JPH0470558A - エタノールセンサー - Google Patents
エタノールセンサーInfo
- Publication number
- JPH0470558A JPH0470558A JP2181583A JP18158390A JPH0470558A JP H0470558 A JPH0470558 A JP H0470558A JP 2181583 A JP2181583 A JP 2181583A JP 18158390 A JP18158390 A JP 18158390A JP H0470558 A JPH0470558 A JP H0470558A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- electrode
- electron acceptor
- enzyme
- ethanol
- sensor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 80
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 5
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000007772 electrode material Substances 0.000 claims description 11
- -1 potassium ferricyanide Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000004020 conductor Substances 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 25
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 6
- 239000010439 graphite Substances 0.000 abstract description 6
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 abstract description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 16
- MMXZSJMASHPLLR-UHFFFAOYSA-N coenzyme pyrroloquinoline quinone Natural products C12=C(C(O)=O)C=C(C(O)=O)N=C2C(=O)C(=O)C2=C1NC(C(=O)O)=C2 MMXZSJMASHPLLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical class NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 2
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589236 Gluconobacter Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012556 adjustment buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 230000027721 electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 239000011088 parchment paper Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007785 strong electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- DCXPBOFGQPCWJY-UHFFFAOYSA-N trisodium;iron(3+);hexacyanide Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] DCXPBOFGQPCWJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、液体試料中のエタノール濃度を測定するエタ
ノールセンサーに関する。
ノールセンサーに関する。
浴液中のエタノールを測定するセンサーとしては、ガス
透過性チューブにキャリヤーガスを流し、チューブ内に
透過したエタノールをガスクロマトグラフ、赤外線ガス
検出器などで検知する装置が知られている。このものは
オンライン計測が可能であるが、装置が大型で複雑であ
るためエタノール測定を簡便に行えないという欠点を有
していた。 これに対して、小型のアルコールセンサーとしては、ア
ルコールに作用する種々の酵素を利用したものが開発さ
れている。これらは、構成が簡単であり比較的容易に作
成できることから実用に供されている。 これらのうち、アルコールオキシダーゼを使用したもの
は、この酵素の基質特異性が低く、メタノールにもエタ
ノールと同様に反応するという欠点を有している。 また、ニコチンアミドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤ）
依存のアルコール脱水素酵素を用いるセンサーは、メタ
ノールに反応しないという点で特異性には優れているが
、高価なＮＡＤを使用しなければならず、またＮＡＤＨ
からＮＡＤへの再生も困難であるため実用的でなかった
。 これらの欠点を克服するために、酢酸菌に存在する細胞
膜結合性アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）ご利用したセ
