧＤ修飾表 面は、血清の存在下でさえ無処理のＰＥＴよりも、はるかに良好な３Ｔ３細胞付 着を支持し、これは修飾表面の固有活性の表示である（図６）。

競争実験では、９０μｇ／ｍｌのＲＣ，ＤＳの存在で、修飾表面への付着か７５ ％減少する結果を生じ、それはさらに基質の生体詩作の活性を立証する（図７） 。修飾フィルム上の、無血清培地の伸展３Ｔ３繊維芽細胞の全部の形態（図３） は正常であるように見えた（図３）。

如何なる細胞骨核組織もＲＧＤＳ修飾表面に観察されなかったということは、Ｒ ＧＤＳ烙飾表首飾表面上の細胞系は完全な付着反応及び、それ以外のものは得ら れないことを示す。しかしながら、これは一般的な現象ではなく、正常なラット の腎臓の繊維芽細胞及びＮｉｌ　８、正常なハムスターの繊維芽細胞系を含むい くつかの細胞型は、単にＲＧＤペプチド（１４）のみを含む基質にも十分な反応 を示してきた。ＧＲＧＤ誘導＝ＰＥＴ上での増殖は、血清依存性であり、非修飾 ＰＥＴ　（図８）のそれと似ていたが、しかし、この図でＧＲＧＤ曲線（白四角 ）が対照曲線（黒菱形）をリードしていることから分るように、最初の付着と伸 展ははるかに早かった。

ＧＲＧＤ結合表面上でのブタ大動脈内皮細胞の付着と伸展もまた、血管内皮ＲＧ Ｄ指向型受容体が特徴づけられていたことから（１５）、予想されたように血清 には依存性がなかった。完全培地におけるＰＡＥ細胞伸展は、４時間で、ＧＲＧ Ｄ誘導フィルム上の方が、無処理のフィルム上よりはるかに広範囲であったがし かし、２４時間では、両表面共に集密単層細胞を示した。これらの観察から、Ｐ ＡＥ細胞付着の運動性は、修飾表面でより急速であることが示された。

申請者の開示した方法は、不溶解性細胞外マトリックス信号への細胞反応を試験 するのに使用される安定した化学的に限定された表面を得る方法を与える。それ はタンパク質吸着からの細胞付着と伸展を脱着させる方法を与える。この考え方 で、細胞付着分子（ＣＡＭｓ）を含１　む必要のない無血清培地（すなわち、血 清から供給されるよりもむしろ純粋なタンパク質か個別に添加される培地）を使 用することを好む人々にとっては作用であろう。

これらの表面か、非常に低い血清濃度で細胞増殖を支持する能力かあるかどうか はその測定か今後に残されている。

培地タンパク質の存在で、ＧＲＧＤ表面は吸着したタンパク質により急速におお われることを理解すべきである。しかしながら、これは、申請者らの培養基中の アルブミンによる試験で（図４．５．７）示されたように、高い親和力をもった ＲＧＤの統合的な結合能力か吸着したタンパク質と育利に競合することによって 問題にはならない。細胞分離は、ＲＧＤ−統合親和力がカルシウム依存性がある ので、カルシウムキレート化によって目的が達せられるだろう。

細胞機能は、細胞付着表面に高度に依存することもまた、注意すべきである（１ ６．１７）。この表面は、１ｎｖｉｖｏでそれに近づいた局部的な環境を与え、 そのためにより強力な付着及びまたはより高い生産性を刺戟する。

例６−ガラス表面のペプチド誘導 本例は、細胞受容体−媒介付着促進基質を与えるために、ガラスのようなセラミ ック表面を誘導する最も好ましい方法の概略を述べるために計画された。

グリコフェーズガラスは、０ｈｌｓｏｎ等の方法（１８）によって作られた。ガ ラスカバースリップ（１８ｘ　１８１＋１１０；　Ｔｈｏｍａｓ）は、０．５Ｍ 水酸化ナトリウム中に２時間浸し、イオン交換水で洗滌し、（３−グリシドキシ プロピル）−トリメトキシシラン（Ｐｅｔｒａｒｃｈ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎ ｃ、）の水溶液（１％ｐ）１５．５　）中に浸した。ｍ本は加熱され、９０°Ｃ で２時間維持された。次にｐＨを３．０に調整し、誘導ガラス上のオキシラン成 分をグリコール群に変換するために再び１時間加熱した。乾燥グリコフェーズガ ラスカバースリップは、乾燥アセトン（乾燥したモレキュラシーブ４　Ａ　；　 Ｆｉｓｈｅｒ）で洗滌された。約１ｍｌの乾燥アセトンに、約２００μｌの乾燥 ピリジンと約１００μｌの乾燥塩化トレシル（Ｆｌｕｋａ　）か加えられた。こ の混合物の最小量を、ガラス結晶皿におかれた各グリコフェーズガラスカバース リップの上部表面に添加した。反応は室温でおよそ１０分間で進行し、次いてカ バースリップを、約１ｍＭの塩酸で洗滌し、最後に約０．２Ｍの重炭酸ソーダの ｐＨ９の緩衝溶液（結合緩衝溶液）で洗滌した。約５５−３０ｎ／＋ｎｌのペプ チド、好ましくは紋１０　ｎｇ／　ｍｌ、を含む結合緩衝液の最小量をカバース リップに添加し、ペプチドを表面に移植するため室温で約２０時間培養した。

この試験に用いたペプチドは、例■に概略述べたように合成された。緩衝液を含 むペプチドは、２０時間の培養期間後取り除かれ、約０．８　Ｍのベーターメル カプトエタノールを含む結合緩衝溶液に置きかえられた。カバースリップは、未 反応のトレシル群か非接着成分と反応するように約２時間培養された。

ＧＲＧＤＹは、およそ５．０ｍｃｉのＮａ１２６　［を含むｐＨ７，４の燐酸緩 衝液へ約２０μｇのペプチドを添加し、ヨードビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に室 温で約１５分間培養する、製造会社の指示に従った方法で放射性標識が行われた 。

標識化ペプチドは、Ｓｅｐ　Ｐａｋ　Ｃ＋ｓ試料製造カートリッジ（Ｗａｔｅｒ ｓ）に反応混合物を加え、メタノール−水−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（８０ ：１９　：　１　ｖ／ｖ）で洗滌し、ＰＢＳで平衡状態にして精製した。カート リッジは、組み込まれなかったヨードを溶出するため１％ｖ　／　ｖ　Ｔ　Ｆ　 Ａで洗滌した。反応混合物は、１′％ＴＦＡ中のメタノール濃度の１０％逐次増 加法を用い、最終溶出液はメタノール−水−ＴＦＡ　（８０：　ｌ　９　：　ｌ ｖ／ｖ）で分別された。カートリッジは、放射能活性がベースラインに戻るまで 、各濃度で洗滌された。各フラクションは、２２０ｎｍ（ｚブシロン＝　８４４ １Ｍ−’　ｃｍ−’）の吸収か測定され、ペプチド濃度が分析された。溶出ペプ チドの９０％以上は、メタノール−水−ＴＦＡ　（４０：５９：１　ｖ／ｖ）の フラクションにあり、凍結乾燥してＰＢＳ中で再構成された。ペプチドの比放射 能は、標識ペプチドの既知量を自動ガンマ−計数器（［５ｏｆｌｅｘ　。

Ｉ　ＣＮ　Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）で計数後、測定された。

平均比放射能は、４４．０±２．０　ｍｃｉ　／ｍｍｏｌであった。

ペプチド表面濃度を測定するため、標識ペプチドを色色な濃度で結合緩衝溶液（ ０，２Ｍ重炭酸ソーダ、ｐＨ１Ｏ）に添加し、トレシル活性化ガラス上で２０時 間室温で培養した。ガラス表面の単位面積当り、溶解ペプチドのモル濃度か反応 しうるように、投入濃度を制限した。

表面濃度は、ガラスの単位面積当り結合するペプチドのモルとして限定され、洗 滌したガラス試料をガンマ−計測器で計測し、標識ペプチドの比放射能を基にそ の値を計算して測定された。

細胞付着受容体の２組の重要な級としての配位子を含む合成ペプチドＧｌｙ　− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＡＳｐ−Ｔｙｒ　（ＧＲＧＤＹ）及びＧｌｙ　−Ｔｙｒ−１１ ｅ　−Ｇｌｙ　−５ｅｒ　−Ａｒｇ　−Ｔｙｒ（ＧＹ　ｒＧｓＲＹ）は、Ｎ−末 端グリシンによって、非−付着修飾ガラス表面、グリセロルブロビルシラン結合 ガラス（グリコフェーズガラス）に共有結合された。グリコフェーズガラスは、 水を吸収しかつヒドロゲルと同様に、水溶液の膨潤とバルクの滲透の関連した問 題なしにタンパク質の吸着を減少さぜる共有共合の有機層を含んでいる。グリコ フェーズガラスは、タンパク質をわずかしか吸収しないので、培地に血清かあっ てさえ、細胞付着の支持には適当ではない。そのために、ＧＲＧＤＹとＧＹＩＧ ＳＲＹか、Ｎｉ　１ｓｓｏｎ等の塩素化トレシル固定化法、（（１９８７）　、 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１３５　：６５−７８）を用いてグリコ フェーズガラスに結合された。Ｎｉ１ｓｓｏｎ等の文献は特に文献によりここに 取り入れられている。

Ｎ〜末端”Ｇ”は、付着ペプチドと表面の間のスペーサーとして用いられ、また Ｃ−末端“Ｙ”は放射性標識ヨウ素化に用いられた。第一アミンは核的に作用し 、塩化トレシル−活性化支持物質と反応し、共有的に結合するので、用いられた ペプチドは、Ｎ−末端“Ｇ”の第一アミンを通して独占的にグリコフェーズガラ スに結合した。ペプチドの表面濃度は、　＋２５１標識物によって測定され、１ ２．１　ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ　／ｍ”であった。この誘導法は、化学的に安定な 基質を生産し、表面で利用できるペプチドの量は正確に測定されまた調節される ので、受容体−仲介細胞付着の研究には宵月であろう。

例７−ベブチド誘導ガラス表面での細胞の付着と伸展本例は、ガラス表面への細 胞付着の量と速度を促進する上で、提案した化学的ガラス表面処理法の有効性を 測定するために計画された。

基質の製造 グリコフェーズガラス基質は、例６に記載した方法で作られた。これらの修飾さ れた基質は、吸着されたタンパク質とは独立に、培養されたヒト包皮繊維芽細胞 （ＨＦＦｓ）の付着と伸展を支持した。

測定されたパラメーター 移植されたＧＲＧＤＹ及びＧＹＩＧＳＲＹの両方の生物学的活性は、培地の血清 の存在及び欠除におけるＨＦＦの付着と伸展の測定によって評価された。巣状の 細胞接触形成及び細胞骨核組織かまた、これらの基質上に観察された。

ＨＦＦの伸展速度は、移植したＹＴＧＳＲ（ＧＹＩＧＳＲＹ）ペプチド基質上で は、ＲＧＤ含１ｒ　（ＧＲＧＤＹ）ペプチド表面よりも非常におそかった。細胞 はフォカルコンタクトを形成し、または血清の存在下でのＲＧＤ誘導基質上では 形成しなかった。巣状接触は、血清が培地に存在した時にのみ、ＹｒＧＳＲ−グ ラフト表面に形成され、ＲＧＤ−含有表面上に観察されたものとは形態的に区別 された（図１Ｏ：図１２）。

付着タンパク質の吸着は、すべての表面で最低であったが、血清は、ミクロフィ ラメントの組織化と付着細胞の伸展の範囲に影響を及ぼした。

例８−誘導ガラス表面におけるペプチド断片ＧＲＧＤＹ、ＧＹＩＧＳＲＹ及びＧ ＲＧＥＹの比較試験誘導ガラス表面は、ＧＲＧＤＹ、ＧＲＧＥＹ及びＧＹＧＳＲ Ｙペプチドを用い、例６に記載の方法により作られた。ＨＦＦ細胞か次にそれぞ れの作られた表面に置かれた。伸展と増殖速度の測定か行われた。無処理のグリ コフェーズガラスは、血清を付加した培地内の基質上で細胞か培養されても、細 胞付着の支持はみられなかったが、これは、タンパク質−結合力の低い基質であ ることを示している。

