JPH05194586A - ペプチド・ミメティックスの迅速合成およびスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ペプチド・ミメティックスの迅速合成および
スクリーニング方法を提供する。 【構成】 少数の結合段階を用いて極めて多数のペプチ
ドを合成し、これらのペプチドを不均一な混合物として
スクリーニングでまとめることができ、生物活性を発現
する特定のペプチドを同定するペプチドの迅速合成方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】酵素および細胞受容体に対する大
型天然リガンドの高い結合親和性および特異性をまねる
分子の生産を目指す、多数の小型ペプチド類の迅速合成
およびスクリーニングのための研究方法を開発した。こ
れらの属性をもつ分子は「ミメティックス」と名付けら
れ、他方面への用途の可能性を有する。例えばミメティ
ックスは容易に合成される分子を表すから、治療剤とし
て魅力がある。本発明の方法は、時間がかかり、困難な
ことが判っている天然リガンドの体系的な変更、および
天然リガンドと何ら既知の構造類似性をもたない化合物
を無作為にスクリーニングする確率の低い研究方法に代
わり得る方策である。この方法は、従来の固相合成法に
よってこれまで達成し得たよりも、一層多数のペプチド
を迅速に同時生産することを可能とし、また所望の活性
に関わりのある特定の配列を純粋な形で容易に決定し、
合成する方途を提供する。本発明の方法は、従来の技術
より優れた幾つかの重要な進歩を提供する。比較し得る
固相法を用いた幾つかの報告では、同時に作成されるペ
プチド数は実質的に数百個に限定される合成を示してい
るのに対して、本発明の方法では、事実上無制限な数の
ペプチドの合成を提供する。

【０００２】

【従来の技術】固相法を用いて短時間に極めて多数の小
型ペプチドの生産を達成した他の最近の報告では、アミ
ノ酸の混合物を結合してペプチド鎖を伸長する方法を開
示している。この方法では、生じたペプチドの濃度を等
しくするため、アミノ酸の異なった相対結合速度を把握
して、混合物中のアミノ酸濃度を調節する必要がある。
しかもこの方法では、所望の活性に関わりのある正確な
配列を決定するため、多重分析手法の適用を必要とす
る。本発明の方法では、異なったアミノ酸の結合速度を
把握する必要を解消し、単一のアミノ酸または群になっ
たアミノ酸群を、各結合段階毎に結合し、確実に等モル
量でペプチドを生産できる点で異なっている。また本発
明の方法では、化学的分析をせずに所望の配列を同定で
き、純粋な形でその後の生産を行うことができる。さら
に別の報告では、合成したオリゴヌクレオチドを繊維状
のファージへ無作為に挿入する方法を報告している。こ
の生化学的な方法は、おそらく無数の小型ペプチドを生
産できるかもしれないが、ただしそれは遺伝子的に暗号
化されたアミノ酸に限られるに相違なく、直鎖状の配置
を有するものだけのはずである。本発明は、Ｄ−アミノ
酸、またはその他の形で修飾したアミノ酸を包含し、分
枝鎖配列の合成をも包含することができる。これらはい
ずれも組換えＤＮＡ法ではできないものである。多分最
も重要なことは、先行技術の方法とは対照的に本発明の
方法では、保持体樹脂の潜在的な妨害なしに、ペプチド
が標的結合部位と相互作用できる作用能を評価できる点
であろう。要するに本発明は、極めて多数の小型ペプチ
ドを生産でき、所望の活性を発現する特定のペプチドま
たはペプチド群を容易に同定でき、それらを純粋な形で
生産できる効果を提供する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は極めて多数の
小型ペプチドの迅速合成およびスクリーニング方法を提
供する。本発明は、小型ペプチドの混合物を生じること
によって、酵素および受容体に対する天然リガンドの高
い結合親和性および特異性をまねる分子を生産する能力
を増強する。この方法の特性によって、混合物中の各位
置で、それぞれ選ばれたアミノ酸の濃度、およびしたが
って各ペプチドの濃度は、規定された比率内に厳密に維
持される。この方法は、所望の活性に関わりのある特定
のペプチドまたはペプチド群を容易に同定し得る能力を
失うことなく、保持体樹脂を含まずに試験できるペプチ
ド混合物の生産を可能とする。このペプチド混合物は、
最後の結合位置で、そして恐らくは特に選ばれた他の位
置で、共通のアミノ酸を含む一連のペプチドで構成され
るが、ただしその他のすべての残基は、さまざまなアミ
ノ酸が無作為に選ばれる。本発明の目的のために、本発
明の方法で作成されたペプチド配列は、直鎖または分枝
鎖の何れかの構造を有し得る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、保持体樹脂の
アリコートへアミノ酸またはアミノ酸群を個々に完全に
結合させることからなる第１の合成段階、およびそれぞ
れ樹脂結合したアミノ酸またはアミノ酸群のアリコート
を完全に混合し、混合物を等アリコートへ分割し、各ア
リコートへアミノ酸またはアミノ酸群を個々に完全に結
合する追加的な段階からなるｎ個の合成段階によって、
それぞれｎ個のアミノ酸またはアミノ酸群で構成された
ペプチド混合物の第１の合成を実施し、所望により混合
物の各構成要素が、その最後の結合位置で既知のアミノ
酸を有するペプチド混合物を作成するように、混合物毎
にペプチドを樹脂から切り離すことからなるペプチド混
合物の合成方法を提供する。