ンサーが開発されている。この酵素は補酵素ピロロキノ
リンキノン（ＰＱＱ）関与で、エタノールに選択的に反
応する。ＰＱＱはＡＤＨと強く結合しているため特別に
固定化する必要がなく、ＮＡＤを使用する必要もないと
いう優れた特徴を有している。 従来、酢酸菌に存在する膜結合型ＡＤＨを利用したセン
サーに関する公開特許としては、■特開昭６１−２６５
５６０号、■特開昭６１−２８１９６１号、■特開昭６
２−２７７５４８号、■特開平１−９６５５２号、■特
開平１−９７８５１号がある。 これらのうち■、■、■は測定系に電子受容体を使用し
ていない、従って、エタノールが酵素により酸化される
と同時に還元型へ変化したＰＱＱを酸化型へ戻す系が弱
いため応答に時間がかかる。 ■、■は測定液中に酸化型の電子受容体を溶解している
。従って、測定時には電子受容体が酵素反応と共役し、
ＰＱＱを酸化型へ復帰させ、自身は還元される。さらに
、これを電極で酸化する方法をとっているので短時間で
測定が可能である。
透過性チューブにキャリヤーガスを流し、チューブ内に
透過したエタノールをガスクロマトグラフ、赤外線ガス
検出器などで検知する装置が知られている。このものは
オンライン計測が可能であるが、装置が大型で複雑であ
るためエタノール測定を簡便に行えないという欠点を有
していた。 これに対して、小型のアルコールセンサーとしては、ア
ルコールに作用する種々の酵素を利用したものが開発さ
れている。これらは、構成が簡単であり比較的容易に作
成できることから実用に供されている。 これらのうち、アルコールオキシダーゼを使用したもの
は、この酵素の基質特異性が低く、メタノールにもエタ
ノールと同様に反応するという欠点を有している。 また、ニコチンアミドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤ）
依存のアルコール脱水素酵素を用いるセンサーは、メタ
ノールに反応しないという点で特異性には優れているが
、高価なＮＡＤを使用しなければならず、またＮＡＤＨ
からＮＡＤへの再生も困難であるため実用的でなかった
。 これらの欠点を克服するために、酢酸菌に存在する細胞
膜結合性アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）ご利用したセ
ンサーが開発されている。この酵素は補酵素ピロロキノ
リンキノン（ＰＱＱ）関与で、エタノールに選択的に反
応する。ＰＱＱはＡＤＨと強く結合しているため特別に
固定化する必要がなく、ＮＡＤを使用する必要もないと
いう優れた特徴を有している。 従来、酢酸菌に存在する膜結合型ＡＤＨを利用したセン
サーに関する公開特許としては、■特開昭６１−２６５
５６０号、■特開昭６１−２８１９６１号、■特開昭６
２−２７７５４８号、■特開平１−９６５５２号、■特
開平１−９７８５１号がある。 これらのうち■、■、■は測定系に電子受容体を使用し
ていない、従って、エタノールが酵素により酸化される
と同時に還元型へ変化したＰＱＱを酸化型へ戻す系が弱
いため応答に時間がかかる。 ■、■は測定液中に酸化型の電子受容体を溶解している
。従って、測定時には電子受容体が酵素反応と共役し、
ＰＱＱを酸化型へ復帰させ、自身は還元される。さらに
、これを電極で酸化する方法をとっているので短時間で
測定が可能である。
上記■、■においては、電子受容体としてフェリシアン
化カリウムやフェナジンメトサルフェート（Ｐ Ｍ Ｓ
）等を測定液もしくは電解液に溶解して使用している
。この測定液は、センサーを長時間使用した場合にはか
なりの量に達する。特に、フローセル方式の測定法では
液量が多くなる。その場き、電子受容体を測定液や電解
液に溶解して利用することは作業性が悪く、フェリシア
ン化カリウムを使用する場きは特にシアンイオンの廃液
処理の問題が生じる。また、ＰＭＳ’＆使用する場合は
、特にランニングコストが高くなる。 また、測定時間としては、■は数分、■は１〜２分を必
要としており、多くの試料を測定する場合にはさらに短
時間で測定可能であることが望ましい。
化カリウムやフェナジンメトサルフェート（Ｐ Ｍ Ｓ
）等を測定液もしくは電解液に溶解して使用している
。この測定液は、センサーを長時間使用した場合にはか
なりの量に達する。特に、フローセル方式の測定法では
液量が多くなる。その場き、電子受容体を測定液や電解
液に溶解して利用することは作業性が悪く、フェリシア
ン化カリウムを使用する場きは特にシアンイオンの廃液
処理の問題が生じる。また、ＰＭＳ’＆使用する場合は
、特にランニングコストが高くなる。 また、測定時間としては、■は数分、■は１〜２分を必
要としており、多くの試料を測定する場合にはさらに短
時間で測定可能であることが望ましい。
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究の結果、電子受
容体を電解液中から排除し、また、短時間で測定が可能
なエタノールセンサーを開発した。 すなわち本発明は、水溶性フェリシアン酸塩と陽イオン
界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン界面活性剤か
ら合成される疎水性化合物を電子受容体として、酢酸菌
膜結合性アルコール脱水素酵素とともに電極剤として混
在せしめた酵素及び電極受容体修飾電極と参照電極とを
組み合わせてなるエタノールセンサーである。 上記に本発明において、水溶性フェリシアン酸塩として
は、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウ
ム、その池水溶性のフェリシアン化物が挙げられる。 また、陽イオン界面活性剤としては長鎖第４級アンモニ
ウム塩、長鎖アルキルピリジニウム塩等が、両性界面活
