JPH05506981A - ガストリン放出ペプチド受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ガストリン放出ペプチド受容体 増殖因子は多数の生理学的および病理学的過程に関与している。哺乳類組織の神 経細胞および神経内分泌細胞において発見される小さいｗＩＩ節ペプチドの数が 次第に増加している。

より最近、動物細胞増殖の調節における神経ペプチドの役割、特に５ｗ１ｓｓ　 ３Ｔ３細胞系における分裂促進ペプチドの作用の証拠が指摘されている。研究さ れた最初の神経ペプチドの１つは、両生類の皮膚から最初に単離されたテトラデ カペプチドであるボンベシンであったＣＡｎａｓｔａｓｉら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎ ｔｉａ　２７　：　１６６−１６７　（１９７１））　、ボンベシンは幾つかの 内因性哺乳類ペプチドと構造的に関連しており、最初に特徴づけられたものはガ ストリン放出ペプチドである。

ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）は、ヒトでは次の配列を有する２７アミノ酸 ペプチドである：　Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌａｕ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｙ−Ｇ 　ｌ　ｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｔｈ　ｒ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｅ　ｕ−Ｔｈｒ−ＬＹｓ　−Ｍｅ 　ｔ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖ ａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ，ｏ　Ｇ　ＲＰは、癌の病原論に おいて自己分泌増殖因子として機能する推定能力のため非常に着目される。特に 、ＧＲＰはヒト小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の増殖を促進することがわかっている。

細胞表面受容体へのＧＲＰ結合は、ホスファチジルイノシチドの加水分解を促進 することによりおよびプロティンキナーゼＣの活性化により、細胞増殖を刺激す ると思われる。ＧＲＰに対する多数の生物学的応答が観察されており、それらと してはＮａ”／Ｈ”対向輸送、細胞内Ｃａ”の可動化、ｃ−ｆｏｓおよびＣ−ｒ ｒｌＹ　Ｃプロトオンコジーンの一過性発現、チロシンキナーゼ活性の誘導、Ｄ ＮＡ合成の増大並びに細胞分裂の促進が挙げられる。

５ＣＬＣの増殖を維持する上でのＧＲＰの役割は、ＧＲＰを不活性化するかまた はその受容体を阻害することによって自己分泌成長周期を中断する効果的な治療 剤を開発できることを暗示する。ＧＲＰの活性部位は５ＣＬＣ膜上の高親和性受 容体に結合するＣ末端領域である。この結合を阻止することにより、５ＣＬＣ増 殖を抑制することができる。これは、ＧＲＰ上の活性部位に結合することで該ペ プチドを不活性化する、ボンベシンに対するモノクローナル抗体を使って既に達 成されているＣ　Ｃｕｔｔ　１ｔｔａら、Ｎａｔｕｒｅ　３１６：８２３−８２ ６　（１９８５））。

受容体へのＧＲＰの結合を阻止し従って５ＣＬＣを治療する他の手段は、受容体 それ自体を阻害することである。これは、ＧＲＰ受容体に結合し且つアンタゴニ ストとして作用する剤を使って達成することができる。ＧＲＰ受容体の場合と同 様に、通常は受容体が一度薬理学的に定義されればアンタゴニストを見つけるこ とができる。可能性のある受容体アンタゴニストの試験は、高度に自動化された アッセイ法の開発とともに一層容易になった。不運にも、それらの系は、精製さ れた活性形態のＧＲＰ受容体を必要とするが、それは容易に獲得できなかった。

この問題は組換え受容体の使用により回避することができる。特定源からの受容 体の再生可能な改良された入手源を提供することと共に、ＧＲＰ受容体反応性薬 剤をスクリーニングする際に組換え受容体を使用することは次の利点を有する： 細胞膜たりの受容体の数が潜在的に多くなり、より大きい試薬の収量およびアッ セイにおけるノイズに対するシグナルの高い比；並びに受容体サブタイプ特異性 （理論的には、より大きな生物学的および病気特異性）を与える。

結合した放射能標識ＧＲＰへのＧＲＰ受容体の架橋を使って、５ＤＳ−ＰＡＧＥ 上でＧＲＰ受容体−リガント接合体を視覚化することができ、そして該受容体の 成る種の他の特徴を推定することができる。Ｒｏｓｅｎｇｕｒｔら、ＰＣＴ／Ｇ Ｂ８８１００２５５゜しかしながら、使用されているこの技術は、受容体の単離 を伴わず、むしろ修飾形態の受容体タンパク質の特徴づけを伴った。不運にも、 より詳細にＧＲＰ受容体の構造的性質を特徴づけるため、および分子レベルでの 作用機序を解明するためには、受容体を精製することが必要である。幾つかの適 用には、受容体の結合活性を維持している活性状態で受容体を精製することが不 可欠である。それらとしては、活性受容体エピトープに対する抗体の作製、リガ ンド結合部位の構造的研究、並びにＧＲＰ結合のアゴニストおよびアンタゴニス トについてのスクリーニングへの精製受容体の利用が挙げられる。

今日まで、はとんどの受容体は活性形態において単離され特徴付けられていない 。これには２つの主な理由がある。第一は、大多数の組織に存在する受容体の量 が微量であること、そして第二は、しばしば受容体はタンパク質の構造を乱し得 る洗浄剤を使って膜から可溶化しなければならないことである。更にそれらの難 点を一層ひどくするのは、成るタンパク質受容体を上手く可溶化する方法が別の タンパク質受容体には好結果でないことがあるという点で、受容体の予想不可能 な性質である。

本発明は、細胞膜からの活性ＧＲＰ受容体の可溶化、溶液中の該受容体の挙動の 特徴づけ、および活性形態での可溶化された受容体の精製に関し、抽出された受 容体は完全なＧＲＰ結合活性を保持している。

特に、本発明は、配列決定可能な品質での可溶化され精製された天然のＧＲＰ受 容体を得、その部分アミノ酸配列を決定し、ＧＲＰ受容体のｃＤＮＡを単離し、 そして該受容体のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を決定することに関 する。

詳しくは、本発明は、宿主細胞中でＧＲＰ受容体をコードするＤＮＡを発現せし め、それによって起源の種の別のタンパク質を完全に含まない、天然のＧＲＰ受 容体のアミノ酸配列を有するＧＲＰ受容体組成物の合成を可能にし、そして更に 新規変異型ＧＲＰ受容体の合成を可能にすることである。

加えて、本発明は、欠陥性ＧＲＰ受容体ＤＮＡまたはｍＲＮＡのハイブリダイゼ ーシコン診断において、および天然源からＧＲＰ受容体をコードするＤＮＡを得 るための、ＧＲＰ受容体またはその断片をコードするＤＮＡの利用に関する。

より詳しくは、本発明は、ＧＲＰ受容体に対して適当な結合親和力を有する化合 物についての薬剤スクリーニングアッセイにおける、組換えＧＲＰ受容体および そのような細胞系からのＧＲＰ受容体および膜の発現を指令するベクターにより 形質転換された細胞系の利用に関する。

更に一層詳しくは、本発明は、ＧＲＰ受容体のタンパク質断片およびそれに向け られた抗体と一緒の組換えＧＲＰ受容体に間する。これは、患者が変更されたレ ベルのガストリン放出ペプチド受容体を有するかどうかを決定する診断アッセイ において有用であろう。ＧＲＰ受容体に対する抗体の検出および／またはＧＲＰ 受容体それ自体の検出に基づくアッセイも、予後診断価値を有するだろう。

更に、本発明は、治療剤として、組換えＧＲＰ受容体またはその断片もしくは誘 導体、例えば該受容体もしくは断片に対する抗体またはスクリーニングアッセイ において定義された特異的受容体アンタゴニストを利用することに関する。

第１図は、ＧＲＰ受容体を可溶化する幾つかの界面活性剤の能力のグラフによる 比較であり、結合活性に対する可溶化の効果を示す。

第２図は、界面活性剤（ＣＨＡＰＳ）濃度の関数としてのＧＲＰ結合活性および ＧＲＰ受容体可溶化のグラフである。

第３図は、可溶性コレステリルエステル安定剤（ＣＨ３）濃度の関数としてのＧ ＲＰ受容体可溶化および活性のグラフである。

第４図は、界面活性剤（ＣＨＡＰＳ）濃度の関数としてのＧＲＰ結合活性のグラ フである。

第５図は、粗可溶性抽出物中のＧＲＰ受容体に架橋結合した”’Ｉ−ＧＲＰの５ ＤＳ−ＰＡＧＥ分析ゲルを示す。

第６図は、精製ＧＲＰ受容体の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の銀染色ゲルを示す。

第７図は、逆相ＨＰＬＣによるＧＲＰ受容体のトリプシン処理断片の分離を示す 。

第８ｒＭは、ＧＲＰ受容体のヌクレオチド配列およびそれの推定アミノ酸配列で ある。完全なＧＲＰ受容体タンパク質および単離したＧＲＰ受容体のトリプシン ペプチドの実験的に決定されたアミノ酸配列は下線が引かれている。推定上の軽 層配列はＩ〜■と表示される。Ｎ−結合グリコシル化の共通配列は箱で囲っであ る。

第９図は、ＧＲＰ受容体の推定アミノ酸配列のヒトロバシー分析を示す。推定上 の軽層配列を番号１〜■で示す。

第１０図は、５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３細胞からのｍＲＮＡのノーザンハイブリダイゼ ーション分析を示す。

第１１図は、ＧＲＰ受容体とサブスタンスに受容体とのアミノ酸配列の比較であ る。

第１２図は、ヒト胎児肺細胞（ＨＦＬ）からのｍＲＮＡのノーザンハイブリダイ ゼーション分析を示す。

第１３図は、ＧＲＰ受容体ｃＤＮＡクローンからの試験管内転写産物を発現する アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞における塩素イオン電流のＧＲ Ｐリガンド依存性誘導を示す。

本発明は、ＧＲＰ受容体を精製しそしてＧＲＰ受容体のトリプシン処理断片のア ミノ酸配列を決定した後に得られたガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体の アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を提供する。

精製したＧＲＰ受容体から得られた部分アミノ酸配列を使ってＤＮＡプローブを 推定し、次いで該ＤＮＡプローブを使って該遺伝子のＧＲＰ受容体ｃＤＮＡ形態 を単離した。幾つかの標準法はＭａｎｉａ目Ｓら、ＭｏＩｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏ ｎｉｎｇ、Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ ｒ、　ＮＹ）またはＦ、　Ｍ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ら、Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｇｒ ｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、 　ＮＹ）に記載されているかまたは参照されている。それらは全て本明細書に参 考として組み込まれる。その手順を大まかに下記に記載する。

５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３細胞から単離したＲＮＡから、λｇｔ１０バクテリオファー ジ中で作製したｃＤＮＡライブラリーを調製した。該ライブラリーをオリゴヌク レオチドで探査する時にｃＤＮＡクローンを単離することに関連する問題を回避 するために、幾つかの変更と独特の技術を使わなければならなかった。特に、該 ライブラリーにおいてＧＲＰ受容体をコードするｃＤＮＡ種を富化することが必 要であった。というのは、末富化のｃＤＮＡライブラリーにおいてはそのような 種が次位の代表物であるためである。最も好ましいコドン用法に基づくヌクレオ チド配列を有するオリゴヌクレオチドプローブをデザインした。ｃＤＮＡライブ ラリーを平板培養し、ｃＤＮＡ挿入断片を含むλファージがそれらのＥ、コリ宿 主を溶菌せしめ、そして各々が個々のｃＤＮＡ挿入断片を含むプラークを形成し た。標識オリゴヌクレオチドプローブを使ってプラークをＧＲＰ受容体ＤＮＡ配 列についてスクリーニングした。ＧＲＰ受容体ｃＤＮＡ種が単離されたが、それ らは完全なＧＲＰ受容体をコードしていなかった。

ポリメラーゼ連鎖反応技術を使って、ＧＲＰ受容体の一部分並びにそれの５′お よび３′隣接領域をコードする追加のｃＤＮＡ種を単離した。次いで遺伝子特異 的プライマー指令ｃＤＮＡクローニングを使って、完全なＧＲＰ受容体翻訳産物 をコードする単一のｃＤＮＡクローンを得た。ここで使用した実際のクローニン グ技術は実施例１２と１３に詳細に記載される。

マウスからＧＲＰ受容体のｃＤＮＡが単離されたら、それを配列決定した。該ヌ クレオチド配列は、ＧＲＰ受容体の一次翻訳産物のアミノ酸配列、即ち、起こり つる翻訳後修飾前のアミノ酸配列を明らかにした。

完全なアミノ酸配列を第８図に示す。本明細書で使用する時、ｒＧＲＰ受容体」 なる用語は、第８図に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチド またはその断片として定義されるだろう。ｒＧＲＰ受容体」なる用語は、また、 マウス以外の種、例えばヒトおよび他の哺乳類のＧＲＰ受容体を包含するように 本明細書で使用されるだろう。

本発明は、第８図のアミノ酸配列と実質的相同性を有するタンパク質またはペプ チドを包含する。ただし、サブスタンスに受容体と実質的に同じであるかまたは それより低い相同性を示すタンパク質またはペプチドを除く。これは第１１ｒＭ に例示される。

相同性は、必要な時はギャップを入れることによって残基の一致を最大にするこ とにより決定される。これは保存性置換を一致と見なした時には変化する。この 定義には、ＧＲＰ受容体配列中の天然の対立遺伝子変異も含まれる。典型的な相 同タンパク質またはペプチドは、第８図のアミノ酸配列と２５−１００％相同性 （ギャップを導入することができる場合）から５０−１００％相同性（保存性置 換が含まれる場合）を有するだろう。幾つかの相同タンパク質またはペプチド、 例えばＧＲＰ受容体サブタイプは、第８図のＧＲＰ受容体と共通な成る種の生物 学的活性を表すだろう。本明細書中で使用する時、「生物学的活性」なる用語は 、ガストリン放出ペプチド結合、天然源からのＧＲＰ受容体に対して生じた抗Ｇ ＲＰ受容体抗体との交差反応性、およびグアニルヌクレオチド調節タンパク質と のカップリングを限定的でなく包含するものとして定義される。

本発明は、生物学的に活性なＧＲＰ受容体ポリペプチドをコードする、ＧＲＰ受 容体またはその任意断片をコードする単離されたＤＮＡの利用を包含する。加え て、本発明は、ＧＲＰ受容体活性を有する生物学的活性タンパク質をコードし且 つ図８に記載のＤＮＡとハイブリダイズすることができる単離されたＤＮＡを包 含する。前記生物学的活性タンパク質は、ＧＲＰ受容体それ自体であることがで き、そして図８に記載のアミノ酸配列を有する。更に本発明は、ＧＲＰ受容体と 相同であるタンパク質をコードしており且つプローブとしてＧＲＰ受容体ｃＤＮ Ａを使って単離されたＤＮＡの用途を包含する。この単離されたＤＮＡは、５′ および３′隣接領域に各々の調節配列を有することができる。

ガストリン放出ペプチド受容体をコードするＤＮＡは、関連のもしくは相同の受 容体をコードする遺伝子、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ種と共に、ＧＲＰ受容体サブ タイプをコードするものおよび異なる種の組織中のＧＲＰ受容体をコードするも のを同定するのに特に有用であろうと予想される。ボンベシン様ペプチドに対し て異なる選択性を有する少なくとも１つのＧＲＰ受容体サブタイプが記載される 。おそらく他のものも存在する。種々のＧＲＰ受容体サブタイプが高度に相同で あると予想される。しかしながら、ＧＲＰ受容体とは一層離れた関連性を有しそ してもはやガストリン放出ペプチドを結合しない受容体タンパク質でさえも、そ れらが充分に相同であれば、ＧＲＰ受容体配列を使うて容易に単離することがで きる。