ヘーターメルカブトエタノールーグラフトガラスは、細胞伸展試験の結果に示し たように（図２８．Ｄ：３Ｂ。

Ｄ）、同じように細胞付着と伸展の支持はみられなかった。ベーターメルカプト エタノールは、ガラス表面上に残っているトレシル群と反応するのに用いられた ので、非付着のバックグランドは、この表面で設定された。さらに、本質的に受 容体−媒介細胞付着を支持せず、グラフト化ＧＲＧＤＹと同様にタンパク質を吸 着するグラフト化ＧＲＧＥＹは細胞付着を支持しなかった（表１）。

この結果は、グリコフェーズガラス上の固定化ＧＲＧＤＹは、この基質上に著る しくタンパク質吸着を強めることはないことを示唆している。

伸展及び増殖速度測定 ＨＦＦ細胞は、例４に概略記載のように作られた。これらの細胞は、実験のため に刈り取られ、Ｃａ２ゝ及びＭｇトのない燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗滌され 、次に０．０５％トリプシンに０．５３ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ　（Ｇ　Ｉ 　ＢＣＯ）を加えた溶液中で１０分間培養された。細胞は遠心分離によって集め られ、血清補足培地または、２ｍｇ／ｍｌの熱不活性化（９０°Ｃ，１０分）ア ルブミン（Ｓｉｇｍａ　）及び抗性物質の加えられたＤＭＥＭからなる培地中に 再懸濁された。

完全培地または無血清培地に懸濁された細胞は、基質上におよそ１０．０００細 胞／ｃｍ”の密度で植えつけられ、５％ＣＯ□雰囲気で３７°Ｃで付着し伸展さ せた。位相差対物レンズと高解像ビデオカメラ（６７Ｍシリーズ、　Ｄａｇｅ− ＭＴＩ）を備えた倒立顕微鏡（Ｆｌｕｏｖｅｒｔ、　Ｌｅｉｔｚ　）を用いて、 色々な時間点で伸展細胞を観察した。

画像は、画像解析方式（シリーズ１５０　、　ＩｍａｇｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ　Ｉｎｃ、　）てデジタル化され、個別の細胞の面積は、デジタル化画像内 の各細胞の周辺の長さをトレーシングバト（Ｄｉｇｉ−Ｐａｄ　、　ＧＴＣＣ） でトレースし、各トレースによって囲まれた面積を積算ルーチンで計算すること によって測定された。少なくともＩ００細胞か分析され、細胞伸展速度が測定さ れるように、積算ヒストグラムか各時間帯毎に作図化された。

基質上の完全培地内の細胞増殖は、１００倍位相差顕微鏡で細胞を可視化して調 へられた。色々な時間帯で、細胞はＩＯ視野で計数され、増殖表面の単位面積当 りの細胞数は、視野の面積当りの平均細胞数を基に計算された。

細胞伸展分析の終点て、タンパク質の合成は、それらを基質に植えつける前に、 ２０μｇ／ｍｌのシクロへキシミドで３０分間細胞を処理することによって阻害 した。

細胞は実験中を通してシクロヘキシミドを含む培地に維持された。可溶性ペプチ ドで処理された細胞は、ペプチドを含む培地で３０分間前培養され、実験期間を 通してその培地に維持された。伸展細胞は、Ｍａｓｓｉａ等により述べられた方 法（１９８９）　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｅｎｇｉｎ、　Ｖ［、Ａｎｎ。

Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、５８９．　Ｉ）Ｉ）、２６１− ２７０゜１９９０）に従って１０視野で数えられた。視野当りの伸展細胞のパー センテージは、視野当り全細胞数に対する伸展細胞の割合を１００倍することに よって計算された。

形態試験 ペプチド−グラフト化２４Ｘ５０カバースリツプ（Ｔｈｏｍａｓ）への細胞付着 は、培養室ステージにのせられ、Ｆｌｕｏｒｏｖｅｎｔ倒立顕微鏡に固定された 。Ｎ　Ｐ　Ｌ　Ｆｌｕｏｔａｒｌ　００　Ｘ　（Ｌｅｉｔｚ）対物レンズを用い 、透過位相差及び干渉反射（ＩＲＭ）Ｂ微鏡か同じ視野で、対物レンズを変える ことなく操作できるようにした。位相差とＩＲＭ画像は、培地に沈めて３７°Ｃ に維持されている生きた細胞から得られた。位相差の照明は、１００Ｗのハロゲ ンランプ及び熱反射フィルターを装着した型０５０２６０出力装置（Ｌｅｉｔｚ 　）によって与えられた。ＨＢＯ１００ｆｆｉ９９００２３ＤＣソース（Ｌｅｉ ｔｚ　）により出力される１００Ｗ水銀アークランプがＩＲＭ用として用いられ た。

画像は、高解像ビデオカメラ（７０シリーズ、　Ｄａｇｅ　−ＭＴＩ）によって 得られ、シリーズ１５０画像解析法でデジタル化された。デジタル化画像は高解 像ビデオモニター（型Ｐ　Ｖ’Ｍ　ｌ　２７１　Ｑ、　５ｏｎｙ）から［１ｌｆ ｏｒｄ　Ｐａｎ　Ｆフィルムを用いて写真撮影された。

けい光顕微鏡 培養時間が終ったペプチド−グラフトガラスカバースリップ上の細胞は、ＰＢＳ 中で洗滌され、ＰＢＳ中３．７％（Ｖ／Ｖ）ホルムアルデヒドで２０分間固定化 された。

それらは次に、ＰＢＳ内で洗滌され、およそ０．２％（ｖ／ｖ）ｈリドンＸ−１ ００を含むＰＢＳ内で室温で約１分間の培養で透過性にされた。細胞は次にＰＢ Ｓ内で洗滌され、およそ９００　ｎｇ／　［１１１のロダミンー共役ファロイジ ン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｉｎｃ、）により室温で２０分培養 してＦ−アクチンで染色された。カバースリップは、ＰＢＳで全部を洗滌され、 ５０％ＰＢＳ−５０％グリセロル内で顕微鏡スライドにのせられた。これらの標 本は、１００　Ｘ　Ｐ　Ｌ　Ｆｌｕｏｔａｒ対物レンズ（Ｌｅｉｔｚ　）を備え たＦｌｕｏｖｅｒｔ顕微鏡で観察され、写真撮影された。

表面における反応部位の数と相当するペプチド濃度は、標識ＧＲＧＤＹ　（図９ ）による滴定で測定された。グラフト化ＧＲＧＤＹの表面濃度は、表面への結合 のために利用されるペプチドの濃度の増加と共に直線的に増加し、最大値１２． １±０．１　ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ　／ｃｍ”　（図９）に達することが測定され た。！　２．０　ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ　／ｃｍ２以上の濃度のペプチドをその後 投入しても、それ以上ペプチドの表面濃度は増加しなかった。１２．１　ｐｉｃ ｏｍｏｌｅｓ　／　ｃｍ”の最大表面濃度は、７３．０００分子数／μｍ２の表 面範囲または、ペプチド間が概算３．３　ｎｍの間隔に相当する。

ペプチド−グラフト化基質上のＨＦＦ伸展速度ＲＧＤ誘導ガラス上の細胞は、血 清のあるなしにかかわらず、２時間の間連続的に伸展することか観察され、完全 培地では（図１０Ａ）、植えつけ後２時間で、分析された細胞の５０％か２１３ ０μｍ２またはそれ以下の面積をもち、また無血清培地（図１０Ｃ）の場合は、 植えつけ後２時間で、５０％の細胞が１０００μｍｌまたはそれ以下の面積であ った。完全培地で組織培養プラスチック上の良く伸展した細胞の平均面積は、２ １００μｍ２であることか観察され、そこでは、非伸展細胞は平均３５５μｍ２ の面積を持っていた。非付着表面で培養された細胞の面積範囲は、血清のあるな しで変ることなく５０％の細胞か５００μｍ２以下の面積であった（ＦＩＧＳ、 ＩＯＢ、Ｄ）。これらの結果は、これらの表面では何の伸展も起らず、細胞の大 部分は非付着性であることか観察された。

細胞伸展はまた、血清の存在、非存在下でのＹＩＧＳＲ−誘導ガラス上で観察さ れた。伸展速度は、グラフトＹＩＧＳＲ表面ては、ＲＧＤ−含有表面より非常に おそく、完全培地（図１０Ａ）または無血清培地（図１ＯＢ）で、伸展の完了ま で６時間以上を必要とした。無血清培地でおよそ９時間後、分析された細胞の５ ０％は１４００μｍ２またはそれ以下の面積をもち（図１０Ｂ）、これは無血清 培地でのＲＧＤ表面の良く伸展したＨＦＦｓの面積に匹敵する。血清は、ＹＩＧ ＳＲ表面の細胞伸展を強化することか認められた：すなわち、植えつけ後９時間 で、分析された細胞の５０％が２３３３μｍ２またはそれ以下の面積をもってい た。非付着対照表面は、ＲＧＤ誘導ガラス試験用として作られたものと同して、 細胞の伸展は、これらの表面ではみられず、試験の時間枠全般を通して細胞面積 の５０％は、６００μｍ２を超えることはなかった。

細胞増殖における移植ＧＲＧＤＹの効果細胞増殖におけるこれらのＲＧＤ−含有 基質の効果は、結合ＧＲＧＤＹを含むガラスに植えつけられたＨＦＦ　ｓの増殖 をモニタリングしてしらべた。ＲＧＤ誘導ガラス上で培養した細胞の増殖を無処 理（グリコフェーズてはない）ガラスのそれと比較した際、増殖速度についての 相違は何も見られなかった（図１１）。

ペプチド−移植基質に対する細胞反応の特徴血清は、ペプチド含有ガラス上の細 胞の伸展を強化したので、非付着ガラスの表面へ移植されたペプチドは、血清の 吸着を促進し、これらの基質上の細胞の付着と伸展を増加するであろう細胞タン パク質を分泌すると仮定された。この可能性のある効果をチェックするため、合 成ペプチドＧＲＧＥＹをガラスに結合させ、これらの表面での細胞伸展か分析さ れた。アスパラ銀酸（Ｄ）に対するグルタミン酸（Ｅ）の置換（１つのメチレン グループのカルボキシル酸側鎖への付加）は、ペプチド（Ｂ）の付着促進活性を 廃止することが立証されたがしかし、ペプチドが潜在的に吸着タンパク質と相互 作用する道に対する影響はあまりない筈である。

共有的に結合したＧＲＧＥＹ上には、たとえ完全培地が使用されても、また細胞 のタンパク質合成が阻害されなかった時でさえ（表１）８時間後に細胞の伸展は 観察されなかった。これらの発見は、共有的に結合したＧＲＧＥＹ及びＧＲＧＤ Ｙペプチドは、細胞伸展を促進しまた強化するような細胞付着タンパク質の吸着 を顕著に増加しないことを示唆する。

これは、表面に移植されたペプチドの細胞付着作用は、細胞表面受容体に対する ペプチドの親和力によるものであって、ペプチドによる血清タンパク質吸着の強 化によるものではないということである。

ＲＧＤ及びＹＩＧＳＲの結合基質上の細胞付着にタンパク質合成か役割りを演じ たかどうか、また、伸展が完了した時点で、伸展した細胞のフラクションを血清 か著るしく増加したか否かを測定するため、８時間の培養後、異なった條件下で 、伸展細胞の百分率か測定された。タンパク質合成も、培地中の血清の存在も、 ＲＧＤ−及びＹＩＧＳＲ誘導ガラス上の伸展した細胞のフラクションに影響しな いことが観察された。両方のペプチド−グラフト化表面上の細胞伸展は、完全に 阻害されたかしかし、培地中の可溶性ペプチドの存在により（表１）これらの基 質上の細胞の付着は、初期に細胞受容体−配位子相互作用により左右されること を示している。