性剤としては例えばアルキルジアミノエチルグリシン形
のものが、そして非イオン界面活性剤としては例えばポ
リオキシエチレン系のもの等が挙げられる。 水溶性フェリシアン酸塩、例えばフェリシアン化カリウ
ムとこれらの界面活性剤とは、水溶液中で反応を起こし
黄色沈でんを生じる。この沈澱物質は本発明における電
子受容体として用いられる。 以下に反応式の一例を示す。 ３［Ｃ＋５Ｈ３）Ｎ（ＣＩ＊）ｘ］Ｂｒ ＋ＫＪｅ（
ＣＮ）ａ→［Ｃ＋５ｔ（ｚｚ（ＣＨｓ）ｚｌｚ［Ｆｅ（
ＣＮ）ａ］’ ＋ ３ＫＢｒ得られた化合物は疎水性
であるので、濾過、水洗して簡単に精製することができ
る。 過去にこのような化合物を電子受容体としてセンサーに
利用した例はない。 また、本発明において使用する細胞膜結合型ＡＤＨを産
生ずる酢酸菌としては、アセトバクター属（＾ｃｅｔｏ
ｂａｃ ｔｅｒ）グルコノバクタ−属（Ｇ ｌ ｕｅｏ
ｎｏｂａｅｔｅｒ）に属するいずれの酢酸菌の菌体でも
よい。 酵素はフレンチプレス法や超音波法等の常法により細胞
膜画分を分離し、さらに界面活性剤で細胞膜画分から抽
出し、種々のクロマトグラフィーにより精製単離して得
ることができる。また、精製単離を行わなくとも酢酸菌
の菌体そのままあるいは細胞膜画分といった粗標品でも
酵素源として利用できる。 なお、本発明の場合も常法と同様に、電極剤にはグラフ
ァイト等の導電性材料粉末を混合して、エタノールセン
サー表面から得られる電流を容易に電極棒へ導くように
することが好ましい。 さらに、本発明のエタノールセンサーの電極剤には、有
機結合剤、例えば流動パラフィンを混合することが好ま
しい、その理由は、酵素と電子受容体が、測定時にエタ
ノール含有試料液と接触して、流出、崩壊するのを防止
するため、また電極表面への接着による上記電極剤修飾
を確実化するためである。 修飾電極を製作するには、まず上記のようにして得られ
たＡＤＨ含有物と電子受容体とを導電性材料粉末（例え
ばグラファイト粉末）と有機結合剤（例えば流動パラフ
ィン）とよく混合してペースト状に練り上げる。次に、
第１図に示すごとく、該ペーストをグラファイト固結物
１３の端面に塗布し、硬化させて電極剤１０とすること
により、膜結合性ＡＤＨと電子受容体とを電極剤に含む
酵素及び電子受容体修飾電極１が製作できる。 修飾電極１の構成は、フランジ付きテフロン製筒体１５
とそれに頭部が突出して螺入されている銅製ネジ付きボ
ルト１２とその前方部に着設されたグラファイト固結物
１３と、更にその前方端面に接合された前記電極剤１０
とからなる。なお、銅製ネジ付きボルト１２の中腹には
取付用ナツト１４が螺合されている。 次に、第２図に示すごとく１、上記修飾電極１を反応セ
ル３に取り１寸ける。反応セル３内には、更に参照電極
２を検知響が位置するように取り付け、また、反応セル
３の中央には磁気撹拌子４を回転自由に枢支する。そし
て、上部には試料供給口３３が、下方左端には電解液導
入口３１が、また上方右端には測定排液導出口３２が設
けられている。 試料中のエタノール濃度を測定するには、第３図に概要
図を例示するエタノール濃度測定装置を使用する。 すなわち、該測定装置の、電解液槽６内の測定用電解液
（例えばｐＨ調整用バッファーと電解質（例えばＫＣＩ
）を含む）をポンプ８で反応セル３中に注入し、測定装
置の定電圧電源部より修飾電極１と参照電極２間に加電
する。その結果、両電極間に発生する酸化電流を電流電
圧変換回路を用いて、電流値を電圧値に変換した後増幅
し、レコーダーでチャートに記録する。なお、増幅され
た電圧値をＡ／Ｄ変換した後、コンピュータで処理する
こともできる１図中、７は測定済み廃液槽である。 電圧が安定した後、エタノールを含んだ試料水溶液の一
定量をマイクロシリンジで前記反応セル３中に注入供給
し、上記と同様にして酸化電流を電圧として測定し、電
圧の増加量を求める。 この増加量とエタノール濃度が比例することからエタノ
ール濃度が求められる。測定中において、スターラ５を
起動して、反応セル３中の磁気撹拌子４５：回転させて
おけば、試料と電解液との混合が均一に行えるので、バ
ラつきのない正確な測定値が得られる。 ところで、電解液は酵素反応を円滑に進めるためにｐＨ
を４から７の間に調製することが望ましく、また例えば
ＫＣＩ等の強電解質を含んでいる必要がある。さらに、
電解液を反応セルの導入口３１に一定流速で注入し、ま
たその導出口３２がら排出させながら測定するフローイ
ンジェクション法によっても測定が可能である。 以上、述べてきたエタノールセンサーによれば、酢酸菌
の細胞膜結合性ＡＤＨによるエタノールの酸化反応及び
ＰＱＱ、電子受容体を介した電子伝達系によって生じる
酸化電流を直接アンペロメトリックに測定することがで
きるため、応答時開が速く直線性に優れている。 さらに、本発明に係る電子受容体は水溶液中て簡単に合
成、単離することができる。また、この電子受容体及び
酵素はいずれも疎水性であるので、特別な処理を行わな
くとも有機結合剤と混合するだけで電極剤として固定化
され、測定用電解液中に溶出することもないため、酵素
固定膜を有する他のバイオセンサー等に比較して、電極
の作成が容易である。そして、本発明に係る電子受容体
をも修飾しており、新規なものである。 本発明のエタノールセンサーを使用して測定する場合に
は、測定用電解液中にフェリシアン化カリウム等の電子
受容体を溶解する必要がないため、作業性が良くなり、
シアン等の廃水処理をする必要がない。 なお、種々の大きさの反応セルを使用したり、フローイ
ンジェクション方式を採ることにより定量範囲を広くす
ることも可能である。
容体を電解液中から排除し、また、短時間で測定が可能
なエタノールセンサーを開発した。 すなわち本発明は、水溶性フェリシアン酸塩と陽イオン
界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン界面活性剤か
