JPH05502224A - 随伴細胞に及ぼす白血病抑制因子の増殖作用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 随伴細胞に及ぼす白血病抑制因子の増殖作用本発明は哺乳類（動物）の随伴細胞 （衛星細胞または外套細胞の増殖および／または分化を促進するための、単独ま たはインターロイキン−６（ＩＬ−６）および／または腫瘍（トランスフォーミ ング）増殖因子α（ＴＧＦα）および／または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の ような他のサイトカインとの組み合せでの白血病抑制因子（Ｌｌ、Ｆ）の用途に 関するものである。本発明はまたＬＩＦが単独または他のサイトカインとの組み 合せで哺乳類の随伴細胞を増殖させ、および／または胚芽細胞に分化するために 用いられる胚芽細胞導入治療を含む方法を意図するものである。本発明はまた、 それぞれイン　ビトロまたはイノ　ビボで哺乳類の随伴細胞の増殖および／また は分化を促進するために、単独または他のサイトカインとの組み合せでのＬＩＦ を含む細胞活性化組成物および医薬組成物を指向するものである。

骨格筋は神経支配され、鯛を介して刺激され骨に結合している並列の多核細胞か ら成っている。これらの高度に分化した細胞は複製され得ないが、筋肉は損傷ま たは病後再生について高い能力を持ち、これは筋線維と密接な関係にある幹細胞 、いわゆる随伴細胞の活性化により達成される。筋細胞核の２０％までが随伴細 胞に見出されることが概算されている。

活性化により、随伴細胞は伸長した単核の胚芽細胞に分化する。

これらは、充分な数の場合、融合して多核化した筋管、すなわち筋線維の前駆体 を形成する。

筋細胞の一次培養は全て随伴細胞より発生する。筋を細かく切り、トリプシンに より処理し、線維および細胞外マトリクスを粉砕する。

この方法の結果放出される随伴細胞は採集し、細胞培養状態下に置匂 約３日の誘導期後、細胞は増殖し、胚芽細胞への分化を受ける。

これらはまた増殖し、培養が全面に達した場合、細胞は融合して多核細胞を形成 し始める。細胞は何回も継代してもよいが、これは融合前に胚芽細胞の段階でな されなければならない。

ヘパリン結合性増殖因子、線維芽細胞増殖因子（Ｆ　Ｇ　Ｆ）が随伴細胞の増殖 を促進することが見出されているが、随伴細胞の増殖および胚芽細胞への続く分 化の制御の特性は、周知ではない（デ・マリオおよびストマン、ディファレンエ ーブタン、第３９巻、４２−４９頁（１９８８年） 本発明は、一部分、培養中の筋細胞増殖の初期の段階に及ぼすいろいろなサイト カインの作用の研究から生じたものである。本発明によって、ＬＪＦおよび程度 は低いがＴＬ−６およびＴＧＦαのような他のサイトカインが随伴細胞の増殖お よび続く胚芽細胞の分化を促進することが見出されている。

したがって、本発明の一つの特徴は、上記の随伴細胞が増殖および／または胚芽 細胞に分化するのに充分な時間および条件下で刺激に有効な量のＬＩＦと上記の 細胞とを接触させることを含む哺乳動物の随伴細胞の増殖および／または胚芽細 胞への分化を促進する方法に関するものである。

本発明の他の特徴は、上記の随伴細胞が増殖および／または胚芽細胞へ分化する のに充分な時間および条件下一種またはそれ以上の他のサイトカインとの同時ま たは逐次の組み合せで刺激に有効な量のＬＩＦと上記の細胞とを接触させること を含む哺乳類の随伴細胞の増殖および／または胚芽細胞への分化を促進する方法 に関するものである。

さらに本発明の他の特徴は、上記の随伴細胞が増殖および／または胚芽細胞へ分 化するのに充分な時間および条件下、増殖および／または分化に有効な量のＬＩ Ｆと哺乳類の随伴細胞とを接触させることおよび次に筋肉に多数の部位で上記の 胚芽細胞を投与することを含んでいる胚芽細胞導入治療法を意図するものである 。この実施態様の別法として、ＬＩＦは一種またはそれ以上の他のサイトカイン との同時または逐次の組み合せで用いられる。

なお、本発明の他の特徴は、一種またはそれ以上の他のサイトカインおよび一種 またはそれ以上の生理学的に許容可能な担体および／または希釈剤との組み合せ でＬＩＦを含んでいる、細胞を活性化する組成物に関するものである。

