JPH05507266A - 同種移植および調和異種移植の拒否反応の阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、同種移植の慢性拒否反応および異種移植の拒否反応の治療に有用な薬 剤に関する。従って、本発明は、宿主中の移植片の生存の増進、あるいは移植損 失の予防に関する。

同種移植は、同種の２つの部分の間の組織の移植である。

２つの異なった種の間の組織の移植である異種移植は、生物学的判定基準によっ て、２つのサブセットに分けられる（Ｃａｌｎｅ、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　 Ｐｒｏｃ、ＩＩ　５５０−５５６　）　ｏこれらの２つのサブセットは、調和異 種移植（ｅｏｎｃＯｒｄａｎｌ　ｘｅａｏｇｒａｌｔＳ）および不調和異種移植 （ｄｉｓｃｏｒｄａｎｊ　ｘｅ＋＋ｏｇｒａｆｔｓ　）である。これらの２つの サブセットは、調和しない種の間で移植された血管化臓器移植片（ａ　ｖ＊５ｃ ｕｌａｒｉｓｅｄ　ｏｒｇａｎ　ｇｒａｆｌ）が超急性拒否反応、即ち、数分あ るいは数時間以内に血管再生を起こすか否かによって区別される。調和種間では 異種移植の超急性拒否反応は起こらない。しかし、移植片は拒否反応を引き起こ し、この拒否反応は、しばしば早められる場合もあるが、数時間あるいは数分間 ではなく数日間にわたって起こる。

これについての確かな証拠はないが、一般に、不調和種間では、超急性拒否反応 は供与種に対して自然に起こる抗体の作用の結果であると考えられている。一方 、調和移植片は、少なくとも調和移植片の崩壊を引き起こすことができる抗体が 存在するわずかな間は生存する。この相違を説明する文献は数多くある。最も精 確なものは、おそら＜ノ為ン７−（Ｈａｍｍｅｒ）の文献（「異種移植（Ｘｅｎ ｏｇｒａｆｊ　）　２５Ｊ（Ｍａｒｋ　Ａ、　Ｈａｒｄｙ、Ｅｄ　）　Ｅｌｓｅ ｖｉｅｒ、　ＡｍｓｔｅＩｄａｍ　（１９８９）　）であろう。ハンマーは、受 容種（宿主）として常にドッグを用いており、腎臓の生存時間が以下のようであ ったことを示している。

ドッグ−ドッグ　１１．４日 ディンゴ（豪州産野犬）−ドッグ　１１．５日つルフードッグ　１９．４日 フォックス−ドッグ　６．５日 ライオン−ドッグ　１０−２４時間 タイガーードッグ　１０−２４時間 キャット−ドッグ　１０−２４時間 ピッグ−ドッグ　１０−３０　分 この結果では、最後の４つの相互作用は不調和異種移植であり、最初の４つは調 和異種移植であろう。ノ１ンマーは、不調和異種移植と調和異種移植との間のこ れらの相違が、それぞれ、交雑ヘム凝集反応抗体（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ 　ｈｅａｍａｇｇｌｕｔｉｏａｔｉｏｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の存在または 不存在に対応すると考えている。

学究的レベルでは、調和種と不調和種との関係を本質的に定義づけるのは困難な ことである。しかしながら、実際問題として、本発明にあたって、異種移植の一 方から他方への超急性拒否反応がない場合には２つの異なった種が調和形式であ るとして取り扱う。従って、本発明にあたって、通常では超急性拒否反応を引き 起こすとしても、それにもかかわらず、例えば、遺伝子操作のような操作を行っ て超急性拒否反応を防ぐことができれば、これらの種は調和しているものとする 。例えば、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９０１０１５７５号には、崩壊加速因子（ｄｅ ｃａｙ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ；　ＤＡＦ）または膜補助因子 タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅｃｏｌａｃｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ；　ＭＣＰ） のような宿主補体ダウンレギュレーター（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　ｃｏｍｐｌｅｍ ｅｎｔ　ｄｏｗｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）を示すために形成転換した潜在的な 異種移植供与動物について開示している。供与動物から提供された臓器は、通常 では不調和的な種とみなされる動物に移植されたでも超急性拒否反応を起こさな い場合がある。従って、本発明にあたって、このような形質転換した供与動物は 、目的とする種と調和的であると考えることができる。

上述した調和関係を有する種として、例えば、ヘアー（野うさぎ）−ラビット、 ハムスター−ラット、およびヒヒーヒト、チンパンジー−ヒトおよびマカックー ヒトなどの非−ヒトと霊長類−ヒトなどがある。