ら合成される疎水性化合物を電子受容体として、酢酸菌
膜結合性アルコール脱水素酵素とともに電極剤として混
在せしめた酵素及び電極受容体修飾電極と参照電極とを
組み合わせてなるエタノールセンサーである。 上記に本発明において、水溶性フェリシアン酸塩として
は、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウ
ム、その池水溶性のフェリシアン化物が挙げられる。 また、陽イオン界面活性剤としては長鎖第４級アンモニ
ウム塩、長鎖アルキルピリジニウム塩等が、両性界面活
性剤としては例えばアルキルジアミノエチルグリシン形
のものが、そして非イオン界面活性剤としては例えばポ
リオキシエチレン系のもの等が挙げられる。 水溶性フェリシアン酸塩、例えばフェリシアン化カリウ
ムとこれらの界面活性剤とは、水溶液中で反応を起こし
黄色沈でんを生じる。この沈澱物質は本発明における電
子受容体として用いられる。 以下に反応式の一例を示す。 ３［Ｃ＋５Ｈ３）Ｎ（ＣＩ＊）ｘ］Ｂｒ ＋ＫＪｅ（
ＣＮ）ａ→［Ｃ＋５ｔ（ｚｚ（ＣＨｓ）ｚｌｚ［Ｆｅ（
ＣＮ）ａ］’ ＋ ３ＫＢｒ得られた化合物は疎水性
であるので、濾過、水洗して簡単に精製することができ
る。 過去にこのような化合物を電子受容体としてセンサーに
利用した例はない。 また、本発明において使用する細胞膜結合型ＡＤＨを産
生ずる酢酸菌としては、アセトバクター属（＾ｃｅｔｏ
ｂａｃ ｔｅｒ）グルコノバクタ−属（Ｇ ｌ ｕｅｏ
ｎｏｂａｅｔｅｒ）に属するいずれの酢酸菌の菌体でも
よい。 酵素はフレンチプレス法や超音波法等の常法により細胞
膜画分を分離し、さらに界面活性剤で細胞膜画分から抽
出し、種々のクロマトグラフィーにより精製単離して得
ることができる。また、精製単離を行わなくとも酢酸菌
の菌体そのままあるいは細胞膜画分といった粗標品でも
酵素源として利用できる。 なお、本発明の場合も常法と同様に、電極剤にはグラフ
ァイト等の導電性材料粉末を混合して、エタノールセン
サー表面から得られる電流を容易に電極棒へ導くように
することが好ましい。 さらに、本発明のエタノールセンサーの電極剤には、有
機結合剤、例えば流動パラフィンを混合することが好ま
しい、その理由は、酵素と電子受容体が、測定時にエタ
ノール含有試料液と接触して、流出、崩壊するのを防止
するため、また電極表面への接着による上記電極剤修飾
を確実化するためである。 修飾電極を製作するには、まず上記のようにして得られ
たＡＤＨ含有物と電子受容体とを導電性材料粉末（例え
ばグラファイト粉末）と有機結合剤（例えば流動パラフ
ィン）とよく混合してペースト状に練り上げる。次に、
第１図に示すごとく、該ペーストをグラファイト固結物
１３の端面に塗布し、硬化させて電極剤１０とすること
により、膜結合性ＡＤＨと電子受容体とを電極剤に含む
酵素及び電子受容体修飾電極１が製作できる。 修飾電極１の構成は、フランジ付きテフロン製筒体１５
とそれに頭部が突出して螺入されている銅製ネジ付きボ
ルト１２とその前方部に着設されたグラファイト固結物
１３と、更にその前方端面に接合された前記電極剤１０
とからなる。なお、銅製ネジ付きボルト１２の中腹には
取付用ナツト１４が螺合されている。 次に、第２図に示すごとく１、上記修飾電極１を反応セ
ル３に取り１寸ける。反応セル３内には、更に参照電極
２を検知響が位置するように取り付け、また、反応セル
３の中央には磁気撹拌子４を回転自由に枢支する。そし
て、上部には試料供給口３３が、下方左端には電解液導
入口３１が、また上方右端には測定排液導出口３２が設
けられている。 試料中のエタノール濃度を測定するには、第３図に概要
図を例示するエタノール濃度測定装置を使用する。 すなわち、該測定装置の、電解液槽６内の測定用電解液
（例えばｐＨ調整用バッファーと電解質（例えばＫＣＩ
）を含む）をポンプ８で反応セル３中に注入し、測定装
置の定電圧電源部より修飾電極１と参照電極２間に加電
する。その結果、両電極間に発生する酸化電流を電流電
圧変換回路を用いて、電流値を電圧値に変換した後増幅
し、レコーダーでチャートに記録する。なお、増幅され
た電圧値をＡ／Ｄ変換した後、コンピュータで処理する
こともできる１図中、７は測定済み廃液槽である。 電圧が安定した後、エタノールを含んだ試料水溶液の一
定量をマイクロシリンジで前記反応セル３中に注入供給
し、上記と同様にして酸化電流を電圧として測定し、電
圧の増加量を求める。 この増加量とエタノール濃度が比例することからエタノ
ール濃度が求められる。測定中において、スターラ５を
起動して、反応セル３中の磁気撹拌子４５：回転させて
おけば、試料と電解液との混合が均一に行えるので、バ
ラつきのない正確な測定値が得られる。 ところで、電解液は酵素反応を円滑に進めるためにｐＨ
を４から７の間に調製することが望ましく、また例えば
ＫＣＩ等の強電解質を含んでいる必要がある。さらに、
電解液を反応セルの導入口３１に一定流速で注入し、ま
たその導出口３２がら排出させながら測定するフローイ
ンジェクション法によっても測定が可能である。 以上、述べてきたエタノールセンサーによれば、酢酸菌
の細胞膜結合性ＡＤＨによるエタノールの酸化反応及び
ＰＱＱ、電子受容体を介した電子伝達系によって生じる
酸化電流を直接アンペロメトリックに測定することがで
きるため、応答時開が速く直線性に優れている。 さらに、本発明に係る電子受容体は水溶液中て簡単に合
成、単離することができる。また、この電子受容体及び
酵素はいずれも疎水性であるので、特別な処理を行わな
くとも有機結合剤と混合するだけで電極剤として固定化
され、測定用電解液中に溶出することもないため、酵素
固定膜を有する他のバイオセンサー等に比較して、電極
の作成が容易である。そして、本発明に係る電子受容体
