JPH05292998A - 生細胞数及び活力の測定方法 - Google Patents
生細胞数及び活力の測定方法Info
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- JPH05292998A JPH05292998A JP12564192A JP12564192A JPH05292998A JP H05292998 A JPH05292998 A JP H05292998A JP 12564192 A JP12564192 A JP 12564192A JP 12564192 A JP12564192 A JP 12564192A JP H05292998 A JPH05292998 A JP H05292998A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】普通のマイクロプレートリーダーを用いて、簡
便かつ迅速に、多検体の細胞活性及び生細胞数を測定で
きる方法を提供すること。 【構成】生細胞を含む測定系に1,4-ナフトキノン、2-メ
チル−1,4-ナフトキノン（メナジオン）又はテトラメチ
ル−ｐ−ベンゾキノン等の酸化型キノンを作用させ、生
成した過酸化水素を、過酸化水素を受容体とする酵素を
介する間接呈色試薬又は直接呈色試薬と反応させ、その
発色強度を分光光度計（比色計）で定量する。好適な酵
素はペルオキシダーゼ、間接呈色試薬はN-（カルボキシ
メチルアミノカルボニル）-4,4'-ビス（ジメチルアミ
ノ)-ジフェニルアミノナトリウム）又はロイコクリスタ
ルバイオレット、直接呈色試薬はシトクロムｃペルオキ
シダーゼである。
便かつ迅速に、多検体の細胞活性及び生細胞数を測定で
きる方法を提供すること。 【構成】生細胞を含む測定系に1,4-ナフトキノン、2-メ
チル−1,4-ナフトキノン（メナジオン）又はテトラメチ
ル−ｐ−ベンゾキノン等の酸化型キノンを作用させ、生
成した過酸化水素を、過酸化水素を受容体とする酵素を
介する間接呈色試薬又は直接呈色試薬と反応させ、その
発色強度を分光光度計（比色計）で定量する。好適な酵
素はペルオキシダーゼ、間接呈色試薬はN-（カルボキシ
メチルアミノカルボニル）-4,4'-ビス（ジメチルアミ
ノ)-ジフェニルアミノナトリウム）又はロイコクリスタ
ルバイオレット、直接呈色試薬はシトクロムｃペルオキ
シダーゼである。
Description
【０００１】
【発明の利用分野】本発明は生細胞又は生細胞を含む生
きた組織、器官等における細胞の活力又は生細胞数を迅
速かつ確実に測定する方法に関する。
きた組織、器官等における細胞の活力又は生細胞数を迅
速かつ確実に測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術とその問題点】医薬品・化粧品・食品の開
発において、その安全性を知るために動物実験が行われ
てきたが、最近動物実験代替法による安全性評価が注目
されている。その理由として、コストダウン、簡便性及
び迅速性などが挙げられ、その方法として、動物の培養
細胞を利用した細胞毒性の検出定量方法の開発が活発に
なっている。その代表的な方法としては、ストレス（化
学的、物理的）を負荷した培養細胞に色素を取り込ませ
て、その取り込み量で生死を判別する方法がある。その
例としては、ニュートラルレッドの生細胞中のライソゾ
ームへの取り込み、又はテトラゾリウム化合物を生細胞
中のミトコンドリアと反応させ、不溶性呈色生成物を蓄
積させた後、これらの色素量をマイクロプレートリーダ
ーで自動的に分光光学的に定量する方法がある。
発において、その安全性を知るために動物実験が行われ
てきたが、最近動物実験代替法による安全性評価が注目
されている。その理由として、コストダウン、簡便性及
び迅速性などが挙げられ、その方法として、動物の培養
細胞を利用した細胞毒性の検出定量方法の開発が活発に
なっている。その代表的な方法としては、ストレス（化
学的、物理的）を負荷した培養細胞に色素を取り込ませ
て、その取り込み量で生死を判別する方法がある。その
例としては、ニュートラルレッドの生細胞中のライソゾ
ームへの取り込み、又はテトラゾリウム化合物を生細胞
中のミトコンドリアと反応させ、不溶性呈色生成物を蓄
積させた後、これらの色素量をマイクロプレートリーダ
ーで自動的に分光光学的に定量する方法がある。
【０００３】しかしながら、これらの方法においては、
色素を細胞内に浸透蓄積させるためには３〜５時間イン
キュベートすることが必要であり、この培養期間中に細
胞の活性が変化する恐れがあるので、これらの方法は、
分単位で変化する細胞毒性を検知する目的に適したもの
とは言えない。
色素を細胞内に浸透蓄積させるためには３〜５時間イン
キュベートすることが必要であり、この培養期間中に細
胞の活性が変化する恐れがあるので、これらの方法は、
分単位で変化する細胞毒性を検知する目的に適したもの
とは言えない。
【０００４】そこで本発明者らは、上記問題を解決しう
るより迅速な生細胞の活性測定方法として、先に、測定
開始後数分以内に細胞の活性を測定しうる、化学発光を