本発明は、更に、本明細書に記載の単離されたＤＮＡと同一のＤＮＡ配列を有す る組換えＤＮＡ分子に関する。

単離されたＧＲＰ受容体ＤＮＡは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌク レオチド挿入およびヌクレオチド鎖の反転により、容易に修飾することができる 。それらの修飾は、ＧＲＰ受容体、その誘導体またはＧＲＰ受容体活性を有する タンパク質をコードする新規ＤＮＡ配列をもたらす。それらの修飾配列を使って 、変異型ＧＲＰ受容体を作製することまたはＧＲＰ受容体種の発現を増強するこ とができる。そのような変異型ＧＲＰ受容体誘導体としては、ＧＲＰ受容体また はその断片の予め決められた部位特異的突然変異体が挙げられる。変異型ＧＲＰ 受容体は、本明細書では、他の点では上述したようなＧＲＰ受容体の相同性定義 内に入るが、欠失、置換または挿入のいずれによるかにせよ、天然に見つかるＧ ＲＰ受容体のものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドであると定義さ れる。特に、部位特異的突然変異型ＧＲＰ受容体は、第８図のＧＲＰ受容体と５ ０％より大きい相同性を有し、且つ第８図のＧＲＰ受容体と共通の生物学的活性 を有するものと定義される。

変異部位は予め決められているが、それは必要条件ではない。例えば、特定の残 基位置における変異体の性能を最適化するために、標的コドンにおいてランダム 突然変異誘発を行い、次いで発現されたＧＲＰ受容体変異体を所望の活性につい てスクリーニングすることができる。既知配列を有するＤＮＡ中の予め決められ た部位に置換変異を作製する方法は当業界で公知であり、例えばＭ１３プライマ ー突然変異誘発である。

ＧＲＰ受容体突然変異誘発は、アミノ酸挿入または欠失を作ることにより行うこ とができる。最終構成物に到達するのに置換、欠失、挿入または任意の置換を組 み合わせてもよい。

挿入はアミノまたはカルボキシ末端融合を含む。ＤＮＡ中の変異は、読み枠の外 側のコード配列中に存在してはならず、そして好ましくは、ハイブリダイズして ループまたはヘアピンといった二次ｍＲＮＡ構造を生成することができる相補的 領域を造らないだろう。

ＧＲＰ受容体またはその断片をコードするＤＮＡは、化学合成により、ｃＤＮＡ ライブラリーのスクリーニングにより、または広範な様々な細胞系もしくは組織 試料から調製したゲノムライブラリーのスクリーニングにより、得ることができ る。

このＤＮＡは、全長受容体または該受容体の断片の合成のため（これは次いで例 えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の作製に用いることができる ）：結合研究のため；変更された受容体分子の作製および発現のため：および構 造／融合研究のために、多様な宿主細胞中で発現させることができる。ＧＲＰ受 容体またはその断片は、適当な発現ベクターにより形質転換またはトランスフェ クトされた宿主細胞中で発現せしめることができる。それらの分子は、組換え宿 主に由来するもの以外のタンパク質または細胞汚染物を実質的に含まず、従って 、医薬上許容される担体および／または希釈剤と組み合わせた医薬組成物におい て特に有用である。

該受容体およびその部分は、別のタンパク質との融合物として発現せしめること もできる。

発現ベクターは、通常は適当な宿主細胞中で認識される適当な遺伝的調節要素に 作用可能に連結されたＧＲＰ受容体遺伝子またはその断片を含有する自己複製性 ＤＮＡまたはＲＮＡ構成物である。それらの調節要素は適当な宿主内での発現に 作用することができる。発現を成し遂げるのに必要な調節要素の特定の型は、使 用する最後の宿主細胞に依存するだろう。一般に、遺伝的調節要素は原核プロモ ーター系または真核プロモーター発現調節系であることができ、そのようなもの としては、転写プロモーター、転写の開始を調節する任意のオペレーター、ｍＲ ＮＡ発現レベルを高める転写エンハンサー、適当なリポソーム結合部位をコード する配列、並びに転写および翻訳を終結させる配列が挙げられる。発現ベクター は通常該ベクターを宿主細胞と独立に複製させる複製開始点も含む。

本発明のベクターは、ＧＲＰ受容体をコードするＤＮＡまたは生物的に活性なＧ ＲＰ受容体ポリペプチドをコードするその断片を含む。該ＤＮＡはウィルス性プ ロモーターの調節下にあることができ、そして選択マーカーをコードすることが できる。本発明は、原核または真核宿主中でＧＲＰ受容体をコードする真核ｃＤ ＮＡを発現することができるそのような発現ベクターの利用も包含する。ここで 、該ベクターは宿主と適合性であり、モしてＧＲＰ受容体をコードする真核ＣＤ ＮＡは、該ベクターを含む宿主の増殖が問題のｃＤＮＡを発現するようにベクタ ー中に挿入される。しかしながら、発現ベクターは、常に使用する予定のそれら の宿主細胞中で複製する必要はない。一般に、発現ベクターは、それらの宿主細 胞中での安定な発現のためまたは細胞あたりの所望の遺伝子のコピー数を大きく 増やす増幅のためにデザインされる。

しかしながら、常に発現ベクターが宿主細胞中で増殖することを要求する必要は ない。宿主細胞により認識される複製開始点を含まないベクターを使って様々な 宿主中でＧＲＰ受容体またはその断片の一時的発現を行うことが可能である。組 換えによって宿主ＤＮＡ中へのＧＲＰ受容体またはその断片の組み込みを引き起 こすベクターを用いることも可能である。

ベクターは、プラスミド、ウィルス、ノくクテリオファージ、組み込み可能なり ＮＡ断片、および宿主のゲノム中へのＤＮＡ断片の組み込みが可能である他のビ ヒクルを含んで成る。

発現ベクターは、作用可能に連結された遺伝子の発現を行う遺伝的調節配列を含 む特殊化されたベクターである。プラスミドが最もよく使われているベクターの 形態であるが、同等な機能を供給しそして当業界で既知であるかまたは既知にな る他のあらゆる形態のベクターも本明細書中での使用に適当である。

形質転換された細胞は、組換えＤＮＡ技術を使って作製されたＧＲＰ受容体ベク ターにより形質転換またはトランスフェクトされている細胞、好ましくは哺乳類 細胞である。形質転換された宿主細胞は普通ＧＲＰ受容体またはその断片を発現 するが、そのＤＮＡのクローニング、増幅および操作の目的ではＧＲＰ受容体を 発現する必要はない。本発明は更に、栄養培地中で形質転換細胞を培養し、かく してＧＲＰ受容体が培養物中に蓄積するのを可能にすることに関する。ＧＲＰ受 容体をまず培養物からそして次には培地から回収すること本発明の目的上、ＤＮ Ａ配列は互いに機能的に関連する時それらは作用可能に連結される。例えば、ポ リペプチドがプレタンパク質として発現されるかまたは膜への該ポリペプチドの 局在化もしくは該ポリペプチドの分泌に関係するならば、プレ配列または分泌リ ーダーのＤＮＡが該ポリペプチドに作用可能に連結される。ポリペプチドの転写 を調節する場合、プロモーターがコード配列に作用可能に連結される。翻訳を可 能にするようにコード配列が置かれる場合、リポソーム結合部位がコード配列に 作用可能に連結される。一般に、作用可能に連結されるとは、連続しており且つ 読み枠内であることを意味する。しかしながら、成る遺伝的要素例えばリプレッ サー遺伝子は連続的には連結されないが、発現を調節するオペレーター配列に結 合している。

適当な宿主としては、原核生物、下等真核生物および酵母または高等真核生物が 挙げられる。原核生物としては、グラム陰性およびグラム陽性生物、例えばＥ、 コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）およびＢ、サブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げら れる。下等真核生物としては、酵母、例えばＳ、セレビシェ−（Ｓ、ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）並びにタマホコリカビ（Ｄｉ　ｃ　 ｔｙｏｓ　ｔｅ　１　ｉｕｍ）といった種が挙げられる。高等真核生物としては 、昆虫細胞のような非哺乳類起源と、ヒト、霊長類およびげつ歯頚のような哺乳 類起源の両方の動物細胞からの確立された組織培養細胞系が挙げられる。

原核宿主−ベクター系は、多数の様々な種のための広範なベクターを含む。本明 細書で使用する時、Ｅ、コリとそのベクターなる語は、他の原核生物用の同等な ベクターを包含するように包括的に用いられるだろう。ＤＮＡを増幅させるため の代表的なベクターはｐＢＲ３２２または任意のその誘導体である。ＧＲＰ受容 体またはその断片を発現せしめるのに使われるベクターとしては、ｌａｃプロモ ーターを含むもの（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーターを含むもの（ｐＢＲ ３２２−ｔｒｐ）：　Ｉｐｐプロモーターを含むもの（ｐＩＮシリーズ）；λ− ｐＰまたはｐＲプロモーターを含むもの（ｐＯＴｓ）；またはｐｔａｃといった ノ翫イブリッドプロモーターを含むもの（ｐＤＲ５４０）といったベクターが挙 げられるがそれに限定されない。Ｂｒｏｓｉｕｓら、“ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶ ｅｃｔｏｒｓ　Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　Ｌａｍｂｄａ−、ｔｒｐ−、１ａｃ−、ａ ｎｄ　Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄＰｒｏｍｏｔｅｒｓ”、　Ｖｅｃｔｏｒｓ：　Ａ 　５ｕｒｖｅｙ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ　 ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｕｓｅｓ　（Ｒａｙｍｏｎｄ　Ｌ、　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ およびＤａｖｉｄ　Ｔ、　Ｄｅｎｈａｒｄｔ編）中、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ 、　Ｂｏｓｔｏｎ、　１９８８゜１０章、　２０５−２３６を参照のこと。

酵母およびタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌ　ｉｕｍ）といった下等真核 生物を、ＧＲＰ受容体含有ベクターを使って形質転換せしめることができる。本 発明の目的上、多数の他の株および種も利用できるけれども、最もよく使われる 下等真核宿主はパン酵母のサツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、それは下等真核生物を包括的に表す のに用いられるだろう。酵母ベクターは、複製開始点（組み込み型のものでない 限り）、選択遺伝子、プロモーター、ＧＲＰ受容体またはその断片をコードする ＤＮＡ、翻訳終結、ポリアデニル化および転写終結のための配列から成る。適当 な酵母用発現ベクターは、３−ホスホグリセレートキナーゼのような構成的プロ モーターおよび種々の他の解糖酵素遺伝子プロモーターまたはアルコールデヒド ロゲナーゼ２プロモーターもしくはメタロチオネインプロモーターのような誘導 性プロモーターを含む。適当なベクターは、次の型の誘導体を含む二自己複製性 低コピー数型（例えばＹＲｐシリーズ）；自己複製性高コピー数型（例えばＹＥ ｐシリーズ）：組み込み型（例えばＹＩｐシリーズ）、またはミニクロモソーム 型（例えばＹＣｐシリーズ）。

高等真核生物組織培養細胞は、機能的に活性なＧＲＰ受容体タンパク質の発現に 好ましい宿主細胞である。理論的には、無を推動物源からであろうとを推動物源 からであろうと任意の真核生物組織培養細胞系が利用できる。しかしながら哺乳 類細胞が好ましい。そのような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよ び増殖は日常の作業になっている。有用な細胞系の例としては、ＨａＬａ細胞、 チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、子ラット腎臓（ＢＲＫ）細胞系 、昆虫細胞系およびサル（ＣＯ５）細胞系が挙げられる。そのような細胞系のた めの発現ベクターは、通常、複製開始点、プロモーター、リポソーム結合部位、 ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡを使用する場合）、ポリアデニル化部位お よび転写終結部位を含む。それらのベクターは通常は選択遺伝子または増幅遺伝 子も含有する。適当な発現ベクターは、アデノウィルス、５ｖ４０、バルボウイ ルス、ワクシニアウィルスまたはシトメガロウイルスのような起源に由来するプ ロモーターを担持しているプラスミド、ウィルスまたはレトロウィルスであるこ とができる。適当な発現ベクターの代表例としては、ｐ　ＣＤＮＡ　１　；　ｐ 　ＣＤ　（Ｏｋａｙａｍａ　ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．５：１１３６− １１４２．１９８５）；　ｐＭＣ１ｎｅ　ｏ　Ｐｏ　１　ｙＡ（Ｔｈｏｍａｓら 、Ｃｅ１ｌ　５１：５０３−５１２．１９８７）　；およびｐＡＣ３７３または ｐＡＣ６１０といったバクロウィルスベクターが挙げられる。

ＧＲＰ受容体は、下記に概略される方法により、活性の低下を伴わずに活性形態 において膜から可溶化しそして精製することができる。ＧＲＰ受容体の源は、組 換えＧＲＰ受容体を発現する真核または原核宿主であることができ、例えば上記 のものである。源はマウス５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞のような細胞系である こともできるが、他の哺乳類細胞系も本発明に含まれる。好ましい細胞系はヒト である。

安定剤および洗浄剤を使ってＧＲＰ受容体を含む膜から活性なＧＲＰ受容体を可 溶化した。安定剤は好ましくは可溶性コレステリルエステルである。特に良好な 結果はコレステリルヘミスクシネート（ＣＨ３）を使って得られた。洗浄剤は非 イオン性、両イオン性等であることができる。特に良好な結果は両イオン性洗浄 剤３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホ ネート（ＣＨＡＰＳ）を使って得られた。

ＧＲＰ受容体を含む細胞膜は、培養されたＧＲＰ受容体含有細胞系、例えば５ｗ １ｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞系を溶解し、次いで遠心することにより調製される。

得られたベレットは再懸濁により洗浄され再度遠心される。

上記および実施例１に記載のようにして適当な細胞系から一旦膜が得られたら、 タンパク質の最終濃度が調整される。

適当な最終タンパク質濃度は約１５ｍｇ／ｍｌである。

次いで、膜はＧＲＰ受容体の可溶化前に膜洗浄される。膜は緩衝液およびＮａＣ １で２回洗浄され、次いで可溶化緩衝液で洗浄され、そして最後に調整されたタ ンパク質濃度において可溶化緩衝液中に懸濁される。最初の２回の洗浄用の適当 な緩衝液組成は、５０！１Ｍ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエ タンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７，５のような媒質、２ｍＭエチレンジア ミン四酢酸酢酸ＤＴＡ）のようなキレート化剤、およびプロテアーゼ阻害剤を含 んで成る。適当なＮａＣ１濃度は１．０Ｍである。洗浄用と懸濁用の両方の可溶 化緩衝液は、典型的には５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５，２ｍＭ　ＥＤＴＡ 、１＋＋Ｍ（エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）〕西酢酸（ＥＧＴＡ）の ような別のキレート化剤、１００ｍＭ　ＮａＣ１およびプロテアーゼ阻害剤から 成ることができる。タンパク質濃度は、例えば約７ｍｇ／ｎ＋１に調整される。

この膜洗浄段階は２倍の精製を提供する。２Ｍ尿素、高ｐＨ緩衝液（ｐＨ１０） またはＫｌのようなカオトロピック塩で膜を洗浄することによって同様な結果を 達成することもできる。この操作は、抽出物中のＧＲＰ受容体の安定性も向上さ せる。該緩衝液中の他の構成成分としては、例えばショ糖を挙げることができ、 そして適当なプロテアーゼ阻害剤としては、限定的でなくアプロチニン、ロイペ プチン、ペプスタチン、バシトリンおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド （ＰＭＳＦ）が挙げられる。

次いで一定の最終洗浄剤濃度を与えるように界面活性剤（ＣＨＡＰＳ）と可溶性 コレステリルエステル安定剤（ＣＨ３）との混合物がゆっくりと膜懸濁液に添加 される。界面活性剤対可溶性コレステリルエステルの重量比は、約２００＝１〜 ５：２の範囲内、好ましくは約１０：１であることができる。あるいは、界面活 性剤が膜懸濁液に添加され、次いで可溶性コレステリルエステルが添加される。

その場合には、最初は１００％界面活性剤が存在し、そして洗浄剤対エステルの 重量比が約２００：１〜５：２の範囲内、好ましくは約１ｏａｆになるまで、可 溶性コレステリルエステルが添加される。ＧＲＰ受容体の可溶化のためには、界 面活性剤の濃度が０．４〜３．０％（Ｗ／Ｖ）であるべきであり、そして最適に はほぼ１５ｎ＋ｇ／ｍｌの膜濃度（膜洗浄段階の前）に対して約０゜７５％（Ｗ ／Ｖ）に設定される。同様に、可溶性コレステリルエステルの濃度は約０．００ １５％〜１．２％（Ｗ　／　Ｖ　）の範囲内である。同様に、はぼ１５ｍｇ／ｍ ｌの膜濃度に対して可溶性コレステリルエステルの濃度は好ましくは約０．０７ ５％（ｗ／ｖ）である。