さらに、なお本発明の他の特徴は、哺乳類の随伴細胞の増殖および／または胚芽 細胞への分化を刺激するための細胞を活性化する組成物の製造における単独また は一種またはそれ以上の他のサイトカインとの組み合せでのＬＩＦの使用に関す るものである。

さらに、なお本発明の他の特徴には、ＬＩＦおよび一種またはそれ以上の他のサ イトカインおよび一種または医薬的に許容可能な担体および／または希釈剤を含 んでいる、随伴細胞の増殖および／または分化を促進するための医薬組成物を提 供することがある。

一つの好ましい実施態様には、ＬＩＦを所望の組み合せでのサイトカインはＩ　 Ｌ−６および／またはＴＧＦαおよび／またはＦＧＦを包含する。

随伴細胞およびサイトカインは同種または異種の哺乳類から生じ得る。同じ哺乳 類が用いられる場合、随伴細胞およびサイトカインは同じ哺乳類の同じかまたは 異なる種から生じ得る。本明細書で意図した哺乳類はヒト、マウスおよび家畜動 物を包含するがこれに限定するものではない。

本発明は、天然に存在している（自然の）、組み換えおよび／または合成のサイ トカインに、および／またはそれらの誘導体および／類縁体に、および／または それらの全ての組み合せに拡大するものである。たとえば、組み換えのネズミお よびヒトのＬＩＦは国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ８８８１０００９３号に開示さ れている。本明細書で用いる用語ｒＬＩ　ＦＪはＬＩＦおよびその誘導体および 類縁体の全ての上記の形を包含し、ＬＩＦ分子のポリペプチド部への単一または 多重アミノ酸置換、欠失および／または添加および分子の炭水化物部（存在する 場合）への単一または多重置換、欠失および／または添加を包含する。ＬＩＦの 誘導体および類縁体は目的の活性度を有する自然の、組み換えの、および／また は合成のＬＩＦの部分を包含する。

本明細書に用いた「同時または逐次の組み合せ」とは、同時すなわち単一の組成 物で、またはかわるがわるそれらの各活性な分子または群の投与で、ＬＩＦおよ び一つまたはそれ以上の他のサイトカインを添加することを意味する。限定され ない例として、ＬＩＦは最初に用い、続いて二番目のサイトカイン続いて三番目 のサイトカイン等々が用いられ得る。別法として、ＬＩＦは最初に続いて用い、 他のサイトカインの組み合せが用いられ得る。他の実施態様として、他のサイト カインは最初に用い（同時または逐次）、続いてＬＩＦが用いられ得る。

本発明は、特に−次性、遺伝学的に検定した筋痛に関して医学的に重要である。

かなり多数のそれらの疾患が存在し、そのうちもつとも重症で、もっとも普通の ものはデュンエンヌ筋ジストロフイ（ＤＭＤ）である。影響を受けた遺伝子は既 知であり、その蛋白質生成物はその由来を調べられている。蛋白質生成物である シストロフィンはおそらく細胞骨格、膜連鎖の成分である。それは太き（，４２ ５０００ダルトンであり、遺伝子はヒト遺伝子の最大のものである。

その複雑さの故に、遺伝学的操作が近い将来に可能になりそうもない。しかし、 他の方法はｍｄｘマウスを含めた筋ジストロフィのマウスのモデルに有効である ことを示されている。

この方法は正常なマウスから誘導した培養物中における胚芽細胞を増殖させ、多 （の部位で突然変異マウスの筋にそれらを注入することを含む。結果は拒絶反応 が最小なだけでなく、また筋が以前になかったシストロフィンを含むことを示し ている。

非常に重度の筋萎縮を示しているマウス株において（シストロフィンが不足して いないが、未知の欠陥をもつ突然変異）筋力はほとんど正常に戻った。

すなわち、培養物中に増殖したヒト胚芽細胞を多くの部位でＤＭＤの筋に注入さ れる胚芽細胞導入療法と称する方法が意図される。

この方法は全ての一次性筋痛に適用でき、ＤＭＤのみに限定されない。

方法は多（の部位で・多数の筋への多数の胚芽細胞の注入を含む。

それは時間がか＼す、胚芽細胞培養のコストが高い。現在、胚芽細胞を培養する 方法はさまざまな濃度の高価な試薬であるウシ胎児血清（ＦＣＳ）を用いた長時 間の培養に培地を利用する。すなわち、胚芽細胞の分化および増殖を促進し得る 全ての因子は胚芽細胞生産のコストの減少に重要である筈である。それ故に、本 発明によって、ＬＩＦは単独またはＩＬ−６および／またはＴＧＦαおよび／″ またはＦＧＦのような他のサイトカインとの組み合せでこの要求を果し得る。

