JPH0466093A - 澱粉含有材料の酵素分解方法によるオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は澱粉含有材料の酵素加水分解方法に関する。

〈従来の技術〉 オリゴ糖は、従来より主に血清中のアミラーゼ活性測定
用の生化学試薬として利用され、また水溶性食物繊維や
腸内細菌の栄養素としての食品素材として知られており
、特にα−マルトペンタオースはその利用価値が高い。

従来のオリゴ糖の工業的生産方法は、澱粉含有材料を澱
粉加水分解酵素を用いて反応系が水系で加水分解する方
法であった。

〈発明が解決しようとする課題〉 しかし、従来の方法では反応系が水系での酵素加水分解
反応のため次のような欠点が見られた。

■澱粉の加水分解速度が遅（、長い反応時間を要し、ま
た生成したオリゴ糖が低濃度でしか得られなかった。

■生澱粉の直接加水分解が困難であるため、生澱粉を加
熱蒸煮して糊化した後に加水分解する必要があった。

■加水分解反応後、水を濃縮するためオリゴ糖の単離に
時間を費やした。

■反応系を滅菌する必要があった。

これらの欠点を解決する方法として、反応系が水−疎水
性有機溶剤の分散系で澱粉含有材料を酵素加水分解する
ことにより、オリゴ糖を製造する方法が考えられる。

ところが、前述の方法では酵素と有機溶媒が直接接触す
るために、反応過程での酵素活性の低下が問題になる。

すなわち、前述の方法では水系と比較して高濃度のオリ
ゴ糖の生産が可能であるが、反応を十分進行させるため
の酵素安定性に問題があった。

本発明は上記の点を解決するものであり、加水分解反応
が速く、短い反応時間でオリゴ糖、特にα−マルトペン
タオースが高濃度で得られ、酵素活性の低下がなく、長
時間経過しても反応を十分進行させることができ、加熱
蒸煮等の前処理による澱粉の糊化な必要とせず、更に反
応系を滅菌する必要もな（、簡単に単離できるオリゴ糖
の製造方法を提供することを目的とするものである。

く課題を解決するための手段〉 本発明は、水−疎水性有機溶剤系中において、界面活性
剤存在下、加水分解酵素による酵素反応で澱粉含有材料
なオリゴ糖に加水分解することを特徴とするオリゴ糖の
製造方法を提供するものである。

本発明は、反応系が水−疎水性有機溶剤の分散系であり
、かつ界面活性剤が存在することに特徴を有するもので
ある。

本発明において、オリゴ糖はグルコースが２個〜５個α
−１，４−グルコシド結合した多糖類とするが、本発明
においては、グルコースも得ることができる。

本発明において、疎水性有機溶剤としては、水と相溶性
のないものであれば、いずれも使用可能であるが具体的
には、ｎ−ペンタン、２−メチルブタン、ｎ−ヘキサン
、２−メチルペンタン、２゜２−ジメチルブタン、２．
３−ジメチルブタン、ヘプタン、オクタン、２−メチル
へブタン、２，２．３−トリメチルへブタン、２，２．
４−　）ジメチルへブタン、ノナン、デカン、ウンデカ
ン、ドデカン等の鎖状飽和炭化水素系溶剤；シクロベン
クン、メチルシクロブタン、シクロヘキサン、メチルシ
クロヘキサン等の環状飽和炭化水素系溶剤；ベンゼン、
トルエン、０−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン
、エチルベンゼン、クメン等の芳香族炭化水素系溶剤；
石油エーテル、軽ベンジン、リグロイン等の石油留分と
して得られる溶剤；ジクロルメタン、クロロホルム、四
塩化炭素、１．２−ジクロルエタン、１，１，２．２−
テトラクロルエタン、トリクロルエチレン、クロルベン
ゼン、２．６−ジ、クロルベンゼン等のハロゲン化炭化
水素系溶剤等が使用できるが、好ましくは、ペンタン、
ヘキサン、ヘプタン、オクタン、２−メチルへブタン、
ドデカン等の鎖状飽和炭化水素系溶剤である。