次いで抽出物は約０℃〜３７°Ｃの範囲内の温度、典型的には２１°Ｃのような 室温でインキュベートされ、次いで０〜２１°Ｃ１典型的には４℃に冷却され、 そして可溶化された受容体を含む抽出物（即ち可溶性抽出物）を得るのに必要と される容積に応じて、標準的遠心機中で高速、好ましくは約１００．０００％ｇ において適当な時間不溶性物質が遠心分離される。

高界面活性剤濃度（０，４〜３．０％）では、該受容体は活性でない。しかしな がら、緩衝液で希釈すると、該受容体は再活性化される。安定剤として働く可溶 性コレステリルエステルの存在は、該受容体が低界面活性剤濃度で再活性化する のに必要である。可溶化された活性ＧＲＰ受容体を使った結合活性を示すアッセ イのためには、懸濁液中の洗浄剤の最終濃度が約０．０２５〜０．２％（Ｗ／Ｖ ）の範囲内に希釈されるべきである。界面活性剤対可溶性コレステリルエステル の重量比は約２００：１〜５：２の範囲内、好ましくは約１０：Ｉに維持される 。従って、可溶性コレステリルエステルの適当な範囲は約０．０００１２５％〜 約０．０８％（ｗ／ｖ）である。

好ましいアッセイ濃度は０．０７５％（Ｗ／Ｖ）界面活性剤および約０．　ＯＯ ７５％（Ｗ／Ｖ）可溶性コレステリルエステルである。

活性形態の可溶化された受容体は次いで精製され、汚染タンパク質が除去される 。ＧＲＰ受容体の精製は、上述した可溶化操作の後に、次の段階を含む多段階法 を伴う。

（１）ポリエチレングリコール沈澱。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加 により可溶性抽出物がらＧＲＰ受容体を沈澱せしめる。ＰＥＧの添加は好ましく は２０％（Ｗ／Ｖ）の最終濃度を与えるように行われる。次いで沈澱物を遠心に より収集し、そして緩衝液に再懸濁する。緩衝液は典型的には２５ｍＭ　ＨＥＰ ＥＳ、　ｐＨ７，５，２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＣＩ。

２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０７５％（ｗ／　ｖ　）洗浄剤、０．００７５％（Ｗ／ Ｖ）可溶性コレステリルエステルおよびプロテアーゼ阻害剤から成ることができ る。該懸濁液の最終容量は好ましくはもとの可溶性抽出物の２５％である。懸濁 液中に不溶性のままであるタンパク質を遠心により除去する。この段階は２倍の 精製を与え、該受容体の安定性を高める。

（２）小麦胚芽凝集素クロマトグラフィー。可溶性抽出物を、典型的には５０ｍ Ｍ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，２ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．２５％（ｗ／ｖ）洗浄剤、０．０２５％（ｗ／ｖ）コレステリルエステルお よびプロテアーゼ阻害剤から成る緩衝液で平衡化された小麦胚芽凝集素アフィニ ティーカラムに適用する。

該カラムをカラム緩衝液と５ｍＭ　Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−トリアセチルキトトリオ ースで溶出させる。ＧＲＰ受容体を含む画分を”’Ｉ−ＧＲＰ結合アッセイによ り同定する。この段階は、炭水化物を含まないタンパク質を除去することにより ５倍の精製を与える。良好な収率を獲得するため、カラムをキトトリオースまた はキトビオースで溶出させることが必要である。

界面活性剤濃度を約０．２％界面活性剤および０．０２％可溶性コレステリルエ ステルより高く維持することにより、収率を高めることもできる。

（３）　Ｇ　ＲＰ−アフィニティークロマトグラフィー。小麦胚芽凝集素カラム 溶出液をＧＲＰアフィニティーカラム上で更に分画する。好ましい態様では、該 カラムは２ｍｇペプチド／ｍｌ充填ゲルにおいてビーズ状マトリックスにカップ リングされたヒト　［Ｎ１ｅ１４．２７］　ＧＲＰＩ３−２７ペプチド（ＧＲＰ のＣ末端部分）を有するビーズ状マトリックスを含む。

該カラムを典型的には２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，２５ｍＭＴｒｉｓ 、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０７５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、０．００７５％（ｗ ／ｖ）ＣＨＳおよびプロテアーゼ阻害剤から成る緩衝液で平衡化する。小麦胚芽 凝集素カラム溶出液中の界面活性剤の濃度は、典型的には２５ａ＋Ｍ　ＨＥＰＥ Ｓ。

２５ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ、　ｐＨ７，５，２ｍＭ　ＥＤＴＡおよびプロテアー ゼ阻害剤から成る溶液での希釈により、好ましくは０．０７５％（Ｗ／Ｖ）に調 整される。試料の適用およびカラムの徹底的洗浄後、結合したタンパク質を０． ２　Ｍより高い濃度の塩により溶出せしめる。０．５Ｍ　ＮａＣ１が特に適当で ある。

次いでＧＲＰ受容体を含む画分を””Ｉ−ＧＲＰ結合アッセイにより同定する。

使用するＧＲＰペプチド（［Ｎ１ｅ１４゜２７コ　ＧＲＰＩ３−２７）　は、Ｔ ｒｉｔｏｎ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ。

（Ａｌａｍｅｄａ、　ＣＡ）により製造された耐酸化性の類似体である。

同様に働くであろう他のＧＲＰペプチドおよびマトリックスとしては、限定的で なくＧＲＰＩ−２７，ＧＲＰＩ４−２７および［Ｌｙｓ３］ボンベシンが挙げら れる。しかしながら、収率および溶出条件は変わるであろう。塩による結合した タンパク質の溶出は、受容体結合活性が保存されそして良好な収率が達成される ため重要である。カラムに負荷する試料中の界面活性剤濃度は最適結果にとって 重要である。界面活性剤の適当な範囲は約０．０２５％〜０．２％（Ｗ／Ｖ）で ある。

界面活性剤対安定剤の比も同様に重要であり、２００：１〜５：２、好ましくは １０：１である。

（４）第二のアフィニティーカラム。前記アフィニティーカラムから溶出したＧ ＲＰ受容体含有画分を脱塩し、そしてその試料を第二のＧＲＰアフィニティーカ ラムに適用し、段階（３）に記載したのと同様に溶出せしめる。次いでＧＲＰ受 容体含有画分を結合アッセイにより同定する。この段階における２つの連続アフ ィニティーカラムの使用は、高純度を与えるために必要とされる。

（５）ゲル濾過。これは限定的に純粋な生成物を与える任意段階である。ゲル濾 過段階はプロテアーゼ阻害剤、塩および残余の界面活性剤を受容体から除去する のにも有用である。

一般に、可溶化された、未精製で且つ可溶化された、および精製された本発明の ＧＲＰ受容体は、少なくともＫｏ＝１０ｎＭの親和力でガストリン放出ペプチド を結合する。本発明に係るマウス５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞系からのＧＲＰ 受容体は、次の特徴を有することが発見された。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で約７０〜１００キロダルトンの見かけ分子量を有する幅広 いバンドとして泳動する：ボンベシン型のポリペプチドと選択的に結合する；約 １０−１００９ＭのＫＤ値を有する：カップリングしたＧプロティンを含まない ；Ｎ結合した炭水化物を含む：脱グリコジル化すると、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で３ ６±５キロダルトンの見かけ分子量を有する；そしてＮ末端付近に−Ｌｅｕ−Ａ ｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔ／ａ　１−Ａ５ｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−３ｅｒ −の部分アミノ酸配列を有する。

配列が既知となった今、ＧＲＰ受容体またはそのいずれかの断片はペプチドを合 成する常法により調製することができる。それらの方法は、Ｊｏｈｎ　Ｍ、　Ｓ ｔｅｗａｒｔおよびＪａｎｉｓ　Ｄ。

Ｙｏｕｎｇ、５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　 （Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、　１９ ８４）　；　Ｍ、　ＢｏｎｄａｎｓｚｋｙおよびＡ、　Ｂｏｎｄａに記載されて いるような方法を包含する。それらの全てが本明細書中に参考として含まれる。

例えば、アジド法、酸クロリド法、酸無水物法、混合酸無水物法、活性エステル 法（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス テルまたはシアノメチルエステル）、カルボジイミダゾール法、酸化−還元法、 またはＤＣＣ／添加剤法を使用することができる。固相および溶液相合成の両方 が前記方法に適用可能である。

ＧＲＰ受容体は、ペプチド合成において典型的に使用されるような上記方法に従 って、通常はアミノ酸を末端アミノ酸に１つずつ順番に縮合させることを含んで 成るいわゆる段階法により、またはペプチド断片を末端アミノ酸にカップリング させることにより、適当に調製される。正しくない位置におけるカップリングを 防ぐために、カップリング反応で使われないアミノ基は保護しなければならない 。

固相合成を採用する場合、Ｃ末端アミノ酸がそのカルボキシル基を通して不溶性 担体または支持体に結合される。不溶性担体はそれが反応性カルボキシル基への 結合能力を有する限り特に限定されない。そのような不溶性担体の例としては、 ハロメチル樹脂、例えばクロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂、ヒドロキシ メチル樹脂、フェノール樹脂、ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニルヒドラジド 化樹脂等が挙げられる。

アミノ基が保護されたアミノ酸は、その活性化カルボキシル基と予め形成された ペプチドまたは鎖の反応性アミノ基との縮合を介して順次結合され、段階的にペ プチドが合成される。完全な配列が合成された後、不溶性担体からペプチドが切 断され、ペプチドが得られる。この面相アプローチは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら によりＪ、　Ａａ＋、　Ｃｈｅｔ　Ｓｏｃ、　８５：２１４９−２１５６　（１ ９６３）中に一般的に記載されている。この記載は参考として本明細書中に組み 込まれる。

ペプチド分離の手段、例えば抽出、沈澱、電気泳動および様々な形態のクロマト グラフィー等により、調製した受容体およびその断片を反応混合物から単離およ び精製することができる。本発明の受容体は、それの所望の用途に依存して様々 な純度において得ることができる。本明細書中に開示されるタンパク質精製技術 を使ってまたは免疫吸着剤アフィニティークロマトグラフィーにおいて本明細書 に記載される抗体を使って、精製を行うことができる。この免疫吸着剤アフィニ ティークロマトグラフィーは、まず抗体を固体支持体に結合せしめ、次いで結合 した抗体を、小細胞肺癌細胞の可溶化溶解物、ＧＲＰ受容体を発現する他の細胞 の溶解物、または後述のＤＮＡ技術の結果としてＧＲＰ受容体を産生する細胞の 溶解物もしくは上清と接舷せしめることにより行われる。

本明細書に含まれるＧＲＰ受容体の誘導体は、アミノ酸配列変異体、グリコジル 化変異体及び他の化学成分との共有又は凝集接合体を包含する。共有誘導体は、 ＧＲＰ受容体アミノ酸側鎖に又はＮ−又はＣ−末端で見出される基に官能基を、 当業界において良く知られている手段により結合することによって調製され得る 。これらの誘導体は、カルボキシル末端又はカルボキシル側鎖を含む残基の脂肪 族エステル又はアミド、ヒドロキシル基を含む残基のＯ−アシル誘導体、及びア ミノ末端アミノ酸又はアミノ基含有残基、たとえばリシン又はアルギニンのＮ− アシル誘導体を包含するが、但しこれだけには限定されない。アシル基は、アル キル成分、たとえば０３〜Ｃ１８の直鎖アルキルの基から選択され、それによっ て、アルカノイルアロイル種を形成する。

主要誘導体は、ポリペプチドの他のタンパク質とＧＲＰ受容体又はそのフラグメ ントとの共有接合体である。これらの誘導体は、組換え培養、たとえばＣ−末端 融合において、又は反応性側基を通してのタンパク質の架橋において有用な当業 界において知られている物質の使用により合成され得る。

架橋剤との好ましいＧＲＰ誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭水化物成分及びシ スティン残基で存在する。

本発明はまた、アミノ酸配列又はグリコジル化における変化よりも他のＧＲＰ受 容体の誘導体の使用にも関する。そのような誘導体は、化学成分との共有又は凝 集会合により特徴づけられる。それらの誘導体は一般的に次の３種に分類される ＝（１）塩、（２）側鎖及び末端残基共有変性及び（３）たとえば細胞膜との吸 着複合体。そのような共有又は凝集誘導体は、免疫原として、ガストリン開放ペ プチドのアフィニティー精製のためのイムノアッセイ又は精製方法における試薬 又は他の結合リガンドとして有用である。たとえば、ＧＲＰ受容体は、抗−ＧＲ Ｐ受容体抗体又はガストリン放出ペプチドのアッセイ又は精製に使用するために 、当業界において良く知られた方法により、固体支持体、たとえば臭化シアン− 活性化セファロースに共有結合することによって固定され、又はグルタルアルデ ヒド架橋により又はそれによらないでポリオレフィン表面上に吸着され得る。Ｇ ＲＰ受容体はまた、たとえばクロラミンＴ方法により放射性ヨウ素化され、診断 アッセイに使用するために、稀土類キレートに共有結合され又は他の螢光成分に 接合された検出可能基によりラベルされ得る。

本発明の溶解されたＧＲＰ受容体は、受容体又はそのフラグメントに対して特異 的な抗血清又は抗体の産生のための免疫原として使用され得る。精製された受容 体は、ＧＲＰ受容体を含む種々の形の不純調製物による免疫化により調製される モノクローナル抗体をスクリーンするために使用され得る。

精製された受容体はまた、高レベルのガストリン放出ペプチド受容体又はＧＲＰ 受容体を含む細胞フラグメントの存在に応答して生成されるいづれかの抗体を検 出するための試薬としても使用され得る。さらに、ＧＲＰ受容体フラグメントは また、本発明の抗体を産生ずるための免疫原としても作用することができる。た とえば、本発明は、第８図に示されるアミノ酸配列への結合親和性を有し又はそ れに対して生がしめられた抗体又はそのフラグメントに関する。特に、本発明は 、二層脂質の外側に存在すると予測される特異的フラグメントへの結合親和性を 有し又はそれに対して生ぜしめられた抗体に関する。これらの７ラグメントは、 Ｎ−末端近くの次のＩＯ望のアミノ酸配列（残基９〜１８）を含む：に示される ように、本発明は、膜の細胞外側上に存在することが予測されるＧＲＰ受容体の フラグメント：残基ｌ〜３９；残基９８〜１１５；残基１７６〜２０９：及び残 基２８８〜３００；及び膜の細胞内側上に存在することが予測されるその受容体 の次の部分：残基６４〜７７；残基１３８〜１５７；残基２３６〜２６６；及び 残基３３０〜３８５を包含する。

抗体は、その天然に存在する形及びその組換え体形で、ＧＲＰ受容体及びそのフ ラグメントに対して生ぜしめられ得る。

さらに、抗体は、その活性形及びその不活性形の両者の形でＧＲＰ受容体に対し て生ぜしめられ、その差異は、活性受容体に対する抗体が、活性受容体において のみ存在するエピトープをたぶんより認識することである。

ＧＲＰ受容体の予定されたフラグメントに対する抗体は、免疫原性タンパク質と フラグメントとの接合体による動物の免疫化により生ぜしめられ得る。モノクロ ーナル抗体は、所望する抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、 正常な又は欠損ＧＲＰに対する結合についてスクリーンされ、又は作用性又は拮 抗性ＧＲＰ受容体活性についてスクリーンされ得る。

本発明の抗体は有意な治療価値を有することができる。それらは、ＧＲＰ受容体 に結合し、そして受容体へのリガンド結合を阻害し、又は生物学的応答を誘発す るガストリン放出ペプチドの能力を阻害する可能性ある拮抗剤であり得る。それ らはまた、非中和抗体としても有用であり、そして抗体が受容体に結合される場 合、細胞自体が殺されるように毒素又は放射性核種に結合され得る。さらに、こ れらの抗体は、薬物又は他の治療剤に、直接的又はリンカ−により間接的に接合 され得る。