利用した方法を発明、提案した（特開平１−160499）。
この化学発光利用測定方法は、酸化型キノンと細胞を数
分間インキュベートするだけで発生する過酸化水素を化
学発光試薬と反応させることにより、僅々５秒間でその
量を測定することができる極めて迅速な方法である。生
成した過酸化水素量と細胞活性又は生細胞数との間には
良好な比例関係が成立する。
るより迅速な生細胞の活性測定方法として、先に、測定
開始後数分以内に細胞の活性を測定しうる、化学発光を
利用した方法を発明、提案した（特開平１−160499）。
この化学発光利用測定方法は、酸化型キノンと細胞を数
分間インキュベートするだけで発生する過酸化水素を化
学発光試薬と反応させることにより、僅々５秒間でその
量を測定することができる極めて迅速な方法である。生
成した過酸化水素量と細胞活性又は生細胞数との間には
良好な比例関係が成立する。
【０００５】しかしながら、この化学発光方法では、反
応が動物細胞のための増殖培地や維持培地に含まれてい
る種々のイオン、特にハロゲンイオンによって阻害され
るため、その測定精度を高めるためには、生成する過
酸化水素量がその測定限界濃度である10-6M 以上になる
ように、充分な数の試料細胞を準備すること、化学発
光反応に対する阻害作用が低い培地を選択すること、及
び、発光を測定するための特別な機器を用意すること
等の配慮を必要とする。
応が動物細胞のための増殖培地や維持培地に含まれてい
る種々のイオン、特にハロゲンイオンによって阻害され
るため、その測定精度を高めるためには、生成する過
酸化水素量がその測定限界濃度である10-6M 以上になる
ように、充分な数の試料細胞を準備すること、化学発
光反応に対する阻害作用が低い培地を選択すること、及
び、発光を測定するための特別な機器を用意すること
等の配慮を必要とする。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明が解決を
意図する課題は、一般的に使用されているマイクロプレ
ートリーダーを用いて、簡便かつ迅速に、多検体の細胞
活性及び生細胞数を測定できる方法を提供することであ
る。
意図する課題は、一般的に使用されているマイクロプレ
ートリーダーを用いて、簡便かつ迅速に、多検体の細胞
活性及び生細胞数を測定できる方法を提供することであ
る。
【０００７】
(1) 概要 以上の課題を解決するため、本発明は、生細胞を含む測
定系に酸化型キノンを作用させ、生成した過酸化水素
を、過酸化水素を受容体とする酵素を介して又は直接呈
色試薬と反応させ、その発色強度を分光光度計（比色
計）で定量することを特徴とする生細胞数及び活力の測
定方法を要旨とする。
定系に酸化型キノンを作用させ、生成した過酸化水素
を、過酸化水素を受容体とする酵素を介して又は直接呈
色試薬と反応させ、その発色強度を分光光度計（比色
計）で定量することを特徴とする生細胞数及び活力の測
定方法を要旨とする。
【０００８】(2) 原理 細胞膜及び細胞質には、還元型補酵素ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及びそのリン酸化合
物（ＮＡＤＰＨ）を補酵素として細胞内の酸化物を還元
する酸化還元酵素が存在していると考えられている。特
にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素の存在はよく知
られている。本発明は、細胞培養液に添加した２−メチ
ル−１，４−ナフトキノン（メナジオン）を始めとする
キノン化合物が生細胞と反応して培養液中に過酸化水素
が蓄積されるという上記公開公報記載の発見に基づい
て、この過酸化水素を小容量の反応系で分光光学的に測
定しようとするのが発明の原理である。
デニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及びそのリン酸化合
物（ＮＡＤＰＨ）を補酵素として細胞内の酸化物を還元
する酸化還元酵素が存在していると考えられている。特
にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素の存在はよく知
られている。本発明は、細胞培養液に添加した２−メチ
ル−１，４−ナフトキノン（メナジオン）を始めとする
キノン化合物が生細胞と反応して培養液中に過酸化水素
が蓄積されるという上記公開公報記載の発見に基づい
て、この過酸化水素を小容量の反応系で分光光学的に測
定しようとするのが発明の原理である。
【０００９】本発明の一実施形態（態様１）において
は、生きた細胞がキノン類と反応することにより細胞系
外へ蓄積された過酸化水素を、ペルオキシダーゼのよう
な過酸化水素を受容体とする酵素を介して間接的に呈色
試薬と反応させることにより生じた呈色強度の強弱を分
光光度計で測定することにより、生細胞数を定量する。
は、生きた細胞がキノン類と反応することにより細胞系
外へ蓄積された過酸化水素を、ペルオキシダーゼのよう
な過酸化水素を受容体とする酵素を介して間接的に呈色
試薬と反応させることにより生じた呈色強度の強弱を分