水−疎水性有機溶剤系における水の割合は、３〜２０ｖ
ｏ１％が好ましく、もっとも好ましくは、３〜１５ｖｏ
１％である。３ｖｏ１％以下になると酵素が失活しやす
（，２０ｖｏ１％を超えると得られる生成物の量が低下
する。

界面活性剤は、使用する澱粉加水分解酵素や疎水性有機
溶剤に応じて適宜選択できる。界面活性剤は大別して、
アニオン活性剤、カチオン活性剤、非イオン性活性剤、
両性活性剤に分けられる。アニオン活性剤は、疎水基を
含む活性剤の主成分が水中でアニオンに解離するもので
あって、セッケン、アルキル硫酸エステル塩、アルキル
アリルスルホン駿塩等が挙げられ、カチオン活性剤は、
水中で長いアルキル基を含む原子団がカチオンとなるも
のであって、トリオクチルアミン、ジメチルアルキルア
ミン等のアルキルアミンまたはその塩が挙げられ、非イ
オン性活性剤は、極性基の結合を多数有するもので、ソ
ルビタンエステル（Ｓｐａｎ）　、ポリオキシエチレン
ソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ　）　、ポリオキシエ
チレンエステル（Ｍｙｒｊ）等が挙げられ、ＨＬ　Ｂ　
（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅｌｉｐｏｐｈｉｌｅ　ｂａｌａ
ｎｃｅ　）なる数値で表わすことができる。両性活性剤
としては、分子中にカチオン活性基とアニオン活性基を
含むもので、アミノ酸塩、アミノスルホン酸塩が挙げら
れる。

その他の界面活性剤としては、ジメチルポリシロキサン
系、ジメチルシルメチレン系、ジメチルポリシラン系等
のケイ素を含む界面活性剤、ベルフルオルアルキル系の
フッ素を含む界面活性剤等が挙げられる。

界面活性剤の使用量としては、使用する溶剤量の０．１
〜２　ｖｏ１％が好ましい。使用量が溶剤量の０．１ｖ
ｏ１％未満の場合、澱粉加水分解酵素活性を安定化させ
るには不充分であり、また溶剤量の２ｖｏ１％を超える
場合、加水分解反応終了後の水と疎水性有機溶剤との分
離が困難となる。

澱粉加水分解酵素としては、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓ
ｅ）が好適なものとして挙げられ、アミラーゼとして例
えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｎｉｇｅｒ）　、バチルス・チルフランス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ズブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、アス
ペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒ
ｙｚａｅ）等由来のアミラーゼ等があり、入手しやす（
、かつ、安価なものが使用できる。

澱粉加水分解酵素の使用量としては、水に対して０．１
〜０．５ｗｔ％が好ましい。０．１ｗｔ％未満では得ら
れるオリゴ糖の量が少なく、０．５ｗｔ％を超えると、
加水分解反応に関与しない不要な酵素が増加する。

基質の澱粉材料としては、可溶性デンプン、コーンスタ
ーチ、ジャガイモ澱粉、小麦澱粉、ライ麦澱粉等の澱粉
が使用できるが、生澱粉は加熱蒸煮等の前処理を必要と
せずそのまま使用することが出来る。

澱粉含有材料の使用量としては、水に対して５〜３０ｗ
ｔ％の割合で使用するのが好ましい。５ｗｔ％未満では
得られる生成物の量が少なく、３０ｗｔ％を超えると目
的とするオリゴ糖の交換率が低下する。

酵素反応の至適温度は水系では５０〜６０℃の範囲であ
るが、本発明では、使用する疎水性有機溶剤の沸点以下
の広い範囲で反応が進み、好ましくは４０〜６０℃の範
囲である。水の使用割合が少ないと０℃以下でも水は凍
ることがないため、例えば、−１０℃でも反応を進める
ことが可能である。これは、疎水性溶媒中にある水が不
凍水状態で系内に存在するためと考えられる。

本発明の酵素反応に都合のよいｐＨは、４．０〜８．０
であるが使用する酵素の至適ｐＨに応じて適宜選択でき
る。このｐＨ値の範囲にするには、緩衝溶液が使用され
る。

反応は、例えば、疎水性有機溶剤中に界面活性剤を加え
て撹拌し、完全に溶解した後、撹拌しながら澱粉含有材
料を分散し、次いで所定のｐＨ値の緩衝溶液中にアミラ
ーゼを溶解させ、この酵素溶液を前記の有機溶剤中に添
加して所定の温度にて撹拌しながら分散させることによ
り行われる。