表　１ ＧＲＧＥＹ　＋　＋　□ ＧＲＧＤＹ　＋　８７　±　８ ＋（ＲＧＤＳ）　。

＋　＋（ＲＧＤＳ）　０ ＤＹＩＧＳＲＹ　＋　７８　±　７ ＋（ＹＩＧＳＲＹ）　０ 十　＋（ＹＩＧＳＲＹ）　０ ＲＧＤ−誘導基質に植えつけ後およそ４時間目に、ま・　た、ＹＩＧＳＲ−誘導 基質に植えつけ後およそ８時間目に、細胞はＩＲＭ及び位相差顕微鏡により生き たまま調べられた。固定した標本は、伸展細胞中のミクロフィラメン）・の分布 を調べるためロダミンー共役ファロイジンで染色された。すべての画像は、デジ タル化され、精度を高めるためバイパスフィルターが用いられた。

無血清でＲＧＤ−移植ガラス上に植えつけられた細胞は、主として細胞の外縁に 小さな円いフォカルコンタクトを形成した（図１３Ｂ）。血清を補充した培地は 、細胞付着分子−被覆基質上にひろがった大きな延長したフオカルコンタクト型 の細胞形成を支持した（図１３Ｄ）。ＹＩＧＳＲ−移植ガラス上の伸展細胞は、 無血清の場合巣状接触を形成しなかった（図１４Ｂ）。培地が血清で補充された 時、フォカルコンタクトがこの基質上に限定してみられたが（ｅ１４Ｄ）、それ らは、形態的に、ＲＧＤ−誘導基質上の図１３Ｄのものとは異なっていた。ＹＩ ＧＳＲ−誘導基質上の巣状接触は、図１３Ｄにあるものと同じように延長型であ ったが、細胞の外縁に顕著に局在していた。位相差画像は（図１３Ａ、Ｃ；１４ Ａ、Ｃ）色々な基質上の伸展細胞の間に何等明瞭な形態学的差異を示さなかった が、ＩＲＭ画像に相当する画像として役に立っている。

ロダミンーファロジン染色は、無血清培地（図１５Ａ）または完全培地（図１５ Ｂ）で培養されたＲＧＤ−移植ガラス上の、伸展細胞での作用性ミクロフィラメ ント束の広範なネットワークを明らかにした。血清補充培地に培養された伸展細 胞によって形成された束は、無血清培地で培養された細胞により形成されたもの より、より極端に染色され、血清が存在した時は厚い繊維状であった。ＹＩＧＳ Ｒ−移植基質上に無血清培地で培養された細胞は、はんのわずかのミクロフィラ メント束しか形成しなかったかしかし、血清が培地にあった時は、厚い束を形成 した。これらの試験は、最小配列の付着−促進合成ペプチドは、たとえばグリコ フェーズガラスのような非透過性、非接着性の材料の表面に共存結合的に移植さ れて、細胞接着を支持する生物学的に活性な、化学的によく限定された表面を生 産することができることを示している。これらの基質は、表面に利用できるペプ チドの量か正確に測定され（図９）、また結合緩衝液にグリシンのような非付着 剤の適当量を加えて、競合的に、移植されるペプチドの量を、調節することが可 能であるため、細胞付着の試験には作用てあろう。これは、受容体−媒介細胞付 着の基準基質として重要な必要條件でありうる。何故ならば、最近、吸着された ＲＧＤ−アルブミン複合体へのインテグリンー仲介細胞付着が、生のタンパク質 に共存結合的に付着するＲＧＤ−含有グループの密度に極めて敏感であることか 示されたからである。

例９−ペプチドー移植基質の安定性 固定化ペプチドか熱及びタンパク質加水分解にどの程度安定であるかを測定する ために標識ＧＲＧＤＹペプチドかグリコフェーズガラス基質に共存結合的に移植 された。放射活性のパーセント（％）ロスは、分解して細胞付着強化に利用でき なくなった固定化ペプチドのパーセント（％）を示すと解釈された。データは、 これらのペプチド−移植基質は、オートクレーブ処理（１２１″Ｃで蒸気滅菌） に極めて安定であることを示唆し、この処理により放射活性のロスは何等実証さ れなかった（表２）。

また、これらの基質上で１週間細胞培養を行ったが、放射活性のロスは認められ なかった。データはまた、処理した基質は、細胞プロテアーゼに対しても安定で あることを示している。

基質放射活性への　ロスの％ 環境的ストレス オートクレーブ（１２１°Ｃ１１５分）　０±Ｏ細胞培養（１週間）　２±１ トリプシンへの曝露　５＋４ 例１Ｏ−ＧＲＧＤ結合ＰＥＴ基質の、前処理したトレシル化しないＰＥＴ基質に 対するペプチド吸着比較ＧＲＧＤ誘導ＰＥＴ基質は、それらの表面への細胞の活 性付着を支持する能力によって特徴づけられた。ＰＥＴ前処理は、色々な時間帯 でヒドロキシル化された塩化トレシル活性化フィルムにＧＲＧＤを結合すること によって最も効果的に活用された。ＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞を用いた細胞伸展 分析か、最大の反応條件を支持する條件を決定するために実施された。およそ４ 時間の前処理が、最大の細胞付着と伸展のために最適であるように思われた（図 １７）。

“正常″結合時間（約２０時間）としてＧＲＧＤにより培養されたＧＲＧＤ結合 ＰＥＴフィルムと前処理した非トレソル化フィルムの比較から、フィルムへのペ プチド吸着が少ないかあるいは、吸着したペプチドが受容体仲介付着反応に利用 されないかの何れかが実証された（図５）。ＧＲＧＤ修飾表面は、血清の存在下 でさえ、無処理のＰＥＴよりも３Ｔ３細胞付着を非常に良く支持し、修飾表面上 の本質的な活性を示している（図６）。

競争実験は、基質の生体特有の活性を一層立証するＧＲＤＳの約９０μｇ／ｍｌ の存在で、修飾表面への付着は７５％減少という結果を生した（図７）。

無血清培地で、修飾フィルム上の伸展３Ｔ３繊維芽細胞の全形態（図３）は、正 常であるように見えたかしかし、これらの條件下で、ミクロフィラメント束と緊 張繊維の形成は検出されなかった。これらの結果は、吸着ＲＧＤペプチドについ て他に示されたように（１９゜２０．１４）、この細胞系及び他での完全な付着 反応は、これらの修飾表面上では得られないことを示している。

しかしなからこれは一般的な現象ではなく、正常なラットの腎臓の繊維芽細胞及 びＮｉｌ　８、正常なハムスターの繊維芽細胞系、を含むいくつかの細胞型は、 単にＧＲＤペプチド（１４）のみを含む基質にも十分な反応を示してきた。ＧＲ ＧＤ誘導−ＰＥＴ上での増殖は、血清依存性であり、非修飾ＰＥＴ　（図８）の それと似ていたがしかし、ＧＲＧＤ曲線か対照曲線をリードしている観察によっ て示されるように（図８）、初期の付着と伸展はもっと急速であった。

ＧＲＧＤ結合表面上でのブタ大動脈内皮細胞の付着と伸展もまた、血管内皮ＲＧ Ｄ指向型受容体が特徴づけられていたことから（１５）予想されたように血清依 存性ではなかった（図１６）。完全培地におけるＰＡＥ細胞伸展は、４時間でＧ ＲＧＤ誘導フィルム上では、無処理のフィルムよりはるかに広範囲であったがし かし、２４時間では、両表面共に集密単層細胞を示した。これらの観察から、Ｐ ＡＥ細胞付着の運動性は、修飾表面で、より急速であることが示された。

例１１−ウサギにおける生体付着ダクロンベロアカフをもつ内在カテーテル （予測的に） 内径約１ｍｍ及び外径３ｍｍのダクロンベロアカフは、基部で、ポリエチレンカ テーテルの周囲におかれ、外科手術用セメントで接着されている。カフの設置前 に、表面をヒドロキシル化するために例３て述へたように酢酸／ホルムアルデヒ ド溶液中で処理されるへきである。次にテトラペプチドＧＲＧＤか例３に述へた ように、トレシル活性と結合によってカフ材料表面に共有結合的に付着されるだ ろう。動物の毛皮は腹部沿いに剃りとり、長さ約１ｃｍで側方に皮膚を切り開く 。カテーテルは、静脈、たとえば下行大静脈に挿入され、カフは丁度皮膚の下側 に置かれるだろう。皮膚は、突き出たカテーテルの周りに、カフをおおうように 一緒に縫い合わされるだろう。

カテーテルでの細菌の感染率がそこで測定されるだろう。

いくつかのカフが一定時間後たとえば１，２．３及び４週間後に、組織同化、再 成長及び炎症の組織学的調査のために取り除かれるだろう。対照実験は、非修飾 ダクロンカフか利用できるだろう。

例１２−神経再成長ガイド （予測的に） 内径約１．５　ｍｍ及び外径的３ｍｍて水及び酸素に高い透過性を示すポリマー 管かラットの再成長ガイドとして使用されるだろう。作用な材料の例は、ポリ（ ヒドロキシエチルメタクリレート）であろう。管腔は、例３て述べたようにペプ チドＧＲＧＤまたはＧＹＩＧＳＲで結合されるだろう。１つの足の神経束は重病 で、一部分かほぼ１ｃｍの長さで取り除かれるだろう。神経束の両末端が管の再 成長の端に挿入されるだろう。そしてガイドの縁かエビアクソナル組織にしっか りと縫い合わされるだろう。

傷口か閉じられ、神経再植法は毎週、電気生理学的に測定されるだろう。対照実 験は、非修飾ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）管を利用すべきである。

例１３−誘導ガラス表面上の異なった密度てのＧＲＧＤＹ移植の比較試験 誘導ガラス表面は、トレシル活性化ガラスに添加されるペプチド量かｌ　２　ｐ ｉｃｏｍｏｌｅｓ　／ａｍ２より少ない場合を除いて、ＧＲＧＤＹを用い、例６ に記載の方法に従って作られた。これにより、既知のペプチド表面密度をもつ基 質が形成された。例６に関連して図９の直線領域は、反応性ガラスに添加された ペプチド量は、ｔ　２　ｐｉｃｏｍｏ−１ｅｓ　／ｃｍ２より少ないか、または 等しい限り、ガラスに結合したペプチド量に等しいことを示している。ペプチド は、表面濃度が０．００１．０．００５．０．０１．０．０５゜０．１，０．５ 及び１．０　ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ　／ｃｍ２で誘導ガラスに共有結合的に付着さ れた。ヒト包皮繊維芽細胞が、４時間の培養後に単にタンパク質と細胞伸展だけ か測定されるように、熱不活性化アルブミンを含むＤＭＥＭ中の材料に植えつけ られた。細胞は次の案に従って、伸展の形態に等級をつけた二円細胞、糸状偽足 なし、１段階二円細胞、１糸状偽足、２段階；円細胞、１糸状偽足以上、３段階 ；偽足をもつ偏平細胞及び多角形の十分に伸展した細胞、４段階。結果は図１８ に示され、０．００１　ｐｉｃｏ−ｍｏｌｅｓ　／Ｃｍ２と同程度に低いレベル で、はとんど完全な伸展反応を促進するに十分であることを示している：このこ とは、特に４段階の細胞のデータから立証され、０、００１　ｐｉｃｏｍｏｌｅ ｓ　／ｃｍ”は段階４の細胞の４２％に結果を与えたのに対し、１．　Ｏｐｉｃ ｏｍｏｌｅｓ　／ｃｍ２は、段階４の細胞の８１％に結果を与えている。これら のことから、細胞反応は、ペプチドの表面密度に依存するか、表面に強い（およ そ最大の半分）反応を与えるには０．００１ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ　／　ａｍ２で 十分である。

