JPH05168470A - 複数の細胞種からなる細胞塊状体とシートおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】所望の大きさと細胞組成を有する複数の細胞種
からなる細胞塊状体とシート、およびその製造法を提供
すること。 【構成】複数の細胞種からなりかつ所望の大きさおよび
所望の細胞組成を有することを特徴とする細胞塊状体あ
るいはシート。温度感応性高分子化合物と細胞の接着・
増殖因子からなる細胞培養基材上に複数の細胞種を播種
して培養し、温度をＬＣＳＴ以下に低下させることによ
って該細胞培養基材から脱離し、得られた細胞集合体を
細胞非接着性基材上で浮遊培養して細胞塊状体あるいは
シートにする複数の細胞種からなる細胞塊状体あるいは
シートの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、複数の細胞種からなる
細胞塊状体とシートおよびその製造法に関する。さらに
詳しくは、本発明は所望の大きさを有し、かつ所望の細
胞組成を有する複数の細胞種からなる細胞塊状体とシー
トに関する。本発明の細胞塊状体あるいはシートは、細
胞産生物を効率よく生産することができる点で有用であ
り、また生体組織の欠損部、病変部の修復用の補てつ物
や薬剤等の生体への効果を評価するためのシュミレータ
ーとして利用しうる点でも有用である。

【０００２】

【従来の技術】生体の器官あるいは組織は、多くの種類
の細胞の集合体によって形成されており、その特異的機
能は異種細胞集合体間の相互作用によって発現しかつ制
御されていると考えられている。例えば、血管は内膜、
中膜、外膜からなっていて、内膜には一層の血管内皮細
胞、中膜には平滑筋細胞、そして外膜には線維芽細胞が
それぞれ存在している。各細胞からは種々のケミカルメ
ディエーターあるいはホルモンが分泌され、他の細胞の
機能を制御していることがわかっている。例えば、血管
内皮細胞からは平滑筋細胞を標的とするホルモンが分泌
され、平滑筋細胞の機能である収縮作用を抑制してい
る。また、線維芽細胞からは血管内皮細胞増殖因子が分
泌され、内皮細胞の増殖を促進している。

【０００３】一方、皮膚は表皮層とその内側の真皮層か
ら構成されていて、それぞれの層は表皮細胞および線維
芽細胞からなっている。そして、線維芽細胞からは表皮
細胞の増殖分化を制御する因子が分泌され、表皮細胞か
らは線維芽細胞の増殖を促進する因子が分泌されてお
り、両細胞間の相互作用によって皮膚の機能が有効に制
御されていることが知られている。

【０００４】肝臓もまた主体である肝細胞以外に類洞を
形成する内皮細胞、星細胞などから形成されており、そ
れぞれの細胞集合体が相互に密接な連絡を取り合うこと
によって肝機能を制御しているものと考えられている。

【０００５】従って、生体内で有している機能を維持し
ながら細胞を培養するには、１種類の細胞のみからなる
培養系によるよりも、生体内で共存している異種細胞を
含む共培養系による方が有利であると考えられている。
例えば、ランゲルハンス島細胞および線維芽細胞の共培
養系はランゲルハンス島細胞のみの培養系と比較してラ
ンゲルハンス島細胞からのインスリン分泌能が著しく増
加することが報告されている（Rabionovitch, A. et a
l., DIABETES (1979) 28: 1108）。また、肝細胞と線維
芽細胞の共培養系では、肝細胞のみの培養系と比較して
著しく肝細胞の寿命が延長することも報告されている
（吉里勝利、第４回初代培養肝細胞研究会抄録、(1988)
11）。

【０００６】従来行われてきた共培養法の大半は、種々
の細胞種の混合物を細胞培養基材上に播種し培養する方
法か、それぞれの細胞種を順次播種し培養する方法であ
った。すなわち、従来の共培養は２次元の共培養系によ
るものであったが、かかる２次元培養には種々の問題点
が存在することが指摘されていた。まず、２次元培養は
細胞の増殖過程には有用なものの、細胞の分化の過程に
は不適であるという点が挙げられる。細胞の分化の過程
は、大部分の細胞が生体内でそれぞれの特異的な機能を
発現して行くために必須の過程であることを考えると、
分化の過程に適さない２次元の共培養系は満足のゆくも
のとは言い難い。また、生体内の大部分の細胞は３次元
構築中に存在しているが、２次元培養によってこのよう
な３次元構造を有する細胞を効果的に培養するには原理
的な問題がある。即ち、２次元の培養系を用いて細胞を
培養すると、２次元の細胞基材が細胞を大変強く結合し
束縛してしまうために、細胞が生体内と同様の特異的な
構築を再生したり生体内と同様の機能を発現するのが困
難になってしまう。さらに、従来の２次元の共培養系で
は、培養した細胞をシートあるいは塊状体などの有用な
形態で回収することは不可能であるという大きな欠点も
ある。これは、従来の回収法で用いられるトリプシンお
よびＥＤＴＡなどの細胞脱離剤が、細胞シートあるいは
塊状体などの形状を維持する上で必要な細胞間結合を破
壊してしまうことによるものである。共培養した細胞を
損傷や病変した生体部位に対する置換用補てん物として
使用したり、あるいは試験物質の生物学的活性を測定す
るための組織あるいは器官のモデルとして使用したりす
るためには、細胞シートや塊状体の形態を維持すること
が必要である。