光光度計で測定することにより、生細胞数を定量する。
【００１０】また、本発明の別の実施形態（態様２）に
おいては、生きた細胞がキノン類と反応することにより
細胞系外へ蓄積された過酸化水素に直接シトクロムｃペ
ルオキシダーゼのような呈色試薬と反応させることによ
り生じた発色強度の強弱を分光光度計で測定することに
より、生細胞数を定量する。
おいては、生きた細胞がキノン類と反応することにより
細胞系外へ蓄積された過酸化水素に直接シトクロムｃペ
ルオキシダーゼのような呈色試薬と反応させることによ
り生じた発色強度の強弱を分光光度計で測定することに
より、生細胞数を定量する。
【００１１】(3) 酵素 本発明は、化学発光測定に必要な検体よりも小容量でか
つ細胞数が少ない反応系で発生する微量の過酸化水素を
検出するため、酵素反応を利用することが特色である。
過酸化水素に関連する酸化還元酵素には多くの種類があ
るが、本発明の目的上、過酸化水素をアクセプターとし
て、酸化還元色素、合成呈色試薬などを酸化発色させる
酸化性酵素、即ちペルオキシダーゼが好ましい。市販の
ペルオキシダーゼは、例えば西洋ワサビ、牛乳などから
抽出された３価の鉄ポルフィリン蛋白質である。
つ細胞数が少ない反応系で発生する微量の過酸化水素を
検出するため、酵素反応を利用することが特色である。
過酸化水素に関連する酸化還元酵素には多くの種類があ
るが、本発明の目的上、過酸化水素をアクセプターとし
て、酸化還元色素、合成呈色試薬などを酸化発色させる
酸化性酵素、即ちペルオキシダーゼが好ましい。市販の
ペルオキシダーゼは、例えば西洋ワサビ、牛乳などから
抽出された３価の鉄ポルフィリン蛋白質である。
【００１２】(4) 呈色試薬 上記態様１の間接呈色試薬色素としては、その酸化生成
物が著しく発色する性質を有するもの、例えば０−フェ
ニレンジアミン、３，3'−ジアミノベンジジン、２，2'
−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリンスルホン
酸）、ロイコクリスタルバイオレット、Ｎ−（カルボキ
シメチルアミノカルボニル）−４，4'−ビス（ジメチル
アミノ）−ジフェニルアミノナトリウム（略称ＤＡ−6
4）又は10−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−
３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナト
リウム（略称ＤＡ−67）などが例示されるが、感度、基
質に対する溶解性などの観点で後二者が最も優れてい
る。因に、後二者の色素は、酸化により、夫々ビントシ
ェッドラーグリーン（λmax 727 nm）及びメチレンブル
ー（λmax 666 nm）を生成する。但し、本発明の測定系
には、例えばメナジオン等のキノン類が共存するため、
キノンと反応して発色又は脱色する色素は好ましくな
い。
物が著しく発色する性質を有するもの、例えば０−フェ
ニレンジアミン、３，3'−ジアミノベンジジン、２，2'
−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリンスルホン
酸）、ロイコクリスタルバイオレット、Ｎ−（カルボキ
シメチルアミノカルボニル）−４，4'−ビス（ジメチル
アミノ）−ジフェニルアミノナトリウム（略称ＤＡ−6
4）又は10−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−
３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナト
リウム（略称ＤＡ−67）などが例示されるが、感度、基
質に対する溶解性などの観点で後二者が最も優れてい
る。因に、後二者の色素は、酸化により、夫々ビントシ
ェッドラーグリーン（λmax 727 nm）及びメチレンブル
ー（λmax 666 nm）を生成する。但し、本発明の測定系
には、例えばメナジオン等のキノン類が共存するため、
キノンと反応して発色又は脱色する色素は好ましくな
い。
【００１３】また態様２の直接呈色試薬としては、シト
クロムｃペルオキシダーゼのような酸化還元酵素の介在
なしに直接過酸化水素と反応して発色するものが使用さ
れる。上記シトクロムｃペルオキシダーゼは、過酸化水
素と瞬間的に安定な複合体を形成し、この複合体の吸光
度（λmax419 nm)が酵素の吸光度（λmax408 nm)と相違
しているため、該吸光度差を測定することにより、生成
した過酸化水素の濃度を測定することができる。因に、
該吸光度差のモル吸光係数は、Δε＝50,000 l・mol-1・
cm-1である。
クロムｃペルオキシダーゼのような酸化還元酵素の介在
なしに直接過酸化水素と反応して発色するものが使用さ
れる。上記シトクロムｃペルオキシダーゼは、過酸化水
素と瞬間的に安定な複合体を形成し、この複合体の吸光
度（λmax419 nm)が酵素の吸光度（λmax408 nm)と相違
しているため、該吸光度差を測定することにより、生成
した過酸化水素の濃度を測定することができる。因に、