移植片の生存の増進は、異種移植（不調和および調和）および同種移植のいずれ の分野においても留意されてきた。

異種移植片の生存の増進のためになされた最初の提案については、アダチ（Ａｄ ａｃｈｉ）らがラットにおける不調和心臓異種移植片の生存について研究してい る（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｐｒｏｃ、　ＸＩＸ（１）　１１４９１１５２　 （１９８７）　）　。潜在的な生存プロモーターの中では、シクロスポリンＡ　 （ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ　Ａ）　、アスピリンおよびコブラ毒因子が研究され ている。さらに、シクロスポリンＡとコブラ毒因子との組み合わせについても研 究されている。アダナらは、シクロスポリンＡとコブラ毒因子で処理したグルー プとコブラ毒因子のみで処理したグループとの間の平均生存時間には、静的に重 要な相違がなかったと報告している。平均生存時間は、４０〜５０時間であった 。また、ケンブ（Ｋｅｍｐ）らは、ラビットの腎臓のキャットへの異種移植の研 究において、様々な潜在的な不調和異種移植片の生存プロモーターについて研究 している（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、Ｐｒｏｃ、ＸＩＸ（６）　４４７１−４４７ ４　（１９８７）　）。

生存プロモーターの候補としては、キャプトブリル（ｃａｐｊｏｐｒｉｌ　）　 、エナラプリル（ｅｎａｌａｐｒｉｌ　）　、ニフエディピン（ｎｉｆｅｄｉｐ ｉｎｅ）　、プロスタサイクリン（ｐｒｏｇｔａｃｙｃｌｉｎ）、クロモリンナ トリウム、アザチオプリン／コルチコステロイドの組み合わせ、シクロスポリン Ａ１およびコブラ毒因子などがある。「７日間まで移植片の生存を延長する顕著 な効果を有する」と著者が述べているコブラ毒因子を除いて、これらの候補の薬 剤のいずれによっても超急性拒否反応を防ぐことができなかった。

また、調和異種移植片の拒否反応は、ハープイー（Ｂａｒｄｙ）らによって研究 され（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　３３Ｄ）　２３７−２４２　（２９８ ７＞）　、彼らは、主にＴ細胞仲介拒否反応（Ｔ−ｃｅｌｌ−＋ｌ１ｅｄｉａｔ ｅｄ　ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ　）に対して行われている療法である、抗リンパ球グ ロブリンと組み合わせたパラジウム−１０９−へマドモルフィリンによる選択リ ンパ系照射（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｌｙｍｐｈｏｉｄ　１ｒｒａｄｉａｔｉｏｎ 　；　Ｓ　Ｌ　Ｉ　）の効果を調べている。

平均生存時間は、平均２．９日間生存した未処理比較対照と比べて、約１２．５ 日であった。ホーマン（Ｈｏｍａｎ　）らは、調和異種移植片の生存を増進させ るシクロスポリンＡの効果について研究した（Ｔｒａｎｓｐｌａｌａｔｉｏｎ　 ３１０）　１６４−１６６　（１９８１））。最も良い移植片の生存は、未処理 比較対照と比べて、２１日間であった。マンデン（Ｍｏｎｄｅｎ）らは、ハムス ターからラットへの肝臓の異種移植について研究し、この研究により、未処理比 較対照と比べて、シクロスポリンＡが移植片の生存を増進させるような重要な効 果を有しないことがわかった（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　４３（５）　 ７４５−７４６　（１９８７））　、また、ヴアルデベレＣＶａｌｄｅｖｅｒｅ 　）らち、ハムスターからラットへの肝臓の異種移植について研究し、この研究 により、牌摘出と共にシクロスポリンＡを投与した場合に、比較対照と比べて移 植片の生存時間の延長効果があり、平均３．６日から平均１７．６日まで延びる ことがわかった（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｐｒｏｃ、　ＩＩＸ（１）　１１５ ８−１１５９　（１９８７）　）。

上述したハープイーらのグループと同様に、ネクトル（ＫｎｅｃｈＮｅ）らは、 シクロスポリンＡ療法と共に、調和異種移植の生存の増進に関する全リンパ系照 射（ｔｏｔａｌ　Ｉｙｍｐｈｏｉｄｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　；　Ｔ　Ｌ　Ｉ　 ）の効果を研究した（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ。

Ｐｒｏｃ、　ＸＩＸ（１）　１１３７−１１３９　（１９８７））　、彼らは、 ハムスターからラットへの心臓の異種移植では、シクロスポリンＡの投与量を多 くことにより生存期間が著しく延長されたが、時折宿主のみが長期間の移植片生 存作用を有していたと報告している。シクロスポリンＡと組み合わせたＴＬＩで は、さらに著しく移植片の生存を増進させた。