本発明の抗体はまた、診断のためにも有用である。捕獲又は非中和抗体として、 それらは、リガンド結合を阻害しないでＧＲＰ受容体に結合することができる。

中和抗体として、それらは、競争結合アッセイにおいて有用であり得る。

受容体フラグメントは、免疫原として使用されるべきポリペプチドに融合され又 は共有結合されるように、他の材料、特にポリペプチドに結合され得る。ＧＲＰ 受容体及びそのフラグメントは、種々の免疫原、たとえばキーホール　リンベッ トヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイド、等に融合し、又は共 有結合され得る。ポリクローナル抗血清を調製するための方法の説明のためには 、たとえば、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｈｏｅｂｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄ ｉｖｉｓｉｏｎ　（Ｈａｒｐｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｗ、　１９６９）。

Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ、　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｅｒｏｌｏｇｉ ｃａｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（Ｄｏｖｅｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ、　１９６２）及びＷｉｌｌｉａｍｓなど、２Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｎ＋ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、＊　 １巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ、　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９６７）　 （これらのすべては、引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。典型的 な方法は、抗原による動物の過剰免疫化を包含する。次に、動物の血液を、反復 免疫化の後すぐに集め、モしてγグロブリンを単離する。

多くの場合、種々の哺乳類宿主、たとえばマウス、ゲラ歯動物、霊長類、ヒト等 からモノクローナル抗体を調製することが所望される。そのようなモノクローナ ル抗体を調製する４版）及びこの中の引例、及び特に、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　 Ｍｉｌｓｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５〜４９７　（１９７５）　（モノクローナル抗体 の１つの生成方法を論じる）に見出され得る。簡単に要約すれば、この方法は、 免疫原の動物への注入を包含する。次に、動物は殺され、そして細胞が牌臓から 採取され、次に骨髄腫細胞と融合される。その結集物は、インビトロで再生でき るハイブリッド細胞又は“ハイブリドーマ”である。ハイブリドーマの集団がス クリーンされ、個々のクローンが単離され、個々のクローンは、免疫源に対する １つの抗体種を分泌する。この態様において、得られる個々の抗体種は、免疫原 性物質上に認識される特異的部位に応答して生成される免疫動物からの単一のＢ 細胞の生成物である。

本発明の抗体はまた、受容体を単離することにおいて、アフィニティークロマト グラフィー処理のために使用され得る。

抗体が固体支持体、たとえば粒子、たとえばアガロース、セファロース又は同様 のものに結合されているカラムが調製され、ここで細胞溶解物がそのカラムに通 され、カラムが洗浄され、続いて弱い変性剤の濃度が高められ、それによって、 精製された受容体タンパク質が開放されるであろう。

ＧＲＰ受容体の天然に存在する形及び本発明のＧＲＰ受容体の組換え体形の両者 は、特に、ＧＲＰ受容体に対する結合活性のための化合物をスクリーニングする ことができるキット及びアッセイ方法において特に有用である。アッセイを自動 化するいくつかの方法が、１手当たり１０，０００種の化合物のスクリーニング を可能にするために最近、開発されて来た。適切なアッセイの開発は、多量の精 製された可溶性受容体の活性状態での利用能力により高く促進され得、たとえば 本発明の方法により達成され得る。

ガストリン放出ペプチド受容体への試験化合物の結合親和性を決定するためのキ ットは、典型的には、試験化合物ニラベルされた化合物、たとえばガストリン放 出ペプチド受容体のための既知の結合親和性を有するリガンド又は抗体；ガスト リン放出ペプチド受容体源（天然に存在するか又は組換え体）：及びラベルされ た遊離化合物から結合体を分離するための手段、たとえばガストリン放出ペプチ ド受容体を固定するための固相を含んで成る。

化合物はスクリーンされた後すぐに、ＧＲＰ受容体への適切な結合親和性を有す るものは、それらが作用剤又は拮抗剤のいづれかとして作用するかどうかを決定 するために、当業界において良く知られているようにして、適切な生物学的アッ セイで評価され得る。

本発明は、種々の薬物スクリーニング技法のいづれかで組換えＧＲＰ受容体を用 いることによって化合物をスクリーニングするために特に有用である。ＧＲＰ受 容体反応性薬物のためのスクリーニングにおける組換えＧＲＰ受容体を用いる利 点は、（ａ）特定源からの受容体の改良された再生可能源；（ｂ）アッセイにお ける高いシグナル：ノイズ比を付与する、細胞膜たりの可能性ある多くの数の受 容体：及び（Ｃ）受容体サブタイプ特異性（高い生物学的及び疾病特異性を理論 的に付与する）を包含する。

薬物スクリーニングの１つの方法は、ＧＲＰ受容体を発現する組換えＤＮＡ分子 により安定して形質転換される真核又は原核宿主細胞を利用する。生存又は固定 形のいづれかでのそのような細胞が、標準の受容体／リガンド結合アッセイのた めに使用され得る。競争アッセイは、細胞（ＧＲＰ受容体の源）がＧＲＰ受容体 、たとえば１！５Ｉ−ＧＲＰに対する既知の結合親和性を有するラベルされたリ ガンド、たとえば”’Ｉ−ＧＲＰ、及びＧＲＰ受容体に対する結合親和性が測定 される試験化合物と接触せしめられ、そしてインキュベートされる場合、特に有 用である。次に、結合されたリガンド及び遊離リガンドが、リガンド結合の程度 を評価するために分離される。結合される試験化合物の量は、測定されるラベル されたリガンド結合の量に反比例する。多くの技法のいづれか１種の技法が、リ ガンド結合の程度を評価するために遊離リガンドから結合体を分離するために使 用され得る。この分離段階は、典型的には、フィルターへの付着、続く洗浄、プ ラスチックへの付着、続く洗浄、又は細胞膜の遠心分離のような方法を包含する 。生存細胞はまた、ＧＲＰ受容体介在の機能、たとえば第２メツセンジヤーレベ ル（Ｃａ）、増殖、等に対する薬物の効果をスクリーンするためにも使用され得 る。

もう１つの方法は、ＧＲＰ受容体の源として、形質転換された真核又は原核宿主 細胞からの膜を利用する。これらの細胞は、ＧＲＰ受容体の発現を指図するＤＮ Ａベクターにより安定して形質転換される。実質的には、その膜は、細胞から調 製され、そしていづれかの受容体／リガンド結合アッセイ、たとえば上記の競争 アッセイに使用される。

さらにもう１つのアプローチは、形質転換された真核又は原核宿主細胞からの溶 解されているが精製されていない、又は溶解され且つ精製された受容体を使用す る。これは、高められた特異性、自動化能力及び高い薬物試験処理量の利点を伴 って、真の“分子”結合アッセイを可能にする。

薬物スクリーニングのためのもう１つの技法は、ガストリン放出ペプチド受容体 への適切な結合親和性を有する化合物に高い処理量のスクリーニングを提供する アプローチを包含し、そしてそれは、１９８４年９月１３日に公開されたヨーロ ッパ特許出願８４／　０３５６４（Ｇｅｙｓｅｎ）に詳細に記載される。第１に 、多くの数の種々の小さなペプチド試験化合物が、固体支持体：たとえばプラス チックピン又は他の表面上で合成される。次に、すべてのビンが、溶解されてい るが精製されていない、又は溶解され且つ精製されたＧＲＰ受容体と反応せしめ られ、そして洗浄される。次の段階は、結合されたＧＲＰ受容体の検出を包含す る。

精製されたＧＲＰ受容体は、前記薬物のスクリーニング技法に使用するためには 、プレート上に直接被覆され得る。しかしながら、ＧＲＰ受容体に対する非中和 抗体は、固相上にＧＲＰ受容体を固定するために捕獲抗体として使用され得る。

本発明はまた、競争性薬物スクリーニングアッセイの使用にも関し、ここで受容 体又は受容体フラグメントに対する中和抗体が受容体に結合するために試験化合 物と競争する。この態様においては、抗体はＧＲＰ受容体の１又は複数の結合部 位を共有するいづれかのポリペプチドの存在を検出するために使用され得、そし てまた、ガストリン放出ペプチドにより占有される受容体上の結合部位を占有す るためにも使用され得る。

さらに、高い親和性リガンド結合部位を含む受容体及びその受容体の可溶性フラ グメントに対する中和抗体が、癌組織におけるガストリン開放ペプチド受容体機 能を阻害するために使用され得る。

本発明はまた、ガストリン放出ペプチド受容体の存在を検出するための種々の診 断用キット及び方法におけるＧＲＰ受容体、そのフラグメント、ペプチド及びそ れらの融合生成物の使用にも関する。

サンプル中のガストリン放出ペプチド受容体の濃度を決定するためのキットは典 型的には、ガストリン放出ペプチド受容体のために既知の結合親和性を有するラ ベルされた化合物（リガンド又は抗体）、ガストリン放出ペプチド受容体の源（ 天然に存在するもの又は組換えのもの）及びラベルされた遊離化合物から結合体 を分離するための手段、たとえばガストリン放出ペプチド受容体を固定するため の固相を含んで成る。

サンプル中のガストリン放出ペプチド受容体の濃度を決定するための方法は、典 型的には、（１）　Ｇ　ＲＰ受容体源から成るサンプルから膜を調製し；（２） その膜を洗浄し、そしてそれらを緩衝液に懸濁し；（３）界面活性剤及び可溶性 コレステリルエステルが添加されている培養培地中で前記膜をインキュベートす ることによって、ＧＲＰ受容体を溶解し：（４）前記溶解された受容体の界面活 性濃度を調節し：（５）ＧＲＰ：ＧＲＰ受容体複合体を形成するために、放射性 ラベルされたＧＲＰと前記希釈溶液とを接触し、そしてインキュベートし：（６ ）たとえば、ポリエチレンイミン処理されたフィルターを通しての濾過により前 記複合・体を回収し：そして（７）前記回収された複合体の放射能を測定する段 階を含んで成る。

受容体又はそのフラグメントに対して特異的な抗体は、高レベルの受容体及び／ 又はそのフラグメントの存在を検出するための診断において有用である。そのよ うな診断ア・ツセイは、溶解物、固定された細胞、免疫螢光を用いることができ 、そしてさらに、血清におけるＧＲＰ受容体に関係する抗原又は同様のものの検 出も包含する。診断アッセイは、均質（遊離試薬と受容体−リガント複合体との 間で分離段階を含まない）又は不均質（分離段階を含む）であり得る。種々の市 販のアッセイは、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）、酵素結合イムノ ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）　、酵 素−複数化イムノアッセイ技法（ＥＭＩＴ）、基質ラベルされた螢光イムノアッ セイ（ＳＬＦＩＡ）及び同様のものを包含する。たとえば、ラベルされていない 抗体は、ラベルされ、そしてＧＲＰ受容体又はその特定のフラグメントに対する 抗体を認識する第２抗体を用いることによって使用され得る。これらのアッセイ はまた、文献においても集約的に論ぜられて来た。

時々、診断アッセイのための試薬が、アッセイの感度を最適にするために、キッ トに供給される。本発明に関しては、アッセイ、手段及びラベルの性質に依存し て、ラベルされた又はラベルされていない抗体、又はラベルされた受容体が通常 、他の添加剤、たとえば緩衝液、安定剤、シグナル産生のために必要な材料、た とえば酵素のための基質、及び目標のものと一緒に供給される。所望には、試薬 は乾燥粉末として供給され、ここで試薬は、アッセイを行なうために適切な濃度 を有する水性媒体に再構成され得る。

薬物スクリーニング及び診断アッセイの前記構成成分のいづれかは、変性なしに 使用され得又は種々の方法により変性され得る。たとえば、共有的に又は非共有 的にラベルすることによって、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に供給す る成分を結合する。これらのアッセイのいづれかにおいては、リガンド、試験化 合物、ＧＲＰ受容体又はそれらに対する抗体が、直接的又は間接的にラベルされ 得る。直接的なラベリングのための可能性は、螢光強度、波長シフト又は螢光偏 光化をモニターできるラベル群、たとえば放射性ラベル、たとえばｌ！Ｉｉ１酵 素（アメリカ特許第３．６４５．０９０号）、たとえばペルオキシダーゼ及びア ルカリホスファターゼ、及び螢光ラベル（アメリカ特許第３．９４０．４７５号 ）を包含する。直接的なラベリングのための可能性は、１つの成分のビオチニル 化及び続（、上記ラベル群の１つに共役されるアビジンへの結合を包含する。

遊離リガントから結合体を、又は遊離試験化合物から結合体を分離するための多 くの方法が存在する。受容体が種々のマトリックス上に固定され、次に洗浄され 得る。適切なマトリックスは、プラスチック、たとえばＥＬ　Ｉ　ＳＡプレート 、フィルター及びビーズを包含する。マトリックスに受容体を固定化するための 方法は、プラスチックへの直接的な付着、捕獲抗体の使用、化学的カップリング 、及びビオチン−アビジンを包含する。このアプローチにおける最後の段階は、 有機溶媒、たとえばポリエチレングリコール又は塩、たとえば硫酸アンモニウム を利用する方法を包含するいくつかの方法のいづれかによる受容体／リガンド複 合体の沈殿を包含する。

他の適切な分離技法は、Ｓ、　Ｊ、　Ｒａｔｔｌｅなど、、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅ Ｉｌｌ、　３３（９）　：１４５７〜１４６１　（１９８４）に記載される螢光 抗体磁気化可能粒子方法及びアメリカ特許第４．６５９．６７８号に記載される ような二重抗体磁気粒子分離法を包含するが、但しこれだけには限定されない。

種々のラベルにタンパク質受容体又はそれらのフラグメントを結合するための方 法は、文献に集約的に報告されており、そして本明細書において詳しく論する必 要はない。多くの技法は、ペプチド結合を形成するためにカルボジイミド又は活 性エステルの使用を通しての活性化されたカルボキシル基の使用、結合のために メルカプト基と活性化されたハロゲン、たとえばクロロアセチル又は活性化され たオレフィン、たとえばマレイミドとの反応によるチオエーテルの形成、又は同 様のことを包含する。

本発明のもう１つの診断観点は、癌を有すると思われる患者におけるガストリン 放出ペプチド受容体のレベルを検出するためにプローブとして使用され得るＧＲ Ｐ受容体配列から取られるオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド配列の使用 を包含する。ＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチド配列の調製、その配列のラベリング 及び配列の好ましい大きさは、多くの記載及び文献に論ぜられて来た。通常、オ リゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約１４個のヌクレオチド、通常少なく とも約１８個のヌクレオチドを有すべきであり、そしてポリヌクレオチドプロー ブは７キロ塩基までを有すことができる。種々のラベル、たとえば最っとも通常 には放射性核種、特に３２Ｆが使用され得る。しかしながら、たとえばポリヌク レオチド中への導入のためにビオチン変性ヌクレオチドを用いての他の技法もま た使用され得る。次に、ビオチンは、広範囲の種類のラベル、たとえば放射性核 種、螢光体、酵素又は同様のものによりラベルされ得るアビジン又は抗体に結合 するための部位として作用する。他方、特異的重複体、たとえばＤＮＡ重複体、 ＲＮＡ重複体、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド重複体又はＤＮＡ−タンパク質重複 体を認識できる抗体が使用され得る。抗体がラベルされ、そしてアッセイが行な われ、ここで重複体が表面に結合され、その結果、表面上での重複体の形成に基 づいて、重複体に結合される抗体の存在が検出され得る。新規抗−センスＲＮＡ へのプローブの使用が、いづれかの従来の技法、たとえば核酸ハイブリダイゼー ション、士スクリーニング法、組換えブロービング法、ハイブリッド開放翻訳法 （ＨＲＴ）及びハイブリッド阻害翻訳法（ＨＡＲＴ）において実施され得る。こ れはまた、増幅技法、たとえばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）も包含する。