該吸光度差のモル吸光係数は、Δε＝50,000 l・mol-1・
cm-1である。
【００１４】(5) 測定法 一定濃度、普通103 〜107 細胞／mLに調整した培養細胞
液を例えば96ウェルのマイクロプレートの各ウェル中に
一定量づつ分注し、これに一定量のキノン化合物溶液を
加え、37℃で一定時間インキュベートした後、一定濃度
の呈色試薬を含むＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，N'−ビ
ス−（２−エタンスルホン酸））緩衝液を一定量、次い
で一定量のペルオキシダーゼを含むＰＩＰＥＳ緩衝液を
加え、更に37℃で一定時間インキュベート後、分光光度
計により一定波長（前記ＤＡ−64では727nm)下にける吸
光度を測定し、発色前の対照の吸光度（ブランク）を控
除した値より、予め決定した検量線に従って過酸化水素
の生成量を求める。添付図４に上記方法による標準的な
測定手順を示す。
液を例えば96ウェルのマイクロプレートの各ウェル中に
一定量づつ分注し、これに一定量のキノン化合物溶液を
加え、37℃で一定時間インキュベートした後、一定濃度
の呈色試薬を含むＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，N'−ビ
ス−（２−エタンスルホン酸））緩衝液を一定量、次い
で一定量のペルオキシダーゼを含むＰＩＰＥＳ緩衝液を
加え、更に37℃で一定時間インキュベート後、分光光度
計により一定波長（前記ＤＡ−64では727nm)下にける吸
光度を測定し、発色前の対照の吸光度（ブランク）を控
除した値より、予め決定した検量線に従って過酸化水素
の生成量を求める。添付図４に上記方法による標準的な
測定手順を示す。
【００１５】
【作用】本発明は、発生した過酸化水素を受容体とする
酵素の酸化作用による呈色試薬の発色又は該過酸化水素
と呈色試薬との発色反応を利用するため、微量の試料で
精密な過酸化水素量の測定が可能であり、このため繁用
の96ウェルマイクロプレートを利用して、多検体の同時
定量が可能である。かつ、測定基質中のハロゲンイオン
などによる影響を受けないから、上記「(5) 測定法」の
項中述べたように、細胞培養液を直接測定することも可
能である。
酵素の酸化作用による呈色試薬の発色又は該過酸化水素
と呈色試薬との発色反応を利用するため、微量の試料で
精密な過酸化水素量の測定が可能であり、このため繁用
の96ウェルマイクロプレートを利用して、多検体の同時
定量が可能である。かつ、測定基質中のハロゲンイオン
などによる影響を受けないから、上記「(5) 測定法」の
項中述べたように、細胞培養液を直接測定することも可
能である。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により発明実施の態様を説明す
るが、例示は単に説明用のもので、発明思想の制限又は
限定を意味するものではない。
るが、例示は単に説明用のもので、発明思想の制限又は
限定を意味するものではない。
【００１７】実施例１（生細胞数の測定） (1) 操作法 ミンク肺細胞（Mv1Lu:ATCC CCL64) を37℃、５％CO
2、飽和水蒸気条件下で培養した。培養液は0.4 ％グルタ
ミン、0.4 ％ペニシリン＋ストレプトマイシン、10％牛
胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地高グルコー
スであった。 サブコンフルエント（亜集密的）状態で、細胞をト
リプシン処理及び遠心分離し、培地をハンクス培地に置
き換えた。 ハンクス培地を用いて細胞を約103 〜107 細胞／mL
に希釈・調整し、96ウェルのマイクロプレートの各ウェ
ルに25μL づつ分注した。 各ウェルの細胞懸濁液に0.4mM のメナジオンを含む
ハンクス培地を25μL/ウェル 添加した。37℃で10分間イン
キュベートした後、100 μM のＤＡ−64を含むＰＩＰＥ
Ｓ緩衝液を50μL/ウェル 、更にペルオキシダーゼを含むＰ
ＩＰＥＳ緩衝液(125U/mL) を10μL/ウェル 添加し、再び37
℃で10分間インキュベートした。 各ウェルの反応液
の727nm における吸光度を測定し、細胞を含まない対照
反応液での吸光度（ブランク）を控除した値より、検量
線に従い各ウェルの過酸化水素生成量を求めた。
2、飽和水蒸気条件下で培養した。培養液は0.4 ％グルタ
ミン、0.4 ％ペニシリン＋ストレプトマイシン、10％牛
胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地高グルコー
スであった。 サブコンフルエント（亜集密的）状態で、細胞をト
リプシン処理及び遠心分離し、培地をハンクス培地に置
き換えた。 ハンクス培地を用いて細胞を約103 〜107 細胞／mL
に希釈・調整し、96ウェルのマイクロプレートの各ウェ
ルに25μL づつ分注した。 各ウェルの細胞懸濁液に0.4mM のメナジオンを含む
ハンクス培地を25μL/ウェル 添加した。37℃で10分間イン