同種移植片の拒否反応に対する従来の療法は、シクロスポリンＡを単独で、ある いはステロイドまたはアザチオプリン組み合わせるか、これらの両方とシクロス ポリンＡを組み合わせて、使用することである。３つの療法の組み合わせは、シ クロスポリンＡを単独で使用する療法と比べて効果がないという見解も幾つかあ る。これらの療法は、急性移植拒否反応の予防および逆転に有効であり、おそら く慢性移植拒否反応の始まりを遅らせ、慢性移植拒否反応が始まった後にはその 反応の逆転に殆ど、あるいは全く効果がないように思われる。

本発明は、調和異種移植片および／または同種移植片の生存をより増進させ、ま たは拒否反応から救出しようとするものである。本発明は、シクロスポリンＡと コブラ毒因子とを組み合わせて、あるいは同様の作用形式を有する化合物を組み 合わせて処理することにより、調和異種移植片本発明の第１の見地によれば、補 体インヒビターと、シクロスポリンＡと同様の活性（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ　 Ａ−１ｉｋｅ　ａｃ！１ｖｉｔｙ　）を有する免疫抑制剤とからなる製剤が提供 される。

従って、本発明による製剤は、少なくとも二つの成分を有する。第１の成分は補 体インヒビターである。補体インヒビターは、補体の活性化を防ぐか、あるいは 補体またはその成分の１つ以上を除去または枯渇させることができる。

補体インヒビターは、補体活性化の古典経路または副経路の両方を阻害すること が好ましい。従って、阻害または除去あるいは枯渇によって、補体インヒビター がＣ３（補体の第３成分）における経路を遮断する役割を果たすことが好ましい 。従って、本発明では、Ｃ３に対する抗体（例えばモノクローナル抗体）を補体 インヒビターとして使用することができる。他の有用な補体インヒビターとして は、可溶性崩壊活性因子（ｓｏｌｕｂｌｅ　ｄｅｃａ７　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ 　ｆａｃｔｏｒ；ＤＡＦ）および可溶性膜補助因子タンパク質（ｓｏｌｕｂｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｃｏｆａｃｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ；　ＭＣＰ）などがある ◇最も好ましい補体インヒビターの一つはコブラ毒因子である。

ヘビ毒は、種々の薬理学的および生化学的活性を有する莫大な数の物質を含む最 も複雑な動物分泌の中にある。補体に影響を及ぼす原理が毒に存在することはほ ぼ１世紀前から周知である。血清補体へのコブラ（Ｎａｊａ　ｎａｉａ　（イン ドコブラ）　ｋａｏｕ＋ｈｉａ）の毒の作用は、ある程度詳細に研究されてきた 。活性因子は、マグネシウムイオンの存在下で血清因子Ｂと組み合わせた１４４ ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質である。因子Ｂは、血清因子りのタンパク 質分解作用によって２つの成分に分解し、ＢｂとＢａを生ずる。ＣｏＦ−Ｂｂ複 合体（ＣｏＦはコブラ毒因子を示す）は、高い活性を有する０３−および０５− 分解酵素またはコンバーターゼである。しかし、正常なＣ３−およびＣ５−コン バーターゼと異なり、ＣｏＦ−Ｂｂは正常な補体調節システムに対する抵抗性を 有する。従って、その作用は、すべての０３が変換して個々の補体の活性が枯渇 するまで続く。Ｃ５の分解によってＣ５ａが放出される。これは、アナフィラキ シ一様の作用を有する。すべてのインドコブラ毒因子がこのＣ５コンバーターゼ 活性を有するのではないが、これは本発明では重要ではないと思われる。補体の 阻害はインドコブラ属（Ｎａｊａ　ｇｅｎｕｓ）の毒に制限されない。

エガートセン（Ｅｇｇｅｒｔｓｅｎ　）らは、コブラ科、クサリヘビ科およびガ ラガラヘビ科のヘビからの毒について研究した（Ｔｏｘｉｃｏｎ　１８８７−９ ６　（１９８０）　）　、研究された２６の毒の中で、２２の毒が正常なヒト補 体の活性を阻害する能力を有している。コブラ毒因子の構造分析により、コブラ 毒因子はコブラＣ３と同等のもの、またはそれを部分的に分解した生成物である ことが示唆される。