例１４−グリコフェーズガラスーペプチドか結合することかできる基準細胞非付 着基質 本例は、ブリコツニーズガラスの細胞付着か乏しいことを説明するために含めで ある。例１５−１９に結びつけると、ペプチドが別の方法で細胞非付着性のまた は細胞付着性に乏しい基質に付着されるときに得ることかできる有利な細胞型の 特性か明らかにされる。

グリコフェーズガラスは、例６の方法で作られた。この表面の細胞伸展は、血清 の存在、非存在の両方で測定され、その結果は下に表にしである。細胞はヒト包 皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）　、ヒトｍ静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト血小板（ Ｐｉｔ　）　、及び５μｍアデノンンシホスフエートで予め刺戟したヒト血小板 （Ｐｒｅｓｔｉｍ　Ｐｉｔ　）であった。ＨＦＦ及びＨＵＶＥＣｓは、５４ｎＭ のＥＧＴＡを含むＰＢＳ溶液て非酵素的に取り入れ、遠心分離にかけ、正常な培 地または、無血清伸展分析のために２ｍｇ／ｍｌの熱−不活性化血清を含む培地 に再懸濁した。細胞伸展の範囲を決めるため、細胞は基質上で４時間培養され、 以前に述へた方法で伸展細胞の百分率か測定された。

血小板伸展は、ＰＲＰＰを各基質に添加し、１０分間培養後、１００ＯＸの変調 対比（Ｈｏｆｆｍａｎ　）光学法で測定された。予備刺戟血小板については、５ μＭのＡＤＰか、基質の培養前にＰＰＰに加えられた。結果は表３に示されてい る。

ＨＵＶＥＣ８１ Ｐｉｔ　ＯＮ、　Ｄ。

Ｐｒｅｓｔｉｍ　Ｐｌｔ　ＯＮ、　Ｄ。

例１５−繊維芽細胞及び血小板ではない内皮細胞の付着を支持するＲＧＤ材料に より結合されたグリコフェーズガラス ペプチドＧＲＧＤＹは、例６に記載のように、グリコフェーズガラス表面に結合 された。細胞伸展分析は、例１４に記載のように実施された。細胞伸展は測定さ れ、表４に報告されている。この材料は、内皮細胞の封入か望ましいか血小板の 付着か有害である場合に血管移植用として有用であろう。

表　４ Ｐｒｅｓｔｉｍ　Ｐｌｔ　ＯＮ、Ｄ 例１６−繊維芽細胞及び血小板ではない内皮細胞の付着を支持するＹＩＧＳＲ材 料により結合されるグリコフェーズガラス ペプチドＧＹ　Ｉ　ＧＳＲＹはグリコフェーズガラス表面に結合された。Ｙ　Ｉ 　Ｃ；ＳＲは、細胞付着を促進するｉ　ＣＡＭラミニン内の配列である（Ｇｒａ ｆ　ｅｔ　ａｌ、川９８７゜Ｃｅ１ｌ　４８　：　９８９−９９６）。細胞伸展 は、例１４に記載の方法で測定された。この材料は、内皮細胞の封入か望まれる か、血小板の付着が有害な場合に、血管移植用に有用であろう。結果は表５に示 されている。

表　５ 細胞の型　伸展　％　伸展　％ 血清あり　血清なし ＨＦＦ　６４　５９ ＨＵＶＥＣ７９７３ Ｐｉｔ　ＯＮ、Ｄ Ｐｒｅｓｔｉｍ　Ｐｌｔ　ＯＮ、Ｄ。

例１７−線維芽細胞と上皮細胞の付着を助けるが血小板の付着は助けないＰＤＳ ＧＲ−材料と結合させたブリコツニーズガラス ペプチドＧＰＯ３ＧＲＹをグリコフェーズガラスの表面に結合させた。ＰＤＳＧ Ｒは、細胞付着活性を有する（ＫＩｅｌｎｍａｎら、Ｉ　９８９　、　Ａｒｃｈ 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｓ、　。

２７２　：　ｌ　：　３９−４５）ラミニン中に発見された配列である。細胞の 伸展は、例１４中で記述された手順によって測定した。結果は、表６中に示され ている。この材料は、内皮細胞の侵入か望ましいが、血小板の付着は有害である 血管移植に有利であると考えられる。

表　６ 細胞型　血清の存在下の　血清なしての伸展率１％　伸展率９％ ＨＦＦ　６６　６４ ＨＵＶＥＣ６６５０ Ｐｉｔ　ＯＮ、　Ｄ・ Ｐｒｅｓｔｉｍ　Ｐｉｔ　ＯＮ、　Ｄ。

例１８−内皮細胞の付着を助けるか線維芽細胞または血小板の付着を助けないＲ ＥＤＶ−材料と結合させたグリコフェーズガラス ペプチドＧＲＥＤＶＹをグリコフェーズガラス表面に結合させた。フィブロネク チンの配列情報に由来する配列ＲＥＶＤは、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら（１９８６、 Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、。

１０３：６　２６３７−２６４７）によってｂ１６−ｆｌＯ細胞の付着を促進す るが、ＢＨＫ線維芽細胞の付着は促進しないことか示された。細胞の伸展は、例 １４に記述した手順によって測定した。結果は、表７に示されている。この材料 は、内皮細胞の侵入は望ましいが、繊維芽細胞と血管平滑筋細胞の侵入と血小板 の付着か有害である血管移植に有利であると考えられる。

ＨＵＶＥＣ７９６９ Ｐｌｔ　ＯＮ、Ｄ Ｐｒｅｓｔｉｍ　Ｐｉｔ　ＯＮ、Ｄ 例１９−ＨＵＶＥＣまたは血小板の伸展を助けないか軸索突起の生成を助けるは ずであるＩ　ＫＶ−ＡＶ材料を結合させたグリコフェーズガラス ペプチドＧＴＫＶＡＶをグリコフェーズガラスの表面に結合させた。ラミニンの 配列情報に由来するＩ　ＫＶＡＶ配列は、Ｔａ５ｌｒｏら（１９８９，Ｊ、　Ｂ ｉｏ、　Ｃｈｍ、、２６４：２７　１６１７４−１６１８２）によっていくつか の細胞型の細胞付着は促進するか伸展は促進せず、神経細胞型の軸索突起の生成 は促進することか示された。細胞の伸展は、例１４に記述された手順によって測 定された。結果は表８に示されている。この材料は、神経細胞の侵入と軸索突起 （ｎｅｕｒｉｔｅｓ）の生成か望ましい神経細織における移植に利点かあると考 えられる。

ＨＦ　Ｆ　４７．４　４２．５ ＨＵＶＥＣ１１，２０ Ｐｉｔ　ＯＮ、　Ｄ。

Ｐｒｅｓｔｉｍ　Ｐｉｔ　ＯＮ、　Ｄ。

例２０−ポリエチレングリコールか固定化されているポリエチレンテレフタレー ト−ペプチドを結合させることができる細胞−非付着性高分子基質（ＰＥＴ／Ｐ ＥＧ） 本明細中で後に記述される溶液処理技術を用いて分子量１８．５００のポリエチ レングリコール（ＰＥＧ）を、ポリエチレンフタレート（ＰＥＴ）に固定化した 。その結果得られたフィルム（ＰＥＴ／ＰＥＧ）は修飾されていないＰＥＴより もはるかにぬれやすくなっており、細胞の付着と伸展を支持しなかった。ペプチ ドをグラフトする手順において使用された溶剤対照として、ＰＥＴ／ＰＥＧをジ オキサン中で１０分間抽出した。血管の組織中に見出され、血管移植片と相互作 用を起し得るので、ヒト血管平滑筋細胞（ＨＶＳＭＣ）もこれらのＰＥＴ／ＰＥ Ｇをベースとした材料の試験に組入れられた。伸展細胞の百分率は例１４に記述 された手順によって決定された。結果は、表９に示されている。ＨＦＦ、ＨＵＶ ＥＣおよびＨＶＳＭＣの伸展は、血清を補添した培地の存在下で定量した。

細胞型　血清の存在下での伸展率２％ ＨＦＦ　０ ＨＵＶＥＣＯ ＨＶＳＭＣ０ ｐｔｔ　。

Ｐｒｅｓｔｉｍ　Ｐｌｔ　０ 例２１−繊維芽細胞と内皮細胞の付着を助けるが、血小板や血管平滑筋細胞の付 着を助けないＰＧＤ−材料を結合させたＰＥＴ／ＰＥＧ ペプチドＧＲＧＤＹは、例１５によけるのと同じ化学的方法によって、例２０の ＰＥＴ／ＰＥＧの表面に共範結合させた。ＨＦＦ、ＨＵＶＥＣおよびＨＶＳＭＣ の伸展は、血清補添培地の存在で定量された。細胞伸展率は、下の表１０に示さ れている如くであった。この材料は、内皮細胞の侵入は望ましいか、血小板の付 着か有害である血管移植に有利であると考えられる。

ＨＦＦ　１００ ＨＵＶＥＣ７１ ＨＶＳＭＣ０ Ｐｌｔ　Ｏ Ｐｒｅｓｔｉｍ　Ｐｉｔ　０ 例２２−内皮細胞の付着を助けるが繊維芽細胞、血小板または血管平滑筋細胞の 付着を助けないＲＥＤＶ−材料を結合させたＰＥＴ／ＰＥＧ ペプチドＲＥＤＶを例２０のＰＥＴ／ＰＥＧ表面に結合させた。ＨＦＦ、ＨＵＶ ＥＣおよびＨＶＳＭＣ展着は血清補添培地の存在下で定量された。細胞伸展率は 、下記の表１１に示されている。この材料は、内皮細胞の侵入が望ましいが、線 維芽細胞と血管平滑筋細胞の侵入と血小板の付着が存置である血管移植に存利で あると考え細胞型　血清の存在下での伸展率０％ ＨＦＦ　０ ＨＵＶＥＣ７８ ＨＶＳＭＣ０ Ｐｌｔ　Ｏ Ｐｒｅｓｔｉｍ　Ｐｉｔ　０ 例２３−ＨＵＶＥＣまたは血小板の伸展を助けないが、ＨＦＦの伸展を助は軸索 突起の生成を助けるはずであるＴ　ＫＶＡＶ−材料を結合させたＰＥＴ／ＰＥＧ ペプチドＧ　ＩＫＶＡＶＹを例２０のＰＥＴ／ＰＥＧに結合させたラミニン配列 情報から由来したＩＫＶＡＶ配列は、細胞付着を促進するかいくつかの細胞型の 伸展を助けず、Ｔａ５ｈｉｒｏら（１９８９，Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、　。

２６４：２７　１６１７４−１６１８２）の神経細胞型の軸索突起の生成を助け ることか示された。細胞伸展率は例Ｉ４に記述された手順によって測定され、表 １２に示されている。この材料は、神経細胞の侵入と軸索突起の生成か望ましい 神経組織の移植片用として育利であると考えられる。

ＨＦＦ　１００ ＨＵＶＥＣ０ Ｐｉｔ　Ｏ Ｐｒｅｓｔｉｍ　Ｐｉｔ　０ 例２４−ポリエチレンオキサイドや他の水溶性ポリマーを高分子生体材料の表面 に組込む溶液技術血液との接触が関与する適用において現在使用されている生体 医学ポリマーは、径の小さい血管移植において使えるに足るだけ、血栓形成作用 を持たないことが証明されていない。血小板や他の血液細胞の付着が、直径が小 さい移植の開孔性が低い主な理由である。そして、本態様の一側面は、血液成分 の生体ポリマーとの相互作用を減少させることである。血小板、白血球、線維芽 細胞などの付着は、ポリマー表面への蛋白質の吸着によって媒介されているので 、蛋白質のこれらのポリマーとの相互作用を減少させる方法が採用された。

ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）表面は、それらの親水性か強いこと、鎖の可 動性ならびにイオン電荷かないことの結果として、血漿蛋白質の吸着に抵抗する ことが観察されている〔２５〕。いくつかの研究グループか、生体適合性、すな わち非付着表面を得る探究における修飾剤としてＰＥＯまたはＰＥＧ　（ポリエ チレングリコール）を使用している。ポリマー表面をＰＥＯて修飾するために種 々の方法が使用されている。これらの中には、ＰＥＧをＰＥＴ　（２６，２７） 　、ポリウレタン〔２８〕やポリビニールアルコール〔２９〕のようなベースポ リマーと共育結合でグラフトさせること、たれ下っているＰＥＧ鎖を有するモノ マーの重合（３０，３１）、ブロック共重合によるベースポリマーへのＰＥＯの 組込み（３２，３３３、またはブロックの１つかＰＥＯである典型的にＡＢ乃至 ＡＢＡ型のブロック共重合体であるＰＥＯを含む界面活性剤の直接の吸着（２５ ，３４）を含む技術かある。これらの技術は、大半が比較的低分子量（５０００ ドルトン未満）のＰＥＯを利用しており、ごく僅かか比較的高分子を使用してい るに過ぎない〔２６゜２７．３４）。

上述の技術のうち若干は、修飾されたポリマーの表面において、納得できる程度 に首尾よく細胞の相互作用を減少させるが、それらの大半は、必要な表面修飾を 得るのに多くの工程か必要である。さらに、それらはベースポリマー表面上の反 応性の物質の構造と入手性によって制約され、多くの場合、各ベースポリマーの 修飾について特異的である。

本発明は、ＰＥＯと他の水溶性ポリマー（ＷＳＰ）をベースポリマー（ＢＰ）の 表面に組込む技術に関する。

本技術は一般性があり、その表面に組込まれるべきＷＳＰを溶解する溶剤中のＢ Ｐの溶解の性質によってのみ制約を受けるにすぎない。本技術は、修飾されるへ き高分子用具や材料（ＢＰから作った）を、ＢＰとＷＳＰの共通の溶剤である液 体中に浸漬することから成る。

ＢＰと溶液の界面は、次に軟化し始め、その結果ＢＰのポリマーネットワークに ゆるみを生ずる。この間に、ＷＳＰの分子が半溶解に界面中に拡散する。一定時 間が経過した後、反応系はＢＰを溶かさないが、浸漬溶剤と相互に溶解し得る水 で停止させる。この結果、その界面の急速な崩壊を生じ、ＢＰネットワーク内の ＷＳＰの鎖を包み込む。このようにして、ＢＰは非共有結合的にではあるが安定 にＷＳＰで修飾される。水と異なる別の停止用溶剤も使用できるかもしれない。

その場合、停止溶剤はＷＳＰを溶解するがＢＰを溶解しない。水以外の停止溶剤 の例にはＰＥＴ　ＴＴＥＮｓ用にメタノール、エタノール、アセトン、ジメチル ホルムアミド、テトラヒドロフラン、そしてＰＭＭＡ　ＰＴＰＮｓ用にエタノー ルとメタノールかあるか、これらに限られるものではない。代替法として、停止 させるためにＷＳＰもＢＰも溶解させない溶剤を使用し、続いてＷＳＰを溶解さ せるかＢＰを溶解させない溶剤によってすすぐことか可能である。さらに代替法 として、系を乾燥し、次に停止溶媒中ですすぎ過剰の溶剤を除くこともできる。

ＢＰ中のＷＳＰ鎖の提案された取込みの模式は、図１９に示されている。（ＢＰ か全部溶けることを防ぐための）適当な希釈、ＷＳＰの濃度、処理時間のような 取込み過程の条件は勿論適切に修飾された安定な物理、的な・内部に入り込んだ ネットワーク（ＰＩＰＮ）を得るため、に最適化される必要がある。比較的短鎖 を存するＷＳＰの分子（すなわち、低分子）は、ＢＰ上の崩壊しつ“つあるネッ トワークによって効果的に包みこまれることかできず、□やがてネットワークか ら拡散してしまうので、ＷＳ′Ｐｆの分子量もある程度重要であるはずであるこ とも結論される。同様に極めて大きな分子（すなわち、高分子量）に゛は′質量 輸送制限があり、ＢＰの表面に効果的に、組込ま・れない。

１つのブロックか疎水性で、他のブロックが′親水性の、場合の２ブロック界面 活性剤共重合体の使□用のみを強調する技術が文献に記述されている。−その技 術が生体材料に適用され得ると述べられているか、デー久や例も提呂されていな い。本発明の”技術は、ＢＰ表面に組込まれるべきすべてのホモポリマーに、一 般的に適用でき、それ自体、□界・面活性剤−の性質をもった２ブロック共重合 体に限られるものではない。

材料と方法 ＰＥＴ上での物理的な内部に入り込んだネットワーク（ＰＺＰＮ）の調製。

ＰＩＰＮ技術を用い、Ｐ　ＥＴ　（Ｍｙｌａｒ、　ＤｕＰｏｎｔ　）の薄いフィ ルムを使用して表面修飾を行い、ＰＥＯ（分子量５０００．１８５００と１０１ ０００ＱＯモル。

Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＰＶＰ（分子量２４０００　ｇ１モル。

Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社）、およびＰＥ０Ｘ　（分子量４３９００ ０　ｇ１モル、　Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社、　＃ＸＡ１０８７４．０５）を 組み込んだ。ＰＥＴフィルムは、使用前に室温でアセトンで少くとも２４時間抽 出した。トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ　Ａ　、　Ｍｏｒｔｏｎ　Ｔｈｌｏｋｏ ｌ社）は、それかＰＥＴならびにＷＳＰｓをすべて溶解するので処理溶媒として 使用された。１００％ＴＦＡＡは、ＰＥＴを極めて速やかに溶解することが分っ たので、ＢＰが十分な時間処理されるためには、希釈を必要とした。高粘性であ るため、０．２ｇ／ｍｏｌで使用してＰＥＯ１０００００とＰＥ０Ｘを例外とし てＷＳＰｓは、０、４９　ｇ／ｍｏｌの濃度で脱イオン濾過水（Ｄ　Ｉ　ＦＷ） の溶液を調製した。ＴＦＡＡを１８−２０％に希釈することが、ＰＥＴフィルム の溶解を防ぎ、水で停止させた後の光学的透明度を維持するのに適していること が見出された。ＴＦＡＡはＷＳＰ水溶液を加えることによって、適切な濃度に希 釈された。次に、ＰＥＴフィルムを希釈ＴＦＡＡ中のＷＳＰ溶液に加え、室温で 定期的にゆるやかに廻しつつ３０分間放置した。その混合物を、次に、大過剰の ＤＩＦＷで停止させ、ＰＩＰＮを製造した。次に、フィルムはＤＩＦＷ中に移し 、保存した。水は、定期的に取換えて、ＢＰ表面から溶脱した可能性かあるＷＳ Ｐをすへて除くために、定期的に変更した。対照は、ＤＩＦＷで同じ希釈をした ＴＦＡＡで、但しＷＳＰなしで処理した。

Ｐｅ１ｌｅｔｈａｎｅ上のＰＩＰＮの調製Ｐｅ１ｌｅｔｈａｎｅ　（Ｄｏｗ　Ｃ ｈｅｍｉｃａ１社、＃２３６３−８０ＡＥ）は、ペレットとして入手した。鋳造 ナイフを使用して、５０ミリの厚さのフィルムを鋳造するために、テトラヒドロ フラン（ＴＨＦ）中５０ｇ／ｍｏｌの濃度のＰｅ１ｌｅｔｈａｎｅの溶液を使用 した。これらのフィルムは、鋳造後６０−７０″Ｃでオーブン中で硬化させ、溶 剤を蒸発させた。多数の異なる溶剤を試して、ＴＨＦがＰｅ１ｌｅ−ｔｈａｎｅ 上ＰＩＰＮの発生に適していることか見出された。

ＰＩＰＮは、以下に説明する理由から、ＰＥＯ！８５００ＷＳＰを使用してのみ 造られた。対照処理（すなわち、ＷＳＰなしでの溶媒希釈）から、ＴＨＦをＤＩ ＦＷで４０％に希釈することが、停止を行った際、フィルムの構造的完全性と光 学透明度を維持するのに必要であることが分った。ＰＥＯ１８５００は、室温で ＴＨＦ中に不溶であったが、６０″Ｃでは可溶であった。

したかって、ｐｅ　１１ｅ　ｔｈａｎｅのための表面修飾は、この温度で行われ た。処理溶液は、ＴＨＦ４０％、ＰＥ０１８５００水溶液、２０％、残りの４０ ％はＤ　Ｉ　ＦＷから成立っていた。この溶液をＰＥＯが溶解するまで６０℃に 加熱し、ｐｅｌｌｅｔｈａｎｅフィルムを１５−２５分間溶液に浸漬した。この 手順の処置は、オーブン中６０°Ｃで行った。次に、溶液は過剰のＤＩＦＷで停 止し、処理したフィルムを水中に移して貯蔵した。ＰＥＯなして同しＴＨＦ希釈 において、対照の処置を行った。

ＰＭＭＡ上のＰＩＦＨの調製 ＰＭＭＡ　（中程度の分子量、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社）は、粉末 として入手した。それを５０ｇ／ｌでアセトンに溶解し、ｐｅｌｌｅｔｈａｎｅ の場合と同様にフィルムに鋳造した。

アセトンはＰＭＭＡに対する修飾溶媒として使用した。

アセトンの６０％への希釈が本工程に適していた。処理溶液は、アセトン、６０ ％、ＰＥ０１８５００水溶液、２０％、（ＰＥＯ４０％水溶液）、および残りの ２０％は水から成立っていた。処理は室温で１５−２５分行い、そのあとで水で 停止させた。修飾したフィルムをもう１度再び水中で貯蔵し、定期的に水を取換 えた。対照試料も処理した。

表面分析と特徴づけ 修飾表面上の接触角度は、あつらえて作った装置で測定した。空気接触角度は、 修飾操作の後、親水性のなんらかの変化を決定するために水面下で測定した。

ポリマー表面上のＥＳＣＡ分析（Ｖ　Ｇ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。

英国）を修飾手順を行った後、ＢＰ表面上のＷＳＰの存在を決定するために行っ た。

ＰＩＰＮ表面上の生物学的反応の測定 修飾表面上の蛋白質吸着試験は、アルブミンを用いて行った（　Ｂ　Ｓ　Ａ、　 Ｓｉｇｍａ）。蛋白質は、ヨードビーズ技術Ｃ３６〕を用いてＴ”５Ｎａｌ　（ Ｉ　ＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）で放射標識した。標識アルブミンの比活 性は５３．９μＣｉ／ｍｇであることが分った。小さいフィルム（０，５Ｘｏ、 　５重ｍ”）を修飾ポリマーから切取り、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中０． ０９４　ｍｇ／　ｍｌの濃度で３７℃で４時間インキュベートした。インキュベ ーション後、フィルムを吸着溶液と同じ濃度のＰＢＳ中のアルブミン溶液ですす ぎ、そのフィルムを吸着を起した蛋白質についてのガンマ−カウンター（［５ｏ ｆｌｅｘ、　ＩＣＮ　Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ　Ｓｙｓｅｍｓ）中でカウントした 。試料は、すべて４重に測定を行った。

短期間での血液との適合性は、必要な調節された流量とこの試験に必要とされる 剪断環境をととのえる平行平面フローチェインバー中で試験した。フローチェイ ンバーは、図２０中に示されている。表面を修飾されたフィルムはフローチェイ ンバーのベースを形成しているガラスカバースリップ（２４Ｘ５０ｍ＋ｎ）上に のせた。非該当材料表面は、すべて被験材料表面に接触する前に、血小板があら かじめ活性化されるのをさけるために、血液か接触する前にアルブミンで被覆し た（４ｇ／旧。

ＨＥＰＥＳ緩衝液）。ヘパリン添加（２単位／ｍｌ）で凝血を防いだ新鮮な採取 ヒト全血をこれらの試験に使用した。血小板は、静脈穿刺時に蛍光染料、メカプ リン（１０μＭ）で標識した。血か流れている間に、血小板の付着と血液の生成 を可視化させるために、そして試験される表面上の付着血小板数を決定するため に、エビ蛍光顕微鏡法とデジタル造影処理を使用した。造影の認識システムは別 の場所で記述されている（３７．３８）。