したがって、本発明の一つの特徴は、随伴細胞を刺激するのに充分な時間および 条件下で単独または１Ｌ−６および／またはＴＧＦαおよび／またはＦＧＦのよ うな他のサイトカインとの組み合せて刺激に有効な量のＬＩＦと上記の随伴細胞 を接触させることを含んでいる哺乳類の随伴細胞の増殖および／または胚芽細胞 への分化を促進する方法を指向するものである。

本発明は、またＩ　Ｌ−６および／′またはＴＧＦαおよび／′またはＦＧＦの ような他のサイトカインおよび一種またはそれ以上の生理学的に許容可能な担体 および／゛または希釈剤と共にかまたは共にてなく、ＬＩＦを含んでいる、細胞 を活性化する組成物を指向するものである。好ましくは、組成物は一種またはそ れ以上の他のサイトカインとの組み合せでＬＩＦを含む。

本発明は、また組成物が一種またはそれ以上の他のサイトカイノおよび一種また はそれ以上の医薬的に許容可能な担体および／または希釈剤と共にかまたは共に でなく、ＬＩＦを含む、哺乳類の随伴細胞の増殖および／′または胚芽細胞への 分化を促進するための医薬組成物を指向するものである。一つの実施態様として 、本明細書で意図したＬＩＦ以外のサイトカインは、Ｉ　Ｌ、−６および／また はＴＧＦαおよび／またはＦＧＦを包含する。医薬組成物の製造方法は、オソル らにより編集され、ここに引用することにより組み込まれたレミングトノズ・フ ァルマノユーティカル・サイエンス第１．６版、１９８０年、フック・パブリジ ング・カンパニーに記載されたように当業界では既知である。投与の経路および 活性な成分の有効量は状況により決定され得るが好ましいのは筋肉内注射であり 、他の経路も用い得る。本発明の実施態様の説明の目的の場合、用いられるＬＩ Ｆの有効量は約０１−約１０００単位／’ｏｌ、好ましくは約１−約１００単位 ／ｍｌ、最も好ましくは約１−約５０単位／ｍｌである。

ＬｒＦの単位１．！ＰＣＴ／ＡＵ８８１０００９３ｉ：定義される。一般に、他 のサイトカインは約１−１００ｎｇ／ｍＡで用いられ得る。さらに詳しくは、Ｉ Ｌ−６は好ましくは約６〇−約１００ｎｇ／ｍＡ、　ＴＧＦαは好ましくは約１ −約２０ｎｇ／ｍｌ、およびＦＧＦは好ましくは約２０−約５０ｎｇ／ｍＡの濃 度で用いられ得る。これらの濃度は状況により変化し得、これらの有効量に本発 明を必ずしも制限することは意図しないものである。

本発明はさらに次の図面および実施例によって記載されるが、これらは発明を限 定するものではない。

図面において 第１図はＦｅ２のいくつかの濃度でＬＩＦに対する継代細胞の反応を示している グラフである。継代マウス胚芽細胞（Ｐ２）を５．７゜５または１０容量％ＦＣ ３を含んでいるＨａｍＦ１２培地中、ウェル当り２５００細胞で９６ウエル　プ レートに入れた。ＬＩＦを表示した濃度で添加し培地の交換なしに細胞を増殖さ せた。細胞数を表示した時間で計算し、ウェル表面ｍ１０２当りの細胞数として 示す。

第２図はヒト胚芽細胞に及ぼすＬＩＦの効果を示しているグラフである。ヒト胚 芽細胞をヒト骨格筋の試料から誘導継代し全面の約８０％に増殖した。これらの 継代細胞を第１図に記載したようにＬＩＦの存在下で増殖させた。