【０００５】この合成方法は、生物活性を有する個々の
ペプチドまたはペプチド群の配列を決定するため、ある
生物検定でまとめられ得る。まとめられた方法は、さら
に Ａ. 各ペプチド混合物の生物活性の第１の検定を実施
し、それによって第１の合成サイクルを完結し、 Ｂ. 各ｎ結合段階において、第１の合成で使用したのと
同一のアミノ酸またはアミノ酸群を使用して第１の合成
をｎ−１段階まで反復し、ｎ段階では、第１の検定で生
物活性が証明されたペプチド混合物の末端で出現したア
ミノ酸またはアミノ酸群を各ペプチド混合物へ完全に結
合してペプチドの第２の合成を実施し、所望により、混
合物毎にペプチドを樹脂から切り離して各ペプチド混合
物の生物活性の第２の検定を実施し、それによって第２
の合成サイクルを完結し、 Ｃ. 完全に既知の配列からなるペプチドを合成するた
め、合成サイクルの段階を合計ｎ回実施することからな
る。本発明が、分枝したペプチド側鎖を有するペプチド
類を上記と同じ迅速合成方法で作成し得る能力を包含し
ていることに注目すべきである。混合物として作成され
たこれらの分枝した分子を同様に活性について検定し
得、活性を有する特定の分子または分子群の配列を直鎖
状ペプチドの場合と本質的に同一の方法で同定し得る。

【０００６】本発明を開示する説明のため、下記の用語
および略号を使用する。用語および略号 ： Ａｃ：アセチル Ｂｚｌ：ベンジル Ｏ−Ｂｚｌ：ベンジルエステル Ｂｏｍ：ベンジルオキシメチル Ｔｏｓ：トシル［４−トルエンスルホニル］ ２Ｃｌ−Ｚ：２−クロロベンジルオキシカルボニル ２，６Ｃｌ−Ｚ：２，６−ジクロロベンジルオキシカル
ボニル ２Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｘ：その本体が未知であるアミノ酸 本明細書ではＬ−アミノ酸は標準３文字表記法により第
１字を大文字で示し、Ｄ−アミノ酸はすべて小文字を用
いた標準３文字表記法で表す。

【０００７】本発明はペプチド合成に日常適用される固
相合成法を用いて実施できる。一般に、生成したペプチ
ドのＣ−末端アミノ酸残基へ究極的に対応するアミノ酸
を、Ｃ−末端アミノ酸残基のカルボキシル基と、付着部
位として樹脂マトリックスに存在する特定の官能基との
間に生じた共有結合によって、不溶性保持体樹脂へ固定
する。ついでペプチドのＮ−末端残基でアミノ基を順次
連続して結合することにより、樹脂結合したＣ−末端ア
ミノ酸で始まるペプチドを作成する。分枝構造が存在す
る場合は、１個以上のＮ−末端残基が存在し得る。ペプ
チドは合成期間を通じて樹脂へ付着し続けるが、完全な
ペプチド配列が組み立てられたら、樹脂から切り離し得
る。２〜約８個のアミノ酸またはアミノ酸群を含んだペ
プチドを生産する方法は、本発明の特に好ましい態様で
ある。

【０００８】新規方法は、樹脂結合したアミノ酸または
ペプチドを、繰り返し混合、分割、結合することに基づ
いている。第１段階では、保持体樹脂を等量の付着部位
を有するアリコートへ分割する必要がある。次に個々に
選ばれたアミノ酸を各アリコートへ完全に結合させる
が、その場合、樹脂の各アリコートを異なったアミノ酸
へ結合させる。その結果、樹脂の各アリコートは、異な
ったアミノ酸へ結合させた他のアリコートと同一モル量
のアミノ酸へ結合することになる。樹脂を完全に混合
し、樹脂結合したアミノ酸の等モル混合物を作る。つい
で混合物を等アリコートに分割し、個々に選ばれたアミ
ノ酸を、アリコート毎に樹脂結合したアミノ酸へさらに
結合する。混合、分割、結合の各段階を段階的に繰り返
すとペプチド混合物が生じる。その場合、最後に結合さ
せたアミノ酸残基は、与えられた混合物中、すべてのペ
プチドで同一であるが、混合物中の各ペプチドの他のす
べての位置で、アミノ酸残基は、与えられた結合段階で
加えたアミノ酸を等モルずつ選んだことを表す。別法と
して、任意の与えられた結合段階で単一のアミノ酸を結
合させ、合成したすべてのペプチドが与えられた位置で
同一のアミノ酸を有するようにできる。これを実施する
と、結合段階の直前に行う分割段階および結合段階の直
後に行う混合段階を省略し得る。この方法によって前記
と同様にペプチド混合物を生じるが、その場合、アミノ
酸の本体は最後の結合位置だけでなく与えられた位置で
も既知である。