【０００７】そこで、細胞脱離剤を用いることなく細胞
シートあるいは塊状体を形成する方法として、次の２つ
のタイプの方法が検討されてきた。１つは、アガー、ア
ガロースなどの細胞非接着性物質をコーティングした培
養基材上で細胞を浮遊培養して細胞同士を自然に凝集さ
せることによって細胞塊状体を形成する方法である（Ca
rlsson, J., et al., Spheroids in Cancer Research
(1984), 1, editedby Acker, H., et al., Springer-Ve
rlag）。この方法については、ポリヒドロキシエチルメ
タクリレートをコーティングした基材を使用した検討も
なされた（Landry, J. et al., J. Cell Biol. (1985)
101: 914）。もう１つの方法は、細胞が弱く付着できる
細胞弱接着性基材上で培養した細胞が細胞脱離剤を使用
せずに自然と脱離することを利用して細胞塊状体を作製
する方法である。プロテオグリカンコーティング基材
（Koide, N., et al., Biochem. Biophys. Res.Commum.
(1985) 161: 385）およびプラスに荷電したポリスチレ
ン（Koide, N.,et al., Experimental Cell Research
(1990) 186: 227）が上記の細胞弱接着性基材として用
いられている。これら２つの方法は複数の共培養系にも
適用された。アガーコーティング基材を用いた第１の方
法によって、HeLa 細胞と線維芽細胞からなる細胞塊状
体が作製された（Sasaki, T., et al., Cancer Researc
h(1984) 44: 345）。プロテオグリカンコーティング基
材を用いた第２の方法によって、肝細胞と血管内皮細胞
からなる細胞塊状体が作製された（Matsushima, K., et
al., 人工臓器 (1990) 19: 848）。

【０００８】上記の細胞塊状体あるいはシートの作製に
関する従来法の大きな問題点は以下の通りである。

【０００９】（１）従来法はすべての種類の細胞に適用
できるとは限らない。これらの方法による細胞塊状体や
シートの生成はそれぞれの細胞の凝集性および脱離性に
強く依存しているが、その凝集性および脱離性は細胞の
種類によって大きく異なっているためである。

【００１０】（２）従来法では細胞塊状体やシートの大
きさと関連する全細胞数を制御することはほとんど不可
能であった。また、細胞塊状体やシートを形成する細胞
の凝集あるいは脱着が偶然あるいは予想外に起きるため
に、大きさを制御することが不可能であった。このた
め、従来法によって調製した細胞塊状体やシートの大き
さの分布は非常に広い範囲にわたっていた。

【００１１】（３）従来法で複数の細胞種からなる細胞
塊状体やシートを作製する時に、その細胞塊状体やシー
トを構成しているそれぞれの細胞種の組成を制御するこ
とは非常に困難であった。

【００１２】上述した問題点は、得られた細胞塊状体や
シートを損傷あるいは病変した生体部位の修復のために
使用したり、あるいは試験物質の生物活性の評価のため
に組織あるいは器官の代替物として使用したりする場合
には、特に深刻である。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
した問題点を解決した複数の細胞種からなる細胞塊状体
あるいはシートを提供することにある。さらには該細胞
塊状体あるいはシートの製造法を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記の目的は、制御され
た大きさおよび制御された細胞組成を有する複数の細胞
種からなる細胞塊状体あるいはシートを提供する本発明
によって達成された。さらには次の工程からなる該細胞
塊状体あるいはシートを形成する方法を提供する本発明
によって達成された。本発明の細胞塊状体あるいはシー
トの製造法は、（ｉ）細胞培養温度よりも低いＬＣＳＴ
を有する温度感応性高分子化合物と細胞の接着・増殖因
子からなる細胞培養基材上に複数の細胞種を播種して培
養し、（ii）該細胞培養基材上で増殖した複数の細胞種
からなる細胞集合体を該温度を該ＬＣＳＴ以下に低下さ
せることによって該細胞培養基材から脱離し、（iii）
該脱離細胞集合体を細胞非接着性基材上で浮遊培養して
細胞塊状体あるいはシートにする各工程からなる。