第３図は表示した濃度てのＴＧＦα置換ＬＩＦの効果を示しているグラフである 。

第４図はＬＩＦ活性に対するＦＣ８濃度の効果を示しているグラフである。ＬＩ ＦおよびＦＣ３筋芽細胞を第２図に記載したように増殖させた。０−２０容量％ の範囲にあるＦｅ２をＬＩＦの添加の前にＨａｍＦ　１．２倍地に添加した。（ ａ）０容量％−５容量％ＦＣ３゜（ｂ）７．５容量％−２０容量％ＦＣ３０第５ 図は培養でＬＩＦ支持筋芽胚芽の融合を示している写真である。ヒト胚芽細胞を ＬＩＦの不存在または３０単位／ｍＡの存在下で増殖させた。これらを採集し、 リン酸緩衝食塩水に懸濁し、ｍｄｘマウスの一つの伸筋　ンギトラム・ロンガス に注入した。５週後にマウスを殺し、筋を低温切開により封埋した。切片を抗ン ストロフィン抗体で処理し、シストロフィンの存在をフルオレスセインを標識し た抗ヒツジ抗体を用いて見えるようにした。（Ａ）Ｃ５７−ＢＬ−１０正常、シ ストロフィン陽性マウスの筋。（Ｂ）注入されない、ンストロフィン陰性ｍｄｘ マウスの筋。（Ｃ）Ｌ　Ｉ　Ｆの存在下で増殖した胚芽細胞を注入したｍｄｘマ ウスの筋。筋鞘の下にシストロフィン陽性部の斑点があることに注意。

第６図は胚芽細胞上のＬＩＦレセプターを示している写真である。

＋２５１−ＬＩＦに付したマウス胚芽細胞のオートラジオグラフィー。

（ａ）”　Ｉ　−Ｌ　Ｉ　Ｆ単独。（ｂ）　１０００倍過剰の非標識のＬＩＦの 存在下での”Ｉ−ＬＩＦｏ 実施例１ 材料および方法 マウス筋細胞 用いた筋はマウスＣＤ７／ＢＬ／１０系のあと足からのものであった。同じ系か らの突然変異体もまた用いた。これは筋蛋白質ンストロフィンカ炊けているｍｄ ｘ突然変異体である。これは同じ遺伝子がヒトの状態に影響を与えるから、筋ン ストロフイて研究するために秀れたモデルである。

これらの細胞の一次培養を５−１０容量％ＦＣＳを用いたことを除いて、グラン ングハら、マスクル・アンド・ナーブ、第１１巻、１２３１−１２３９頁、１９ ８８年に記載されたように増殖させた。

集密状態の約８０％のとき、細胞を簡単にリン酸緩衝食塩水で洗浄し、解離緩衝 液中で００２５重量／容量％トリプシンで処理して、それらを解離した。ウシ胎 児血清（Ｆｅ２）を５容量％濃度に添加して、トリプシンを抑制し、細胞を１０ 分間１１０００ｒｐで遠心分離し、リン酸緩衝食塩水で二度洗浄した。それらを 次に集密状態の１０％でＨａｍＦ１２．２０容量％ＦＣ５に入れて、継代細胞と した。

ヒト筋細胞。

これらの条件下で、多くの細胞は生存し、分化するが、２０容量％ＦＣＳを用い る最適条件の場合よりも低い速度である。通常、３−４日の誘導期があり、その 間に細胞数が減少に向かい、続いて５−７日で胚芽細胞の出現がある。細胞を最 終的に３−５０００細胞／ウエルの濃度て９６ウエルクラスタープレートに入れ る。増殖因子を培養の開始後３日に添加し、効果を期間を通して随伴細胞または 胚芽細胞のような細胞を数えてはかった。

ヒト骨格筋の試料（０，５−１，５ｇ）を外科手術を通して同意している患者か ら協力している外科医により取出した。ヒト倫理委員全会認可をモナノ大学、モ ナシ医学センター、クレイトンおよびローヤル　チルドレン病院、パークビレ− から保有する。それらの試料を研究所に逆送し、培養を基本的にマウス細胞につ いて記載したように開始した。