キュベートした後、100 μM のＤＡ−64を含むＰＩＰＥ
Ｓ緩衝液を50μL/ウェル 、更にペルオキシダーゼを含むＰ
ＩＰＥＳ緩衝液(125U/mL) を10μL/ウェル 添加し、再び37
℃で10分間インキュベートした。 各ウェルの反応液
の727nm における吸光度を測定し、細胞を含まない対照
反応液での吸光度（ブランク）を控除した値より、検量
線に従い各ウェルの過酸化水素生成量を求めた。
【００１８】(2) 結果及び考察 添付図１の如く、生細胞数と過酸化水素生成量との間に
は、正の比例関係が成立した。生細胞の測定範囲は104
〜２×105 細胞／mLで、96ウェルのマイクロプレートで
は、2.5 ×102 〜５×103 細胞／ウェル が測定可能であっ
た。このときの測定時間は、生細胞とメナジオンのイン
キュベーション時間10分と、過酸化水素測定時間10分と
の合計20分を要した。ただし、細胞の種類や培養条件に
よって測定範囲が変化する。
は、正の比例関係が成立した。生細胞の測定範囲は104
〜２×105 細胞／mLで、96ウェルのマイクロプレートで
は、2.5 ×102 〜５×103 細胞／ウェル が測定可能であっ
た。このときの測定時間は、生細胞とメナジオンのイン
キュベーション時間10分と、過酸化水素測定時間10分と
の合計20分を要した。ただし、細胞の種類や培養条件に
よって測定範囲が変化する。
【００１９】
【図１】
【００２０】これに対し、先発明の化学発光法による過
酸化水素定量法では、直接測定に要する時間は僅か５秒
であるが、測定可能な生細胞数の下限が105 細胞／mLで
あり、また、96ウェルのマイクロプレートの使用は、現
存の発光検出機では感度的に困難である。かつ先発明の
方法は、細胞培養液については適用できないので、事前
に細胞洗浄して測定に好ましい培養液と置換しなければ
ならず、この処理によって細胞の活力が変化する可能性
も考えられる。
酸化水素定量法では、直接測定に要する時間は僅か５秒
であるが、測定可能な生細胞数の下限が105 細胞／mLで
あり、また、96ウェルのマイクロプレートの使用は、現
存の発光検出機では感度的に困難である。かつ先発明の
方法は、細胞培養液については適用できないので、事前
に細胞洗浄して測定に好ましい培養液と置換しなければ
ならず、この処理によって細胞の活力が変化する可能性
も考えられる。
【００２１】以上述べた諸事情を考慮すると、最も使用
頻度の多い96ウェルのマイクロプレートによる生細胞数
の測定については、本発明の方が実際的に優っていると
判断される。
頻度の多い96ウェルのマイクロプレートによる生細胞数
の測定については、本発明の方が実際的に優っていると
判断される。
【００２２】実施例２並びに対照例１及び２（本発明及
び対照法による細胞毒性の測定） 動物細胞に対する各種界面活性剤の細胞毒性を、それぞ
れ本発明法、化学発光法（先発明法）及びニュートラル
レッド取り込み法で測定し、優劣を比較した。 供試界面活性剤など 略号など 化学名 ＢＣ： ベンゼトニウムクロライド ＡＢＡＣ： アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド ツイーン20：ポリオキシエチレンソルビタン モノラウレート グリセロール ＳＤＳ： ドデシル硫酸ナトリウム
び対照法による細胞毒性の測定） 動物細胞に対する各種界面活性剤の細胞毒性を、それぞ
れ本発明法、化学発光法（先発明法）及びニュートラル
レッド取り込み法で測定し、優劣を比較した。 供試界面活性剤など 略号など 化学名 ＢＣ： ベンゼトニウムクロライド ＡＢＡＣ： アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド ツイーン20：ポリオキシエチレンソルビタン モノラウレート グリセロール ＳＤＳ： ドデシル硫酸ナトリウム
【００２３】(1) 操作法（実施例２） (1-1) 発明法（酵素法） ミンク肺細胞（Mv１Lu：ATCC CCL 64)を、96ウェル
のマイクロプレートに２×104 細胞／ウェル になるように
添加し、37℃、５％CO2 、飽和水蒸気条件下で３日間培
養した。培養液は実施例１と同じであった。 コンフルエント（集密的）状態で、各濃度に調整し
た界面活性剤を含む培地に置き換え、更に１時間培養し
た。 培養後、ハンクス培地で繰り返し細胞を洗浄し、界
面活性剤を除去した。各ウェルに0.2mM のメナジオンを
含むハンクス培地を50μL/ウェル 添加した。次いで、37℃
で10分間インキュベートした後、100 μM ＤＡ−64を含
むＰＩＰＥＳ緩衝液を50μL/ウェル 、更にペルオキシダー
ゼを含むＰＩＰＥＳ緩衝液(125U/mL) を10μL/ウェル 添加
し、再び37℃で10分間インキュベートした。 各ウェルの反応液の727nm における吸光度を測定
し、細胞不含の反応液での吸光度（ブランク）を控除し
た値より、検量線に従い、各ウェルの過酸化水素生成量
を求めた。 無処理細胞での過酸化水素生成量に対する、処理細
胞の過酸化水素生成量の比を算出し、活力度とした。
のマイクロプレートに２×104 細胞／ウェル になるように