本発明では、明らかに毒性の問題があるので、一般に、コブラ毒因子および他の ヘビ毒因子をそのままの形で投与しない。従って、毒性の問題を解決する他の方 法がなければ、一般に、少な（とも部分的に未精製の毒から活性因子を精製する 必要がある。本発明に使用するためには、コブラ毒または他のヘビ毒因子を等質 性に精製する必要はないが、他に何もないとしても明らかに調整の問題により、 実質的に精製された因子の使用を処方し易い。半精製製剤としてのコブラ毒因子 は、シグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ、　Ｐｏｏｌ ｅ、　Ｄｃｒｓｅｔ）のような化学品供給者から得ることができる。シグマ社は 、社内備付けの精製用の未精製のコブラ毒も供給している。未精製のコブラ毒か らコブラ毒因子への調整方法の例は後述する。

本発明では、天然のコブラ毒因子および他のヘビ毒因子の使用に加えて、組換え ＤＮＡ技術によって製造されたものを含む合成因子と同様に、このような因子の 類似物（活性フラグメントを含む）を使用することができる。本発明の使用に適 するようにするＣｏＦの特徴は、正常な分解メカニズムに対する抵抗性がある因 子Ｂｂを有する安定した複合体を形成する能力である。従って、本発明では、こ の特徴を有する他の分子を使用することも好ましい。

本発明による製剤の第２の成分は、シクロスポリンＡと同様の活性を有する免疫 抑制剤である。このような化合物は当業者には周知であり、シクロスポリンＣお よびシクロスポリンＧのようなシクロスポリンＡ以外のシクロスポリンも含まれ る。また、エイコサノイド（ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ　）もｍｙｃｉｎ　）およ びＦ　Ｋ　５０６　（Ｆｕｉｉｓａｗａ）を含む。化合物ＦＫ５０６は、本発明 で使用するのに好ましい化合物の一つであるが、最も好ましいものはシクロスポ リンＡ自体である。シクロスポリンＡは、商標ＳＡＮＤＩＭＵＮとしてサンドズ 社（９ａｎｄｏｘ）から市販されている。

本発明の特に好ましい実施例は、上述したようなそれぞれ最も好ましい化合物で あるコブラ毒因子とシクロスポリンＡからなる製剤である。

他の成分を本発明による製剤中に存在させることもできる。通常、賦形剤が存在 し、他の活性成分の存在は除外されない。各々のカテゴリーの１以上の活性成分 を存在させることができる。

活性成分は、単一の製剤中で一緒に投与される必要はない。従って、本発明の第 ２の見地によれば、同種移植片または異種移植片の生存の増進、または拒否反応 からの救出のために、同時に、または別個に、あるいは引き続いて使用する結合 製剤として使用する生成物であって、補体インヒビターと、シクロスポリンＡと 同様の活性を存する免疫抑制剤とを含む生成物が提供される。

本発明の第３の見地によれば、補体インヒビターの製剤と、シクロスポリンＡと 同様の活性を有する免疫抑制剤の製剤とからなるキットが提供される。

本発明の実施例では、シクロスポリンＡと、シクロスポリンＡと同様の活性を有 する他の免疫抑制剤は、通常、非経口的に投与される。このような場合に、免疫 抑制剤を含む製剤は滅菌されている。しかし、シクロスポリンＡ自体および他の 幾つかの免疫抑制剤は、経口投与することができ、その場合には滅菌は本質的な ものではない。シクロスポリンＡ自体はわずかに水に可溶であるが、実用的には 植物油のような油に溶かすのが好ましい。オリーブ油が実用的であることがわか った。油に溶かす必要があるのは、水に不溶の免疫抑制剤を取り扱う場合だけで あり、免疫抑制剤は生理的に受け入れられる適当な担体に溶かすことができる。

溶解の必要がない場合もある。免疫抑制剤を調整する濃度は、免疫抑制剤自体の 性質および予定の用量に依存するが、一般に臨床医または医師の指導に基づく。

しかし、一般的には、シクロスポリンの製剤の濃度を、非経口投与の場合には１ 〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１〜１０ｍ、ｇ／ｍ１、典型的には約５ｒｎｇ／ｍ ！、経口投与の場合には２５〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば５０〜１００　ｍ　ｇ 　／　ｍ　１、典型的には約１００ｍｇ／ｍｌに調整するのが適当であることが わかった。

コブラ毒因子のような補体インヒビターは、一般に非経口投与され、そのため、 一般に滅菌されている。コブラ毒因子自体は、リン酸塩類バッファー（アジ化物 を除（）、あるいは他の適当な溶媒または担体中に製剤することができる。経口 用製剤を開発することもできる。製剤中の補体インヒビターの濃度は最終的に予 定された用量に依存するが、これは臨床医または医師の監督に基づく。しかし、 ＰＢＳ中のコブラ毒因子の製剤は、その純度に依存して０゜０５ｍｇ／ｍ、１か ら溶解度の限界までの濃度に調整することができる。実用的には、５ｍｇ／ｍ１ 以下、例えば、０゜１〜０．２ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を 有する組成物が有用である。