反応後、撹拌を止めると自動的に有機層と水層とが相分
離するので、その水層を濃縮することにより生成物を含
有する濃厚液を得る。

従来、このような処理は雑菌の侵入を排除するために密
閉系で行わねばならなかったが、本発明では疎水性有機
溶剤を用いるため反応系の滅菌の必要がなくなり、反応
系が系外の菌から遮断され、雑菌による汚染が防止され
る。また有機溶剤を使用するため水系よりも使用する水
量が減少し、後処理時の水の濃縮が簡単となる。

また、界面活性剤を水−疎水性有機溶剤系中に添加する
ことにより、疎水性有機溶剤中にほぼ球状の逆ミセルを
形成し、その中心部にかなりの量の水を保持したＷａｔ
ｅｒ　ｐｏｏｌを形成する。このＷａｔｅｒ　ｐｏｏｌ
中には澱粉加水分解酵素と澱粉含有材料が存在し、この
中で酵素反応が進行する。この時、澱粉加水分解酵素は
、逆ミセル内のＷａｔｅｒｐｏｏｌの外周部付近に主に
存在し、疎水性有様溶剤との接触機会が多いが、界面活
性剤の緩衝作用により、活性の安定性が保持される。

なお、有機溶剤臭を除くために分離された水層を活性炭
や活性白土等の吸着処理剤による脱臭処理を施しても良
い。生成した反応混合物から未反応物を除くには、例え
ば、液体クロマトグラフィー、カーボンセライトクロマ
トグラフィーゲル濾過クロマトグラフィーの技術を利用
して単離することが出来る。

〈実施例〉 次に本発明を実施例、比較例を挙げて説明する。

実施例１ ３００ｍｌの三角フラスコに、ｎ−ドデカン９０ｍ１と
界面活性剤Ｔｗｅｅｎ　６０（ポリオキシエチレンｎ−
モノステアリン酸ソルビタン、ＨＬＢ　＝１４．９．東
京化成工業製）１ｍｌを加えて４０℃で完全に溶解する
まで撹拌した。°一方、アミラーゼとしては、バチルス
・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌｕｓ
）由来のα−アミラーゼ（和光純薬工業製）を用いて、
リン酸緩衝溶液（ｐＨ６，０，イオン強度５０ｍＭ）　
１０ｍ１中にα−アミラーゼ５０ｍｇを溶解させ、この
酵素溶液０、５ｇ＋１と緩衝溶液９．５ｍｌを上記三角
フラスコに添加して４０℃で撹拌速度６００ｒｐｍで撹
拌した。

比較例 ３００ｍ１三角フラスコに、ｎ−ドデカン９０ｍ１と実
施例１のリン酸緩衝溶液９．５ｍｌおよび酵素溶液０．
５ａ＋１を加えて、４０℃で撹拌速度６００ｒｐｍで撹
拌した。

実施例１、比較例の反応液１００μｍを所定時間ごとに
可溶性澱粉（和光純薬工業製）の１％ｗ／ｖ標準液（ｐ
Ｈ６，０）　０．４ｍｌに加えて４０℃で３０分間イン
キュベートした。その後、１００℃の熱水に容器ごと１
０分間入れ、α−アミラーゼを完全に失活させた。その
後、５分間遠心分離（１６０００ｒｐｍ）させ、その上
清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ。

カラム：　Ａｓａｈｉｐａｋ　Ｇ５−２２０ＨＸ　２本
、カラム温度：６０℃）で分析した。各反応系における
オリゴ糖のトータル濃度の最大値を１００％として各時
間のオリゴ糖のトータル濃度を比較し、α−アミラーゼ
の活性安定性を調査した。なお、Ｇ、以下のオリゴ糖に
はグルコースも含まれるものとする。その結果を第１図
に示す。

第１図より、比較例の界面活性剤を含有しない反応系に
おいては、α−アミラーゼは約２０時間で失活している
が、実施例１の界面活性剤含有の反応系においては、ａ
−アミラーゼの活性は長時間安定している。