【００１５】本発明で使用する細胞培養基材は、温度感
応性高分子化合物と細胞の接着・増殖因子からなる。

【００１６】温度感応性高分子化合物は、ＬＣＳＴ以上
では固化し、ＬＣＳＴ以下になるとすぐに水溶液中に溶
解する。したがって、ＬＣＳＴ以上の温度で複数の細胞
を培養し、その後温度をＬＣＳＴ以下に下げることによ
って培養細胞を脱離することができる。しかし、大部分
の細胞は、温度感応性高分子化合物そのものに接着して
増殖することができないので、細胞培養基材には細胞の
接着・増殖因子も存在させておく。このような培養基材
を使用することによって、その基材上に形成した細胞集
合体を個々の細胞に分解することなく、またその細胞数
を減少させることもなく、該集合体を培養基材から脱着
することができるのである。

【００１７】本発明の製造法の工程（i）では、複数の
細胞種を同時に播種して培養してもよいし、複数の細胞
種を別々にあるいは順次に播種して培養してもよい。複
数の細胞種を同時に播種して培養する場合には複数の細
胞種が該培養基材に直接接着するのに対して、別々にま
た順次に接種して培養する場合にはただ１つの細胞種の
みが該培養基材に接着するだけである。細胞の接着能は
細胞の種類に強く依存するため、同時に複数の細胞種を
播種し培養する方法を採ると、細胞集合体の全細胞数お
よび細胞組成を播種時の細胞組成比によって制御しにく
いこともある。また、細胞の脱着能も細胞の種類に依存
するため、工程（ii）において複数の細胞を同時に脱着
させにくいこともある。このため、接着能や脱着能の異
なる複数の細胞を播種して培養するときには、これらの
細胞を別々にあるいは順次に播種して培養する方法を採
るのが好ましい。

【００１８】最も好ましい方法は、最初の細胞種を播種
しコンフルエントになるまで培養した後に第２番目の細
胞種を播種、培養する方法である。このような順次播種
し培養する方法を採ることによって、各細胞種からなる
多層構造を作製することも可能である。 本発明によれ
ば、実質的には何層からなる細胞集合体でも作製するこ
とができる。好ましいのは約１０層、より好ましくは２
〜５層からなる細胞集合体である。工程（ii）の脱着工
程では、コンフルエントになった第１細胞種が脱着工程
でスカーフのようにその他の細胞種を完全に包み込み、
細胞集合体からの細胞の離散を有効に防止することもで
きる。

【００１９】最終的に得られる細胞塊状体あるいはシー
トの全細胞数および各細胞種の細胞数は、順次播種して
培養する方法を採ることによって容易にかつ正確に制御
することができる。細胞基材上でコンフルエントになっ
た第１細胞種の数は、第２細胞種を播種する前に位相差
顕微鏡などの既知の手段で容易にかつ正確に算出するこ
とができる。続いて播種し培養した第２細胞種の細胞数
も、いろいろな方法で計測することができる。例えば、
第１番目のコンフルエントの細胞層上に付着した第２細
胞種の細胞数を位相差顕微鏡によって直接算出する方法
や、培養液中に浮遊している未接着の第２細胞種の細胞
数を算出して第２細胞種の播種時の細胞数から差し引い
て算出する方法などが挙げられる。

【００２０】工程（iii）において、工程（ii）で脱着
した細胞集合体を細胞非接着性基材の上で浮遊培養する
ことによって、細胞塊状体あるいはシートに変換する。
好ましい細胞非接着性基材の１つは温度感応性高分子化
合物をコーティングしたものである。

【００２１】本発明で播種して培養することができる細
胞種として、線維芽細胞、肝細胞、内皮細胞、膵細胞、
表皮細胞、骨細胞、神経細胞、筋細胞、腎細胞および脳
細胞などを挙げることができるが、本発明はこれらの細
胞種に限定されるものではない。