イン　ビボ胚芽細胞移入。

継代マウスまたはヒト胚芽細胞を３０単位／ｍｌＬ　Ｉ　Ｆの不存在下または存 在下で集密状態の８０−９０％に増殖させ、上記の通り採取した。それらを３Ｘ １０’細胞／ｃａｌでリン酸緩衝食塩水に懸濁した。生後２５−３２日の突然変 異株ｍｄｘマウスをビブノルム（０，３ｍｌ／ｋｇ）およびンアザバン（５ｍ９ ／ｋｇ）の混合物の腹腔的注入により麻酔をかけた。一つの伸筋ジギトルム・ロ ンガスを露出さ也胚芽細胞を注入した。それらの細胞を２７ゲージに先端を電解 研摩した針と合ったＳＧＥ皮下注射器から１μｍロットで導出した。皮下注射器 をミクロマニピュレーターに装填して、注入の位置および深さを制御した。４ま たは５回の注入を１．５−２ｍｍの間隔で各マウスにした。対照の注入をリン酸 緩衝食塩水のみを用いて実施した。損傷を縫い合せ、マウスが回復するのを可能 にした。

４−６週後、動物を首を切ることにより殺し、ＥＤＬを再露出し、水冷リン酸緩 衝食塩水で冷却し、摘出して組織−Ｔｅｋ　ＯＣＴに埋め込み、液体Ｎ２の温度 でイソペンタンにより急冷した。塊を一２５℃でトリミングし、横方向切片を３ −４μｍに一２０℃で低温恒温装置中で切った。通風乾燥した後、切片をリン酸 緩衝食塩水で１／２００に希釈した５Ｑｋｄまたは３Ｑｋｄの抗シストロフィン 抗体（ホフマンら、セル、第５１巻、９１９−９２８頁、１９８７年）により処 理した。前免疫血清を同様に希釈した。１００％湿度で３０分間、室温でのイキ ュベーノヨン後、切片を３回洗浄し、次に１／４希釈でフルオレスセインイソチ オシアネート・ロバー抗ヒツジ抗体法（サイレニアス・メルボルン）に付した。

それを再び洗浄し、カッく−グラスに載せた。

実施例２ マウス胚芽細胞 マウス胚芽細胞の一次培養を継代し、いろいろな濃度でＬＩＦを含んでいる培地 に増殖させた。この方法を５．７５および１０容量％ＦＣ３を含んている培地で ３回実施した。こうして、継代細胞が一次培養と同じ方法でＬＩＦに反応するか どうか試験することおよびまたいろいろな増殖条件下でのＬＩＦへの反応を調べ ることが可能てあった。

第１図は継代マウス細胞がＦｅ２のいくつか細胞濃度でＬＴＦに反応することを 示す。ＬＩＦの最適濃度は、−次培養に対するのと同様に３０単位／ｍ／（１４ ｐｇ／ｍＡ’）である。低い濃度でよりも１０容量％ＦＣ３ａ度でのＬｒＦが大 きな効果があり、これは対照よりも１３倍の増大である。

ヒト胚芽細胞 これらの細胞を供与体ヒト筋から増殖させ、継代細胞を最初のマウス細胞培養に 実施したように７５容量％ＦＣ３を含んでいるＨａｍＦ１２培地に９６ウエル集 積プレートでウェル当り２−３０００細胞で接種した。培地はいろいろな濃度の ＬＩＦを含有した。細胞数を１２日まで時間で数え、結果を第２図に示す。マウ ス細胞によるのと同様に、ＬＩＦによる胚芽細胞の増殖の著しい促進があった。

また、ＬＩＦに見い出された最適濃度は３０単位／ｍｌであった。これはヒト胚 芽細胞がマウス胚芽細胞と同じ方法でＬＩＦと反応することを示す。

以前に、ＴＧＦαがマウス胚芽細胞をも促進することを見い出している。ヒト細 胞を１０ｎｇ／ｍＩ！までの範囲の濃度でこのサイトカインの存在で増殖させた 。第３図はマウス細胞で見い出したのと同様に、ｌｏｇ／ｍｌの最適濃度でのＴ ＧＦαへの早い反応があったことを示す。ＬＩＦの場合と同様に、高濃度は最適 でよりも少い効果しかなかった。マウス細胞と異なって、反応は早く起った。こ れは種の相違または細胞の継代またい（つかの他の未知の因子に依り得る。