実施例２ ３００ｍ１三角フラスコに、それぞれｎ−ドデカン９５
ｍ１．９０ｍ１．８０ｍ１．７０ｍ１．６０ｍ１と実施
例１のリン酸緩衝溶液４．７５ｍ１．９．５ｍｌ、　１
９ｍ１．２８．５ｍｌ、　３８ｍ１．９５ｍ１と実施例
１の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ　６０を１ｍｌずつ加えて４
０℃で完全に溶解するまで撹拌した。この三角フラスコ
に、実施例１の可溶性澱粉をそれぞれ０、２５ｇ、　０
．５ｇ、　１．　Ｏｇ、　１．５ｇ、　２．０ｇ、　５
．０ｇを加えて分散させた後、実施例１の酵素溶液をそ
れぞれ０．２５ｍ１゜０、５ｍ１．１．０ｍｌ、　１．
５ｍｌ、　２．０ｍｌ、　５．０ｍｌを加えて４０℃で
撹拌速度ｓｏｏｒｐｍで撹拌して加水分解反応を行なっ
た。

反応後、７２時間後に生成したＧｓ以下のオリゴ糖のト
ータル生成濃度（ｇ／ｄｉ）を実施例１と同様に定量し
た。Ｇ１１以下のオリゴ糖トータルの生成濃度と水含有
量の関係を第２図に示す。また、水含有量別に生成した
Ｇ、以下のオリゴ糖のトータル生成濃度（ｇ／ｄｉ）を
実施例１と同様に定量した。６６以下のオリゴ糖のトー
タル生成濃度および変換率の経時変化を第３図に示す。

また水含有量別の生成したＧ５の生成濃度（ｇ／ｄｌ）
を実施例１と同様に定量した。Ｇ、の生成濃度および変
換率の経時変化を第４図に示す。なお、６５以下のオリ
ゴ糖にはグルコースも含まれるものとする。

第２図より、水含有量が５％の時、Ｇ、以下のオリゴ糖
のトータル生成濃度が最大となることがわかる。また第
３図、第４図より水含有量が５％の時には、加水分解の
反応速度が速く、かつ長時間経過しても加水分解反応が
十分に進行してＧ。

以下のオリゴ糖のトータル生成濃度およびＧ、の生成濃
度および変換率は上昇するが、水含有量が増加するにつ
れ、加水分解の反応速度が遅く、かつ長時間経過しても
生成濃度および変換率は変わらず、酵素活性の安定性が
失われ、反応が十分に進行しない。

〈発明の効果〉 以上の説明で明らかなように、本発明のオリゴ糖の製造
方法によれば、加水分解の反応速度が速く、かつ酵素活
性の安定性を保持することができ、長時間経過しても十
分に反応を進行させることができるので、オリゴ糖、特
にマルトペンタオースを高収率で得ることができる。ま
た反応後の反応操作が簡単となり、また前処理すること
なしに澱粉含有材料を直接反応させることができる。さ
らに、有機溶剤を用いるため、反応系の滅菌の必要がな
くなり、反応系が菌から遮断され、雑菌による汚染が防
止される。従って、本発明はオリゴ糖を従来法よりも工
業的に簡単に高収率で得られるため、大量生産が可能と
なり、生化学試薬のみならず機能性食品としての用途が
広がることが期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１と比較例の酵素反応におけるα−アミ
ラーゼの活性の経時変化を示すグラフ、第２図は実施例
２における、７２時間後の緩衝溶液の割合とＧｌｌ以下
のオリゴ糖のトータル生成濃度の関係を示すグラフ、第
３図は実施例２の各反応系におけるＧ、以下のオリゴ糖
のトータル生成濃度の経時変化を示すグラフ、第４図は
実施例２の反応系におけるマルトペンタオースの生成濃
度の経時変化を示すグラフである。 出願人　株式会社　曙ブレーキ中央技術研究所代理人　
弁理士　　舘　　　野　　分 時間　（Ｈｒ） 第１図 水分含有量　１％） 第２図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 水−疎水性有機溶剤系中において、界面活性剤存在下、
   加水分解酵素による酵素反応で澱粉含有材料をオリゴ糖
   に加水分解することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。