【００２２】本発明の方法は、所望の大きさと細胞組成
を有する細胞塊状体やシートを製造することができる点
に大きな特徴がある。後述する実施例から明らかなよう
に、細胞培養基材の表面積や各細胞の播種密度を調節す
ることによって、各細胞の数を容易に制御することがで
きる。また、本発明の方法によれば、様々な形態を有す
る細胞塊状体やシートを製造することもできる。例え
ば、適宜条件を設定することによって、特定の細胞が別
の細胞を完全に覆った構造や、特定の細胞が別の細胞を
一部分覆った構造を有する細胞塊状体やシートと製造す
ることができる。このような本発明の方法を利用して製
造される細胞塊状体のうち、膵ランゲルハンス島または
膵ランゲルハンス島細胞からなる中心部を全部または一
部覆った線維芽細胞からなる細胞塊状体は、とくに優れ
た効果を有する。この細胞塊状体は、優れたインスリン
分泌能力を有するとともに、その活性が長期間にわたり
維持されるため、人工臓器としての利用価値が極めて高
いものである。このように、本発明の方法で製造した細
胞塊状体やシートは、生体修復用補てつ物をはじめとす
る医療用製品としての有用性が高いものと期待される。

【００２３】本発明で用いる細胞培養基材に使用する温
度感応性高分子化合物とは、ＬＣＳＴ（Lower Critical
Solution Temperature）を有し、ＬＣＳＴ以下では水
和状態でありＬＣＳＴ以上では脱水和状態に変化するこ
とを特徴とする高分子化合物である。温度感応性高分子
化合物の例としては、ポリＮ置換アクリルアミド誘導
体、ポリＮ置換メタアクリルアミド誘導体およびこれら
の共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレン
オキサイド、エーテル化メチルセルロース、ポリビニル
アルコール部分酢化物などを挙げることができる。特に
好ましいのは、ポリＮ置換アクリルアミド誘導体または
ポリＮ置換メタアクリルアミド誘導体またはこれらの共
重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコ
ール部分酢化物である。

【００２４】好ましい高分子化合物を以下にＬＣＳＴが
低い順に列挙する。

【００２５】ポリーＮ−アクリロイルピペリジン； ポリーＮ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド； ポリーＮ−イソプロピルアクリルアミド； ポリーＮ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド； ポリーＮ−イソプロピルメタアクリルアミド； ポリーＮ−シクロプロピルアクリルアミド； ポリーＮ−アクリロイルピペリジン； ポリーＮ,Ｎ−エチルメチルアクリルアミド； ポリーＮ−シクロプロピルメタアクリルアミド； ポリーＮ−エチルアクリルアミド； 上記の高分子化合物は単独でも、他の単量体と共重合し
てもよい。共重合する単量体としては、親水性単量体、
疎水性単量体のいずれも用いることができる。一般的に
は親水性単量体と共重合するとＬＣＳＴは上昇し、疎水
性単量体と共重合するとＬＣＳＴは下降する。したがっ
て、これらを適宜選択することによっても所望のＬＣＳ
Ｔを有する高分子化合物を得ることができる。

【００２６】親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリ
ドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリル
アミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチル
メタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒ
ドロキシメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレ
ート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およ
びそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチルスルホン酸な
ど、並びに塩基性基を有するＮ,Ｎージメチルアミノエ
チルメタクリレート、Ｎ,Ｎージエチルエチルアミノエ
チルメタクリレート、Ｎ,Ｎージメチルアミノプロピル
アクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられるがこ
れらに限定されるものではない。

【００２７】細胞膜は通常、陰性に荷電しているので静
電的相互作用による基質に対する細胞の接着性を向上さ
せるために、塩基性を有する単量体との共重合体を用い
るのが好ましい。

【００２８】一方、疎水性単量体としては、エチルアク
リレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリ
レート等のアクリレート誘導体およびメタクリレート誘
導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミドなどのＮ置換
アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アク
リロニトリル、スチレン、酢酸ビニルなどが挙げられる
がこれらに限定されるものではない。

【００２９】本発明に使用する温度感応性高分子化合物
は、分子量が１.０ｘ１０⁵以上であることが望ましい。
さらに望ましくは１.０ｘ１０⁶以上である。本発明でい
う分子量とは、粘度より求めた平均分子量をさす。例え
ば、ポリーＮ−イソプロピルアクリルアミドに関して
は、平均分子量（Ｍｎ）と極限粘度（［η］）の関係式
は、 ［η］ ＝ ９,５９ｘ１０^-5 Ｍｎ^0.65 （２７℃テトラヒドロフラン溶液）（伊藤，R. T. Gero
nimo, 繊維高分子材料研究所研究報告第１５９号（１９
８８））となる。

【００３０】一方、本発明で使用する細胞接着・増殖因
子の例としては細胞外マトリックス、ゼラチン、レクチ
ン、フィブロネクチンのような接着性タンパクの結合部
位である接着性オリゴペプチド、イガイ由来の接着性タ
ンパク、塩基性高分子などが挙げられる。細胞外マトリ
ックスとは、生体中の細胞間に存在する物質であり、コ
ラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチ
ン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよびス
ロンボスポンジンなどが挙げられる。