シクロスポリンＡは本質的に水に不溶であるが、コブラ毒因子は水に可溶である ので、これらの２つの好ましい活性成分は、一般に別個につくられ、実際には別 個に投与される。しかし、これは本質的なものではなく、２つの活性成分の適当 なエマルジョンをつくり、活性成分の種々の組み合わせを共通の溶媒に溶かすか 、あるいは少なくとも共通の担体中に懸濁させることができる。

非経口的注入（注射）に対する比較試験を行った。好ましい注射部位は筋肉であ る。筋肉内注射によって生ずる貯蔵効果のためである。しかし、筋肉内注射が有 利であるとは限らない場合には、ある環境では静脈内注射が適当であり、また、 皮下注射がよい場合もある。状況によっては腹膜内注射も使用することができる 。

本発明の第４の見地によれば、補体インヒビター、およびシクロスポリンＡと同 様の活性を有する免疫抑制剤を、同種移植片または調和異種移植片の生存を増進 、あるいは拒否反応から救出するための試薬の製剤に使用する方法が提供される 。従って、本発明は、宿主中における同種移植片または調和異種移植片の増進、 あるいは拒否反応からの救出方法に適用される。この方法は、移植片受容体また は予定された移植片受容体に、補体インヒビターと、シクロスポリンＡと同様の 活性を有する免疫抑制剤とを投与することからなる。

多くの場合には、移植片の外科的処置を行う前に、本発明に有用な活性成分の一 部またはすべてを予め投与するのが好ましい。また、同種移植に関する本発明の 主な利点は、本発明に有用な活性成分の組み合わせが、慢性拒否反応を防止し、 あるいは、慢性拒否反応（これは、一般に移植後長い年月が経った後に起こる） が始まった後にそれを管理する（即ち拒否反応から救出する）ために有用である ことに留意すべきである。

慢性拒否反応に苦しむ同種移植片受容体、またはその危険性がある同種移植片受 容体は、シクロスポリンＡを有する免疫抑制剤、またはシクロスポリンＡと同様 の活性を有する免疫抑制剤を受け入れ易い。本発明にあたって、このような患者 における慢性移植片拒否反応を処理または防止するためには、補体インヒビター 療法を加える必要があるだけである。本発明の第５の見地によれば、シクロスポ リンＡと同様の活性を有する免疫抑制剤で処理した移植片受容体における同種移 植片または調和異種移植片の生存を増進、あるいはこのような移植片の拒否反応 から救出する試薬の製剤に使用する補体インヒビターが提供される。従って、本 発明は、宿主中における同種移植片または調和異種移植片の増進および／または 拒否反応からの救出方法に適用される。この方法は、シクロスポリンＡと同様の 活性を有する免疫抑制剤で治療した移植片受容体または予定する移植片受容体に 、補体インヒビターを投与することからなる。

シクロスポリンＡと同様の活性を有する免疫抑制剤は、適当に有効かつ毒性のな い程度に投与され、処理される種および移植される臓器と関係する。ヒトの場合 のシクロスポリンＡの耐性の上限は、その腎毒素および受容体の年齢によって決 定される。多くの場合、ヒトの治療には１日当たり２０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇが 安全な上限であるが、他の種はさらに高い耐性を有することができる。シクロス ポリンＡは少ない用量で有効であり、投与できる最低量は単に有効な反応を示す 最低量である。ある場合には、１日当たりユないし２ｍｇ／ｋｇが有効であるこ とがわかった。一般的には、１日当たり５〜ｌＱｍｇ／ｋｇを投与することがで きる。

非経口投与の場合には、シクロスポリンＡは１日置きに投与することができ、そ の場合には用量は２倍である。しかし、経口ルートが好ましく、毎日の投薬量は 生活規則（摂生）の選択による。特に、シクロスポリンＡは、しばしば１日に２ 回以上投与でき、選択的に１日の全用量を５〜１０ｍｇ／ｋｇとすることができ る。シクロスポリンＡと同様の活性を有する他の免疫抑制剤は、有効かつ毒性の ない用量で投与され、その用量は臨床医または医師によって決定される。

コブラ毒因子のような補体インヒビターは、有効に補体活性を阻害する量で投与 され、補体溶血５ｏ（ＣＯｍｐｌｅｍｅ［ＩＩｈａｅｍｏｌｙｓｉｓ５０　；　 ＣＨ２Ｏ）検定法によって決定される。コブラ毒因子の投与の安全な上限は決定 されなかったが、２ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇの用量では毒性があるとは思われない。