【０００９】この方法は、少数の結合段階を用い、極め
て多数のペプチドを生物学的検定に好適な量で生じる。
その結果、選ばれたアミノ酸を使用して、作成できる限
りのあるゆる配列が作成される。例えばペプチド合成に
２５種のアミノ酸を選び、２５反応を連続して２巡する
５０結合段階だけで、６２５種のジペプチドが生産さ
れ、反応を３巡する７５結合段階では、１５６２５種の
トリペプチドが生産され、反応を４巡する１００結合段
階だけで、３９０６２５種の独自のテトラペプチドが生
産される。混合物中のペプチド数がさらに多い場合で
も、結合段階数を多くすればするほど一層長鎖のペプチ
ドが生産される。合成に使用するために選ぶアミノ酸数
とその種類は、１巡目の反応から次の反応へと変え得る
が、どのアミノ酸が最も好適であるかを推定しない無作
為選択を反映させることもでき、あるいは所望の活性に
影響を及ぼすことが判ってている特徴に基づいて、一定
のアミノ酸を特に選ぶこともできる。この方法で達成で
きる連続結合の数は、ペプチドの固相合成を制限する当
業界既知の因子だけに支配される。ただし混合物中のペ
プチド数を増加すると、ペプチド濃度総和の分数として
各ペプチドの量を減少することに注意すべきである。し
たがって以下に説明するように、ペプチド混合物の合成
をある生物検定でまとめて、活性ペプチドの配列を決定
する場合は、実際に実施できる結合数を決めるのに検定
の感度を考慮しなければならない。即ち、不活性混合物
成分の大過剰の「ノイズ」の中で、恐らく唯一のペプチ
ドから発せられる活性シグナルを認識する検定能におい
ては、活性を試験すべき混合物中に含み得るペプチド数
が制限因子となるであろう。またある検定を、混合物中
のペプチド活性の検出に利用する際は、混合物中のペプ
チドの溶解度も、合成できるペプチドの実質的な限界に
ついてこれと同じ考慮が反映する。

【００１０】ペプチドを生産するこの方法を生物検定と
組み合わせると、活性を有する混合物中のペプチドまた
はペプチド群の特定の配列が容易に同定され、その結
果、純粋な形で生産される。最初にペプチドを樹脂から
切り離したのち、生物活性を検定し得る。ペプチドを樹
脂から切り離すことにより、例えば立体障害のような因
子に起因するペプチド活性を妨害する可能性をとり除
く。ついでペプチドを混合物として生物検定に掛ける。
混合物中の各ペプチドは、最後の結合位置で既知のアミ
ノ酸残基を有するから、検定によって混合物が活性を有
することが判明したら、必然的に最後の結合部位でアミ
ノ酸残基が同定される。ペプチド混合物を合成し、活性
を検定する全体の手順を「合成サイクル」と名付ける。
観察された活性に関わりのある混合物中のペプチドまた
はペプチド群の特定の配列を同定するため、第１の合成
サイクルで検定によって測定された、活性を有する混合
物中のすべてのペプチドを、これと同じ混合、分割、結
合操作によって再合成する。ただしこの第２の合成サイ
クルでは、最後から２番目の結合のあと、ペプチド混合
物を混合しない。即ち、与えられた混合物で、最後から
２番目に結合したアミノ酸の本体は既知である。ついで
前の合成サイクルの生物検定によって同定された最後に
結合したアミノ酸を、混合物毎にペプチドへ結合するか
ら、その結果、最後に結合した２対のアミノ酸残基の本
体は、与えられたペプチド混合物のすべてのペプチドで
既知である。混合物をもう一度生物検定に掛け、活性を
発現した混合物を同定する。その結果、観察された活性
に関わりのあるペプチドの２つのアミノ酸残基の本体が
決定される。所望の活性を有するペプチド混合物を再合
成し、混合物を再検定に掛ける手順を繰り返し、それに
よって混合物で認められた活性に関わりのあるペプチド
配列を完全に解明するまで、合成サイクル毎に追加的な
アミノ酸残基を同定する。

【００１１】使用する樹脂は下記のように作成してもよ
く、あるいは既にアミノ酸を結合した樹脂を商業的な供
給源から購入してもよい。既に樹脂結合した形で購入し
たアミノ酸は、発明の要約で説明した第１の合成の結合
段階のため置換する。個々のアミノ酸からペプチドを生
産する方法だけでなく、群になったアミノ酸群を任意の
結合段階、またはすべての結合段階で結合することがで
きる。群になったアミノ酸群は、この開示範囲で説明し
たように結合することができる単なる既知のペプチドで
ある。したがって、多重ペプチド合成およびスクリーニ
ング技術を用いて既知のペプチド配列をＮ−末端、Ｃ−
末端、またはその双方で伸長することにより、ペプチド
混合物を作成し、生じた活性を有する配列を同定するこ
とができる。また既述したように、この方法によって作
成したペプチドは、分枝した配置を有し得る。