本発明は、有意な治療価値を有する。ＧＲＰ受容体に対する結合親和性を有する ものとして同定される化合物と共に、ＧＲＰ受容体（天然に存在するか又は組換 えの）、そのフラグメント及びそれに対する抗体が、癌性組織、たとえば前立腺 及び膵臓腫瘍の処理及び小さな細胞性肺癌の処理において有用であろう。さらに 、本発明は、ＧＲＰ受容体の異常な発現又は異常な開始に関係するいづれかの疫 病又は疾患において治療価値を有するであろうと思われる。たとえば、ＧＲＰ受 容体は、神経学的機能に投書を示し、そして胃腸、肺及び脳組織に影響を及ぼす と思われる。

組換えＧＲＰ受容体又はＧＲＰ受容体抗体が精製され、そして次に、治療への使 用のために、生理学的に無害の安定剤及び賦形剤と共に、医薬的に許容できるキ ャリヤー又は希釈剤と組合され得る。次に、これらの組合せは、無菌下で濾過さ れ、そして投与バイアル中に、凍結乾燥投与形として置かれ又は安定化された水 性調製物中に貯蔵される。本発明はまた、補体結合でない抗体の使用にも関する 。

ＧＲＰ受容体又はそのフラグメントを用いての薬物スクリーニングが、ＧＲＰ受 容体への結合親和性を有する化合物と同定するために行なわれ得る。次に、続く 生物学的アッセイは、化合物が本来の刺激活性を有するかどうか、及び従って、 それがガストリン放出ペプチドの活性を遮断する場合、遮断薬又は拮抗剤である かを決定するために使用され得る。同様に、本来の刺激活性を有する化合物は、 受容体を活性化し、そして従って、それがガストリン放出ペプチドの活性を刺激 する場合、作用剤である。本発明はさらに、拮抗剤としてのＧＲＰ受容体に対す る抗体の治療的使用にも関する。

ＧＲＰ受容体（組換え体）、そのフラグメント及び受容体又はそのフラグメント に対する抗体、拮抗剤及び作用剤は、処理されるべき宿主に直接的に又は化合物 のサイズに依存して投与され、それらの投与の前、それらをキャリヤータンパク 質、たとえばオボアルブミン又は血清アルブミンに接合せしめることが所望され る。治療用製剤は、いづれか便利な投与製剤で投与され得る。活性成分を単独で 投与することが可能であるが、好ましくは、それは医薬製剤として存在する。

製剤は、１又は複数の許容できるキャリヤーと一緒に、上記で定義された少なく とも１種の活性成分を含んで成る。個々のキャリヤーは、他の成分と適合し、そ して患者に対して有害でない態様で医薬的に及び生理学的に許容できるべきであ る。製剤は、経口、腸内、鼻又は非経口（たとえば皮下、筋肉内、静脈内及び皮 膚下）投与のために適切なものであり得る。製剤は便利には、単位投与形で存在 し、そして当業界において良く知られたいづれかの方法により調製され得る。本 発明の療法は、他の化学療法又は化学予防剤と組合され得、又はそれと共闘して 使用され得る。

本発明の広い範囲は、本発明を制限するものではない次の例により最良に理解さ れる。

マウス５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞を、Ｔ−８５０ローラーボトル（１００の ロフト）中、１０％（体積／体積）ウシ胎児血清により補充されたダルベツコの 変性イーグル培地において、３７℃で１０％のＣＯｘ　／９　ｏ％の空気雰囲気 下で集密性まで増殖した。収穫の後、培地を排出し、そして個々のボトルを、５ ０ｍ１のカルシウム／マグネシウムフリーのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ−ＣＭＦ） により２度すすいだ。細胞を、ＰＢＳ−ＣＭＦ　（３７°Ｃに暖められた）中、 ２５〜３０ｍ１の０．０４％（重量／体積’）ＥＤＴＡと共に室温で１５分間イ ンキュベートした。次に、細胞を、堅実にたたくことによって除き、そして氷上 、２５０１の円錐型遠心分離管中にピペットで移した。６個のローラーボトルか らの細胞を、佃々の遠心分離管に組合した。ローラーボトルを、最後に２５ｍ！ のＰ　Ｂ　Ｓ　ＣＭＦによりすすいだ。細胞を、５ｏｒｖａｌｌＲＣ−３Ｂ遠心 分離機により４℃で１０分間、１８００ｒｐｍでベレット化した。個々のペレッ トを、４°Ｃで、５０ｍ１の新鮮なＰＢＳ−ＣＭＦ中に再懸濁した。２〜３個の 遠心分離管からの細胞を組合し、ベレット化し、そして追加のＰＢＳＣＭＦ１２ ０ｍｌにより洗浄した。最終細胞ペレツトを、２００ｍ１の細胞溶解緩衝液（５ ０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５，２ｕ＋ＭのＭｇＣｌ　！　、１ｍＭのＥＧＴ Ａ、５０Ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、２．５μｇ／ｍｌのペプスタチン、１０Ｍ ｇ／ｍｌのアプロチニン及び０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド （ＰＭＳＦ））中に再懸濁し、た。細胞を、Ｎ、キャビテーションにより溶解し た。簡単に言えば、１００ｍ１の細胞懸濁液を、９００ｐｓｉのＮ、に加圧され た密封されたステンレス鋼容器中、水中に置いた。その懸濁液を、小さなオリフ ィスを通して収集用管中にチャンバーからゆっくり開放し、細胞の急速な分解及 び溶解を引き起こした。細胞溶解は、顕微鏡による可視化により完結であること がわかった。膜を、４“Ｃで３０分間、３９．０００Ｘｇでベレット化し、溶解 緩衝液に再懸濁し、そして再びベレット化した。そのペレットを、貯蔵緩衝液（ ５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、り■７．５．１ｎ＋ＭのＥＧＴＡ、０．２５Ｍのスクロ ース、５０Ｍｇ／ｌのロイペプチン、２５Ｍｇ／ｒｎＩのペプスタチン、ｌＯμ ｇ／ｍｌのアプロチニン及び０．５　ｍＭのＰＭＳＦ）中において、１５＠ｇの 膜タンパク質／ｍｌの濃度で懸濁した。膜を、ｌ及び５ｍｌの体積でアリコート し、液体窒素中で急速凍結し、そして−８０℃で貯蔵した。

実施例２ ＧＲＰ受容体の溶解のための界面活性剤の比較他のシステムでの受容体抽出のた めに使用されるいくつかの界面活性剤を試験し、５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞 膜からのＧＲＰ受容体を溶解するそれらの能力を測定した。ジギトニン、Ｔｒｔ ｔｏｎ　Ｘ−１００，ＣＨＡＰＳ及びＣＨ３を有するＣＨＡＰＳのすべてを用い て、０．５０％の界面活性剤濃度で膜を抽出し、そしてすべては、”Ｉ−ＧＲＰ に架橋することによって放射性ラベルされた受容体の溶解において効果的であっ た。計数７分（ＣＰＭ）として測定される、”Ｉ−ＧＲＰ　（０，０２ｎＭ）の 結合を、第１図に示されるように、抽出に使用される界面活性剤（０，１％）及 びいくつかの濃度のラベルされていない１４〜２７のＣ−末端アミノ酸のＧＲＰ 　（ＧＲＰ１４−２７）の存在下でアッセイした。ＣＨＡＰＳ＋ＣＨ３による抽 出のみが、検出可能な結合活性を生成した。すべての活性剤はＧＲＰ受容体の溶 解において効果的であるので、ジギトニン、Ｔｒｆｔｏｎ　Ｘ−１００及びＣＨ ＡＰＳにより調製された抽出物における結合活性の観察の不良は、溶解工程の間 の受容体不活性化の結果であった。

しかしながら、ＣＨＡＰＳ　（ＣＨＳを含まない）により抽出された受容体の部 分的再活性化が、ＣＨ８の続く添加により達成され得ることが注目された。これ は、ＣＨ５が活性ＧＲＰ受容体を促進する場合、安定剤として作用することを確 証した。

ＧＲＰ−受容体の溶解のために界面活性剤濃度の比較実施例１におけるようにし て調製された５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞膜を、種々の濃度の界面活性剤ＣＨ ＡＰＳと共にインキュベートした。遠心分離による不溶性材料の分離の後、可溶 性ＧＲＰ結合活性を上清液から測定した。０．７５％（Ｗ／Ｖ）のＣＨＡＰＳが ＧＲＰ受容体を溶解するために使用される場合、最大の受容体結合が、第２図に 示されるように観察された。しかしながら、タンパク質の最大の溶解度を得るた めには、１．０％（ｗ／ｖ）又はそれ以上のＣＨＡＰＳ濃度が必要とされた。Ｇ ＲＰ受容体結合は、高い界面活性剤濃度で一定して低下した。ＣＨＡＰＳにより 溶解される受容体に対する特異的ＧＲＰ結合を観察するためには、安定剤ＣＨ５ を包含することが必要とされた。ＣＨＡＰＳ　：　ＣＨ８の比は、抽出及びアッ セイ条件下で１０：１で維持された。

ＧＲＰ受容体の溶解のために安定剤濃度の比較実施例１におけるようにして調製 された５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞膜を、種々の量のコレステリルヘミスクシ ネート（ＣＨＳ）の存在下で０．７５％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳにより溶解した 。遠心分離により不溶性材料を除去した後、可溶性ＧＲＰ受容体結合活性を、０ ．０７５％（ｗ　／　ｖ　）のＣＨＡＰＳ濃度及び溶解段階に使用される濃度よ りも１０倍低いＣＨ８濃度で上清液から測定した。第３図に示されるように、Ｃ ＨＡＰＳ　：　ＣＨＳの最適比は、約１０：１であった。

溶解されたＧＲＰ受容体の結合活性のために界面活性剤製界面活性剤の濃度に対 する結合活性の依存性を研究した。

第４図に示されるように、受容体へのＧＲＰ結合性は、０．０７５％〜０．１％ の狭い最適ＣＨＡＰＳ濃度を有し、そして特異的結合は０．４％以上のＣＨＡＰ Ｓ濃度で劇的に低下する。

０．４％の濃度以上の界面活性剤レベルはまた、たぶん、界面活性剤凝集物の形 成による、アッセイにおける非特異的バックグラウンドの高い上昇を引き起こす 。ＧＲＰ受容体は、高い阻害性である界面活性剤レベル（０，７５％）により膜 から最大に抽出されるが、ＣＨＡＰＳによる受容体分子の不活性化は可逆性であ るように思えた。０．７５％のＣＨＡＰＳ及び０．１５％のＣＨ８中でインキュ ベートされた受容体の完全な結合活性を、界面活性剤の濃度を透析により減じた 後、回復することができた。

ＧＲＰ結合のための最適ｐＨ ２０ｍＭのＭＥＳ、２０ｍＭのＣＨＥＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ。

２ｍＭのＥＤＴＡ、１０＋＋ｇ／ｍｌのＢ　ＳＡ、３０　ｔｔ　ｇ／ｗ＋１のバ シトラシン、０．０２　ｎＭの”’Ｉ−ＧＲＰ及び５μｇのＣＨＡＰＳ抽出され た膜タンパク質の溶液５００ｍ１中において、ｐＨ５〜ＩＯの種々のｐＨ値で、 ”Ｉ−ＧＲＰ結合性を決定した。

１５℃で３０分間のインキュベーションの後、サンプルを氷上で冷却した。この 後、結合したリガンド及び遊離リガンドの分離の前、ｐＨを通常にするために５ ０μＭのＨＥＰＥＳ　５゜Ｏｍｌを添加した。受容体結合は、７．５のｐＨで最 適であることが見出された。しかしながら、受容体は、４℃で少なくとも２４時 間、ｌＯのｐＨで、活性の損失を伴わないで、インキュベーションに耐えること ができる。対照的に、４℃でｐＨ５の緩衝液と共に受容体のインキュベーション は、結合活性の急速な損失を引き起こした。

実施例１において調製された５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞膜を、５０ｍＭのＨ ＥＰＥＳ、Ｉ）Ｈ７，５，１，０ｍＭのＥＧＴＡ。

１００ｍＭのＮａＣ１，０，２５Ｍのスクロース、５０　ｔｔ　ｇ／ｍｌのロイ ペプチン、５μｇ／ｍｌのペプスタチン、ｌＯμｇ／ｍｌのアプロチニン、３０ μｇ／ｌのバシトラシン及び０．５　ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリ ド溶液１ｍｌ当たり１５ｍｇのタンパク質で懸濁した。３−（（３−コラミドプ ロピル）ジメチルアミノ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）：コレス テリルヘミスクシネート（ＣＨ３）のｌＯ：ｌの比での混合物を、ゆっくりと添 加し、０．７５％のＣＨＡＰＳの最終濃度を生成した。抽出物を、２１°Ｃで３ ０分間インキュベートし、４°Ｃに冷却し、そして不溶性材料を、１００．００ ＱＸｇで６０分間の遠心分離により除去した。透明な上清液を液体Ｎ、中で凍結 し、そして活性の損失を伴わないで一８０℃で貯蔵した。

損なわれていない又は界面活性剤溶解化膜（２０〜５０μｇ、実施例３における ようにして調製された）への特異的”’Ｉ−ＧＲＰ　（３−（１２５ヨードチロ シル１５）ガストリン放出ペプチド、１９００〜２０００Ｃｉ／ミリモル）結合 性を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５，２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍｇ／ｍｌ のウシ血清アルブミン（ＢＡＳ）、３０μｇ／＋＋＋１のバシトラシン及び０． ０２　ｎＭの”’Ｉ−ＧＲＰ中においてアッセイした。界面活性剤溶解化膜抽出 物のアッセイのために、最終ＣＨＡＰＳ界面活性剤濃度を、０．０５０％〜０． ２０％の間に調整した。ＣＨＳの濃度を、ＣＨＡＰＳの濃度の１１５〜１／ｌＯ で維持した。サンプルをまた、ＢＳＡを排除して調製した。１５℃で３０分間の インキュベーションの後、サンプルを０℃に冷却した。結合されたリガンド（” Ｊ−ＧＲＰ　：　ＧＲＰ受容体複合体）を、ポリエチレンイミン処理されたＷｈ ａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｂフィルターを通しての急速な濾過、続く、水冷却のトリス 緩衝液（５０ｍＭのトリス／ＣＩ。

ｐＨ７゜５）４ｍｌによる４回の洗浄により回収した。フィルターを、ｌ５ｏｄ ａｔｅ　５００ガンマカウンターで計数した。

非特異的バックグラウンドは、特異的結合部位と競争するためにアッセイへの１ １００ｎのラベルされていないＧＲＰの包含により決定され、そして典型的には 、１．５〜２％の結合される特異的放射能を表わした。非特異的結合は、フィル ターへの”’Ｉ−ＧＲＰの低い程度の結合によるものとされる。

溶解された受容体の結合活性は、界面活性剤の濃度に高く依存することが見出さ れた。第４図に示されるように、受容体へのＧＲＰ結合は、０．０７５％のＣＨ ＡＰＳｌｏ、０１５％のＣＨＳ−？）、１０％のＣＨＡＰＳｌｏ。０２％のＣＨ ８の狭い最適濃度を有し、そして特異的結合は、０．４％１０．０８％以上のＣ ＨＡＰＳ／ＣＨＳ濃度で劇的に低下する。約０．４％以上の界面活性剤レベルの ＣＩＡＰＳ及び０．０８％のＣＨ８はまた、たぶん界面活性剤凝集物の形成によ り、非特異的バックグラウンドの高い上昇を引き起こす。受容体は、高い阻害性 である界面活性剤（０，７５％のＣＨＡＰＳ）により膜から最大に抽出されるの で、ＣＨＡＰＳによる受容体の不活性化は、不可逆的であると思われた。実際、 ０．７５％のＣＨＡＰＳ＋０．１５％のＣＨ３中でインキュベートされた受容体 の完全結合活性が、透析による界面活性剤の濃度の低下に基づいて回復せしめら れ得た。

アッセイを、種々の時間のインキュベーションについて行ない、そしてＢ　Ｓ　 Ａ　（１０ｍｇ／ｉｆ）はアッセイに包含されるか又は除外された。１５°Ｃで の可溶性受容体へのＩ！Ｊ　ＱＲＰ結合性は、２０分までに一様になり、そして ２時間までの間、一定に持続した。リガンドのタンパク質分解を阻止するために 添加されるＢＳＡの排除は、結合運動学に対して有意な効果を有さなかった。