をも修飾しており、新規なものである。 本発明のエタノールセンサーを使用して測定する場合に
は、測定用電解液中にフェリシアン化カリウム等の電子
受容体を溶解する必要がないため、作業性が良くなり、
シアン等の廃水処理をする必要がない。 なお、種々の大きさの反応セルを使用したり、フローイ
ンジェクション方式を採ることにより定量範囲を広くす
ることも可能である。
次に本発明を実施例により具体的に説明する。
１ 人 ＡＤＨの
培養したＧ Ｉｕｃｏｎｏｂａｃｔｏｒ ５ｏｂｏｘ
ｙｄａｎｓ （ＩＦＯ１２５２８＞の菌体を遠心分離
して集菌し、得られた菌体をフレンチプレスにより破砕
した。この破砕物を超遠心分離（１００，０ＯＯｘε、
６０分）して得られた沈でん（膜画分）をそのまま膜結
合性ＡＤＨとして用いた。 ２）−罵六 の人 陽イオン界面活性剤の１種である臭化ｎ−ヘキサデシル
トリメチルアンモニウムのＯ，１Ｍ水溶液に、０．０５
Ｍフェリシアン化カリウム水浴液を同量添加する。する
と瞬時に反応が起こり、黄緑色の疎水性化き物が懸濁生
成された。 この化合物をろ紙てろ過し、充分水洗した後、減圧乾燥
し、電子受容体として使用した。この物質は水に不溶で
あり有機液相にわずかに溶解した。 ３〉酵素 び 飾 の 上記（１）で得られたＡＤＨ含有膜画分（Ａ）、上記（
２〉で得られた電子受容体（Ｂ）、グラファイト粉末（
Ｃ）及び流動パラフィン（Ｄ＞を、Ａ ：Ｂ ：Ｃ：Ｄ
＝１０：１：１２：１０の比率（重量比）で混きし、ペ
ースト状に練り上げたものを第１図図示のごとく、を極
のグラファイト固結物１３の先端部分に少量塗り込んで
固結させた後、その表面を硫酸紙でこすって平滑にし、
酵素及び電子受容体保有する修飾電極１を製作した。 ４エ ノール゛ の （ａ）エタノール濃度検量線図の作成：上記（３）で製
作された修飾電極１を、第３図に図示するごとく、反応
セル３に取り付け、０． １Ｍリン酸バッファー（ｐＨ
６，０）にＯ，１Ｍ塩化カリウム、２０饋Ｍ塩化マグネ
シウムを含有した電解液をポンプ８で反応セル３中に導
入口３１がら注入し、スターラー５を起動して磁気撹拌
子４を回転させて攪拌した。 次いで定電圧電源部より修飾電極１と参照電極（塩化銀
電極）２に＋０．６Ｖ加；し、両；極１゜２間に発生す
る電流を電圧電流変換回路により電圧に変換した後、こ
れを増幅し、レコーダーでチャートに記録した。 電圧が安定したところで電圧値■。を測定し、次に既知
の濃度のエタノール試料水溶′ｆＬ５μｍを反応セル３
内にマイクロシリンジて注入した。 エタノール試料水溶液の添加とともに直ちに電圧が変化
し３０〜６０秒で出力が安定するので、この時の電圧値
■、を測定しＶ。とＶ、との差ΔＶを算出した。 さらに、反応セル３にポンプ８て電解液をセル容量の５
倍量程度注入しセル３内を洗浄した後、再びＶ。を測定
した。電解液で洗浄した場きのベースライン復帰も３０
〜６０秒てあった。このようにセルの洗浄、電圧測定、
試料の注入、電圧測定の操作を繰り返し、種々の濃度の
エタノールに対する。■を測定し、第４図に示す検量線
を作成した。 （ｂ）試料のエタノール濃度測定： アルコール発酵の発酵液やビールについて、（ａ）と全
く同じ方法でム■を測定し、先に作成した検量線と比較
してエタノール濃度を算出した。 この値は、ガスクロマトグラフで測定した値とよく一致
していた。
ｙｄａｎｓ （ＩＦＯ１２５２８＞の菌体を遠心分離
して集菌し、得られた菌体をフレンチプレスにより破砕
した。この破砕物を超遠心分離（１００，０ＯＯｘε、
６０分）して得られた沈でん（膜画分）をそのまま膜結
合性ＡＤＨとして用いた。 ２）−罵六 の人 陽イオン界面活性剤の１種である臭化ｎ−ヘキサデシル
トリメチルアンモニウムのＯ，１Ｍ水溶液に、０．０５
Ｍフェリシアン化カリウム水浴液を同量添加する。する
と瞬時に反応が起こり、黄緑色の疎水性化き物が懸濁生
成された。 この化合物をろ紙てろ過し、充分水洗した後、減圧乾燥
し、電子受容体として使用した。この物質は水に不溶で
あり有機液相にわずかに溶解した。 ３〉酵素 び 飾 の 上記（１）で得られたＡＤＨ含有膜画分（Ａ）、上記（
２〉で得られた電子受容体（Ｂ）、グラファイト粉末（
Ｃ）及び流動パラフィン（Ｄ＞を、Ａ ：Ｂ ：Ｃ：Ｄ
＝１０：１：１２：１０の比率（重量比）で混きし、ペ
ースト状に練り上げたものを第１図図示のごとく、を極
のグラファイト固結物１３の先端部分に少量塗り込んで
固結させた後、その表面を硫酸紙でこすって平滑にし、
酵素及び電子受容体保有する修飾電極１を製作した。 ４エ ノール゛ の （ａ）エタノール濃度検量線図の作成：上記（３）で製
作された修飾電極１を、第３図に図示するごとく、反応
セル３に取り付け、０． １Ｍリン酸バッファー（ｐＨ
６，０）にＯ，１Ｍ塩化カリウム、２０饋Ｍ塩化マグネ
シウムを含有した電解液をポンプ８で反応セル３中に導
入口３１がら注入し、スターラー５を起動して磁気撹拌
子４を回転させて攪拌した。 次いで定電圧電源部より修飾電極１と参照電極（塩化銀
電極）２に＋０．６Ｖ加；し、両；極１゜２間に発生す
る電流を電圧電流変換回路により電圧に変換した後、こ
れを増幅し、レコーダーでチャートに記録した。 電圧が安定したところで電圧値■。を測定し、次に既知
の濃度のエタノール試料水溶′ｆＬ５μｍを反応セル３
内にマイクロシリンジて注入した。 エタノール試料水溶液の添加とともに直ちに電圧が変化
し３０〜６０秒で出力が安定するので、この時の電圧値
■、を測定しＶ。とＶ、との差ΔＶを算出した。 さらに、反応セル３にポンプ８て電解液をセル容量の５
倍量程度注入しセル３内を洗浄した後、再びＶ。を測定
した。電解液で洗浄した場きのベースライン復帰も３０
〜６０秒てあった。このようにセルの洗浄、電圧測定、
試料の注入、電圧測定の操作を繰り返し、種々の濃度の
エタノールに対する。■を測定し、第４図に示す検量線