【００３１】塩基性高分子化合物の例としては、ポリリ
ジン、ポリヒスチジン、プロタミンサルフェイト、ポリ
ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ポリジメ
チルアミノプロピル（メタ）アクリレート、ポリエチレ
ンイミンおよびポリビニルピリジンなどが挙げられる。

【００３２】本発明で使用する細胞培養基材は典型的に
は細胞培養温度よりも低いＬＣＳＴを有する温度感応性
高分子化合物と細胞の接着・増殖因子を支持体の上にコ
ーティングすることによって製造することができる。

【００３３】このような培養基材は温度感応性高分子化
合物と細胞接着・増殖因子の混合物の水溶液をＬＣＳＴ
よりも低い温度で支持体の全部あるいは一部にコーティ
ングし、該コーティング層を乾燥することによって得ら
れる。また、温度感応性高分子化合物と細胞の接着・増
殖因子の混合物水溶液中にＬＣＳＴ以下の温度で支持体
を浸漬し、乾燥する工程によっても本発明の培養基材は
得られる。

【００３４】さらに、本発明で使用する培養基材は支持
体表面に温度感応性高分子化合物の層を形成させた後に
該層の上に細胞の接着・増殖因子の層を形成させる方法
によっても得られる。また、本発明に用いられる培養基
材は支持体表面に細胞の接着・増殖因子の層を形成させ
た後に該層の上に温度感応性高分子化合物の層を形成さ
せることによっても得られる。

【００３５】本発明で使用する温度感応性高分子化合物
と細胞の接着・増殖因子との混合割合は典型的には１：
０.１〜１：３であり、この値は用いられる細胞の接着
・増殖因子の種類および細胞種によって変わる。

【００３６】乾燥後のコーティング層の厚さは０.２μm
以上、好ましくは０.５μm以上、より好ましくは１.０
μm以上である。コーティング層の厚さが０.２μm以下
の場合には細胞の脱着性が著しく悪化するため細胞の脱
着に大変長時間を要し、その結果、細胞の機能が不安定
になる。

【００３７】本発明で使用する支持体としては透明ある
いは半透明のものが好ましく、ガラスあるいはプラスチ
ックが好ましい。典型的なプラスチックとして、ポリス
チレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレー
ト、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポ
リアミド、ポリビニリデンフロライド、ポリオキシメチ
レン、ポリビニルクロライド、ポリアクリロニトリル、
ポリテトラフロロエチレンおよびポリジメチルシロキサ
ンなどが挙げられる。支持体の形態については特別の制
限はなく、ディッシュ、プレート、フィルム、シートな
どの形状で用いられる。

【００３８】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明の範囲は特許請求の範囲の項の
記載により定まるものであり、以下の実施例により制限
を受けるものではない。

【００３９】

【実施例】実施例１ Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマー（ＮＩＰＡＡ
ｍ、Eastman KodakCo.）５０ｇをベンゼン５００mlに溶
解し、２,２'−アゾビスイソブチルニトリル（ＡＩＢ
Ｎ）０.２ｇを重合開始剤として使用して、６０℃で１
２時間、窒素気流中にて撹拌下で重合を行った。重合物
はベンゼン中で沈澱するためデカンテーションした後、
沈澱物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解してエチ
ルエーテルを用いて沈澱精製を行うことによってポリー
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）を
得た。このようにして得たＰＮＩＰＡＡｍの数平均分子
量は２.０ｘ１０⁶であった。０.５％（Ｗ／Ｖ）のＰＮ
ＩＰＡＡｍ水溶液のＬＣＳＴおよび１.０％（Ｗ／Ｖ）
のＰＮＩＰＡＡｍのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）のＬＣＳＴ
を濁度法で測定した結果、それぞれ３２℃と２９℃であ
った。ウシの真皮ペプシン可溶化タイプＩコラーゲン
（滅菌済、高研（株）製）０.５％（Ｗ／Ｖ）水溶液を
用いて、ＰＮＩＰＡＡｍ濃度が０.２５％（Ｗ／Ｖ）、
コラーゲン濃度が０.２５％（Ｗ／Ｖ）の等量混合溶液
を作製した。直径約９mmの穴の開いた型と直径約１５mm
の穴の開いた型を用いて、上記の混合溶液を直径が６０
mmの市販品の疎水性ディッシュ（Falcon）底面上にコー
ティングすることによって、コーティング面積が約０.
６cm²の培養基材と約１.８cm²の培養基材（タイプＩ基
材）を作製した。コラーゲンとＰＮＩＰＡＡｍの重量混
合比は１：１でありコーティング層の厚さは約２μmで
あった。またこれとは別に、直径３５mmの市販の組織培
養用ディッシュ（Falcon）上に０.５％（Ｗ／Ｖ）のＰ
ＮＩＰＡＡｍのみを含有する水溶液をコーティングして
タイプII基材を作製した。コーティング層の厚さは約２
μmであった。