【００１２】ペプチド結合を生成する当業界周知の技術
を用いてアミノ酸を結合する。１つの方法は、カルボキ
シル基がペプチド断片の遊離Ｎ−末端アミノ基との反応
に一層感受性となる誘導体へアミノ酸を変換する方法で
ある。例えば保護基を有するアミノ酸を、クロロギ酸エ
チル、クロロギ酸フェニル、クロロギ酸ｓｅｃ−ブチ
ル、またはクロロギ酸イソブチルと反応することによ
り、アミノ酸を混合無水物へ変換できる。別法としてア
ミノ酸を２，４，５−トリクロロフェニルエステル、ペ
ンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニル
エステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ブチルオ
キシカルボニルエステル（ｔ−ＢＯＣ）、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル、または１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールから作成したエステルのような活性エス
テルへ変換することがてきる。別の結合方法として、
Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）
またはＮ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩ
Ｃ）のような好適なカップリング剤の使用が挙げられ
る。その他の好適なカップリング剤は当業者にとって自
明のことであろう［シュローダー(Schroder)およびルプ
ケ(Lubke)、ザ・ペプタイズ(The Peptides)、アカデミ
ック・プレス社(Academic Press)、１９６５年、第III
章、および米国特許第４２５９２３４号参照］。

【００１３】結合反応の間、反応性α−アミノ官能基が
関与する副反応を防止するため、ペプチド合成に使用す
る各アミノ酸のα−アミノ基を保護しなければならない
ことは理解し得よう。またある種のアミノ酸は反応性の
ある側鎖官能基を含んでおり（例えばスルフヒドリル、
ε−アミノ、β−およびγ−カルボキシル、イミダゾー
ル、グアニジノ、およびヒドロキシル等）、そのような
官能基は、最初の結合段階およびその後の結合段階中、
ともに保護しなければならないことは理解し得よう。好
適な保護基は当業界既知である［例えばプロテクティブ
・グループス・イン・オーガニック・ケミストリー(Pro
tective Groups in Organic Chemistry)」、マコーミー
(M. McOmie)編、プレナム・プレス社(Plenum Press)、
ニューヨーク(Ｎ.Ｙ.)、１９７３年、および米国特許第
４６１７１４９号参照］。個々の保護基を選ぶには一定
の条件を観察しなければならい。α−アミノ保護基は、
結合反応に採用した条件下でα−アミノ官能性を不活性
にしなければならず、結合反応後、保護基は、側鎖の保
護基が除去されず、それによってペプチド断片の構造を
変えない条件下で容易に除去できるものでなければなら
ず、しかもα−アミノ保護基は結合直前の活性化による
ラセミ化の可能性を除かなければなならない。側鎖の保
護基は、結合反応に採用した条件下で側鎖の官能基を不
活性にしなければならず、α−アミノ保護基を除去する
のに採用した条件下で安定でなければならず、しかもペ
プチド完成の際、必要ならばペプチド連鎖の構造を変え
ない条件下で容易に除去できるものでなければならな
い。

【００１４】ペプチド合成に有用なことが判っている保
護基が、その除去の際に使用する試薬に対する反応性を
異にすることは当業者に明らかなことであろう。例えば
トリフェニルメルチルおよび２−（ｐ−ビフェニリル）
イソプロピルオキシカルボニルのようなある種の保護基
は非常に不安定であり、緩和な条件下で切断できる。ｔ
−ブチルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニ
ル、アダマンチルオキシカルボニル、およびｐ−メトキ
シベンジルオキシカルボニルのような他の保護基は、そ
れよりやや不安定性が少なく、その除去にはトリフルオ
ロ酢酸、塩酸または三フッ化ホウ素の酢酸溶液のような
中等度の強酸が必要である。さらにベンジルオキシカル
ボニル、ハロゲン化ベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニ
トロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシ
カルボニルおよびイソプロピルオキシカルボニルのよう
な他の保護基は、さらに不安定性が少なく、その除去の
ためにフッ化水素（ＨＦ）、臭化水素またはトリフルオ
ロ酢酸ホウ素のトリフルオロ酢酸溶液のような強酸が必
要である。また９−フルオロエニルメチルオキシカルボ
ニル（Ｆｍｏｃ）保護基も使用し得、他の保護基をその
まま脱離しない条件下でピペリジンにより容易に除去さ
れる。