５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞膜におけるＧＲＰ受容体は、結合されたＧタンパ ク質であることが見出された。従って、溶解性受容体への”’！−ＧＲＰ結合に 対するグアニルヌクレオチドの効果を研究した。最終の界面活性剤濃度は０．０ ７５％ＣＨＡＰＳであり、そして０．０１５％のＣＨ３が存在した。損なわれて いない５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞膜におけるＧＲＰ受容体のＧタンパク質結 合は、受容体のリガンド親和性がヌクレオチドＧＤＰ及びＧＴＰ並びに非加水分 解性ＧＴＰ類似体ＧＭＰＰＮＰの存在下で約１０倍減じられる観察から推定され た。Ｍｇ！＋の存在下で、グアニルヌクレオチドは、高い親和性のリガンド／受 容体／Ｇタンパク質三元複合体からＧタンパク質の解離を誘発することが推定さ れ、低い親和性を示すリガンド／受容体複合体の形成がもたらされる。ＣＨＡＰ Ｓにより膜から抽出されるＧＲＰ受容体は、膜へのＧＲＰ結合性を約８０％減じ るレベルで、Ｍ　ｇｔゝ及びＧＴＰ又はＧＭＰＰＮＰの存在下でそれらのリガン ド結合性質に変化を示さなかった。Ｍ　ｇ２４′の存在下でＧＲＰ結合に対する ＧＴＰの効果の欠乏は、受容体とそのＧタンパク質との相互作用か界面活性剤抽 出物に維持されないことを示す。次の表における対照は、Ｍ　ｇ　Ｃ１！を含む 。

溶解された膜 対照　２８ 対照＋１０μＭのＡＭＰＰＮＰ　２７．８対照＋ｌＯμＭのＧ　Ｔ　Ｐ　２７． ５対照＋１０μＭのＧＭＰＰＮＰ　２６．５対照　２８．９ 対照＋５μＭのＡＴＰ　２９．７ 対照＋５μＭのＡＭＰＰＮＰ　３３．４対照＋５μＭのＧＴＰ　１０．７ 対照＋５μＭのＧＭＰＰＮＰ　１０．５損なわれていない及び溶解された５ｗ１ ｓｓ　３Ｔ３膜へのＩ′’Ｉ−ＧＲＰのスキャッチャード分析を行なった。１つ の特定の実験が下記に論ぜられており、ここで受容体の溶解された及び膜結合さ れた形の結合パラメーターは、類似する条件下で決定された。アッセイは１５° Ｃで測定された。溶解された又は損なわれていない膜のアッセイのためには、そ の結合反応は、それぞれ３０分及び１８０分で停止せしめられた。次のものは結 合パラメーターであり、ここでに０は解離定数であり、そしてＢ、は最大の結合 容量である：Ｋｌ、（損なわれていない膜）＝３７ｐＭＫＤ（溶解された膜）　 ＝１０１１Ｍ Ｂ、（損なわれていない膜）＝０．７９ｐモル／ｍｇタンパク質Ｂ、（溶解され た膜）　＝　１．０１）モル／腸ｇタンパク質スキャッチャード分析は、高い親 和性結合部位の存在を示した。データにおけるいくらかの非直線性及びばらつき が、正確な結合データの決定が最っとも困難である低い値の結合／遊離リガンド で観察された。可溶性受容体（１０ｐＭ）のリガンド結合の解離定数は、観察さ れる可溶性受容体に結合するＧタンパク質の欠乏にもかかわらず、損なわれてい ない膜における受容体（３７ｐＭ）により示される定数よりも低かった。

上記のように、そのようなＧタンパク質結合は、大きさの程度で膜受容体の親和 性を増強する。しかしながら、そのアッセイは、Ｇタンパク質相互作用により失 なわれる親和性を補足する可溶性受容体へのＧＲＰ結合のために最適化された条 件下で行なわれた。他の実験においては、溶解された受容体の解離定数は、１０ ｐＭ〜３０ｐＭの範囲であることが計算された。そのデータは、受容体結合部位 の機能的な配慮が、界面活性剤溶液において維持されたことを示した。

この実験からのスキャッチャードデータはまた、５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３粗細胞膜に ０．７９　ｐモルの受容体／ｍｇタンパク質が存在し、そして受容体結合部位の 約５０％が界面活性剤による膜の抽出により溶解されたことを示した。受容体活 性の最っとも効果的な溶解性を必要とすることが見出された要因のいくつかは、 ＮａＣ１の包含（＞　１００ｍＭ）　、二価のカチオンの排除及び室温での膜の 抽出であった。ＮａＣ１は受容体の最適な溶解のために必要とされるが、その塩 は、５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞膜及び界面活性剤溶解性受容体へのＧＲＰ結 合を阻害した（ＩＣｓ。＝約５０ｍＭ）。しかしながら、１．０Ｍまでの濃度で のＮａＣ１による受容体の阻害は、完全に可逆的であることが見出された。

溶解された３Ｔ３膜への”’Ｉ−ＧＲＰの結合を、種々のラベルされていない競 争体ペプチドの存在下でアッセイした。

ＧＲＰのＣ−末端の８個のアミノ酸（ＧＲＰ２０〜２７）は、完全な細胞におけ るＧＲＰ受容体への高い親和性結合のために不可欠であることが見出された。完 全なＧＲＰ配列（ＧＲＰＩ２７）、ＧＲＰのＮ−末端部分（ＧＲＰＩ〜１６）、 物質Ｐ１物質Ｐ拮抗剤、フィサレミン（これらのすべては、Ｐｅｎ１ｒｓｕｌａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｅｌｍｏｎｔ　ＣＡからであった）及び（Ｎ ｌ　ｅ１４！７）　ＧＲＰ　１３〜２７　（すなわち、Ｌｙｓ−Ｎｌｅ−Ｔｙ　 ｒ−Ｐ　ｒｏ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉｙ−Ａｓｎ−Ｈ１ｓ−Ｔｒｐ−Ａ　１ａ−Ｖａ　 Ｉ−Ｇ　］　ｙ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−Ｎ　ｆ　ｅ−ＮＨ＊）として言及される、メ チオニンのために置換されたノルロイシンを有するＧＲＰのＣ−末端部分を、可 溶性３Ｔ３繊維芽細胞膜抽出物への１！’Ｉ−ＧＲＰ結合のために競争するそれ らの能力について試験した。可溶性受容体へのＩｔｌｉ−ＧＲＰ結合の５０％阻 害を引き起こすのに必要とされる〔Ｎ１　ｅ””　］　ＧＲＰ　１３〜２７の濃 度（Ｉ　Ｃｓｅ＝　０．３　ｎＭ）は、ＧＲＰＩ〜２７の濃度（Ｉ　Ｃｓ＊＝　 ０．１　ｎＭ）よりもわずかに高かった。対照的に、Ｎ−末端部分（ＧＲＰＩ〜 １６）は、可溶性受容体への結合のために ”’Ｉ−ＧＲＰと競争することができない。さらに、物質Ｐ１物質Ｐ拮抗剤及び フィサレミンは、試験される濃度で（１０００ｎＭまでの）、阻害効果を有さな かった。これらの結果は、完全な細胞及び単離された膜における類似する研究に おいて見出された結果にひじょうに類似する。

溶解された５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３膜におけるＧＲＰ受容体の分子量を、ホモニ官能 価架橋試薬ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ”）を通してそれ を結合された”’Ｉ−ＧＲＰ！、：共有架橋し、そして５Ｄｓ−ＰＡＧＥ　（ド デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によるラベルされた 受容体の親和性を分析することによって評価した。この架橋剤は、−次アミノ基 に対して特異的である。可溶性３Ｔ３繊維芽細胞膜タンパク質（４０μｇ）を、 ５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０７５％のＣＨＡＰＳ、０．０ １５％のＣＢＳ、３０μｇ／ｍｌのノくシトラジン及び０．２　ｎＭの＋１ｌ− ＧＲＰの溶液５００ｍ１中において１５℃で３０分間インキュベートした。その 結合反応体を０℃に冷却し、そしてＢＳ”を添加し、３ｍＭの最終濃度を得た。

架橋を、トリス緩衝液（１，０Ｍのトリス／ＨＣ１，ｐＨ７，５）　０．１０ｍ １の添加により停止した。さらに１０分間のインキュベーションの後、０．１ｍ ｌのＴＣＡ（１００％）を添加し、そしてその溶液を０°Ｃで３０分間インキュ ベートした。沈殿した物質を遠心分離により集め、水冷却のアセトンにより洗浄 し、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中において９５℃で３分間加熱した 。サンプルを、７．５％のゲル上での５ＤＳ−ＰＡＧＥにゆだね、そしてゲルを フルオログラフ処理した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ技法の詳細な説明は、Ｌａｅｍｍｌｉなど、、　Ｎａｔｕｒｅ 　２２７：６８０　（１９７０）　（これは、引用により本明細書に組込まれる ）に見出される。第５図は、ゲル表示を例示する。

レーン　組　成 Ａ　添加なし Ｂ　Ｏ，１ｎＭのラベルされていないＧＲＰ（：　０．５ｎＭのラベルされてい ないＧＲＰｐ　１．　ＯｎＭのラベルされていないＧＲＰＥ　１１００ｎのラベ ルされていないＧＲＰ強くラベルされた種は、約７５〜１００　ＫＤａの見掛Ｍ ｒを伴って、拡散バンドにおいて移動した。低レベルのラベルされていないＧＲ Ｐはこの種のラベリングを阻害し、このことは、ラベリングがひじように特異的 であることを示唆する。ラベルされたバンドの広さは、ＧＲＰ受容体が炭水化物 を含むことが見出された事実と一致する。ラベルされた生成物は、完全な細胞又 は膜架橋実験に由来する生成物にひじように類似する。架橋された完全な細胞に 由来するサンプルのＮ−グリカナーゼ処理は、ラベルされたタンパク質がＮ−結 合された炭水化物を含むことを示した。脱グリコジル化されたタンパク質は、５ ＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて３８ＫＤａの見掛のＭｒＳｗｉｓｓ　３Ｔ３繊維芽細 胞膜（２〜３ｇのタンパク質）を実施例１に記載されるようにして調製し、そし て２００ｍ１の貯蔵用緩衝液（実施例１を参照のこと）に懸濁した。膜を、Ｎａ Ｃ１（５，０Ｍ）５０ｍｌと共に混合し、ＮａＣ１濃度を約ＩＭにし、４０．Ｏ ＯＯＸｇで３０分間の遠心分離によりベレット化し、そして高い塩緩衝液（５０ ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５，２ｍＭのＥＤＴＡ、１．０ＭのＮａＣ１，２５ μｇ／ｎ＋１のロイペプチン、ｉｏμｇ／ｍｌのアプロチニン、２５μｇ／１ｍ ｌのペプスタチン及び０．５　ｍＭのＰＭＳＦ）２００ｍｌにより４°Ｃで２度 洗浄した。次に膜を低い塩緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、　ｐ）！？、５．　 ２ｍＭのＥＤＴＡ、２５μｇ／ｍｌのロイペプチン、ｌＯμｇ／ｍｌのアプロチ ニン、Ｚ５μｇ／ｌのペプスタチン及び０．５　ｍＭのＦＭＳＦ）により洗浄し 、そして５０！ＩＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５，２ｍＭのＥＤＴＡ、１μＭのＥ ＧＴＡ、１００ｄのＮａ　Ｃ１，０，０３ｍｇ／ｍｌのバシトラシン、２５μｇ ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２．５μｇ／ｍｌのペ プスタチン及び０．５＋ＭのＦＭＳＦ溶液２００＋ａｌに再懸濁した。ＣＨＡＰ Ｓ及びＣＨ３の混合物を含む原液を、膜にゆっくりと添加し、ＣＨＡＰＳ及びＣ Ｈ３の濃度を、それぞれ０．７５％及び０．０７５％の最終濃度にした。その混 合物を、２１″Ｃで３０分間インキュベートし、４℃に冷却し、そして１００、 ＯＯＯＸｇで６０分間、４：Ｃで遠心分離した。上溝液は、溶解されたＧＲＰ受 容体を含んだ。

ポリエチレングリコールによる沈殿 溶解された抽出物（１９０ｍＭ）に、水冷却されたポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ）８．０００　（水中において５０ｗ／Ｖ％）１２６ｍＭを添加した。十分 な混合の後、形成された沈殿物を、１００．ＯＯＯＸｇで１０分間の遠心分離に より集めた。ペレットを、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７， ５，２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０７５％のＣＨＡＰＳ、０．０Ｏ７５％のＣＨＳ、 ５μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１０μｇ／ｍ１のバシトラシン溶液５０ｍ１に 、Ｐｏｔ　ｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍハモナイザーの助けにより懸濁した。いく らかの不溶性タンパク質を含む懸濁液を、６９．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心分離 し、そしてペレットを捨てた。

小麦胚のアグルチニンクロマトグラフィーＰＥＧによる沈殿化の後、ＧＲＰ受容 体を、レクチンアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した。小麦 胚のアグルチニンーアガロース樹脂（３〜５ｍｇのレクチ２７ｍｇ湿潤ゲル）　 （Ｅ−Ｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ　Ｍａｔｅｏ、ＣＡ）を含むカラ ム　（１，６ｘ　９　ｃｍ）を、５０＋＋＋ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５，２ｍ ＭのＥＤＴＡ、０．２５％のＣＨＡＰＳ、０．０２５％のＣＨ３，５μｇのロイ ペプチン及び１０μｇのバシトラシン溶液により４°Ｃで平衡化した。可溶性抽 出物を、１体積のカラム緩衝液により希釈し、そして最終界面活性剤濃度を０． ２５％のＣＨＡＰＳ及び０．０２５％のＣＨＳに調整した。サンプルを、１゜５ ｍｌ／分の流速で、レクチンカラムに適用した。次に、カラムを約１０カラム体 積の緩衝液により洗浄し、モしてカラム緩衝液＋５ｍＭのＮ、Ｎ’　、Ｎ’−ト リアセチルキトトリオースにより溶離した。ＧＲＰ受容体結合活性を含む画分を プールし、そして２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７，５，２， ０ｍＭのＥＤＴＡ、５μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１０μｇ／ｍｌのバシトラ シン溶液２３体積により希釈した。

ＧＲＰアフィニティークロマトグラフィーＡｃｔｉｇｅｌ超流動樹脂（１０ｍｌ ）　（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ、Ｓａｎ　Ｇａｂｒｉｅｌ、ｃＡ）を、１００ｍＭの ＫＰＯ４（ｐＨ７，０）５体積により洗浄した。前記樹脂を、２ｍｇ／ｍｌの（ Ｎｌ　ｅ”！７）ＧＲＰ１３〜２７を含む、１００ｍＭ（７）ＫＰＯａ及びｌｏ ｏｍＭのＮａＣＮ　Ｂ　Ｈ＊溶液１０ｍ１と共に、軽く撹拌しながらインキユベ ートシた。樹脂を、１００ｍＭ（ＤＫＰ　Ｏｓ　（ｐＨ７，０）　ｉ、：ヨり洗 浄し、続いて１００ｍＭのＫＡｃ、ｐＨ４゜０，０．５ＭのＮａＣ１゜１００ｍ Ｍのトリス、ｐｕｓ、ｏ、及び０．５　ＭのＮａＣ１により交互に洗浄した。樹 脂のカラム（１，６ｘ　５　ｃｍ）を、２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＨＥＰＥ Ｓ、９Ｈ７，５，２，０ｍＭのＥＤＴＡ、０゜０７５％のＣＨＡＰＳ、０．００ ７５％のＣＨ３，５μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１０μｇ／＋ｏｌのバシトラ シン溶液により４℃で平衡化した。レクチンカラムから溶離された粗ＧＲＰ受容 体を、０．１＋ａ！／分でＧＲＰアフィニティーカラム上に負荷した。次に、カ ラムを、約２０体積の平衡化緩衝液により洗浄した。結合された受容体を、平衡 化緩衝液＋０．５ＭのＮａｃｌにより０．２ｍｌ／分の流速でカラムから溶離た し。受容体を含む画分を、　”’Ｉ−ＧＲＰ結合活性のアッセイにより固定し、 そしてプールした（１０〜１３ｍ１）。その溶離プールを、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅ ｐ−１０（Ａｍｉｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ）を用いて限外濾過により 約１ｍｌに濃縮した。次に、１５体積のアフィニティーカラム平衡化緩衝液によ るサンプルの希釈及び１ｍＭへのサンプルの再濃縮により、前記サンプルを脱塩 した。この脱塩段階をくり返し、そして得られた１ｍＭのサンプルを、アフィニ ティーカラム平衡化緩衝液により５ｍＭに希釈した。精製されたＧＲＰ受容体の ＰＡＧＥ分析は、有意なレベルの汚染の存在を示した。半純粋受容体のこの溶液 を、上記のようにして調製された第２　（Ｎｌｅ′４１７）ＧＲＰ１３〜２７− ａｃｔｉｇｅｌ超流動性カラム（１，ＯＸ　３　ｃｍ）上に、１．８ｍｌ／時で 負荷した。そのカラムを、２０力ラム体積の平衡化緩衝液により洗浄し、そして 結合された受容体を、平衡化緩衝液＋０．５ＭのＮａＣ１により、０．１ｍｌ／ 分の流速で溶離した。