を作成した。 （ｂ）試料のエタノール濃度測定： アルコール発酵の発酵液やビールについて、（ａ）と全
く同じ方法でム■を測定し、先に作成した検量線と比較
してエタノール濃度を算出した。 この値は、ガスクロマトグラフで測定した値とよく一致
していた。
以上のとおり、本発明のエタノールセンサーによれば、
酢酸菌の細胞膜結合性ＡＤＨによるエタノールの酸化反
応及びＰＱＱ、電子受容体を介した電子伝達系によって
生じる酸化電流を直接アンペロメトリックに測定するこ
とができるため、反応時間が速く直線性に優れている。 また、本発明に係る電子受容体は水溶液中で簡単に合成
・単離することができ、そしてこの電子受容体及び酵素
はいずれも疎水性であるので、特別な処理を行わなくと
も有機結合剤と混合するたけて電極剤として固定化され
、測定用電解液中に溶出することもない。このため、酵
素固定膜を有する従来のエタノールセンサーに比較して
、電極の作成が容易である。 さらに、本発明のエタノールセンサーを使用して測定す
る場合には、測定用電解液中にフェリシアン化カリウム
等の電子受容体を溶解する必要がないため、作業性が良
くなり、シアン等の廃水処理をする必要がない。
酢酸菌の細胞膜結合性ＡＤＨによるエタノールの酸化反
応及びＰＱＱ、電子受容体を介した電子伝達系によって
生じる酸化電流を直接アンペロメトリックに測定するこ
とができるため、反応時間が速く直線性に優れている。 また、本発明に係る電子受容体は水溶液中で簡単に合成
・単離することができ、そしてこの電子受容体及び酵素
はいずれも疎水性であるので、特別な処理を行わなくと
も有機結合剤と混合するたけて電極剤として固定化され
、測定用電解液中に溶出することもない。このため、酵
素固定膜を有する従来のエタノールセンサーに比較して
、電極の作成が容易である。 さらに、本発明のエタノールセンサーを使用して測定す
る場合には、測定用電解液中にフェリシアン化カリウム
等の電子受容体を溶解する必要がないため、作業性が良
くなり、シアン等の廃水処理をする必要がない。
第１図は本発明実施例の酵素及び電子受容体修飾電極の
構造図、第２図は反応セルの構造図、第３図はエタノー
ル濃度測定装置の概要図、第４図はエタノールセンサー
を用いた検量線図をそれぞれ示す。 図中 １：修飾電極、２：参照電極、３・反応セル４：磁気撹
拌子２５：スターラ、６：電解槽。 ７：排液槽、８：ボンブ、１０：電極剤。 １１：７ランジ付きテフロン製筒体。 １２：銅製ネジ付きボルト。 １３・グラファイト固結物、１４：ナツト。 ３１・電解液導入口、３２：測定液排出口３３・試料供
給口
構造図、第２図は反応セルの構造図、第３図はエタノー
ル濃度測定装置の概要図、第４図はエタノールセンサー
を用いた検量線図をそれぞれ示す。 図中 １：修飾電極、２：参照電極、３・反応セル４：磁気撹
拌子２５：スターラ、６：電解槽。 ７：排液槽、８：ボンブ、１０：電極剤。 １１：７ランジ付きテフロン製筒体。 １２：銅製ネジ付きボルト。 １３・グラファイト固結物、１４：ナツト。 ３１・電解液導入口、３２：測定液排出口３３・試料供
給口
Claims (4)
- （１）水溶性フェリシアン酸塩と陽イオン界面活性剤、
両性界面活性剤又は非イオン界面活性剤から合成される
疎水性化合物を電子受容体として、酢酸菌膜結合性アル
コール脱水素酵素とともに電極剤として混在せしめた酵
素及び電極受容体修飾電極と、参照電極とを組み合わせ
てなることを特徴とするエタノールセンサー。 - （２）電極剤が、導電性材料粉末を混合してなるもので
あることを特徴とする請求項１記載のエタノールセンサ
ー。 - （３）水溶性フェリシアン酸塩が、フェリシアン化カリ
ウムであることを特徴とする請求項１又は２記載のエタ
ノールセンサー。 - （４）電極剤が、酵素と電子受容体と有機結合剤との混
合物からなるものであることを特徴とする請求項１ない
し３のいずれかに記載のエタノールセンサー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2181583A JPH0752177B2 (ja) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | エタノールセンサー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2181583A JPH0752177B2 (ja) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | エタノールセンサー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0470558A true JPH0470558A (ja) | 1992-03-05 |
| JPH0752177B2 JPH0752177B2 (ja) | 1995-06-05 |
Family
ID=16103347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2181583A Expired - Lifetime JPH0752177B2 (ja) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | エタノールセンサー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0752177B2 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07198668A (ja) * | 1993-11-04 | 1995-08-01 | Lg Electron Inc | アルコール濃度測定用バイオセンサ、その製造方法、およびそれを用いた飲酒測定器 |