添加し、37℃、５％CO2 、飽和水蒸気条件下で３日間培
養した。培養液は実施例１と同じであった。 コンフルエント（集密的）状態で、各濃度に調整し
た界面活性剤を含む培地に置き換え、更に１時間培養し
た。 培養後、ハンクス培地で繰り返し細胞を洗浄し、界
面活性剤を除去した。各ウェルに0.2mM のメナジオンを
含むハンクス培地を50μL/ウェル 添加した。次いで、37℃
で10分間インキュベートした後、100 μM ＤＡ−64を含
むＰＩＰＥＳ緩衝液を50μL/ウェル 、更にペルオキシダー
ゼを含むＰＩＰＥＳ緩衝液(125U/mL) を10μL/ウェル 添加
し、再び37℃で10分間インキュベートした。 各ウェルの反応液の727nm における吸光度を測定
し、細胞不含の反応液での吸光度（ブランク）を控除し
た値より、検量線に従い、各ウェルの過酸化水素生成量
を求めた。 無処理細胞での過酸化水素生成量に対する、処理細
胞の過酸化水素生成量の比を算出し、活力度とした。
【００２４】(1-2)対照例１（化学発光法） ミンクの肺細胞（Mv１Lu：ATCC CCL 64)を、24ウェ
ルのマイクロプレートに1.5 ×105 細胞／ウェル となるよ
うに添加し、37℃、５％CO2 、飽和水蒸気条件下で３日
間培養した。培養液は実施例１と同じであった。 コンフルエント状態で、各濃度に調整した界面活性
剤を含む培地に置き換え、更に１時間培養した。 培養後、ＭＥＭ−α（Mimimum Essential Medium E
agle Alpha Modifi-cationの略）で繰り返し細胞を洗浄
し、界面活性剤を除去し、各ウェルにＭＥＭ−α 500μ
L を添加した。 20mMメナジオン溶液を５μL/ウェル 添加して37℃で10
分間インキュベートした後、ＴＤＰＯ（ビス〔４−ニト
ロ−２−［３，６，９−トリオキサデシルオキシカルボ
ニル］−フェニル〕オキサレート）・ピレンを含む発光
試薬を 500μL/ウェル 添加し、５秒間の発光量を測定し
た。 細胞不含の反応液での発光量（ブランク）を控除
し、検量線より各ウェルの過酸化水素生成量を求めた
後、無処理細胞での過酸化水素生成量に対する処理細胞
の過酸化水素生成量の比を算出し、活力度とした。
ルのマイクロプレートに1.5 ×105 細胞／ウェル となるよ
うに添加し、37℃、５％CO2 、飽和水蒸気条件下で３日
間培養した。培養液は実施例１と同じであった。 コンフルエント状態で、各濃度に調整した界面活性
剤を含む培地に置き換え、更に１時間培養した。 培養後、ＭＥＭ−α（Mimimum Essential Medium E
agle Alpha Modifi-cationの略）で繰り返し細胞を洗浄
し、界面活性剤を除去し、各ウェルにＭＥＭ−α 500μ
L を添加した。 20mMメナジオン溶液を５μL/ウェル 添加して37℃で10
分間インキュベートした後、ＴＤＰＯ（ビス〔４−ニト
ロ−２−［３，６，９−トリオキサデシルオキシカルボ
ニル］−フェニル〕オキサレート）・ピレンを含む発光
試薬を 500μL/ウェル 添加し、５秒間の発光量を測定し
た。 細胞不含の反応液での発光量（ブランク）を控除
し、検量線より各ウェルの過酸化水素生成量を求めた
後、無処理細胞での過酸化水素生成量に対する処理細胞
の過酸化水素生成量の比を算出し、活力度とした。
【００２５】(1-3)対照例２（ニュートラルレッド（Ｎ
Ｒ）取り込み法） ミンクの肺細胞（Mv１Lu：ATCC CCL 64)を、96ウェ
ルのマイクロプレートに２×104 細胞／ウェル になるよう
に添加し、37℃、５％CO2 、飽和水蒸気条件下で３日間
培養した。培養液は実施例１と同じであった。 コンフルエント状態で、各濃度に調整した界面活性
剤を含む培地に置き換え、更に１時間培養した。 培養後、培地で細胞を洗浄し、界面活性剤を除去し
た。ＮＲ（ニュートラルレッド）溶液を 100μL/ウェル 添
加し、37℃、５％CO2 、飽和水蒸気条件下で３時間培養
した。 ＮＲ溶液を捨て、固定液(10 ％ホルマリン液)100μ
L/ウェル を添加し、室温にて１分間放置した。 固定液を捨て、抽出液（酸性イソプロパノール) 10
0 μL/ウェル を添加し、室温にて20分間放置した。 軽く攪拌した後、マイクロプレートリーダーで 550
nmの吸光度を測定し、無処理細胞での吸光度に対する処
理細胞での吸光度の比を算出して活力度とした。
Ｒ）取り込み法） ミンクの肺細胞（Mv１Lu：ATCC CCL 64)を、96ウェ
ルのマイクロプレートに２×104 細胞／ウェル になるよう
に添加し、37℃、５％CO2 、飽和水蒸気条件下で３日間
培養した。培養液は実施例１と同じであった。 コンフルエント状態で、各濃度に調整した界面活性
剤を含む培地に置き換え、更に１時間培養した。 培養後、培地で細胞を洗浄し、界面活性剤を除去し
た。ＮＲ（ニュートラルレッド）溶液を 100μL/ウェル 添
加し、37℃、５％CO2 、飽和水蒸気条件下で３時間培養
した。 ＮＲ溶液を捨て、固定液(10 ％ホルマリン液)100μ
