JPH04503452A - バチルスチュリンギエンシスの殺虫毒素を産生するように形質転換した植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

パ　ルス　ユリンギエンシスの殺　−１を産生ずるように３ｆ・ 本発明は、２つの新規のバチルスチュリンギエンシス（則り狂工上旧己旦１幻」 −）株（ｒＢｔＰｃｓ１２０８株」及びｒＢｔＰＧｓＩ２４５株」）に係わる。 これらの株はいずれも、胞子形成中に結晶（それぞれｒＢｔＰＧｓｒ２０８結晶 」及びｒＢｔＰＧｓｉ２４５結晶Ｊ）にパッケージされる結晶化タンパク質（そ れぞれｒＢｔＰＧｓＩ２０８結晶タンパク質」及びｒＢｔＰＧｓＩ２４５結晶タ ンパク質」）を産生ずる。これらのＢｔＰＧＳ＋２０８株及びＢｔＰＧＳＩ２４ ５株はブダペスト条約の条項に従い、１９８９年１月１９日にそれぞれ受託番号 ５１３１及び５１３２でドイツ連邦共和国Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｈｅｇ　Ｉ Ｂ、Ｄ−３３００８ｒａｕｎｓｃｈ−ｗｅ：ｇ、　Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍ ｌｕｎｇＦｔｉｒ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ａｎｄ　Ｚｅト１ｋｕｌ ｔｕｒｅｎ（’″ＤＳＮ”　）に寄託した。 本発明は、甲虫類に対して活性を示す殺虫組成物であって、そのままの形態のＢ ｔＰｆｌ：５Ｉ２０８もしくはＢｔＰＧＳＩ２４５株か、又は好ましくはＢｔＰ ＧＳＩ２０８もしくはＢｔＰＧＳＩ２４５結晶、結晶タンパク質もしくはその活 性成分を活性材料として含む殺虫剤組成物にも係わる。 本発明は更に、 １　）　ＢｔＰＧＳＩ２０８株のゲノムに由来するＤＮＡ配列（ｒｂｔＰＧｓ１ ２０８遺伝子」）であって、ＢｔＰＧＳＩ２０８結晶中に存在する７４ｋＤａタ ンパク質（ｒＢｔＰｃｓ１２０８プロトキシン」）をコードするＤＮＡ配列と、 ２　）　ＢｔＰｆｌ：５１２４５株のゲノムに由来するＤＮＡ配列（ｒｂｔＰに ５Ｉ２４５遺伝子」）であって、ＢｔＰＧＳＩ２４５結晶中に存在する１２９ｋ Ｄａタンパク質（ｒＢｔＰＧｓＩ２４５プロトキシン」）トコードするＤＮＡ配 列とにも係わる。 ＢｔＰＧＳＩ２０８７　口）　キシ”ｌ及びＢｔＰＧＳＩ２４５プロトキシンは 、対応するＢｔＰＧＳＩ２０８株及びＢｔＰＣＳＩ２４５株によって産生され、 その後対応するＢｔＰＧＳＩ２０８結晶及びＢｔＰＧＳＩ２４５結晶にパッケー ジされるタンパク質である。 本発明は更に、それぞれＢｔＰＧＳ１２０８プロトキシン及びＢｔＰに５Ｉ２４ ５プロトキシンがら（例えばトリプシン消化によって）得ることができる６８ｋ Ｄａタンパク質（ｒ　ＢｔＰＣＳＩ２０８毒素」）及び６６ｋＤａタンパク質（ ｒ　ＢｔＰＧＳＩ２４５毒素」）にも係わる。 ＢｔＰＧＳＩ２０８毒素及びＢｔＰ＋ｌ；５Ｉ２４５毒素はそれぞれＢｔＰＧＳ １２０８株及びＢｔＰ（：５Ｉ２４５株によッテ産生されりＢｔＰＧｓＩ２０８ 結晶及びＢｔＰＣＳＩ２４５結晶から遊離し得る殺虫活性タンパク質であり、い ずれも甲虫類に対して大きな活性を示す、　ＢｔＰＧＳＩ２０８毒素及びＢｔＰ ＧＳＩ２４５毒素は、甲虫類に対して殺虫効果のある対応するＢｔＰｌ；５１２ ０８プロトキシン及びＢｔＰＣ：５Ｉ２４５プロトキシンの最小部分を示すもの と考えられる。 本発明は更に、植物細胞の形質転換に使用でき、１）対応するＢｔＰｆｌ：５Ｉ ２０８プロトキシン又はＢｔＰＧＳｒ２４５プロトキシンの殺虫効果のある部分 をコードするｂｔＰＧｓＩ２０８又は素又はＢｔＰＧＳ１２４５毒素だけをコー ドするｂｔＰＩｌ；５Ｉ２０８遺伝子又はｂｔＰ［；５Ｉ２４５遺伝子の切断（ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）部分（「切断ｂｔＰＧＳＩ−世又はｂｔＰＣ：５ｒ２４５ 遺伝子」）と、２）植物細胞中で殺虫効果のあるｂｔＰＧＳＩ２０８又はｂｔＰ Ｉ；Ｓ＋２４５遺伝子部分を転写するのに適したプロモーターと、３）植物細胞 中で殺虫効果のあるｂｔＰＧＳＩ２０８又はｂｔＰＧＳＩ２４５遺伝子部分を発 現するのに適した転写終結及びポリアデニル化シグナル とを含むキメラ遺伝子にも俤わる。