血流は、１００／秒の壁剪断速度で１０分間維持された。

修飾されたポリマー表面上を血が流れた後、フィルムをリン酸緩衝液食塩水（Ｐ 　Ｂ　Ｓ）中で静かにすすぎ、次に、ＰＢＳ中の２５％ゲルタールアルデヒド溶 液で一夜固定した。次に血液と接触した表面を走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）で精 査し、血小板付着ならびに付着した血小板の形態を評価し、異なる表面上の血小 板の伸展と活性化の程度を調査した。

修飾ポリマー表面への細胞の付着を防ぐ上でのＰＥＯや他のＷＳＰｓの効果のさ らにより厳密な試験として、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）の細胞培養を、これ らの表面上で遂行した。修飾したポリマー上のこれらの細胞の蛋白質の吸着、し たがって付着と伸展を減少させる上でのこれらの表面の効果を決定するために、 付着および伸展の検定を行った。

結果と考察 修飾した表面上の接触角度の測定によってこれらの表面の修飾操作前後の相対的 親水性の示唆が与えられた。

いかなる測定を行う前にもポリマーは、すへて水中で少くとも１週間抽出された 。表１３には修飾したＰＥＴ表面上の接触角のデータが示されている。表１４に はＰｅ１ｌｅｔｈａｎｅについての接触角データか示され、表１５には、ＰＭＭ Ａについてのデータか示されている。

表１３ 修飾ＰＥ７表面についての接触角 修　飾　接触角 無処理Ｐ　Ｅ　Ｔ　６５．３±０．９ 、対照Ｐ　Ｅ　Ｔ　５０．５±２．８ ＰＥＴ−ＰＥＯ５０００’　１４．９±２．８ＰＥＴ−ＰＥＯ１，８５０００１ ９，４±３．６ＰＥＴ−ＰＥＯＩ　０００００　２１．２±２．３ＰＥＴ−ＰＶ Ｐ２４０００　２０．６＋２．８ＰＥＴ−ＰＥＯＸ４３９０００　２２．２±２ ．４修飾されたＰｅｌｌｅｔｈａｎｅ表面についての接触角修　飾　接触角 無処理ＰＥＬＬ　−４４，９±３．１ 対照Ｐ　Ｅ　Ｌ　Ｌ　３５．２±２．７ＰＥＬＬ−ＰＥＯ１８５００２４，６± ４．３修飾されたＰＭＭＡ表面についての接触角修　飾　接触角 無処理ＰＭＭＡ　５９．６±３．０ 対照ＰＭＭＡ　３７．０±３．３ 重ＭＭＡ−ＰＥＯ１８５００２２，３±１．８接触角の減少は、ポリマー表面の 親水性の増加を示している。無処理ＰＥＴは、アセトンで抽出されただけの処女 ポリマーを表している。対照ＰＥＴは無処理ポリマーよりも小さい接触角を示し 、ＴＦＡＡでの処理は、事実その親水性を少し増加させることが示されている。

ＷＳＰで処理したフィルムは、親水性のはるかに大きな増加を示し、ＰＥＴの表 面にそれぞれのＷＳＰｓの存在を示している。

Ｐｅ１ｌｅｔｈａｎｅ　（Ｐ　Ｅ　Ｌ　Ｌ　）上の接触角のデータはＰＥＴ表面 についての場合と同じ傾向を示している。ＰＥ０１８５００で修飾したＰｅ１ｌ ｅｔｈａｎｅは、相当するＰＥＴ表面に対するのと同様な接触角を示している。

さらに再び同じ傾向がＰＭＭＡについても得られている。したがって、ＷＳＰで 修飾した表面は、互いに極めて近い接触角をもっていて、同様な程度の親水性と 同様な界面エネルギーをもっていることか示唆される。

修飾されたＰＥＴ表面上の放射標識アルブミン吸着の分析により、図２１に示さ れている結果か与えられた。

データは、明らかにＰＥＯ１８５００で修飾された表面についてだけアルブミン 吸着の鋭い低下を示している。

この表面については、対照の吸着の約８０％の減少が観察されている。ＰＶＰ修 飾表面は、約２０％の減少をＰＥ０Ｘ修飾表面は対照の約３０％の減少を示して いる。

ＰＥ０５０００と１ｏｏｏｏｏで修飾した表面は有意に異なる吸着水準を示さな い。このデータは、ＰＥＯ、５ｏｏｏはポリマー表面において蛋白質の吸着を防 ぐに足るだけの大きな分子量ではなく、そして、ＰＥ０１０００００は嵩だかす ぎて、それが蛋白質の吸着を防ぐことができるようになる配置で、ポリマー表面 に効果的に組込まれることができないことを示唆すると考えられる。

全血がポリマー表面上を流れる間にエビ蛍光顕微鏡ビデオによって得られた修飾 ＰＥＴに対する血小板の付着の分析を図２２に示しである。ＰＥＯＩ　８５００ で修飾された表面は、血小板付着において、対照値の約５％への減少を示してい る。ＰＥ０Ｘて修飾した表面も対照水準の約１０％への存意な減少を示している 。ＰＥ０ｉｏｏｏｏｏで修飾した表面は約３０％への減少を示しており、ＰＥＯ ５０００とＰＶＰ修飾表面は、対照値の４０−８０％の減少を示している。これ は、ＰＥ０１８５００で修飾したＰＥＴについての蛋白質吸着データとよく相関 している。ＰＥ０Ｘで修飾されたＰＩＴ上の血小板付着の存意な低下は説明され ていない。

１０％ウシ胎児血清を補添したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ ）中でのヒト包皮線維芽細胞の付着と伸展か、ＷＳＰで修飾した表面の蛋白質吸 着を防ぐ上での存効性の試験として使用された。細胞は、ＰＥＴ、Ｐｅ１ｌｅｔ ｈａｎｅＳＰ　ＭＭＡて修飾した表面上に既知の濃度で接種され、そして接種４ 時間後伸展細胞を計数しその後は、定期的に集密状態に達するまで計数した。

ＰＥＴで修飾したフィルムは、２５日間水で抽出した後３００００細胞／ｃｍ” を接種した。最も劇的な結果は、ここで、ＰＥＴ上のＰＥＯ１８５００で修飾し た表面について得られた。図２３においてみることができるように、ＰＥ０１８ ５００で修飾したＰＥＴ表面を除き、すべての表面が最初の接種後５−１ｏ日以 内に集密状態に達した。９日、および１５日ロー再接種したにもかかわらず、Ｐ ＥＯ１８５００は３０日を越えた日数がすぎてさえも、細胞はこの表面に付着し ない。集密状態に達する表面の中では、ＰＥ０Ｘで修飾した表面は応答が最もお そいか、結局は集密状態に達している。これらの結果は、蛋白質吸着と血小板付 着実験から得られたデータと厳密に一致している。ＰＥｏＸ表面についての結果 は、血液と接触する適用においてはこのような表面は、短期間においては適切に 挙動するか、接触時間が長くなると、結局は血栓形成性に変る可能性かあること か示唆されていると思われる。

これらの結果は、ＰＩＦＨの形でポリマー表面へ含浸させたとき、蛋白質吸着、 それゆえ細胞の相互作用を防ぐ上てＰＥＯＩ　８５００の作動性と適切性を示し ている。

これらの結果の成行きとして、Ｐｅ１ｌｅｔｈａｎｅとＰＭＭＡをＰＥＯ１８５ ００でのみ修飾して、ＰＥＴについての早期の結果を再確認することに決定した 。溶解など適切な条件を決定した後、これらのポリマーにＰＥ０１８５００を含 浸させ、これらの表面上にＰｒＰＮを得た。細胞はこれらの修飾した表面にさら にきびしい条件下で接種した。（すなわち、ＰＥＴの接種密度の２．５倍）これ らの条件下では、無処理のＰＥＴのような納得できる程度に付着性な基質は２日 未満で集密状態に達するであろう。Ｐｅ１ｌｅｔｈａｎｅについて得られた結果 を図４に示しである。そして、ＰＭＭＡについての結果は、図２５に示しである 。また再び、ＰＥＯ１８５００は、これらの基質上の細胞伸展と生長を首尾よく 減少させている。処理溶媒の濃度か増加するにつれて細胞付着は減少し、ＰＥ０ １８５００がベースポリマーによりよく組込まれることを示している。

異なる修飾表面についての表面親水性はひろく変動する細胞応答を生じ、表面の 可動性と組込まれたポリマーの適切な鎖の長さは、ポリマーの表面において細胞 相互作用の結果を決定する重要な要因であることを示している。

これらの結果は、ポリマーのシステムの修飾にＰＩＰＮ技術か一般的に適用可能 であり、その上、蛋白質吸着、したかって生物材料表面における相互作用を阻害 するＰＥ０１８５００のことのほかすぐれた能力を示している。この技術の既存 の生物医学的ポリマーへの応用の可能性は測り知れない。簡単な溶液工程なので 、あらかじめ作られた用具はＷＳＰの適切な溶液に浸漬し、次に水のような用具 に対して溶解性のない非溶媒に移すことによって、簡単に修飾することかできる 。

ＰＩＰＮは、最低５．６週間にわたって、極めて安定のように思われる。（低い 細胞付着と蛋白質吸着を示した）ＰＥ０１８５００で修飾された表面についての 細胞付着と蛋白吸着の実験は、これらのＰＩＰＮｓの調整後、それぞれ２５日と ２０日間行われｔこ。これら２０日から２５日の期間を通して、それらは連続的 に水中で抽出された。

この工程と水溶性ポリマーＰＥ０（ＰＥＧ）（好ましくは分子量１８５００）の 応用には、血管移植、カテーテルやベーシングリードのような血流と接触する生 体材料を含む領域かある。その上、これらの修飾ポリマー表面上の反応性のＰＥ Ｏ末端基を、特別な細胞型のみを付着するであろう表面を産生ずるための適切な 生体特異的ペブチＦ：（本明細の他の場所で述へられた）の結合場所として役立 てることか可能である。例えば、血管移植のような適用の場合には、内皮細胞か 付着細胞とされるかもしれない。現在市販されている血管移植の約半分は、この 例の主たる焦点であるＤａｒｃｏｎ　（Ｐ　Ｅ　Ｔ　）から作られている。他の 応用には、バイオセンサー膜、眼内レンズ（ＰＭＭＡ）のような細胞付着か望ま しくない組織と接触する材料か含まれる。材料はまた、非吸着性の支持体が特異 的吸着リガンドの結合にとって望ましい蛋白質のアフィニティークロマトグラフ ィーでの使用のために作ることかできる。非吸着性チューブと袋も、蛋白質と血 液工程の他の領域においても宵月かもしれない。本発明の技術は、バイオテクノ ロジーと食品加工において使用するための限外濾過膜の製造、または、処理に応 用されると考えられる。極めて清潔な水のシステム（例えば、ミクロエレクトロ ニクス産業において使用されるような）、そして、多分海洋の付着物がつかない 表面のような非生物的応用もあると思われる。

ＰＥ７表面へのフィブリノーゲンの吸着、ＰＭＭＡとＰｅ１ｌｅｔｈａｎｅの表 面へのアルブミンとフィブリノーゲンの吸着；これらの表面上のＰＥＯや他のＷ ＳＰｓの存在を示すＥＳＣＡデータ：　Ｐｅ１ｌｅｔｈａｎｅとＰＭＭＡ表面に ライての血液接触、ならびに、これらの表面における血小板の形態を評価するた めに、血液と接触した後のＳＥＭ分析、そして、最後にさらにマウスでの皮下移 植のようなｉｎ　ｖｉｖｏ試験についてさらに検討を計画している。

ＰＥＴ−ＰＥＯ１８５００に関する予備的データは、細胞付着を防ぐのに効果的 であることか示された。対照１週間のＰＥＴ移植片は、広範囲な線維形成と被包 形成を起したか、相当するＰＥＯＩ　８５００で修飾したＰＥ７表面は、最小限 の細胞付着状態で自由に浮いているのか見出された。