【００４０】ヒトの真皮由来の線維芽細胞は Yoshizato
らの方法によって採取、維持した（Yoshizato, K., et
al., Biochem. Biophys. Acta (1980) 627: 23）。初
代培養肝実質細胞は体重が約１５０ｇの５週令の雄ラッ
ト（Charles River Japan,Inc.）から０.０５％（Ｗ／
Ｖ）のコラゲナーゼを用いて肝を灌流することによって
採取した。ヒトの真皮由来の線維芽細胞を１０％（Ｗ／
Ｖ）ＦＢＳ、２０mMＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／mlのペニシ
リンと１００mg／mlのストレプトマイシンを添加した培
地（ＤＭＥＭ）に浮遊させて３７℃に加温した。該ヒト
真皮由来の線維芽細胞浮遊液を播種濃度約４.０ｘ１０⁴
／cm²で表面積がそれぞれ約０.６と約１.８cm²のタイプ
Ｉ基材上に播種した。５％炭酸ガス、９５％空気の加湿
インキュベーター中で３７℃で３日間培養することによ
って、該線維芽細胞はコンフルエント状態に増殖した。
コンフルエント状態の確認およびコンフルエント状態の
線維芽細胞の密度の測定は倒立位相差顕微鏡によって行
った。次に、あらかじめ３７℃に加温したラットの初代
培養肝実質細胞の浮遊培地を、該コンフルエント状態の
線維芽細胞単層上に播種濃度約１.０ｘ１０⁴および約
５.０ｘ１０⁴でそれぞれ播種した。６０分間共培養した
後に９０％以上の肝実質細胞が該コンフルエント線維芽
細胞層に付着していることが倒立顕微鏡観察によって確
認された。その後、培養ディッシュを３７℃のインキュ
ベーターから２５℃の室温中に取り出し約５分間そのま
まの状態で放置した。この操作により、肝細胞が付着し
た線維芽細胞単層はタイプＩ基材からその細胞集合体と
して完全に脱着した。脱着した細胞集合体を、培養液中
に溶解したＰＮＩＰＡＡｍおよびコラーゲンによる汚染
を防止するために冷却したＰＢＳで２回、冷却した培地
で１回洗浄した後に、あらかじめ３７℃に加温してある
タイプII基材中の培地に移した。細胞塊状体の形成およ
び維持は、５％炭酸ガス、９５％空気の加湿インキュベ
ーター中、タイプII基材上にて３７℃で行った。培地交
換は３日毎に行った。

【００４１】細胞塊状体中の線維芽細胞数および肝細胞
数を次の方法によって測定した。４日間培養した細胞塊
状体を４℃で６０分間１０％ホルマリン中性緩衝液に浸
漬することによって固定化した。次に脱水しパラフィン
ワックス中に包埋した。細胞塊状体の中心部付近から厚
さ約２μmの薄層切片を切り出し、ワックスを除去した
後に通常の方法によってヘマトキシリン・エオシン（Ｈ
Ｅ）染色を行った。免疫染色のためにワックスを除去し
た薄層切片を、内在性のペルオキシターゼ活性を除去す
るためにＨ₂Ｏ₂を０.３重量％含有するメタノール中に
３０分間浸漬した。それから該切片を６０分間ヤギ血清
中に浸漬し、次にラットのアルブミンに対するウサギの
ＩｇＧ（Cappel, Organon Teknika Corporation）（Ｐ
ＢＳにより５００倍に希釈）中に３０分間浸漬した。次
いでウサギのＩｇＧに対するビオチン化ヤギ抗体中に３
０分間浸漬し、さらに３７℃で加湿器中でアヴィジンー
ビオチンーペルオキシダーゼ錯体（ＡＢＣ）（Vector L
aboratories, Inc.）中で３０分間浸漬した。結合した
ペルオキシダーゼを、０.０１重量％のＨ₂Ｏ₂を含む０.
５mg／mlのＤＡＢ（Dojindo Laboratories）中に２分間
浸漬することによって検出した。得られた試料切片をヘ
マトキシリンによって中和染色して乾燥した。