L/ウェル を添加し、室温にて１分間放置した。 固定液を捨て、抽出液（酸性イソプロパノール) 10
0 μL/ウェル を添加し、室温にて20分間放置した。 軽く攪拌した後、マイクロプレートリーダーで 550
nmの吸光度を測定し、無処理細胞での吸光度に対する処
理細胞での吸光度の比を算出して活力度とした。
【００２６】(2) 結果及び考察 添付図２及び図３が示すように、供試したどの界面活性
剤についても、測定方法の相違による阻害曲線の差異は
認められなかった。従って、本発明は、公知方法と同様
に細胞毒性の検出に適用できることが判る。
剤についても、測定方法の相違による阻害曲線の差異は
認められなかった。従って、本発明は、公知方法と同様
に細胞毒性の検出に適用できることが判る。
【００２７】
【図２】
【００２８】
【図３】
【００２９】実施例３（キノンの有効性について） 各種のキノンについて、動物細胞の活力測定に対する適
否を検討したところ、CCL 64、PC−3 及びNIH 3T3 の各
細胞に対して、下表−１の示す通り、１，４−ナフトキ
ノン、２−メチル−１，４−ナフトキノン（メナジオ
ン）及びテトラメチル−ｐ−ベンゾキノンの３種類はど
の細胞に対しても有効であったが、１，２−ナフトキノ
ン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、１，５−
ジアミノアントラキノン及びｐ−ベンゾキノンは何れの
細胞についても検出できる量の過酸化水素を生成せず、
また２−ヒドロキシ−１，４ーナフトキノン、アントラ
キノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウム、アントラ
キノン、クロラニル及びクロラニル酸は、細胞の種類に
より測定可能量の過酸化水素を発生しなかった。
否を検討したところ、CCL 64、PC−3 及びNIH 3T3 の各
細胞に対して、下表−１の示す通り、１，４−ナフトキ
ノン、２−メチル−１，４−ナフトキノン（メナジオ
ン）及びテトラメチル−ｐ−ベンゾキノンの３種類はど
の細胞に対しても有効であったが、１，２−ナフトキノ
ン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、１，５−
ジアミノアントラキノン及びｐ−ベンゾキノンは何れの
細胞についても検出できる量の過酸化水素を生成せず、
また２−ヒドロキシ−１，４ーナフトキノン、アントラ
キノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウム、アントラ
キノン、クロラニル及びクロラニル酸は、細胞の種類に
より測定可能量の過酸化水素を発生しなかった。
【００３０】
【表１】
【００３１】
なお本測定は、24ウェルのマイクロ
プレートに細胞を培養し、コンフルエントの状態になっ
た時点で、培養液をＭＥＭ−α 500μL に置換し、20mM
の各キノン５μLを加えて、37℃で10分間インキュベー
トした。その後、実施例１に準じて生成した過酸化水素
を測定する方法を用いた。
なお本測定は、24ウェルのマイクロ
プレートに細胞を培養し、コンフルエントの状態になっ
た時点で、培養液をＭＥＭ−α 500μL に置換し、20mM
の各キノン５μLを加えて、37℃で10分間インキュベー
トした。その後、実施例１に準じて生成した過酸化水素
を測定する方法を用いた。
【００３２】
【発明の効果】以上説明した通り、本発明は、一般的に
使用されているマイクロプレートリーダーを用いて、簡
便かつ迅速に、多検体の細胞活性及び生細胞数を測定で
きる方法を提供できたことにより、薬物、食品などの毒
性検定その他、一般生化学的研究の便益に貢献しうる。
使用されているマイクロプレートリーダーを用いて、簡
便かつ迅速に、多検体の細胞活性及び生細胞数を測定で
きる方法を提供できたことにより、薬物、食品などの毒
性検定その他、一般生化学的研究の便益に貢献しうる。
【図１】本発明方法による動物生細胞数と過酸化水素発
生量との相関を示すグラフ。
生量との相関を示すグラフ。
【図２】本発明法による各種界面活性剤の動物生細胞に
対する阻害作用を示すグラフ。
対する阻害作用を示すグラフ。
【図３】化学発光法及びニュートラルレッド取り込み法
による各種界面活性剤の動物生細胞に対する阻害作用を
示すグラフ。
による各種界面活性剤の動物生細胞に対する阻害作用を
示すグラフ。
【図４】標準的な測定手順を示す流れ図。
Claims (5)
- 【請求項１】 生細胞を含む測定系に酸化型キノンを作
用させ、生成した過酸化水素を、過酸化水素を受容体と
する酵素を介して又は直接呈色試薬と反応させ、その発
色強度を分光光度計（比色計）で定量することを特徴と
する生細胞数及び活力の測定方法。 - 【請求項２】 過酸化水素を受容体とする酵素がペルオ
キシダーゼである請求項１の測定方法。 - 【請求項３】 酸化型キノンが、１，４−ナフトキノ
ン、２−メチル−１，４−ナフトキノン（メナジオ
ン）、テトラメチル−ｐ−ベンゾキノンからなる群から
選ばれた化合物である請求項１の測定方法。 - 【請求項４】 生成した過酸化水素を受容体とする酵素