コブラ毒因子の最低投薬量は種に依存し、ＣＨ３０検定法によって容易に決定す ることができる。毎日の用量が０．０１から０．１または０．２ｍｇ／ｋｇの場 合がコブラ毒因子に有効であることがわかった。他の補体インヒビターの有効か つ毒性のない投薬量も、当業者によって、例えばＣＨ５０検定法を使用して容易 に決定することができる。

コブラ毒因子はその最初の活性を約６時間維持し、筋肉内投与後に効果を発揮す る。最初の活性が認められれば、その活性は１日以上、例えば２日間持続するの で、コブラ毒因子を毎日投与する必要はない。実際には、コブラ毒因子を１日置 きに投与することが好ましい。その場合には、投与の日の投薬量を２倍にするこ とが好ましい。実用的には、特に好ましい投薬量の摂生は、１日置きに０．４ｍ ｇ／ｋｇを筋肉内投与することである。

シクロスポリンＡまたは他の免疫抑制剤の投与は、一般的に連続的なものである 。コブラ毒因子または他の補体インヒビターの投与は、一般に連続的なものでは ないが、延長することができる。これさえも調和異種移植の治療またはその拒否 反応からの救出に短期間の治療だけが必要な場合には、実用的には本質的なもの ではない。

本発明の第２から第５の見地による好ましい特徴は、必要な変更を加えた第１の 見地に関するものである。

以下の製剤および実施例を参照して、本発明を以下に説明する。実施例は添付図 面に言及している。

図１は、ハムスターの心臓のラットへの異種移植片の生存を示すグラフであり、 移植後の日数に対する生存率をプロットしている。

図２は、ハムスターの心臓のシクロホスファミド処理したラットへの異種移植片 の生存を示すグラフであり、図１に対応するグラフである。

調整 この調整は、未精製のコブラ毒からコブラ毒因子を調整するためのプロトコール を与える。

インドコブラ（Ｎａｊａ　ｎａｊａ　Ｋａｏｕ！ｈｉａ）　（シグマ社、製品番 号Ｖ−９１２５、ロフト番号　１１６Ｆ−０３９８および５８Ｆ−０５６５）の 毒１ｇを、ｐＨ７，５の脱気したリン酸ナトリウムバッファー（０，ＯＩＭ）６ ０ｍｌに溶かし、これをＤＥＡＥセスロース（ＤＥ５２、Ｗｈａｔｍａｎｎ）の ９０ｃｍｘ２６ｍｍ　（内径）のカラムに注入し、同じバッファーで平衡にした 。次に、このカラムを、溶出液のＡ２８０吸光度が０に戻るまで、１時間当たり ４３．０ｍｌの出発バッフｙ　−（ｓｔａｒｔｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　）で溶離 した。次に、出発バッファーおよび限界バッファー（ｌｉｍｉｔ　ｂｕｔｌｅｒ ）（０，５Ｍ塩酸ナトリウムを含むｐＨ７，５の０．０１Ｍリン酸ナトリウム） の勾配が３リツトル＝３リツトルの直線になるように、１時間当たり４０．０ｍ 、１の量で注入し、７．０ｍｌの留分を集めた。この留分の抗補体性を試験し、 正の留分をプールしてＣＸ−１０限外ろ過器で濃縮した。

コブラ毒因子プール全体を、９０ｃｍｘ２６ｍｍ　（内径）の５ｅｐｈａｄｅｘ 　Ｇ２００　（ｆｉｎｅ）カラム（ｐｈａ　ｒｍａｃ　１ａＧＢ　Ｌｉｍｐｅｄ 、　Ｌｏｎｄｏｎ）に注入し、ＰＢＳ　（アジ化合物を含まない）で平衡にし、 １時間当たり３６ｍ１の割合でＰＢＳで溶離した。５ｍｌの留分を集め、抗補体 性について検定した。コブラ毒因子（即ち活性留分）は、特にピークの下行性の 肢（ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ　ｌｉｍｂ　）にプールされ、ＣＸ−１０限外ろ過器 で濃縮され、一定分量に分けて、いつでも使用できるように一２０℃で冷凍保存 した。

上述したコブラ毒因子の抗補体性活性は、以下の方法によって測定することがで きる。２０μｍの留分を、２０μｍの新鮮なヒトの血清とともに３７℃で２０分 間温装した。

次に、５μｌの量を、２％アガロース水溶液５．０ｍｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡを 含む２倍強度ＰＢ８４．５ｍｌ、洗浄したギニアビッグの１０％赤血球０．５ｍ ｌ、および新鮮な正常なヒトの血清からなる試験板内のウェル（ｗｅｌｌｓ　） に加えた。