【００１５】結合段階が完結したら、保護基をもつペプ
チドを樹脂保持体から切り離し、すべての保護基を除去
し得る。切断反応および保護基の除去は同時に行っても
よく、あるいは段階的に行ってもよい。樹脂保持体がク
ロロメチル化したポリスチレン樹脂である場合、ペプチ
ドを樹脂へ固定している結合は、Ｃ−末端部分の遊離カ
ルボキシル基と、樹脂マトリックス上に存在する多数の
クロロメチル基の１つとの間に生じたエステル結合であ
る。エステル結合を切断することができ、樹脂マトリッ
クスへ浸透できることが判っている試薬によって固着結
合を切断できることは理解し得よう。特に好都合な１方
法は、液体無水ＨＦ処理によるものである。この試薬は
ペプチドを樹脂から切り離すだけでなく、すべての保護
基をも除去し得る。したがってこの試薬を使用すると、
完全に脱保護されたペプチドが直接得られる。保護基を
除去せずにペプチドを切り離したいと所望する場合は、
保護されたペプチド−樹脂結合をメタノール分解し、Ｃ
−末端カルボキシル基がメチル化された保護基をもつペ
プチドを得ることができる。ついで緩和なアルカリ性の
条件下でメチルエステルを加水分解して、遊離のＣ−末
端カルボキシルを得ることができる。ついで液体ＨＦの
ような強酸処理により、ペプチド連鎖上の保護基を除去
できる。本発明のペプチドのようなペプチド生成に関す
る特に有用な手技は、ヒューイ(K.Y. Hui)ら［１９８８
年、ジャーナル・オブ・メジシナル・ケミストリー（J.
Med. Chem.)、３１巻、１６７９〜１６８６頁］により
報告されている。保護基をもつペプチドを樹脂から切り
離す別の方法は、アンモノリシスによるか、またはヒド
ラジン処理による方法である。またＮ−末端α−アミノ
基に存在する保護基が、保護されているペプチドを樹脂
保持体から切り離す前に、または切断と同時に優先的に
除去され得ることは理解し得よう。

【００１６】当業者であれば、本明細書で導入した態様
を既知または開発された任意の固相化学とともに使用
し、アミノ酸および誘導体のあらゆる組み合わせによ
り、任意の鎖長または配列のペプチドを生産できること
は理解し得よう。分枝鎖分子を生じるために、アミノ酸
またはアミノ酸の連鎖を第１の連鎖の残基に存在する２
番目のアミノ基へ結合させ得る。例えばリシンのような
アミノ酸の２番目のアミノ基へアミノ酸またはアミノ酸
群を付着させ得るため、伸長しつつあるすべてのペプチ
ドに共通なある点で、リシンのようなアミノ酸を結合す
ることができる。別法として、アミノ酸が分枝点として
働き得るようにするため、２個またはそれ以上のアミノ
基を有する修飾したアミノ酸を合成し得る。ついでこれ
らの側鎖分枝を、直鎖分子で説明したのと同一の混合、
分割、結合によって伸長することができる。分枝鎖分子
を作成する場合、側鎖分枝上の保護基は１番目の分枝を
組み立てるのに使用した保護基と異なっていなければな
らない。例えばある分枝にｔ−Ｂｏｃ保護基を使用し、
別の分枝にＦｍｏｃ保護基を使用することにより、異な
った条件および異なった脱保護試薬を使用して異なった
分枝の選択的な操作が可能である。

【００１７】天然に存在し、または存在しない多くのア
ミノ酸を、保護しまたは保護しないどちらの形ででも各
種の供給源から商業的に入手できる。商業的な供給源か
ら入手できない他のアミノ酸の場合は合成し得る。本発
明を実施するために必要なすべての試薬および物質は、
他に指定しない場合、アドバンスト・ケムテック(Ad-va
nced ChemTech)（郵便私書箱１４０３、ルイスビル(Lou
isville)、ＫＹ）、またはアプライド・バイオシステム
ズ(Applied Biosystems)、（８５０リンカーンセンター
ドライブ(Lincoln Center Dr.)、フォスターシティー(F
oster City)、ＣＡ）から入手できる。本発明は生物活
性のためのどのような特殊検定にも依存しない。ペプチ
ドの任意の所望の活性を認識し得る任意の検定を本発明
の方法の一部として使用して、所望の活性に関わりのあ
るペプチド混合物中の特定のペプチドまたはペプチド群
を同定し、これを生産することができる。共通の検定と
しては受容体−リガンド結合、免疫学的反応性、または
酵素活性に対する効果等が挙げられる。以下の実施例で
説明する手技および供給源は本発明を説明する手段とし
て示したものであって、発明の範囲を限定する目的をも
つものではない。

【００１８】

【実施例】実施例１ ：ＲａＭＰＳ（商標）［デュポン社(DuPont)、
５４９アルバニーストリート(Albany St.)、ボストン(B
oston)、ＭＡ］多重ペプチド合成装置を使用し、Ｃ−末
端をアミド化したペプチドをｐ−メチルベンズヒドリル
アミン（ｐ−ＭＢＨＡ）樹脂上に合成した。使用したア
ミノ酸はｔ−Ｂｏｃ−α−アミノ保護基を有し、側鎖
は、Ａｓｐ（Ｏ−Ｂｚｌ）、Ｇｌｕ（Ｏ−Ｂｚｌ）、Ｓ
ｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−
Ｚ）、Ｄ−Ｔｙｒ（２，６Ｃｌ−Ｚ）、およびＡｒｇ
（Ｔｏｓ）のような保護基で保護した。ＲａＭＰＳ（商
標）装置は溶媒および未結合のアミノ酸のような可溶性
試薬を吸引するため、基本的に多数のポリプロピレン製
反応容器へ真空を同時に適用できるマニホルドである。
これらの反応容器（カートリッジと呼ばれる）は真空の
適用を調節するためのバルブ、および吸引の際に、保持
体樹脂を任意の結合したアミノ酸またはペプチドと一緒
にカートリッジ内に保持する「ポリボール」をもち、そ
れによって合成の分離、洗浄、中和、脱保護の各段階を
促進する。