ＧＲＰ受容体結合活性を含む画分をプールし、そして限外濾過により０．３１に 濃縮した。

ゲル濾過 精製された受容体を、５ｕｐｅｒｏｓｅ−６ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上でのクロマトグラフィー 処理により脱塩化した。カラムを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５，２ｍＭ のＥＤＴＡ、０．０７５％のＣＨＡＰＳ、０．００７５％のＣＨＳ及び１００ｍ ＭのＮａＣ１溶液により平衡化した。受容体を、０．４ｍｌ／分でクロマトグラ フィー処理した。受容体を、約２ｍｔにカラムから溶離した。

精製されたＧＲＰ受容体の特徴化 溶解された粗抽出物からの純粋なＧＲＰ受容体の全体の収率は、高い親和性の” ′Ｉ−ＧＲＰ結合活性の回収に基づいて１０〜２０％の範囲であった。精製され た受容体により得られた結合データのスキャッチャード分析は、ＧＲＰのための その親和性（Ｋ、＝１０〜３０ｐＭ）が、界面活性剤溶解性粗抽出物における受 容体と実質的に同じであることを示唆した。そのデータは、３０〜５０ｐモルの 受容体部位が、この例に概略されるように、受容体の最終精製画分に典型的には 得られることを示す。これは、脱グリコジル化された受容体がＳＤＳ　ＰＡＧＥ ゲル上で３６±５ＫＤの見掛は分子量を示すことを考慮して、約１〜２μｇの受 容体タンパク質に対応する。

受容体調製の銀染色された５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、７０〜１００ＫＤの見掛は 分子量を有する強く染色する単一の拡散バンドを示した。受容体調製は、実質的 に汚染物を含まなかった。第６図は、精製されたＧＲＰ受容体の銀染色されたゲ 小表示を例示する。ＧＲＰ受容体バンドの銀染色の相対的レベルを、ゲル上に負 荷された受容体タンパク質のおおよその量を決定するために、既知量のタンパク 質と比較した。得られた概算値は、”’Ｉ−ＧＲＰ結合データのスキャツチャー ド分析によって存在が評価される値の範囲に存在し、そしてこのことは、ゲル上 の強く染色するバンドがＧＲＰ受容体であることを確証した。さらに、精製され たＧＲＰ受容体の見掛は分子量は、親和性ラベルされた受容体により得られた分 子量に相当した。これは、完全な細胞、損なわれていない膜又は可溶性粗抽出物 における受容体に”’Ｉ−ＧＲＰを結合し、そしてホモニ官能価架橋試薬により 受容体−リガント複合体を架橋することによって得られた。

ＳＤＳ　ＰＡＧＥ上でのＧＲＰ受容体バンドの拡散性質は、炭水化物を含むタン パク質の特徴である。精製された受容体の一部を、Ｉｏｄｏｇｅｎ　（Ｐｉｅｒ ｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）の存在下での１２５　■Ｎ　ａｌによる沃 素化により放射性ラベル化し、ゲル上での受容体の検出を増強した。Ｎ−グリカ ナーゼによる放射性ラベルされた受容体の処理は、７０〜１００ＫＤバンドの損 失、及び脱グリコジル化された受容体を表わす、約３６±５ＫＤでの新規バンド の発生をもたらした。

ＧＲＰ受容体の一部のアミノ酸配列の決定精製されたＧＲＰ受容体のＮ−末端近 くの一部の配列を、逐次エドマン分解により決定した。残基８〜１７のために得 られた配列は次の通りであった：　−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−０実施例１１ 精製されたＧＲＰ受容体のトリプシン処理及びトリプシンフラグメントの単離 精製されたＧＲＰ受容体を、実施例１Ｏに記載されるようにして調製した。５ｕ ｐｅｒｏｓｅ−６クロマトグラフイー処理の後、４０ｐモルの受容体を、”Ｉ− ＧＲＰ結合データのスキャッチャード分析に基づいて得た。これは、約１．６μ ｇのタンパク質に相当した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−ＬＯ装置（Ａｍｉｃｏｎ）を 用いての限外濾過により、サンプルを約１００μｌに濃縮した。次に、サンプル を水２ｍｌにより希釈し、そして１００μｌに濃縮した。さらにもう１度、サン プルを水２ｍｌにより希釈し、そして１００μｍに濃縮し、そして最後に、水１ ｍｌにより希釈し、そして１３８μｌに濃縮した。トリプシンにより受容体を消 化するために、トリプシン０．１μｇを添加し、そしてサンプルを３７℃でイン キユベートシた。２時間後、追加の０．１μｇのトリプシンを添加し、続いて、 ５時間のインキュベーションの後、追加の０．２μｇのトリプシンを添加した。

３７℃で２２時間後、サンプルを液体窒素中で急速に凍結せしめ、そして−８０ ℃で貯蔵した。

トリプシン消化されたＧＲＰ受容体を室温に融解し、そして３７℃で３０分間、 １０ｍＭの最終濃度で、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）により還元した。ＤＴＴ 処理された全トリプシン消化物を、２．１　ｍａ＋Ｘ　３　ｃｍの０４カラム（ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、　Ａｑｕａｐｏｒｅ　Ｂｕｔｙｌ、３００オングストローム の孔サイズ）及び水中、Ｏ，ＯＳ％のトリフルオロ酢酸（Ｔ’ＦＡ）（溶媒Ａ） 〜１００％アセトニトリル中、０．０５％のＴＦＡ　（溶媒Ｂ）の線状グラジェ ントを用いて、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分別した。

ＨＰＬＣグラジェントのための条件は、０．２ｍｌ／分の流速で、６０分でＯ％ 溶媒Ａ〜１００％溶媒Ｂであった。流出画分を、２１５ｎｎ＋で検出し、１分間 融で集め、そして４℃で貯蔵した。

ペプチド配列の分析のために、連続的画分をプールし、そして５ｐｅｅｄ　Ｖａ ｃ　（Ｓａｖａｎｔ、　Ｆａｒｍｒｊｒｇｄａｌｅ、　ＮＹ）上で約５０μｌの 最終体積に濃縮した。サンプルを、Ｂｉｏｂｒｅｎｅ　（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ　（ＡＢＴ）、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ　ｓにより処理され、 そして予備循環されたガラス繊維フィルター上に完全に負荷した。

自動化されたアミノ酸分析を、フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ−）アミノ酸 の同定のためにＡＢＩモデルにＯＡネオンライン検出ＨＰＬＣシステムを備えた ＡＢＩモデル４７５Ａガス相配列決定機（Ｈｅｗｉｃｋなど、、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６：７９９０〜７９９７．１９８１）上で行なった。Ｐ ＴＨ−アミノ酸の定量化を、−組の既知のＰＴＨ−アミノ酸対照（ＡＢＩ）’６ ０ｐモルを用いてＡＢ！モデル９００データシステムにより行なった。この態様 においては、組合されたトリプシンＨＰＬＣ画分５６〜５９がアミノ酸配列ＭＡ ＳＦＬＶＦＹＶ　Ｉ　ＰＬＡｌ　１　（Ｔ５６１５９と命名される）を付与し； トリプシンＨＰＬＣ画分４４はアミノ酸配列ＱＬＴＳＶＧＶＳＶ　（Ｔ４４と命 名される）を生成し；そしてトリプシンＨＰＬＣ画分５０はアミノ酸配列ＰＮＬ Ｆ　Ｉ　５ＸＬＡＬＧ　（Ｔ５０と命名される）（ここでＸは同定されていない 残基を示す）を付与した。

Ｎ　Ｈ２−末端配列分析を、水によるサンプルの洗浄及びＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　 １０限外濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ。

ＭＡ）上でのサンプルの濃縮後、損なわれていない精製されたＧＲＰ受容体に対 して行なった。サンプル（９５％又は約９５μｍ）を、Ｂｉｏｂｒｅｎｅ　（Ａ ＢＩ）により予備循環されたガラスフィルター上に負荷し、そしてＮＨｌ−末端 配列の分析を、ＡＢＩ　４７５Ａガス相配列決定機（Ｈｅｗｉｃｋなど、）上で ３０サイクルの自動化されたエドマン分解を通して行なった。ＰＴＨ−アミノ酸 の同定及び定量化を、ＡＢＩ　１２０Ａ　ＰＴＨ−アミノ酸分析機及びＡＢＩ　 ９００データシステムを用いて行なった。ＧＲＰ受容体の２種の精製された調製 物に対する２種の別々のＮ　Ｈｘ−末端配列試験に続いて、次の１７残基のコン センサスＮＨ，−末端アミノ酸配列を得た（ここでＸは特定のアミノ酸の正確な 評価が行なわれていない残基を示す）： ＡＰＮＸＸＳＸＬＮＬＤＶＤＰＦＬＳ。

実施例１２ ５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３ＧＲＰ受容体をコードするｃＤＮＡクローンの同定 予備研究は、ネズミの胚の繊維芽細胞系（Ｂａｌｂ　３Ｔ３）が、ＧＲＰ受容体 発現性５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３ネズミ繊維芽細胞系に量及び分布においてひじように 類似するｍ　ＲＮ　Ａのレパートリ−を発現するが、しかし標準の結合アッセイ において検出できる細胞表面ＧＲＰ受容体を有さなかったことを確立した（Ｋｒ ｉｓなど、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ２６２：１１２１５〜１１２２０゜ １９８７；　Ｚａｃｈａｒｙなど、、Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ　８２　：　７６１６〜７６２０．１９８５）　、これらの観察は、Ｇ ＲＰ受容体ｍＲＮＡが５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３に存在するが、しかＢａ１ｂ　３Ｔ３ ｍＲＮＡに不在である制限された数の転写体の１つであることを示唆した。ポリ アデニル化されたｍＲＮＡを、５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３及びＢａ１ｂ　３Ｔ３細胞系 の両者から単離し、そして５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３のｍＲＮＡに由来するが、しかし Ｂａ１ｂ　３Ｔ３のｍＲＮＡには表わされないｃＤＮＡのために富化された５ｗ １ｓｓ　３Ｔ３消去性ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｗｉｓｓ　３Ｔ３５ｕｂｔｒａ ｃｔｅｄ　ｃＤＮＡ　Ｉｔｂｒａｒｙ）を、出版されている方法論を用いて生成 するために使用した（Ｔｉｍｌｉｎなど、。

Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、１８：１５８７〜１５９３．１９９０．引用 により本明細書に組込まれる）。３００塩基対を越える長さのｃＤＮＡ挿入体を 、λｇｔｌＯバクテリオファージｃＤＮＡクローニングベクターに連結し、そし てライブラリーを、確立された方法（Ｄａｖｉｓなど、、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｔ＋ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

［！１ｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８６）を用いて増幅した。

ライブラリーを、その配列が精製されたＧＲＰ受容体タンパク質のトリプシン消 化物からＨＰＬＣにより精製された内部トリプシンフラグメント（Ｔ５６１５９ ）のアミノ酸配列に基づかれているオリゴヌクレオチドプローブによりスクリー ンした。内部ペプチドのアミノ酸配列（ＭＡＳＦＬＶＦＹＶＩＰＬＡＩＩ）を用 いて、１３：　（５’　ＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＴＣＡＣＡＴＡＧＡ ＡＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴ　３’　）として言及される４４塩基 の長さのプローブをもたらす、その配列が文献（Ｌａｔｈｅ、　Ｍｏｌ旧ｏｆ、 　１８３：１〜１２．１９８５）に記載されるように最適コドン使用頻度に基づ かれている長い非変性アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成した。Ｉ３プロー ブを、γ”Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを用いてＤａｖｉｓなどの 技法により５′末端のリン酸化によりラベルした。ラベルされたプローブを、前 記のハイブリダイゼーション及び洗浄条件（ｗ。

ｏｄ、　Ｃｈａｐｅｒ　４８　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｔｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ　１５２：４４３〜４４７゜１９８７）を用いて消去性ライブラリーから１ ００．０００個のクローンをスクリーンするために使用した。二重反復スクリー ニングは、５種の陽性クローン（プラーク精製された）を同定した。５種のクロ ーンからのＥｃｏＲＩ挿入体を、プラスミドベクターｐＧＥＭ４　（Ｐｒｏｍｅ ｇａ）中にサブクローンし、そしてハイブリダイズする挿入体のヌクレオチド配 列を、５ｅｑｕｅｎａｓｅＺ０二本鎖配列決定キット（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌ）を用いて決定した。５種のクローンのうち２種（ＴＩ及びＴ２）は、オリ ゴヌクレオチドプローブを構成するために使用される内部ペプチドをコードする オーバーラツプＤＮＡ配列の同一領域を有した。そのフラグメントを、ＥｃｏＲ Ｉ消化によりプラスミドベクターから除去し、そして上記（Ｄａｖｉｓなど、） のようにしてゲル電気泳動及びエレクトロエリューションにより精製した。精製 された挿入体フラグメントを、１００，０００個のライブラリーメンバーの第２ スクリーニングにおいて消去性ライブラリーから他のオーバラップｃＤＮＡクロ ーンを同定するプローブを生成するために、市販のキット及び供給者の推薦（Ｂ ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてラン ダムプライマー拡張によりラベルした。同定された９個の追加のクローンのヌク レオチド配列分析は、単一の長い読み取り枠を示し、この予測される翻訳生成物 は、構成配列内で末端が停止コドンになる内部トリプシンフラグメントアミノ酸 配列を包含した。読み取り枠のアミノ末端は、消去されたライブラリーから単離 されたクローンのいづれにも存在しなかった。

読み取り枠のアミノ末端でｃＤＮＡの５′末端を得るために、インビトロポリマ ラーゼ鎖反応増幅（ＰＣＲ）ｃＤＮＡクローニング方法（５’　ＲＡＣＥ）を、 Ｆｒｏｈｍａｎなど、　、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：　８９９８〜９００２． 　１９８８に記載されるようにして、前記で分析されたｃＤＮＡクローンの既知 のヌクレオチド配列に由来する２種のネストされた遺伝子−特異的オリゴヌクレ オチド（ＥＸＴ３：　５　’　ＧＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣ３’　； ＥＸＴ２：５’　ＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＴＴＡ）を用いて行なった。Ｅ ＸＴ３は、５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３　ｍＲＮＡの逆転写のための遺伝子−特異的プラ イマーとして使用され、そしてＥＸＴ４は、ＴａｑＤＮＡポリマラーゼ触媒法Ｐ ＣＲのための遺伝子−特異的プライマーとして使用された。１９個の５’　ＲＡ ＣＥ　ｃＤＮＡを単離し、そして特徴づけ、そして最長の距離に拡張するクロー ンのうち５種を、前記のようにして配列決定した。ヌクレオチド配列の分析は、 イニシエーターメチオニンコドンで開始する、内部トリプシンペプチドアミノ酸 配列をコードする長い読み取り枠の拡張を示した。読み取り枠の予測されるアミ ノ酸配列を、精製されたＧＲＰ受容体（実施例１１）に由来するアミノ末端配列 と比較した。実験的に決定されたアミノ酸配列は、推定される配列の位置ｌでメ チオニンを含まないが、しかし残基２〜１８に十分に対応した。推定されるアミ ノ酸２〜４及び８〜１８（第８Ａ図）は同一であった。