以下の参考文献は、他の場所で引用された文献と同様に、引用された理由により 、ここに参考として関係部分に組込まれている。

引用文献 １、Ｇｒｉｎｎｅｌｌ、　Ｆ、　（１９７８）、”Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ａｄｈｅ ｓｉｖｅｎｅｓｓ４０２−４１０゜ ３、Ｐｅａｒｌｓｔｅｉｎ、　Ｅ、、　（１９７６）、Ｎａｔｕｒｅ、　２６２ ：　４９７−５００゜ ２６５−２７４゜ ３６９−３７７゜ −４９７゜ ＋３．　）Ｉｙｎｅｓ、Ｒ，０，、（ｔ９８７）、Ｃｅ１１．　４８：　５４９ −５５４゜１４、　Ｓｉｎｇｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、（＋９８７）、Ｊ、Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｌ、、＋０４：６０９−６２５゜ ２２、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、、（１９８６）、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｎｄ　ｔｈｅｏｒｅ ｔｉｃａｌ　ａｓｐｅｃｔｓ。

２５、Ｊ、Ｈ，Ｌｅｅ、Ｊ、Ｋｏｐｅｃｅｋ、ａｎｄ　Ｊ、Ｄ、Ａｎｄｒａｄｅ 、Ｊ。

ｔｈｅ　ＡＣＳ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　Ｍａｔｅｒｉ ａｌｓ：　５ｃｉｅｎｃｅａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６２．７３１．　 ２９９０゜２７、Ｗ、　Ｒ，Ｇｏｍｂｏｔｚ、　Ｗ、　Ｇｕａｎｇｈｕｉ、　ａ ｎｄ　Ａ、　Ｓ、　Ｈｏｆｆ−ｍａｎ、Ｊ、ＡｐＯ［、Ｐｏｌｙｍ、Ｓｃｉ、３ ７．　９１．　１９８９゜２８、　Ｎ、Ｃｈｉｓａｔｏ、に、Ｄ、Ｐａｒｋ、Ｔ 、０ｋａｎｏ、ａｎｄ　Ｓ、Ｗ。

Ｋｉｍ、Ｔｒａｎｓ、　Ａｍ、　Ｓｏｃ、　Ａｒｔｉｆ、Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｏｒ ｇａｎｓ　３５゜３５７、　１９８９゜ ２９、Ｍ、Ｖ、５ｅｆｔｏｎ、Ｇ、ＬＬａｎｏｓ、ａｎｄ　Ｗ、Ｒ，［ｐ。

Ｐｒｏｃｅｅｄｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＡＣ３Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｌ ｙｍｅｒｉｃ　Ｍａｔｅｒ−ｉａｌｓ：　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎ ｅｅｒｉｎｇ　６２．７４１．１９９０゜３０、Ｓ、Ｎａｇａｏｋａ　ａｎｄ　 Ａ、Ｎａｋａｏ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　１１．１１９゜１９９０゜ ３１、Ｙ、Ｍｏｒｉ、Ｓ、Ｎａｇａｏｋａ、Ｈ，Ｔａｋｉｕｃｈｊ、ｅｔ　ａｌ 、。

Ｔｒａｎｓ、　Ａｍ、　Ｓｏｃ、　Ａｒｔｉｆ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｏｒｇａｎ ｓ　２８．４５９゜１９８２゜ ３２、Ｅ、Ｗ、Ｍｅｒｒｉｌｌ、Ｅ、Ｗ、Ｓａｌｚｍａｎ、Ｓ、Ｗａｎ、ｅｔ　 ａｌ、。

Ｔｒａｎｓ、Ａｍ、Ｓａｃ、Ａｒｔｉｆ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｏｒｇａｎｓ　２８． 　４８２゜１９８２゜ ３３、Ｓ、Ｋ、Ｈｕｎｔｅｒ、Ｄ、Ｅ、Ｇｒｅｇｏｎｉｓ、Ｄ、Ｌ、Ｃｏｌｅｍ ａｎ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｔｒａｎｓ、Ａｍ、Ｓａｃ、Ａｒｔｉｆ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｏｒｇ ａｎｓ　２９゜２５０、　１９８３゜ ３４、Ｃ，Ｍａｅｃｈｌｉｎｇ−Ｓｔｒａｓｓｅｒ、　Ｐｈ、　Ｄｅｊａｒｄｉ ｎ、　Ｊ、　Ｃ。

Ｇａ１ｉｎ、ａｎｄ　Ａ、Ｓｃｈｍｉｔｔ、Ｊ、Ｂｉｏｍｅｄ、Ｍａｔｅｒ、Ｒ ｅｓ、２３゜１３８５、　１９８９゜ ３６、　Ｍ、に、Ｍａｒｋｗｅｌｌ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２５．４２ ７゜１９８２゜ ＦＩＧ、３Ａ ＦＩＧ、３８ ＦＩＧ、　４ ＃伸展細胞７０ｍ２ 基質 ＦＩＧ、　５ ＃伸展細胞／ｃｍ２ 時間（時） ＦＩＧ、　６ ＃伸展細胞／Ｃｍ２ ＋血清　−血清 基質 ＦＩＧ、　７ ％伸屡細胞 ＰＥＴに結合したＧＲＧＤ ＦＩＧ、　８ μ伸展細胞／ｃｍ２ 時間（時） インブ・ント濃度（ｐｍｏＬ／ｃｍ２）ＦＩＧ、　１０Ａ 分析された細胞分画（％） ＦＩＧ、　１０Ｂ 分析された細胞分画（％） 面積（μｍ２　） ＦＩＧ、　１０Ｃ 分析された細胞分画（％） 面積（μｍ２　） ＥＩＧ、　１０Ｄ 分析された細胞分画（％） ＦＩＧ、　１１ 細胞数／Ｃｍ２ ＦＩＧ、　１２Ａ 分析された細胞分画（％） 面積（μｍ２　） ＦＩＧ、１２Ｂ 分析された細胞分画（％） 面積（μｍ２　） ＦＩＧ、１２Ｃ 分析された細胞分画（％） ０　２αリ　ぼに０ 面積（μｍ２　） ＦＩＧ、１２Ｄ 分析された細胞分画（％） 面積（μｍ２　） ＦＩＧ、　１３Ａ ＦＩＧ、　１３８ ＦＩＧ、　１３Ｃ ＦＩＧ、１３Ｄ ＦＩＧ、　１４Ａ ＦＩＧ、　１４８ Ｆ”ｌＧ、１４Ｃ ＦＩＧ、１４Ｄ ＦＩＧ、１５Ａ ＦＩＧ、１５８ ＦＩＧ、　１５Ｃ ＦＩＧ、１５Ｄ ＦＩＧ、　１６ μ伸展細胞／Ｃｍ２ 基質 処理時間 ｅ シリンジポンプ ＦＩＧ、　２１ 対照の％ 対照の％ ＦＩＧ、　２３ 集密状態％ 集密状態％ 時間１日 ＦＩＧ、２５ ％集密状態 時間１日 手続補正書泪地 平成４年６月１０日

Claims (95)