【００１９】２２個のカートリッジに、樹脂１ｇ当たり
アミン付着部位約０.６ミリモルを有するｐ−ＭＢＨＡ
樹脂０.２ｇをそれぞれ加えた。アミン付着部位をジイ
ソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の１０％ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＡ）溶液で中和した。表１に挙げた
ｔ−Ｂｏｃ−アミノ酸それぞれ４当量（樹脂アミン１モ
ル当たり４モル）をＤＭＦ １mlに溶解して、カートリ
ッジへ添加した。カートリッジにはそれぞれ異なったｔ
−Ｂｏｃ−アミノ酸を添加した。ついで１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の０.５Ｍ ＤＭＦ溶液
４当量をカートリッジへ添加し、さらにジイソプロピル
カルボジイミド（ＤＩＣ）４当量を加えた。カートリッ
ジを端から端へ６０分間振とうし、ついで洗浄し、中和
し、さらに同一条件下に、同一濃度で、これと同一のア
ミノ酸と再結合した。この第２の結合では、樹脂上のす
べての付着部位が確実に結合することが必要である。次
のアミノ酸へ連続する前に、ニンヒドリン分析によって
結合反応が完全であることを試験した。５０％トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）、５％アニソール、および４５％塩
化メチレンで３０分間処理することにより、ｔ−Ｂｏｃ
−アミノ酸を脱保護した。結合した樹脂を各カートリッ
ジから取り出し、完全に混合し、それによって第１の位
置で結合したアミノ酸のモル量がそれぞれ同一である混
合物を生産した。

【００２０】樹脂結合したアミノ酸混合物を２３個のカ
ートリッジへ均等に分割した。ついで表１に挙げた２２
種のｔ−Ｂｏｃ−アミノ酸および遷移状態のｔ−Ｂｏｃ
アミノ酸「スタチン」（Ｓｔａ）をアミノ酸混合物アリ
コートへ結合させた。その場合、各アリコートを異なっ
たｔ−Ｂｏｃ−アミノ酸と結合させた。この結合を上記
と同様に実施し、それぞれＮ−末端でアミノ酸残基が既
知である２２種の異なった樹脂結合したジペプチドを有
する２３種のペプチド混合物を作成した。結合反応を２
巡すると５０６種の独自のジペプチドが生産された。脱
保護する前に、結合反応が完全であることをもう一度試
験した。樹脂結合したジペプチドをカートリッジから取
り出し、完全に混合し、各位置で結合したアミノ酸のモ
ル量がそれぞれ同一であるジペプチド混合物を作成し
た。樹脂結合したジペプチドを２２個のカートリッジへ
均等に分割した。ついで表１に挙げた２２種のｔ−Ｂｏ
ｃ−アミノ酸をジペプチド混合物アリコートへ結合させ
た。その場合、各アリコートを異なったｔ−Ｂｏｃ−ア
ミノ酸と結合させた。この結合を、上記と同様に、ただ
しｔ−Ｂｏｃアミノ酸を最後に添加して、脱保護の際に
起こり得るジケトピペラジンの生成を防止して実施し、
それぞれＮ−末端のアミノ酸残基が既知である５０６種
の異なった樹脂結合したトリペプチドを有する２２種の
ペプチド混合物を生産した。結合反応を３巡して１１１
３２種の独自のトリペプチドを作成した。脱保護する前
に、結合反応が完全であることをもう一度試験した。樹
脂結合したトリペプチドをカートリッジから取り出し、
完全に混合して、各位置で結合したアミノ酸のモル量が
それそれ同一であるトリペプチド混合物を生産した。

【００２１】樹脂結合したトリペプチド混合物を２２個
のカートリッジへ均等に分割した。ついで表１に挙げた
２２種のｔ−Ｂｏｃ−アミノ酸をトリペプチド混合物ア
リコートへ結合した。その場合、各アリコートを異なっ
たｔ−Ｂｏｃ−アミノ酸と結合させた。この結合を第１
の結合で説明したのと同様に実施し、それぞれＮ−末端
でアミノ酸残基が既知である１１１３２種の異なった樹
脂結合したテトラペプチドを有する２２種のペプチド混
合物を生産した。結合反応を４巡すると２４４９０４種
の独自のテトラペプチドが生産された。結合反応が完全
であることをもう一度試験した。Ｎ−末端残基をアセチ
ル化するため、テトラペプチドを酢酸、ＨＯＢｔ、およ
びＤＩＣの１０当量で２時間インキュベートした。樹脂
結合したアセチル化したテトラペプチドをカートリッジ
から取り出し、ただし前段階とは異なり、各カートリッ
ジで作成したペプチド混合物を別々に保った。したがっ
て共通のカートリッジから得られたすべてのテトラペプ
チドは、Ｎ−末端で結合した同一のアミノ酸を有する
が、連鎖の他のすべての残基は、与えられた段階で結合
させたアミノ酸がそれぞれ等モルずつ無作為に選ばれた
ことを表していた。即ち、各カートリッジから得られた
テトラペプチドは、Ｎ−末端残基を一定に保って、選ば
れたアミノ酸で生産し得るあらゆる可能性のある配列の
等モル混合物を表していた。