次に、試験板を＋４℃で一晩中装置した。陽性は放置後の消散のクリアゾーンに よって示される。

例１ この例では、ラットはパンティング（Ｂａｎｄｉｎｇ　）およびキングダム（Ｋ ｉｎｇｄｏｍ　）産のＤＡラットを用い、ハムスターはシリア産のハムスターを 用いている。ヘロン（Ｈｅｒ＋＋ｎ　）の方法（Ａｃｊａ　Ｐａｔｈｏｌ、Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、５ｃａｎｄ、７９３６６−３７２　（１９７１））に従って、 ハムスターの心臓をラットの首に移植した。ヘロンの文献に記載されたカフ（ｃ ｕｆｆ）技術を用いて大動脈を頚動脈に接合した。同様に肺動脈を頚静脈に接合 した。他のすべての心臓の管は結紮した。クランプを除去してから数分後に心臓 が鼓動し始めた。次に、移植した心臓を覆うように皮膚を閉じ、外部からの触診 法により毎日観察した。

心臓の移植片の生存データは、図１の線１で示している。

移植片の生存率の中央値は３日であった。

例２ シクロスポリンＡを１日置きに２０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇの用量で投与したこと を以外は例１と同様の操作を繰り返した。シクロスポリンＡは、オリーブ油中の ２　Ｑ　ｍ　ｇ　／　ｍ　１の製剤として投与し、移植時に最初の用量を与える ように筋肉内注射した。その後、１日置きに注射した。移植片の生存データは図 １に示され、この例の結果は線２で示されている。

移植片の生存率の中央値は３日であった。

例３ １日置きに０．４ｍｇ／ｋｇの用量でコブラ毒因子を投与したこと以外は例１と 同様の操作を繰り返した。コブラ毒因子は、アジ化合物を含まないＰＢＳ中に０ ．５ｍｇ／ｍ１のコブラ毒因子を含む溶液として投与した。最初の注射は移植時 に筋肉内注射によって行い、その後１日置きに筋肉内注射を行った。移植片の拒 否反応のデータは第１図に示している。この結果は線３で示しており、これは移 植片の生存率の中央値は６日であることを示している。

例４ シクロスポリンＡとコブラ毒因子の両方を宿主に投°与すること以外は例１と同 様の操作を繰り返した。シクロスポリンＡは、１日置きに２０ｍｇ／ｋｇの用量 で投与し、シクロスポリン投与条件は例２と同じにした。コブラ毒因子は例３と 同じ条件で投与した。シクロスポリンＡとコブラ毒因子のいずれも移植時に最初 に投与した。また、移植片の生存データは図に示している。図１の線４に示すよ うに、この例では移植片の拒否反応は観察されなかった。現在、移植片の生存の 中央値は５０日以上経過している。

移植後２８日経過後にコブラ毒因子の投与を中断したこと以外は例４と同様の操 作を繰り返した。移植片の生存の中央値は１００日以上であった。１０３日目ε １０５日目日目匹の動物を犠牲にして移植片の組織学的な試験を行ったところ、 通常の心臓の構造を示した。残ったラットは、鼓動するハムスターの心臓ととも に、これまで５力月以上生存している。

例６　（比較例） 例１に示すプロトコールによって、２０匹のラットにハムスターの心臓を与えた 。これらは例２に示すようなシクロスポリンＡで処理し、さらに移植前日（ｄａ ｙ−１）と移植の２日後に、ＥＮＤＯＸＡＮ　シクロホスファミド（２０ｍｇ／ ｋｇ）を肺動脈内（ｉ、Ｐ、）に与えた（ＥＮＤＯＸＡＮはシクロホスファミド の商品名であり、抗体産出の阻害剤である。）。図２の線５に示すように、ハム スターの心臓は拒否反応を起こした。観測された遅延型拒否反応（遅延は不十分 なシクロホスファミド療法の結果である）は、不適当な免疫抑制プロトコールか ら生ずるタイプの遅延型異種移植拒否反応と似ている。

例７ ５匹のラットを例６と同様に処理し、さらに、７日目（ｄａｙ　７　）から例４ と同様にコブラ毒因子で処理した。コブラ毒因子による処理は１４日間続けた。

２図の線６に示すように、すべての動物は拒否反応から救出された。

図１ 図２ 移植後の日数 要約 同種移植片および調和異種移植片の生存を増進、あるいはこのような移植片を拒 否反応から救出するために、シクロスポリンＡ１シクロスポリンＡと同様の活性 を有する他の化合物、およびコブラ毒因子、あるいは他の補体インヒビターを組 み合わせて使用することができる。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成　４年１０月　 ９日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ９１１００５２２ ２、発明の名称 同種移植および調和異種移植の拒否反応の阻害３、特許出願人 住　所　イギリス国　ロンドン　イージー１ニー　２デイーワイ。