マツチしないアミノ酸（アミノ酸５〜７、第８Ａ図）は、たぶんそれらがＮ−結 合グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｃｙｓ−３ｅｒ）に位置するので、元のアミノ酸 配列においては不明瞭であった。

さらに、精製された５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３ＧＲＰ受容体（実施例１１）に由来する 、内部トリプシンペプチドＴ４４（ＱＬＴＳＶＧＶＳＶ）及びＴ５０　（ＰＮＬ Ｆ　Ｉ　５ＸＬＡＬＧ）からのアミノ酸配列は、複合ＧＲＰ受容体ｃＤＮＡの長 い読み取り枠内でのセグメントにマツチした。

遺伝子特異的プライマー指図のｃＤＮＡクローニングを用いて、中断されていな い完全な読み取り枠をコードする単一のｃＤＮＡクローンを得た。この方法にお いては、ＧＲＰ受容体ｍＲＮＡの３′未翻訳領域の１８個のヌクレオチドセグメ ントに相補的な遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＥｒＴ７：５’ＴＡＣＴＴＴ ＧＡＧＡＴＡＣＡＡＴＧＧ３　’　）を用いて、Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖ逆転写酵素によ る一本鎖ｃＤＮＡの合成をプライムした。二本鎖ｃＤＮＡを生成し、そして標準 の方法（Ｄａｖｉｓなど、）を用いて、λｇｔｌｏ中にクローンした。５００， ０００個のクローンを、ｃＤＮＡの５′未翻訳領域中に拡張する５’ＲＡＣＥｃ ＤＮＡクローンの１つに由来するｃＤＮＡフラグメントプローブによりスクリー ンした。２０個以上のクローンを同定し、そして１０個をプラーク精製し、そし て標準の方法（Ｄａｖｉｓなど、）によりプラスミドベクター中にクローンした 。ヌクレオチド配列の分析は、それらのクローンがＧＲＰ受容体タンパク質の中 断されていない完全な読み取り枠を含むことを確証した。ＧＲＰ受容体のＤＮＡ 配列及びその推定上のアミノ酸配列は、第８図に示される。

読み取り枠のヌクレオチド配列の分析は、予測されるタンパク質のいくつかの興 味ある特徴を示した。そのタンパク質の予測される分子量は、約４３，１００ド ルトンであり、実施例１Ｏに記載される５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３細胞からのＮ−グリ カナーゼ還元されたＧＲＰ結合タンパク質について報告される分子量と一致した 。疎水性の分析は、ＧＲＰ受容体がグアニン−ヌクレオチド結合タンパク質（Ｇ −タンパク質）（Ｆｉｓｃｈｅｒなど、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６ ３：２８０８２８１６．　１９８８）に結合される初期観察に一致する、７個の 推定上のトランスメンブランドメイン（第９図）の存在を予測した。Ｇ−タンパ ク質結合の受容体遺伝子の種類は、典型的には、７個のトランスメンブランドメ イン内の又はそれに隣接する一定の保存される残基を共有する　（Ｍａｓｕなど 、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２９：　８３６〜８３８゜１９８７）。これらの保存さ れるアミノ酸は、ＧＲＰ受容体配列（第８図）の読み取り枠内の予定位置に見出 される。Ｎ−結合のグリコジル化のための５個の可能性ある部位（Ａｓｎ−Ｘ− ５ｅｒ／Ｔｈｒ）が示され（第８図）、これは、ＧＲＰ受容体が強くグリコジル 化され、そしてＧＲＰ受容受容少糖タンパク質−グリカナーゼ処理が、約７０〜 １００ＫＤ〜約３８±５ＫＤのＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク 質の見掛は分子量を減じる観察に一致した。

ノザンプロット分析（Ｄａｖｉｓなど、）を用いて、５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３　ＧＲ Ｐ受容体をコードする転写体の性質を同定したく第１０図）ｏｓｗｉｓｓ　３Ｔ ３及びＢａ１ｂ３Ｔ３細胞に由来するポリアデニル化されたｍＲＮＡ１μｇを精 製し、そしてホルムアルデヒド含有の１％アガロースゲル上での電気泳動により 分解し、続いてそれを、ニトロセルロースフィルターに移した。そのフィルター を、カルボキシ末端トランスメンブランドメイン５，６及び７並びに３′未未翻 訳列の一部をコードする４５０塩基対のｃＤＮＡフラグメントにハイブリダイズ した。そのプローブを、市販のランダムプライマー拡張キット　（Ｂｅｔｈｅｓ ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ｌａｐにより ５００　ｃｐＩ１１／μｇの比活性にラベルした。２種のｍＲＮＡがプローブに 特異的にハイブリダイズし、これらのサイズは、マウス２　Ｂ　Ｓ　（５，０Ｋ ｂ）及び１８Ｓ（２，０Ｋｂ）マーカーに比較して７．２Ｋｂ及び３．ＯＫｂで あることが見積もられた（第１０図）。予測されるように、それらの２種のｍＲ ＮＡ形は、５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３からのｍＲＮＡにのみ検出され、モしてＧＲＰ受 容体転写体はＢａ１ｂ　３Ｔ３細胞からのｍＲＮＡに観察されなかった。

ヒト胎児肺細胞に発現されるＧＲＰ受容体（Ｋｒｉｓなど１．Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２６２：１１２１５１１２２０．　１９８７）と３ｗ１ ｓｓ　３Ｔ３細胞受容体との間の相同性の程度を決定するために、ノザンプロッ ト分析を行なった。ポリアデニル化されたｍＲＮＡをヒト胎児肺細胞から単離し 、そしてプローブとして５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３細胞ＧＲＰ受容体の同じ４５０塩基 対のｃ　ＤＮＡフラグメントを用いて、実施例１２に記載されるようにしてノザ ン分析にゆだねたが、但しハイブリダイゼーションフィルター洗浄段階の厳重さ が減じられた。約７．２及び３．ＯＫｂの２種のｍＲＮＡ種をヒト細胞系に検出 し、これらは、マウス５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３細胞ｍ　ＲＮ　Ａに観察されるものに 一致した（第１２図）。プロットのために使用される条件に基づけば、同定され るｍＲＮＡ種は、５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３　ＧＲＰ受容体プローブに少なくとも８０ ％相同であった。その結果は、実施例１２に記載されるマウスＧＲＰ受容体ｃＤ ＮＡが、ヒトを包含する他の哺乳類種におけるＧＲＰ受容体をコードするｃＤＮ Ａ又はゲノムＤＮＡフラグメントを容易に単離するために使用され得ることを示 唆した。

及び確立された方法（Ｄａｖｉｓなど、、　１９８６）を用いて、転写ベクター ｐＧＥＭ４　（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローンされる？”７スＧＲＰ受容体ｃＤＮ Ａタンパク質コード領域（第８図）から調製した。合成された転写体（約２０ｎ ｇ）を、アフリカッメガエルの卵母細胞中に注入した。１６時間後、卵母細胞を ボルテージクランプし、そして１０−”ＭのＧＲＰを含む溶液に浸した。第１３ 図に示されるように、クロリド電流（約１６０ｎＡの大きさ）に依存するＧＲＰ リガンドが、リガンドの添加と時を同じくした。これらの結果は、Ｃａ’ゝ依存 性クロリドチャネルにＧタンパク質を通して結合される、アフリカッメガエルの 卵母細胞表面上でのインビトロ転写体依存性ＧＲＰ受容体の発現を示す。リガン ド依存性クロリド電流は、応された対照の卵母細胞には観察されなかった。

ＦＩＧＵＲＥ　１ 姉ね濃度（Ｘ） （０，２ＸＣＨＡＰＳ濃度で維持されるＣＨ３濃度）ＦＩＧｔｌＲＥ　２ ＣＨＡＰＳ：　ｃｐｓ比 ロ＝コー競争体 ５＋　ｉｏｏ　ｎＭ　Ｇ日ρ ＦＩＧＵＲＥ　３ ＦＩＧＵＲＥ　４ ＡＢ　ＣＤＥ ＦＩＧｔｌＲＥ　５ Ｗ ２０〇　− ＦＩＧｔＪＲＥ　６ ＦＩＧＵＲＥ　１２ ＦＩＧＬＩＲＥ　１３ 国際調査報告 一崗悄一謔１＾−１−１軸　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０６１２’；

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的に活性のガストリン放出ペプチド受容体ポリペプチドをコードする ガストリン放出ペプチド受容体又はそのフラグメントをコードする単離されたＤ ＮＡ。
2. ２．ガストリン放出ペプチド受容体活性を有する生物学的に活性なタンパク質を コードし、そして第８図のＤＮＡによりハイブリダイズすることができる単離さ れたＤＮＡ。
3. ３．前記タンパク質が第８図のアミノ酸配列を有する請求の範囲第２項記載のＤ ＮＡ。
4. ４．ガストリン放出ペプチド受容体に相同であるタンパク質をコードする単離さ れたＤＮＡであって、前記ＤＮＡがプローブとしてガストリン放出ペプチド受容 体を用いて単離されることを特徴とするＤＮＡ。
5. ５．５′及び３′末端にそれぞれの調節配列をさらに含んで成ることを特徴とす る請求の範囲第１、又は４項記載のＤＮＡ配列。
6. ６．請求の範囲第１，２又は４項記載のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、そして ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入及びヌクレオチド延長 の逆位から成る群から選択された突然変異を含み、そしてガストリン放出ペプチ ド受容体活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
7. ７．請求範囲第１，２又は４項記載のＤＮＡ配列を含んで成ることを特徴とする 組換えＤＮＡ分子。
8. ８．遺伝的制御要素に操作的に結合される請求の範囲第１，２又は４項記載のＤ ＮＡ配列を含んで成ることを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
9. ９．前記制御要素が、原核性プロモーターシステム及び真核性発現制御システム から成る群から選択されることを特徴とする請求の範囲第８項記載の組換えＤＮ Ａ分子。
10. １０．前記分子が原核又は真核宿主におけるガストリン放出ペプチド受容体をコ ードする真核性ｃＤＮＡを発現するための発現ベクターであり、前記ベクターが 前記宿主と適合し、そしてガストリン放出ペプチドをコードする真核性ｃＤＮＡ が、前記ベクターを含む宿主の増殖が前記ｃＤＮＡを発現するようなベクター中 に挿入される請求の範囲第７項記載の組換え体分子。
11. １１．請求の範囲第７項記載の組換えＤＮＡ分子が宿主中に導入され、そして前 記ＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現することを特徴とする宿主。
12. １２．原核生物；たとえばグラム陰性及びグラム陽性生物、たとえばＥ．コリ（ Ｅ．ｃｏｌｉ）；下等真核生物、たとえば酵母：及び高等真核生物、たとえば動 物細胞及び哺乳類細胞、たとえばヒトから成る群から選択される請求の範囲第１ １項記載の宿主。
13. １３．請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列によりコードされ、そして組換え宿主 に由来するもの以外のタンパク質又は細胞汚染物を実質的に有さない組換えＤＮ Ａ。
14. １４．請求の範囲第１３項記載の組換えタンパク質及び従来の医薬的に許容でき るキャリヤー及び／又は希釈剤を含んで成る医薬組成物。
15. １５．生物学的に活性なガストリン放出ペプチド受容体ポリペプチドをコードす るガストリン放出ペプチド受容体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを含 んで成るベクター。
16. １６．前記ＤＮＡがウィルスプロモーターの制御下にある請求の範囲第１５項記 載のベクター。
17. １７．選択マーカーをコードするＤＮＡをさらに含んで成る請求の範囲第１５項 記載のベクター。
18. １８．前記ＤＮＡが、第８図のガストリン放出ペプチド受容体と約５０％以上の アミノ酸相同性を有し、そして第８図のガストリン放出ペプチド受容体と同じよ うに生物学的活性を示す予定された部位特異的変異体のガストリン放出ペプチド 受容体をコードする請求の範囲第１５項記載のベクター。
19. １９．請求の範囲第１５項記載のベクターにより形質転換された多細胞生物から の細胞。
20. ２０．哺乳類細胞である請求の範囲第１９項記載の細胞。
21. ２１．請求の範囲第１９項記載の細胞を栄養培地中で培養し、受容体の培養物で の蓄積を可能にし、そして培養物から受容体を回収することを含んで成る方法。
22. ２２．前記受容体が培養培地から回収される請求の範囲第２１項記載の方法。
23. ２３．組換えガストリン放出ペプチド受容体又はそのフラグメントに対して結合 親和性を有する抗体。
24. ２４．ガストリン放出ペプチド受容体又はそのフラグメントに対して発生せしめ られる請求の範囲第２３項記載の抗体。
25. ２５．前記受容体が第８図のアミノ酸配列を有する請求の範囲第２３又は２４項 記載の抗体。
26. ２６．前記フラグメントが、次の部分的アミノ酸配列：残基１〜３９；残基６４ 〜７７；残基９８〜１１５；残基１３８〜１５７；残基１７６〜２０９；残基２ ３６〜２６６：残基２８８〜３００；及び残基３３０〜３８５から成る群から選 択される請求の範囲第２５項記載の抗体。
27. ２７．非中和抗体である請求の範囲第２３項記載の抗体。
28. ２８．中和抗体である請求の範囲第２３項記載の抗体。
29. ２９．毒素に接合される請求の範囲第２３項記載の抗体。
30. ３０．放射性核種に接合される請求の範囲第２３項記載の抗体。
31. ３１．サンプル中のガストリン放出ペプチド受容体の濃度を決定するためのキッ トであって、ガストリン放出ペプチド受容体のための既知の結合親和性を有する ラベルされた化合物、組換えガストリン放出ペプチド受容体及びラベルされた遊 離化合物から結合体を分離するための手段を含んで成るキット。
32. ３２．前記分離するための手段がガストリン放出ペプチド受容体を固定するため の固相である請求の範囲第３１項記載のキット。
33. ３３．前記ラベルされた化合物がリガンドである請求の範囲第３１項記載のキッ ト。
34. ３４．前記リガンドがガストリン放出ペプチドである請求の範囲第３３項記載の キット。
35. ３５．前記ラベルされたリガンドが抗体である請求の範囲第３１項記載のキット 。
36. ３６．前記固相が捕獲分子を含む請求の範囲第３２項記載のキット。
37. ３７．前記捕獲分子がガストリン放出ペプチド受容体に対する抗体である請求の 範囲第３項記載のキット。
38. ３８．ガストリン放出ペプチド受容体への試験化合物の結合親和性を決定するた めのキットであって、ガストリン放出ペプチド受容体のための既知の結合親和性 を有するラベルされた化合物、組換えガストリン放出ペプチド受容体及びラベル された遊離化合物から結合体を分離するための手段を含んで成るキット。
39. ３９．前記分離のための手段が溶解されたガストリン放出ペプチド受容体を固定 するための固相である請求の範囲第３８項記載のキット。
40. ４０．前記ラベルされた化合物がリガンドである請求の範囲第３８項記載のキッ ト。
41. ４１．前記リガンドがガストリン放出ペプチドである請求の範囲第４０項記載の キット。
42. ４２．前記ラベルされたリガンドが抗体である請求の範囲第３８項記載のキット 。
43. ４３．前記固相が捕獲分子である請求の範囲第３９項記載のキット。
44. ４４．前記捕獲分子がガストリン放出ペプチド受容体に対する抗体である請求の 範囲第４３項記載のキット。
45. ４５．ガストリン放出ペプチド受容体の異常発現又は異常開始に関連する疾病又 は疾患を有する患者の処理方法であって、組換えガストリン放出ペプチド受容体 への結合親和性を有する抗体を投与することを含んで成る方法。
46. ４６．ガストリン放出ペプチド受容体の異常発現又は異常開始に関連する疾病又 は疾患を有する患者の処理方法であって、組換えガストリン放出ペプチド受容体 又はそのフラグメントを投与することを含んで成る方法。