と共存せしめられる呈色試薬が、Ｎ−（カルボキシメチ
ルアミノカルボニル）−４，4'−ビス（ジメチルアミ
ノ）−ジフェニルアミノナトリウム）又はロイコクリス
タルバイオレットである請求項２の測定方法。 - 【請求項５】 生成した過酸化水素と反応せしめられる
呈色試薬がシトクロムｃペルオキシダーゼである請求項
１の測定方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12564192A JPH05292998A (ja) | 1992-04-17 | 1992-04-17 | 生細胞数及び活力の測定方法 |
| EP93106115A EP0566109A1 (en) | 1992-04-17 | 1993-04-15 | Colorimetric assay for the determination of density or activity of viable cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12564192A JPH05292998A (ja) | 1992-04-17 | 1992-04-17 | 生細胞数及び活力の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05292998A true JPH05292998A (ja) | 1993-11-09 |
Family
ID=14915056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12564192A Pending JPH05292998A (ja) | 1992-04-17 | 1992-04-17 | 生細胞数及び活力の測定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0566109A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05292998A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE184652T1 (de) * | 1993-01-15 | 1999-10-15 | Univ Minnesota | Verfahren zur voraussage des bakterienzuwachses auf einer oberfläche |
| AU710730B2 (en) * | 1993-01-15 | 1999-09-30 | Regents Of The University Of Minnesota | Method to predict active growth of bacteria adhered to a surface |
| CN107907534A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-04-13 | 深圳市安帝宝科技有限公司 | 一种用于1,5‑脱水‑d‑山梨醇检测显色试剂 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3342977A1 (de) * | 1983-11-28 | 1985-06-05 | Barbara Dr. 6220 Rüdesheim Schöbel | Verfahren zur diagnostischen bestimmung von wasserstoffperoxid und wasserstoffperoxid bildenden substrat/enzymmischungen |
| US4746607A (en) * | 1985-02-07 | 1988-05-24 | Eastman Kodak Company | Use of substituted quinone electron transfer agents in analytical determinations |
| JPH07121901B2 (ja) * | 1986-07-01 | 1995-12-25 | 和光純薬工業株式会社 | 新規な尿素誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法 |
| JPH0630628B2 (ja) * | 1987-12-16 | 1994-04-27 | キング醸造株式会社 | 生細胞数及び活力の測定方法 |
-
1992
- 1992-04-17 JP JP12564192A patent/JPH05292998A/ja active Pending
-
1993
- 1993-04-15 EP EP93106115A patent/EP0566109A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0566109A1 (en) | 1993-10-20 |
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