ＩｊＦ活性化のＦＣ５濃度の効果。

継代ヒト胚芽細胞を０−２０容量％ＦＣ５の範囲の濃度のＦｅ３を含有している ＨａｍＦ　１２培地に増殖させた。ＦＣ３ａ度のそれぞれで、ＬｒＦを０３０ま たは１００単位／ｍ７で添加した。第４図は０および１容量％ＦＣ５でＬＩＦの 不存在下または存在下で細胞の増殖はないことを示す。ＦＣ８濃度が２容量％で ある場合、ここでもＬＩＦの不存在下で増殖はないが、いくらかの増殖はＬＩＦ の存在で起る。Ｆｅ２の濃度を増すことで、ＬＩＦは増大した増殖をもたらし、 先に示したように、３０単位／ｍｉ’のＬＩＦは全ＦＣ８ａ度で１００単位／ｍ ｌよりもさらに効果的である。ＬＩＦによる増殖の最適の促進が１５容量％ＦＣ ３で起ることを見い出した。

イン　ビボ胚芽細胞移入。

マウスにＥＤＬ筋当り１−１．５Ｘ１０’細胞の割合で、実施例１に記載のよう にＬＩＦの存在下でマウスかまたはヒト胚芽細胞培養を注入した。これらを殺し 、筋を４〜６週後免疫細胞化学的に調製した。第５Ａ図は（：５７−ＢＬ−１０ シストロフィン陽性対照マウス株のＥＤＬ筋にシストロフィンの存在を示す。他 の研究者が記載したように（バートリソンら　ネーチャー、第３３７巻、１７６ −１７９頁、１９８９年）シストロフィンは筋線維綱膜の表面の下にある。ｍｄ ｘンストロフィン陰性筋を第５Ｂ図に示す。免疫反応は明らかでない。

第５Ｃ図はヒト胚芽細胞を６週早く注入したｍｄｘマウスからのＥＤＬ筋切片を 示す。融合が起っていることは線維の筋鞘にあったシストロフィン陽性パッチか ら見ることができる。陽性融合をマウス胚芽細胞をＥＤＬ筋に注入した場合に見 い出した。

胚芽細胞に対するＬＩＦレセプター マウス筋芽胚芽をカバーグラス上に増殖させ、フィブロネクチンで調製して、確 実に充分な付着をさせた。培養の８日後、それらに非標識のＬＩＦの不存在下お よび１０００培過剰の存在下で１２５Ｉ−標識したＬｒＦを作用させた。第６Ａ 図はＬＩＦレセプターが胚芽細胞に対して存在することを示すが、第６Ｂ図は低 い非特異性結合を示す。

当業者は、本明細書に記載した本発明が、特に記載したちの以外にも、変形およ び修正が可能なことを理解できる筈である。本発明が全ての上記の変形や修正を 包含することは当然理解されるべきである。本発明はまた個々にまたは全体に本 明細書に言及し、または示した全ての段階、特性、組成物および化合物および上 記の段階または特性の任意の２つまたはそれ以上のおよび全ての組み合せを包含 する。

Ａ、ＬＱＢ、Ｌ３．ＣＩＪＯ；Ｄ、Ｌ３０．Ｅ、Ｌｌｏｏ、（ＵＮＩＴＳ／ＭＬ ）Ａ　、ＴＯ：Ｂ、ＴＱ　３：　Ｉ’：　Ｔｌ、０：Ｄ、　Ｔ３，０：ｆ、　Ｔ Ｔ）（ｎｇ／ｍ１）ＩＬＩＦＩ：　ＯＩＪ／ｍｌ　３０　Ｕ／ｍｌ　７００　Ｌ １７ｍｌ／Ｆｌ：Ｓ　７５’／−ノ　−ＦＣ’Ｓ　大フー／−ノｌＦｒ５７５６ ／、／　／ＦＣ５Ｘ）’／、ノ日 ／Ｌ７Ｆノ・Ｏｕ／ｍｌ　３０　Ｕ／ｍｌ　７００　Ｕ／ｒｎ／国際調査報告 ＮＮＥＸ’ＩＯフ伍り８ロせ仇η℃Ｗ山Ｓ込に１既ＰゴσＯＮ都団ゑ竹工罷扁Ｑ ■ｌ距こにψζ！四φ聾