| WO1998020332A1 (en) * | 1996-11-07 | 1998-05-14 | Sensalyse Holdings Limited | Biosensor incorporating a surfactant |
| WO2001000865A3 (en) * | 1999-06-29 | 2001-09-13 | Drew Scient Ltd | Amperometric sensor |
| WO2001022957A3 (de) * | 1999-09-29 | 2002-06-27 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung von gangliosiden und anderen substanzen zur modulation von sphingolipid-cholesterin-mikrodomänen |
| JP2008013150A (ja) * | 2006-07-10 | 2008-01-24 | Autoliv Development Ab | シートベルト用バックル装置 |
| JP2009006776A (ja) * | 2007-06-27 | 2009-01-15 | Autoliv Development Ab | シートベルトバックル装置 |
| JP2010043978A (ja) * | 2008-08-13 | 2010-02-25 | Toyota Motor Corp | 酵素電極およびその製造方法 |
| US10479233B2 (en) | 2017-02-10 | 2019-11-19 | Honda Motor Co., Ltd. | Seat apparatus for vehicle |
-
1990
- 1990-07-11 JP JP2181583A patent/JPH0752177B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07198668A (ja) * | 1993-11-04 | 1995-08-01 | Lg Electron Inc | アルコール濃度測定用バイオセンサ、その製造方法、およびそれを用いた飲酒測定器 |
| WO1998020332A1 (en) * | 1996-11-07 | 1998-05-14 | Sensalyse Holdings Limited | Biosensor incorporating a surfactant |
| AU720663B2 (en) * | 1996-11-07 | 2000-06-08 | Sensalyse Holdings Limited | Biosensor incorporating a surfactant |
| WO2001000865A3 (en) * | 1999-06-29 | 2001-09-13 | Drew Scient Ltd | Amperometric sensor |
| US7135100B1 (en) | 1999-06-29 | 2006-11-14 | Drew Scientific Ventures Llc | Amperometric sensor |
| US7608180B2 (en) | 1999-06-29 | 2009-10-27 | Drew Scientific Holdings, Inc. | Amperometric sensor |
| WO2001022957A3 (de) * | 1999-09-29 | 2002-06-27 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung von gangliosiden und anderen substanzen zur modulation von sphingolipid-cholesterin-mikrodomänen |
| JP2008013150A (ja) * | 2006-07-10 | 2008-01-24 | Autoliv Development Ab | シートベルト用バックル装置 |
| JP2009006776A (ja) * | 2007-06-27 | 2009-01-15 | Autoliv Development Ab | シートベルトバックル装置 |
| JP2010043978A (ja) * | 2008-08-13 | 2010-02-25 | Toyota Motor Corp | 酵素電極およびその製造方法 |
| US10479233B2 (en) | 2017-02-10 | 2019-11-19 | Honda Motor Co., Ltd. | Seat apparatus for vehicle |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0752177B2 (ja) | 1995-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ikeda et al. | Amperometric fructose sensor based on direct bioelectrocatalysis | |
| Karyakin et al. | A high-sensitive glucose amperometric biosensor based on Prussian Blue modified electrodes | |
| Tkac et al. | Improved selectivity of microbial biosensor using membrane coating. Application to the analysis of ethanol during fermentation | |