【００２２】テトラペプチドをジクロロメタンで洗浄
し、室温で乾燥した。ついでテトラペプチドを、９０％
液体無水ＨＦ／５％ｐ−チオクレゾール／５％ｍ−クレ
ゾールで０℃で７０分間処理してＭＢＨＡ樹脂から切り
離した。この処理によってすべての側鎖保護基も同時に
除去された。ＨＦを留去し、切断したテトラペプチドを
ジエチルエーテル５０mlで０℃で３０分間沈殿させた。
切断したテトラペプチドおよび廃樹脂を半融ガラスロー
トで濾取し、テトラペプチドを沈殿させるため、ジエチ
ルエーテル４×２０mlで洗浄した。沈殿したテトラペプ
チドを５０％酢酸／３０％アセトニトリルに溶解し、こ
れを丸底フラスコへ濾過した。容量の約７０％を真空蒸
留によって留去し、残部を水で希釈し、凍結乾燥した。
回収したペプチドの乾燥重量を測定し、混合物を５０％
酢酸／３０％アセトニトリルに再溶解して、これを少量
ずつのアリコートへ分割した。

【００２３】

【表１】Ｌ−アミノ酸 Ｄ−アミノ酸 アルギニン アラニン アスパラギン酸 アスパラギン グルタミン グルタミン酸 ヒスチジン ロイシン イソロイシン リシン リシン フェニルアラニン フェニルアラニン プロリン プロリン トリプトファン メチオニン チロシン セリン バリン チロシン トリプトファン

【００２４】実施例２：実施例１で生成したテトラペプ
チド混合物を、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）ア
スパルチルプロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害す
るペプチドの阻害能を測定する検定に掛けた。ＨＩＶ−
１複製サイクルにおける臨界段階は、ウイルスゲノムに
よって暗号化されているある種のポリプロテイン生産物
のタンパク質分解プロセッシングである。前駆体タンパ
ク質を切断して、レトロウイルスの生活環に必要な成熟
タンパク質を生成する。したがってＨＩＶ−１プロテア
ーゼに作用して、これを阻害する化合物は、後天性免疫
不全症候群（エイズ）の処置における治療剤として重要
な役割を演じ得る。

【００２５】検定でペプチド濃度合計が約１５５８５μ
Mとなるように、テトラペプチド混合物を、それぞれ試
験前にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。
各混合物には１１１３２種の独自のテトラペプチドが存
在するから、個々のテトラペプチドは、検定でそれぞれ
本質的に１.４μMであった。結果を、切断した基質をタ
ンパク質分解酵素で処理および処理しなかった対照測定
と比較した酵素阻害活性パーセントで報告する。表２か
ら判るように、数種のテトラペプチド混合物は有意なタ
ンパク質分解活性阻害能を示した。Ｎ−末端にＰｈｅ残
基を有するテトラペプチド混合物はプロテアーゼ活性を
１０３％阻害し、観察された活性に関わりのある特定の
ペプチドまたはペプチド群の配列を完全に解明するため
の再合成プロセスに選ばれた。

【００２６】ついでＮ−末端にＰｈｅ残基を有するテト
ラペプチドを、上記と同じ態様で、実施例１で説明した
のと同一組み合わせのアミノ酸を使用し、ただし第３の
結合段階ののち、トリペプチド混合物を互いに混合せず
に再合成した。第３の結合位置でアミノ酸の本体が既知
であるトリペプチド混合物が得られた。ついで各トリペ
プチド混合物をＰｈｅと結合し、Ｎ−末端でその本体が
既知である２個のアミノ酸を有する２２種の樹脂結合し
たテトラペプチド混合物を生産した。これらのテトラペ
プチド混合物を切り離し、実施例１で説明したように検
定のため調製した。テトラペプチド混合物をそれぞれＤ
ＭＳＯで希釈したのち、プロテアーゼ検定に掛けた。検
定におけるペプチドの濃度合計を５０６０μMとし、し
たがって各混合物中の５０６種の独自のテトラペプチド
の濃度はそれぞれ１０μMであった。表２から、Ｎ−末
端にＰｈｅ−Ｉｌｅを有するテトラペプチドがプロテア
ーゼ活性を６８％阻害することが判明した。ついでＮ−
末端にＰｈｅ−Ｉｌｅを有するテトラペプチドを本質的
に実施例１にしたがい、ただし上述のようにＮ−末端で
３個のアミノ酸配列が既知であるように修飾して再合成
した。それぞれ２２種の独自のテトラペプチドを含んで
いる２３種の各テトラペプチド混合物を、上述のように
プロテアーゼ検定で再検定した。検定におけるペプチド
の濃度合計を２２０μMとし、したがって各混合物中の
２２種の独自のテトラペプチドの濃度はそれぞれ１０μ
Mであった。表２から判るように、Ｎ−末端にＰｈｅ−
Ｉｌｅ−Ｓｔａを有するテトラペプチド混合物はプロテ
アーゼ活性を８３％阻害した。