ホルボーン　バイアダクト　２１ 名　称　・イミュトラン　リミテッド 国　籍　イギリス国 １、代理人 住　所　東京都千代田区二番町１１番地９ダイアパレス二番町例えば、国際出願 ＰＣＴ／ＧＢ９０１０１５７５号には、崩壊加速因子（ｄｅｃａｙ　ａｃｃｅｌ ｅｒａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ：　ＤＡＦ）または膜補助因子タンパク質（ｍｅ ｍｂｒａｎｅ　ｃｏｆａｃｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｊｎ：ＭＣＰ）のような宿主補体 ダウンレギュレーター（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｄｏｗｎ 　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）を示すために形成転換した潜在的な異種移植供与動物 について開示している。

供与動物から提供された臓器は、通常では不調和的な種とみなされる動物に移植 されたでも超急性拒否反応を起こさない場合がある。従って、本発明にあたって 、このような形質転換した供与動物は、目的とする種と調和的であると考えるこ とができる。

上述した調和関係を有する種として、例えば、ヘアー（野うさぎ）−ラビット、 ハムスター−ラット、およびヒヒーヒト、チンパンジー−ヒトおよびマカックー ヒトなどの非−ヒトと霊長類−ヒトなどがある。

移植片の生存の増進は、異種移植（不調和および調和）および同種移植のいずれ の分野においても留意されてきた。

異種移植片の生存の増進のためになされた最初の提案については、アダチ（Ａｄ ａｃｈりらがラットにおける不調和心臓異種移植片の生存について研究している （Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｐｒｏｃ、　ＸＩＸ（１）　０４５−１１４８　（ １９８７）　）　、潜在的な生存プロモーターの中では、シクロスポリンＡ　（ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ　Ａ）、アスピリンおよびコブラ毒因子が研究されてい る。

国際調査報告 ”１．”’４”””””””　ＰＣＴ／ＧＢ　９１１００５２２

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．補体インヒビターと、シクロスポリンＡと同様の活性を有する免疫抑制剤と からなる製剤。
2. ２．前記補体インヒビターが、補体活性化の古典経路と副経路の両方を阻害する ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の製剤。
3. ３．前記補体インヒビターが、ＭＣＰ、ＤＡＦまたはＣ３に対する抗体からなる ことを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の製剤。
4. ４．前記補体インヒビターが、Ｂｂ因子と安定な複合体を形成する分子からなり 、この複合体が正常な崩壊メカニズムに抵抗性を有することを特徴とする請求の 範囲第１項に記載の製剤。
5. ５．前記補体インヒビターがコブラ毒因子からなることを特徴とする請求の範囲 第１項または第２項に記載の製剤。
6. ６．前記シクロスポリンＡと同様の活性を有する免疫抑制剤が、シクロスポリン またはエイコサノイドであることを特徴とする請求の範囲第１項から第５項のい ずれかに記載の製剤。
7. ７．前記免疫抑制剤がシクロスポリンＡであることを特徴とする請求の範囲第６ 項に記載の製剤。
8. ８．前記免疫抑制剤がＦＫ５０６であることを特徴とする請求の範囲第６項に記 載の製剤。
9. ９．補体インヒビターと、シクロスポリンＡと同様の活性を有する免疫抑制剤と を含み、同種移植片または調和異種移植片の生存の増進、あるいは拒否反応から の救出のために、同時に、または別個に、あるいは引き続いて使用する結合製剤 として使用する生成物。
10. １０．補体インヒビターの製剤と、シクロスポリンＡと同様の活性を有する免疫 抑制剤の製剤とからなるキット。
11. １１．同種移植片または調和異種移植片の生存を増進、あるいは拒否反応から救 出する試薬の製剤に、補体インヒビターと、シクロスポリンＡと同様の活性を有 する免疫抑制剤とを使用する方法。
12. １２．移植片受容体または予定する移植片受容体に、補体インヒビターと、シク ロスポリンＡと同様の活性を有する免疫抑制剤を投与することからなり、宿主中 の同種移植片または調和異種移植片の生存を増進、あるいはこのような移植片を 拒否反応から救済する方法。
13. １３．シクロスポリンＡと同様の活性を有する免疫抑制剤で処理した移植片受容 体における同種移植片または調和異種移植片の生存を増進、あるいは拒否反応か ら救出する試薬の製剤に使用する補体インヒビター。
14. １４．シクロスポリンＡと同様の活性を有する免疫抑制剤で処理した移植片受容 体または予定する移植片受容体に、補体インヒビターを投与することからなり、 宿主中の同種移植片または調和異種移植片の生存を増進、あるいはこのような移 植片を拒否反応から救出する方法。