| EP0400918A1 (en) | Enzyme sensor | |
| Malinauskas et al. | Alcohol, lactate and glutamate sensors based on oxidoreductases with regeneration of nicotinamide adenine dinucleotide | |
| Xuejiang et al. | Conductometric nitrate biosensor based on methyl viologen/Nafion®/nitrate reductase interdigitated electrodes | |
| Matsumoto et al. | Amperometric flow injection determination of fructose with an immobilized fructose 5-dehydrogenase reactor | |
| Castilho et al. | Amperometric biosensor based on horseradish peroxidase for biogenic amine determinations in biological samples | |
| Bu et al. | NAD (P) H sensors based on enzyme entrapment in ferrocene-containing polyacrylamide-based redox gels | |
| Moore et al. | Enzymically amplified voltammetric sensor for microliter sample volumes of salicylate | |
| Schubert et al. | Enzyme electrodes for L-glutamate using chemical redox mediators and enzymatic substrate amplification | |
| Tag et al. | Measurement of biodegradable substances with a mycelia-sensor based on the salt tolerant yeast Arxula adeninivorans LS3 | |
| Kulys et al. | Sensitive yeast bioelectrode to L‐lactate | |
| Omidinia et al. | Electrochemical nanobiosensing of phenylalanine using phenylalanine dehydrogenase incorporated on amino-functionalized mobile crystalline material-41 | |
| JPH0470558A (ja) | エタノールセンサー | |
| Zhuang et al. | Rapid determination of sucrose and glucose in microbial fermentation and fruit juice samples using engineered multi-enzyme biosensing microchip | |
| Kulys et al. | Electrocatalytic oxidation of ascorbic acid at chemically modified electrodes | |
| Haemmerli et al. | Amperometric determination of phosphate by use of a nucleoside phosphorylase-xanthine oxidase enzyme sensor based on a Clark-type hydrogen peroxide or oxygen electrode | |
| US5306413A (en) | Assay apparatus and assay method | |
| Connor et al. | Tissue-and microbe-based electrochemical detectors for liquid chromatography | |
| Schuhmann et al. | Evaluation of polypyrrole/glucose oxidase electrodes in flow-injection systems for sucrose determination | |
| Tang et al. | Enzyme electrode for amplification of NAD+/NADH using glycerol dehydrogenase and diaphorase with amperometric detection | |
| Matuszewski et al. | Simultaneous enzymatic determination of glucose and ascorbic acid using flow‐injection amperometry | |
| Shi et al. | On‐line biosensors for simultaneous determination of glucose, choline, and glutamate integrated with a microseparation system | |
| Wollemberger et al. | Microbial membrane electrode for steroid assay |