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. （１）随伴細胞にとって増殖および／または筋芽細胞への分化に充分な時間およ び条件下で刺激に有効な量のＬＩＦと上記の細胞とを接触させることを含む、哺 乳類の随伴細胞の増殖および／または筋芽細胞への分化を刺激する方法。
2. （２）さらに、ＬＩＦとの同時または逐次の組み合せによる一種またはそれ以上 の他のサイトカインの添加を含んでいる。請求項１記載の方法。
3. （３）ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随伴細胞か同じ哺乳類からのもので ある。請求項１または２記載の方法。
4. （４）ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随伴細胞が同一種の哺乳類からのも のである、請求項３記載の方法。
5. （５）ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随伴細胞が異なる哺乳類からのもの である、請求項１または２記載の方法。
6. （６）哺乳類がヒト、マウスまたは家畜動物である、請求項１−５の何れか１項 記載の方法。
7. （７）ＬＩＦおよび／またはサイトカインが組み換えまたは合成法で製造される 、請求項１または２記載の方法。
8. （８）サイトカインがＩＬ−６、ＴＧＦαおよび／またはＦＧＦの一つまたはそ れ以上である、請求項１−７の何れか１項記載の方法。
9. （９）ＬＩＦが約０．１−約１０００単位／ｍｌの濃度で供給され、サイトカイ ンが約１−約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、請求項１−９の何れか１項 記載の方法。
10. （１０）ＬＩＦが約１０−１００単位／ｍｌの濃度で供給される、請求項９記載 の方法。
11. （１１）ＬＩＦが約１０−５０単位／ｍｌの濃度で供給される、請求項１０記載 の方法。
12. （１２）随伴細胞にとって増殖し、および／または筋芽細胞に分化するのに充分 な時間および条件下で増殖および／または分化に有効な量のＬＩＦと哺乳類の随 伴細胞とを接触させることおよび次に多くの部位で筋に上記の筋芽細胞を投与す ることを含む、筋芽細胞導入治療法。
13. （１３）さらにＬＩＦとの同時または逐次の組み合せによる一種またはそれ以上 の他のサイトカインの添加を含んでいる、請求項１２記載の方法。
14. （１４）ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随伴細胞が同じ哺乳類からのもの である、請求項１２または１３記載の方法。
15. （１５）ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随伴細胞が同一種の哺乳類からの ものである、請求項１４記載の方法。
16. （１６）ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随伴細胞か異なる哺乳類からのも のである、請求項１２または１３記載の方法。
17. （１７）哺乳類がヒト、マウスまたは家畜動物である、請求項１２−１６の何れ か１項記載の方法。
18. （１８）ＬＩＦおよび／またはサイトカインが組み換えまたは合成法で製造され る、請求項１２または１３記載の方法。
19. （１９）サイトカインがＩＬ−６、ＴＧＦαおよび／またはＦＧＦの一種または それ以上である、請求項１−１８の何れか１項記載の方法。
20. （２０）ＬＩＦが約０．１−約１０００単位／ｍｌの濃度で供給され、サイトカ インが約１−約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、請求項１２−１９の何れ か１項記載の方法。
21. （２１）ＬＩＦが約１−約１００単位／ｍｌの濃度で供給される、請求項２０記 載の方法。
22. （２２）ＬＩＦが約１０−約５０単位／ｍｌの濃度で供給される請求項２１記載 の方法。
23. （２３）得られる筋芽細胞が筋内注入により投与される、請求項１２−２０の何 れか１項記載の方法。
24. （２４）一種またはそれ以上の他のサイトカインおよび一種またはそれ以上の整 理学的に許容可能な担体および／または希釈剤との組み合せでＬＩＦを含んでい る細胞活性化組成物。
25. （２５）ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随伴細胞が同じ哺乳類からのもの である、請求項２４記載の組成物。
26. （２６）ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随伴細胞が同一種の哺乳類からの ものである、請求項２５記載の組成物。
27. （２７）ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随伴細胞が異なる哺乳類からのも のである、請求項２４記載の組成物。
28. （２８）哺乳類がヒト、マウスまたは家畜動物である、請求項２４−２７の何れ か１項記載の組成物。
29. （２９）ＬＩＦおよび／またはサイトカインが組み換えまたは合成法で製造され る、請求項２４記載の組成物。
30. （３０）ＬＩＦとの組み合せでのサイトカインかＩＬ−６、ＴＧＦαおよび／ま たはＦＧＦの一種またはそれ以上である、請求項２４−２９の何れか１項記載の 組成物。
31. （３１）哺乳類の随伴細胞の増殖および／または筋芽細胞への分化を促進するた めの細胞活性化組成物の製造におけるＬＩＦの用途。
32. （３２）さらにＬＩＦとの同時または逐次の組み合せによる一種またはそれ以上 のサイトカインの用途を含んでいる、請求項３１記載の用途。
33. （３３）哺乳類がヒト、マウスまたは家畜動物である、請求項３１または３２記 載の用途。