【特許請求の範囲】
1. １．共有結合的に連鎖したペプチドが化学的に付着し、当該ペプチドが１２アミ ノ酸残基よりも少ない、表面からなる細胞培養基質。
2. ２．当該ペプチドが、細胞認識アミノ酸配列ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、またはＲＥＤ Ｖを含む、請求項１の細胞培養基質。
3. ３．当該ペプチドが少なくとも 【配列があります】 からなる群から選ばれたものである、請求項１の細胞培養基質。
4. ４．当該ペプチドが３及び９アミノ酸残査の間をもつ、請求項１の細胞培養基質 。
5. ５．当該ペプチドが４または６アミノ酸残基をもつ、請求項１の細胞培養基質。
6. ６．ペプチドが４アミノ酸残基をもち、さらにＧＲＧＤとして限定される、請求 項５の細胞培養基質。
7. ７．ペプチドが６アミノ酸残基からなり、さらにＧＹＩＧＳＲとして限定される 、請求項５の細胞培養基質。
8. ８．ペプチドが６アミノ酸残基からなり、さらにＧＲＥＤＶとして限定される、 請求項５の細胞培養基質。
9. ９．ペプチドが６アミノ酸残基からなり、さらにＧＲＤＳＧＲとして限定される 、請求項５の細胞培養基質。
10. １０．ペプチドが６アミノ酸残基からなり、さらにＧＩＫＶＡＶとして限定され る、請求項５の細胞培養基質。
11. １１．基質が１つのセラミック；１つのポリマー及び１つの金属からなる群から 選ばれた材料からなる、請求項１の細胞培養基質。
12. １２．基質が１つのポリマー；または１つのセラミックからなる、請求項１の細 胞培養基質。
13. １３．基質が１つのセラミックからなる、請求項１、２または３の細胞培養基質 。
14. １４．セラミックがガラスである、請求項１３の細胞培養基質。
15. １５．ガラスがグリセロルプロピルシランの結合したガラスからなる、請求項１ ４の細胞培養基質。
16. １６．ペプチドがＧＲＧＤＹまたはＧＹＩＧＳＲＹペプチドからなる、請求項１ ５の細胞培養基質。
17. １７．基質が１つのプラスチック：１つのポリ（ヒドロキシエチルメチルアクリ レート）；１つのポリ（エチレンテレフタレート）；１つのポリ（テトラフルオ ロエチレン）；１つの弗化エチレン；及び１つのポリ（ジメチルシロキサン）か ら成る群から選ばれたポリマーからなる請求項１の細胞培養基質。
18. １８．ポリマーがポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）である、請求項１の 細胞培養基質。
19. １９．ペプチドがＧＲＧＤである、請求項１８の細胞培養基質。
20. ２０．ポリマーがポリ（エチレンテレフタレート）である、請求項１の細胞培養 基質。
21. ２１．ペプチドがＧＲＧＤまたはＧＹＩＧＳＲである、請求項２０の細胞培養基 質。
22. ２２．金属がチタニウムである、請求項１１の細胞培養基質。
23. ２３．ペプチドがおよそ０．００１ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２とおよそ１００ ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２の間の表面濃度で、基質に付着している、請求項４ の細胞培養基質。
24. ２４．ペプチドがおよそ０．５ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２とおよそ２０ｐｉｃ ｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２の間の表面濃度で、基質に付着している、請求項４の細胞 培養基質。
25. ２５．ペプチドがおよそ１２ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２の表面濃度で基質に付 着している、請求項４の細胞培養基質。
26. ２６．ペプチドで化学的に表面を誘導する；及び、ペプチドが誘導した表面に植 えつける細胞からなり、ペプチドが長さが１２アミノ酸残基より少なく、またア ミノ酸配列ＲＧＤ．ＹＩＧＳＲ，ＧＲＥＤＹ，ＧＰＤＳＧＲ，ＧＩＫＶＡＶまた はＲＥＤＶを含む、表面への細胞付着を強化する方法。
27. ２７．動物細胞はヒト、ネズミ、昆虫またはブタの細胞である、請求項２６の方 法。
28. ２８．細胞はヒトの細胞である、請求項２６の方法。
29. ２９．細胞は３Ｔ３細胞、大動脈細胞、または包皮細胞である、請求項２６の方 法。
30. ３０．細胞は３Ｔ３繊維芽細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５８）からなる請求項２ ６の方法。
31. ３１．細胞はヒト包皮繊維芽細胞からなる、請求項２６の方法。
32. ３２．表面が、およそ０．００１ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２とおよそ１００ｐ ｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２の間のペプチド濃度からなる、請求項２６または２８ の方法。
33. ３３．表面が、約０．５ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２と約２０ｐｉｃｏｍｏｌｅ ｓ／ｃｍの間のペプチド濃度からなる、請求項２６または２８の方法。
34. ３４．表面が、約１２ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２のペプチド濃度からなる、請 求項２６または２８の方法。
35. ３５．表面の活性反応群成分；表面反応群成分へ結合するペプチド；及び表面の 反応群へ共有的に結合するペプチド、からなり、当該ペプチドは、１２アミノ酸 残基より小さく、細胞培養表面の表面活性群成分へ共有結合を形成する、細胞培 養表面修飾方法。
36. ３６．表面が、１つの組織培養フラスコ；１つのペトリ皿、微粒子担体：大粒子 担体；繊維；単一の材料から成る支持体；及び回転瓶から成る群から選ばれた用 具の表面からなる、請求項３５の方法。
37. ３７．表面が、１つのセラミック；１つのポリマー：及び１つの金属から成る群 から選ばれた材料からなる、請求項２６または３５の方法。
38. ３８．金属がチタニウムである、請求項３７の方法。
39. ３９．表面が１つのポリマーからなる、請求項３７の方法。
40. ４０．ペプチド上のグリシンリンカーアームの末端第一アミンが、塩化トレシル 活性によってポリマー表面のヒドロキシル群へ移植される、請求項３７の方法。
41. ４１．ポリマーがポリ（ヒドロキシエチルメチルアクリレート）である、請求項 ３９の方法。
42. ４２．ペプチドが少なくとも、 【配列があります】 からなる群から選ばれた１つである、請求項２６または３５の方法。
43. ４３．ペプチドがＧＲＧＤであり、ペプチドのアミンと表面の水酸基成分の間の 共有化学結合によって、化学的に付着する、請求項４１の方法。
44. ４４．ペプチドのグリシンリンカーアーム上の末端第一アミンが、塩化トレシル 活性によってポリマー表面の水酸基群へ移植される請求項３５の方法。
45. ４５．表面の反応群は、グルタルアルデヒド；塩化シアヌル；塩化スルホニル； 臭化シアン；及びトリフルオロエタンスルホニルクロライド。から成る群から選 ばれた化学薬品へ表面を曝露することによって活性化されるであろう、請求項２ ７の方法。
46. ４６．塩化トレシルによる処理で、ポリマー表面の表面反応成分を活性化し；そ してペプチド−結合表面を作成するために、ポリマーの活性化表面成分へ、グル シル末端アミンを経由してＧＲＧＤペプチドを結合する、ことからなるポリマー 表面へペプチドを結合する方法。
47. ４７．塩化トレシル処理は、ポリマー表面を、乾燥エーテル、トリエチルアミン 及び塩化トレシルへ、室温で１５分間曝露することからなる、請求項４６の方法 。
48. ４８．ＧＲＧＤペプチドのポリマー表面への結合は、さらに、活性化表面をアル カリ性緩衝液ですすぎ：また結合方法はさらに、約６０−１００ｎｇ／ｍｌのＧ ＲＧＤペプチドの濃度をもつ塩基性緩衝溶液中で、すすいだ表面を培養するよう に限定されることからなる、請求項４６の方法。
49. ４９．ポリマー表面はポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）からなる、請求 項４８の方法。
50. ５０．水酸基成分によって、前処理をおこなったポリマーを形成するため、ポリ マーをホルムアルデヒド及び酢酸の混合液中に浸す；前処理を行ったポリマーを 、乾燥エーテル、トリフルオロエタンスルホニルクロライド及びトリエチルアミ ンの混合液に浸す；浸した前処理ポリマーを中性緩衝溶液ですすぐ；そしてペプ チド結合表面を作成するため、１０ｎｇ／ｍｌと１００ｍｇ／ｍｌの間のペプチ ドを含む緩衝溶液中で、すすいだ前処理ポリマーを培養することからなる、水酸 基のないポリマー表面へ、ペプチドを結合する方法。
51. ５１．ホルムアルデヒドと酢酸の混合液は約１８．５％（ｖ／ｖ）のホルムアル デヒドと約１Ｍの酢酸からなる、請求項５０の方法。
52. ５２．ポリマーは、ホルムアルデヒドと酢酸の混合液に室温で約４時間浸される 、請求項５０の方法。
53. ５３．緩衝溶液は、約０．２Ｍの重炭酸ソーダ緩衝溶液でｐＨ１０、からなる、 請求項５０の方法。
54. ５４．ペプチドは約１０ｎｇ／ｍｌＧＲＧＤペプチドである、請求項５０の方法 。
55. ５５．すすいだ前処理ポリマーは、室温で約２０時間培養される、請求項５０の 方法。
56. ５６．ペプチドー結合表面は、約０．００１ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２と約１ ００ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２の間のペプチド濃度からなる、請求項５０の方 法。
57. ５７．ペプチドー結合表面は、約０．００１ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２と約２ ０ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２の間のペプチド濃度をもつ、請求項５０の方法。
58. ５８．ペプチドー結合表面は約１２ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２のペプチド濃度 からなる、請求項５０の方法。
59. ５９．前処理したポリ（エチレンテレフタレート）表面を形成するため、ポリ（ エチレンテレフタレート）を、約１８．５％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒド及び １Ｍ酢酸からなる混合液に室温で約４時間浸す；トレシル活性化された表面を形 成するため、前処理した表面を、約２０ｍｌ転換エーテル、約４０μ１の２，２ ，２−トリフルオロエタンスルホニルクロライド及び約２ｍｌトリエチルアミン からなる混合液に室温で１５分間浸す；トレシル活性化された表面を約０．２Ｍ の重炭酸ソーダ、ｐＨ１０の緩衝溶液中ですすぐ；そして、化学的に結合したペ プチドをもつポリ（エチレンテレフタレート）表面を形成するため、すすいだト レシル活性化表面を、６０−１００ｎｇ／ｍｌの間のＧＲＧＤ，ＧＰＤＳＧＲ， ＧＩＫＶＡＶ，またはＧＹＩＧＳＲペプチドをもつ０．２Ｍの重炭酸ソーダ緩衝 溶液中で約２０時間室温で培養することからなり、当該方法は、約０，００１ｐ ｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２と約２０ｐｉｃｏｍｏｌｅｓ／ｃｍ２の間の表面濃度 を与える、ペプチドをポリ（エチレンテレフタレート）表面へ化学的に結合する 方法。
60. ６０．用具の表面にペプチドを共有結合的に付着させ、当該ペプチドは１２アミ ノ酸残基より少なく、細胞の用具表面への細胞受容体媒介付着を容易にするアミ ノ酸配列を含むことからなるｉｎ　ｖｉｖｏの移植用生体医療用具を製造する方 法。
61. ６１．生体医療用具は、眼内レンズ；縫合：陰茎移植；心臓移植；股関節部移植 ；カテーテル；人工静脈；人工動脈；人工膣移植；人工腱；人工靱帯：人工骨ね じ；人工骨板；人工骨片；人工骨関節；人工皮膚；及び人工神経成長ガイド、か らなる群から選ばれる、請求項５８の方法。
62. ６２．生体医療はカテーテルまたは人工神経成長ガイドである、請求項６０の方 法。
63. ６３．生体医療用具はポリエチレンからなるカテーテルである、請求項６３の方 法。
64. ６４．ペプチドは 【配列があります】 からなる群から選ばれる、請求項５８の方法。
65. ６５．ペプチドはＧＲＧＤ，ＧＰＤＳＧＲ，ＧＩＫＶＡＶまたはＧＹＩＧＳＲで ある、請求項６０の方法。
66. ６６．物理的に内部に入り込む水溶性ポリマーの表面をもつ水不溶解ベースポリ マーからなる物質の構成。
67. ６７．物理的に内部に入り込む水溶性ポリマーの表面をもち、当該水溶性ポリマ ーは、細胞を付着するための共有結合的に付着したペプチドをもち、ベースポリ マーに組み込まれる前後に、内部に入り込む水溶性ポリマーを形成する、水−不 溶解性ベースポリマーからなる細胞培養または生体医療用基質。
68. ６８．ペプチドが少なくとも、ＲＧＤ，ＲＥＤＶ，ＰＤＧＳＲ，及びＩＫＶＡＶ の１つからなる、請求項６７の細胞培養基質。
69. ６９．当該ペプチドは、少なくとも 【配列があります】 からなる群から選ばれる１つである、請求項６７の細胞培養基質。
70. ７０．当該ペプチドは、３及び９の間のアミノ酸残基からなる、請求項６７の細 胞培養基質。
71. ７１．当該ペプチドは、４または６アミノ酸残基からなる、請求項６７の細胞培 養基質。
72. ７２．ベースポリマーは、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ウレタン） 、ポリ（メチルメタクリレート）、またはポリ（スチレン）、である、請求項６ ７の物質の構成または請求項６８の細胞培養基質。
73. ７３．ベースポリマーは熱可塑性プラスチックである、請求項６７の物質の構成 または請求項６８の細胞培養基質。
74. ７４．ベースポリマーは高度の膨潤性熱可塑性ポリマーである、請求項６７の物 質の構成または請求項６８の細胞培養基質。
75. ７５．ベースポリマーはポリ（エチレンテレフタレート）である、請求項６７の 物質の構成または請求項６８の細胞培養基質。
76. ７６．水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポ リ（エチロキサゾリン）、またはポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）である、請求項 ６７の物質の構成または請求項６８の細胞培養基質。
77. ７７．水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオ キシド）である、請求項６７の物質の構成または請求項６８の細胞培養基質。
78. ７８．水溶性ポリマーは、５０００より大きく、１０００００より小さな分子量 をもつ、請求項７７の構成または基質。
79. ７９．水溶性ポリマーは、分子量が５０００より大きく、１０００００より小さ い、請求項６７の物質の構成または請求項６８の細胞培養基質。
80. ８０．水溶性ポリマーは、約１８５００の分子量をもつ、請求項６７の物質の構 成または請求項６８の細胞培養基質。
81. ８１．ベースポリマー及び水溶性ポリマーは、少なくとも１つの共通の溶媒をも つ、請求項６７の物質の構成または請求項６８の細胞培養基質。
82. ８２．ベース重合基質の少なくとも一部を溶解しうる溶媒で、水溶性ポリマーの 溶液を作る工程；ベース重合基質の表面の重合成分をゆるめる溶液で、ベース重 合基質を処理する工程；及びゆるめた表面ポリマー成分を元の位置にもどし、そ れによって水溶性ポリマーの内部に入り込んだ鎖が補集されるように、処理した ベース重合基質を停止溶媒にさらす工程からなる、水溶性ポリマー領が内部に入 り込むネットワークを備えた表面をもつベース重合基質を作成する方法。
83. ８３．ベース重合基質は、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ウレタン） 、ポリ（スチレン）またはポリ（メチルメタクリレート）、及び水溶性ポリマー は、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルピ ロリドン）、またはポリ（エチロキサゾリン）である、請求項８２の方法。
84. ８４．溶媒は、トリフルオロ酢酸水溶液、テトラヒドロフラン水溶液またはアセ トン水溶液である、請求項８２の方法。
85. ８５．重合基質はポリ（エチレンテレフタレート）である請求項８２の方法。
86. ８６．重合基質はポリ（エチレンテレフタレート）であり、水溶性ポリマーはポ リ（エチレンオキシド）またはポリ（エチレングリコール）である請求項８２の 方法。
87. ８７．ベース重合基質は、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ウレタン） またはポリ（メチルメタクリレート）である請求項８２の方法。
88. ８８．水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシ ド）、ポリ（ビニルピロリドン）、またはポリ（エチルオキサゾリン）である請 求項８２の方法。
89. ８９．水溶性ポリマーは、５０００より大きく、１０００００より小さな分子量 をもつ、請求項８２または８６の方法。
90. ９０．水溶性ポリマーは約１８５００の分子量をもつ、請求項８２または８６の 方法。
91. ９１．水溶性ポリマーは単独重合体である、請求項８２または８６の方法。
92. ９２．停止ポリマーは水溶性ポリマーを溶解するが、重合基質は溶解しない、請 求項８２の方法。
93. ９３．停止溶媒は水である請求項８２の方法。
94. ９４．停止溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミド 、テトラヒドロフランまたはベンゼンである、請求項８２の方法。
95. ９５．停止溶媒は、重合基質及び水溶性重合基質に対、し非溶媒であり、最終工 程には、請求項９２に述べた停止溶媒のすすぎが加えられる、請求項８２の方法 。