【００４２】線維芽細胞と肝細胞の数をＨＥ染色された
切片および上述した間接的免疫ペルオキシダーゼ染色さ
れた切片の顕微鏡写真からそれぞれ算出した。またすべ
ての細胞塊状体の直径を位相差顕微鏡写真から計測し
た。

【００４３】すべての細胞塊状体中の肝細胞および線維
芽細胞の数および塊状体の大きさを表１に示す。表１か
ら明らかなように、タイプＩ基材の表面積および肝細胞
の播種密度を調節することによって、線維芽細胞および
肝細胞の数をそれぞれ容易にかつ正確に制御することが
可能である。また、細胞塊状体の径を本発明の方法にお
ける全細胞数によって正確に制御することも可能であ
る。

【００４４】

【００４５】実施例２ 膵ランゲルハンス島を Lacy の方法（Lacy, P. E., et
al., DIABETES (1967)16: 35）によって約３００ｇの体
重のＷＫＡラットから採取した。得られたランゲルハン
ス島の径は２００〜５００μmであった。

【００４６】タイプＩ基材を実施例１で用いた０.２５
％（Ｗ／Ｖ）ＰＮＩＰＡＡｍ と０.２５％（Ｗ／Ｖ）コ
ラーゲンの混合物水溶液を径が３５mmの Falcon ディッ
シュ上にコーティングすることによって作製した。コー
ティング層中のコラーゲンとＰＮＩＰＡＡｍの混合重量
比は１：１であり、コーティング層の厚みは約２μmで
あった。また、タイプII基材は実施例１で用いた方法で
作製した。実施例１で用いたものと同一の培地中にヒト
真皮由来の線維芽細胞を浮遊させあらかじめ３７℃に加
温して上述のタイプＩ基材上に初期播種濃度が約４.０
ｘ１０⁴／cm²で播種した。５％炭酸ガス、９５％空気の
加湿インキュベーター中４日間、３７℃でコンフルエン
トになるまで培養した。ここで、コンフルエント状態の
確認とコンフルエント状態の線維芽細胞の密度の計測は
倒立位相差顕微鏡によって行った。次いで、３７℃に加
温された培地中に浮遊させた上記の２〜３個のランゲル
ハンス島を上述した線維芽細胞の単層上に播種した。１
０時間後に倒立位相差顕微鏡によって播種したランゲル
ハンス島が線維芽細胞の単層上に接着しているのが確認
された。次いでタイプＩ基材を３７℃のインキュベータ
ーから取り出し、室温（約２５℃）中に放置した。この
操作によって、ランゲルハンス島が接着した線維芽細胞
単層が徐々にタイプＩ基材から脱着し、ランゲルハンス
島を包み込むことが倒立位相差顕微鏡観察によって確認
された。この脱離過程でランゲルハンス島の線維芽細胞
層からの分離は認められなかった。このようにして得ら
れた線維芽細胞とランゲルハンス島からなる細胞集合体
をＰＢＳで２〜３回洗浄した後、上述したタイプII基材
中のあらかじめ加温された培地中に移し、４日毎に培地
交換をしながら浮遊培養を行った。この培養過程で細胞
集合体は完全な細胞塊状体へと変化した。タイプII基材
上で１４日間培養した後、該細胞塊状体を１０％ホルマ
リン中性緩衝液にて固定し、脱水、パラフィンワックス
中に包埋した。細胞塊状体の中心部付近から厚さ約２μ
mの切片層を切り出した。ワックスを除去した後にその
切片層を通常の方法に従ってＨＥ染色した。ＨＥ染色に
より播種したランゲルハンス島が完全に線維芽細胞によ
ってカプセル化されていて該細胞塊状体がランゲルハン
ス島と線維芽細胞からなっていることが確認された。

【００４７】実施例３ 実施例２と同様の方法で、径が約２５０μmのランゲル
ハンス島１個を含むヒト真皮由来の線維芽細胞からなる
細胞塊状体を作製した。５％炭酸ガス、９５％空気の加
湿インキュベーター中で３７℃において、該細胞塊状体
を、１０％（Ｗ／Ｖ）ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを用い
て培地を４日間毎に交換しながらタイプII基材上で培養
した。該細胞塊状体から培地中に分泌されるインスリン
量を通常の免疫分析によって測定した。４０日間の培養
後でもインスリンの分泌量は約３３μＵ／ランゲルハン
ス島／日であった。また、２カ月培養した後、該細胞塊
状体を上述したＨＥ染色で観察したところ線維芽細胞に
よってカプセル化されたランゲルハンス島内部には壊死
は認められなかった。比較実験として径が約３５０μm
のランゲルハンス島のみを上記と同一条件でタイプII基
材上で培養したところ１０日間の培養でインスリンの分
泌量は約４μＵ／ランゲルハンス島／日に低下し、ＨＥ
染色によって２週間の培養でランゲルハンス島内部に壊
死が認められた。これらの事実は線維芽細胞による細胞
塊状体の形成はランゲルハンス島の活性および機能を長
期間維持するために有効であることを示している。