【００２７】

【表２】 決定したテトラペプチド混合物の検定結果 KWN＝既知残基 KWN-X-X-X Phe-KWN-X-X Phe-Ile-KWN-X Phe-Ile-Sta-KWN Arg 17 0 8 8 Ala 11 0 6 Asp 117 0 15 0 Gln 58 0 18 0 His 8 0 21 0 Ile 102 68.0 21 0 Leu 51 0 18 68 Lys 29 0 16 0 Val 30 28 15 1 Phe 57 23 15 43 Phe 103 7 16 0 Pro 9 0 17 0 Met 96 5 19 0 Ser 17 0 18 0 Tyr 98 8 4 0 Trp 65 6 7 19 Trp 81 9 1 0 Lys 5 0 0 0 Pro 9 0 21 0 Tyr 68 5 14 0 Glu 78 0 15 9 Asn 27 0 14 Sta 83.0

【００２８】Ｎ−末端にＰｈｅ−Ｉｌｅ−Ｓｔａを有す
る２２種のテトラペプチドを、本質的に実施例１にした
がってそれぞれ再合成し、プロテアーゼ検定に掛けた。
表２から判るように、テトラペプチドＰｈｅ−Ｉｌｅ−
Ｓｔａ−ｌｅｕはプロテアーゼ活性を６８％阻害し、最
も強力なテトラペプチドであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ポール・デイビッド・ゲゼルヘン アメリカ合衆国46240インディアナ州イン ディアナポリス、ハーバーヒル・ドライブ 3816番 (72)発明者 レベッカ・アン・オーエンズ アメリカ合衆国46218インディアナ州イン ディアナポリス、グレンリッジ・ドライブ 2013番

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 保持体樹脂のアリコートへアミノ酸また
   はアミノ酸群を個々に完全に結合させることからなる第
   １の合成段階、およびそれぞれ樹脂結合したアミノ酸ま
   たはアミノ酸群のアリコートを完全に混合し、混合物を
   等アリコートへ分割し、各アリコートへアミノ酸または
   アミノ酸群を個々に完全に結合する追加的な段階からな
   るｎ個の合成段階によって、それぞれｎ個のアミノ酸ま
   たはアミノ酸群で構成されたペプチド混合物の第１の合
   成を実施し、所望により混合物の各構成要素が、その最
   後の結合位置で既知のアミノ酸を有するペプチド混合物
   を生産するように、混合物毎にペプチドを樹脂から切り
   離すことからなるペプチド混合物の合成方法。
2. 【請求項２】 Ａ. 保持体樹脂のアリコートへアミノ酸
   またはアミノ酸群を個々に完全に結合させることからな
   る第１の合成段階、およびそれぞれ樹脂結合したアミノ
   酸またはアミノ酸群のアリコートを完全に混合し、混合
   物を等アリコートへ分割し、各アリコートへアミノ酸ま
   たはアミノ酸群を個々に完全に結合する追加的な段階か
   らなるｎ個の合成段階によって、それぞれｎ個のアミノ
   酸またはアミノ酸群で構成されたペプチド混合物の第１
   の合成を実施し、所望により混合物の各構成要素が、そ
   の最後の結合位置で既知のアミノ酸を有するペプチド混
   合物を生産するように、混合物毎にペプチドを樹脂から
   切り離して各ペプチド混合物の生物活性の第１の検定を
   実施し、それによって第１の合成サイクルを完結し、 Ｂ. 各ｎ結合段階において、第１の合成で使用したのと
   同一のアミノ酸またはアミノ酸群を使用して第１の合成
   をｎ−１段階まで反復し、ｎ段階では、第１の検定で生
   物活性が証明されたペプチド混合物の末端で出現したア
   ミノ酸またはアミノ酸群を各ペプチド混合物へ完全に結
   合してペプチドの第２の合成を実施し、所望により、混
   合物毎にペプチドを樹脂から切り離して各ペプチド混合
   物の生物活性の第２の検定を実施し、それによって第２
   の合成サイクルを完結し、 Ｃ. 完全に既知の配列からなるペプチドを合成するた
   め、合成サイクルの段階を合計ｎ回実施することからな
   る高度の活性を有するペプチドの同定方法。
3. 【請求項３】 生産したペプチドが分枝した構造を有す
   る請求項１に記載の方法。