【００４８】実施例４ 実施例２で用いたものと同様のランゲルハンス島から O
no らの方法によってランゲルハンス島細胞を作製した
（Ono, J., et al., Endocrinol. Japan (1977) 24: 26
5）。ランゲルハンス島の代わりにランゲルハンス島細
胞を用いて実施例２と同様の方法で線維芽細胞よりなる
細胞塊状体を作製した。ＨＥ染色の結果、ランゲルハン
ス島細胞が線維芽細胞によって完全にカプセル化されて
いることがわかった。

【００４９】実施例５ 実施例１で用いたものと同一の培地およびタイプＩ基材
をあらかじめ３７℃に加温しヒト真皮由来の線維芽細胞
を初期播種密度約４.０ｘ１０⁴／cm²で播種した。３７
℃で５％炭酸ガス、９５％空気の加湿インキュベーター
中で３日間培養し、コンフルエントの線維芽細胞単層を
作製した。次いで、上述した培地中に浮遊させたヒト臍
帯動脈由来の血管内皮細胞を播種密度約５.０ｘ１０⁴／
cm²で上述の線維芽細胞単層上に播種した。６０分後、
大部分の播種血管内皮細胞が線維芽細胞単層上に接着し
た。次いでタイプＩ基材を３７℃のインキュベーターか
ら取り出し室温（約２５℃）に放置した。倒立位相差顕
微鏡によってこの操作により血管内皮細胞が接着した線
維芽細胞単層が徐々にタイプＩ基材から脱着し、血管内
皮細胞を包みこむことが確認された。この脱着過程では
血管内皮細胞および線維芽細胞の離散はほとんど認めら
れなかった。

【００５０】線維芽細胞と血管内皮細胞からこのように
して得られた細胞集合体をＰＢＳで２〜３回洗浄し、そ
れからタイプII基材中のあらかじめ３７℃に加温された
培地中に移し４日毎に培地を交換しながら浮遊培養し
た。この培養過程で該細胞集合体は完全な細胞塊状体に
変化した。タイプII基材上で１４日間培養した後、該培
養塊状体を１０％ホルマリン中性緩衝液中で固定、脱
水、パラフィンワックス中に包埋した。該細胞塊状体の
中心部近辺から切片層を層厚２μmで切り出した。ワッ
クスを除去した後に通常の方法に従って該切片をＨＥ染
色した。ＨＥ染色により播種された血管内皮細胞が完全
に線維芽細胞によりカプセル化されていて該細胞塊状体
が血管内皮細胞と線維芽細胞からなっていることが確認
された。

【００５１】

【発明の効果】本発明の方法によれば、所望の構造と所
望の細胞組成を有する複数の細胞種からなる細胞塊状体
を容易に得ることができる。従って、本発明の方法は、
様々な細胞塊状体の形成に広く応用することができ、そ
の技術的価値は極めて高いものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｍ 3/00 Ｚ 9050−4Ｂ (72)発明者 森 有一 神奈川県横浜市金沢区釜利谷町1642−21 Ｂ−４ (72)発明者 山崎 学 神奈川県秦野市鶴巻1200−１ コーポ鶴巻 Ａ−405 (72)発明者 窪田 倭 東京都国立市東三丁目21−24

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】複数の細胞種からなりかつ所望の大きさお
   よび所望の細胞組成を有することを特徴とする細胞塊状
   体あるいはシート。
2. 【請求項２】（ｉ）細胞培養温度よりも低いＬＣＳＴを
   有する温度感応性高分子化合物と細胞の接着・増殖因子
   からなる細胞培養基材上に複数の細胞種を播種して培養
   し、 （ii）該細胞培養基材上で増殖した複数の細胞種からな
   る細胞集合体を該温度をＬＣＳＴ以下に低下させること
   によって該細胞培養基材から脱離し、 （iii）該脱離細胞集合体を細胞非接着性基材上で浮遊
   培養して細胞塊状体あるいはシートにする各工程からな
   ることを特徴とする複数の細胞種からなる細胞塊状体あ
   るいはシートの製造法。
3. 【請求項３】請求項２の製造法によって製造される細胞
   塊状体あるいはシート。
4. 【請求項４】請求項３の細胞塊状体あるいはシートを含
   む生体修復用補てつ物。