このキメラ遺伝子は以後ｒｂｔＰｌ；５Ｔ２ ０８又はｂｔＰＣＳＩ２４５キメラ遺伝子」と称する。殺虫効果のあるｂｔＰＧ Ｓｒ２０８又はｂｔＰＧＳＩ２４５遺伝子部分は、ＢｔＰ（，５ｌ−２０８−Ｎ ＰＴＩＩ又はＢｔＰＧＳＩ２４５−ＮＰＴ　ＩＴ融合タンパク質をコードするハ イブリッド遺伝子であって、切断ｂｔＰＧｓＩ２０８又はｂｔＰに５Ｉ２４５遺 伝子と選択可能なマーカー遺伝子例えば二速転子との融合体を含むハイブリッド 遺伝子（ｒ　ｂｔＰＧＳＩ２０８−■！又はｂｔＰＧＳＩ２４５−ｎｅｏハイブ リッド遺伝子」）としてｂｔＰＧＳ１２０８又はｂｔＰＧＳＩ２４５キメラ遺伝 子中に存在す遺伝炉中ましい。 本発明は更に、 １）殺虫効果のあるｂｔＰＣＳＩ２０８又はｂｔＰＣＳＩ２４５遺伝子部分でゲ ノムが形質転換された例えばジャガイモのような植物の細胞（「形質転換植物細 胞」）、並びに２ン殺虫効果のあるｂｔＰＧＳＩ２０８又はｂｔＰＣ５Ｉ２４５ 遺伝子部分を含むゲノムを有し且つ甲虫類に対して耐性のある形質転換植物細胞 から再生された植物又はこのようにして再生された植物から製造された植物（「 形質転換植物」）にも係わる。 本発明は更に、好ましくはエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔ ｉｏｎ）によって、ｂｔＰＣＳＩ２０８又はｂｔＰＣＳＩ２４５道。 転子の全体又は一部分を運ぶベクターで形質転換した亀、リリエ土旧７（ｒ　Ｂ 　ｔ　Ｊ　）株にも係わる。 １１へ１１ Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ工１ｅｎｓｉｓ１は胞子形成時に内生結晶を産生ずるグラム陽 性菌である。前記結晶は昆虫の幼虫に対して特異的な毒性を示すタンパク質から なる。これまでに開示されたＢｔバッタイブ（ｐａｔｈｏｔｙｐｅ）には次の３ 種類がある二毛虫等の鱗翅預に対して活性を示すバッタイブＡ、蚊及びブユのよ うな特定の双翅類に対して活性を示すバッタイブＢ、並びにカプトムシ等の甲虫 類に対して活性を示すパンタイプＣ（ＥＩ　Ｉｅｒら、１９８６）。 甲虫類に対して毒性の結晶を産生ずるＢｔ株は、Ｂｔ　ｔｅｎｅ−ｂｒｉｏｎｉ ｓ（米国特許第４，７６６．２０３号、欧州特許公告第０．１４９゜１６２号） 、Ｂｔ　Ｍ−７もしくはＢｔ　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ（欧州特許公告第０゜２１３ ．８１８号、米国特許第４，７７１．１３１号）及びＢｔＳｌ　（欧州特許出願 第８８／４０２，１１５．５号）として開示されている。 Ｂｔ胞子は一般的な水中発酵技術によって大量生産できるため、Ｂｔ菌は殺虫剤 組成物源として産業的に有用な菌である。 殺虫タンパク質をコードする成る種のＢｔ株に由来する遺伝子フラグメントはこ れまでにも同定されており、植物に耐昆虫性を与えるべく植物ゲノム中に組込ま れてきた。しかしながら、このようなりｔ遺伝子フラグメントを植物中で発現さ せるプロセスは簡単なものではない、　ｓｉ！Ｉｖｓ胞中での殺虫タンパク質の 発現を最適に生起させるためには、各１３を遺伝子フラグメントが目的昆虫に対 する実質的な毒性を保持するＢｔプロトキシンの水溶性部分をコードするように 、各Ｂｔ遺伝子フラグメントを特異的な方法で操作しなければならないことが判 明した（欧州特許出願第８６／３００，２９１．１号及び第８８７４０２，１１ ５．５号、１９８６年１月２２日に出願された米国特許出願第８２１．５８２号 ）。 光１し四」！一 本発明ではバッタイアＣの２つの新規Ｂｔ株、即ちＢｔＰＧＳｉ２０８株及びＢ ｔＰＧＳＩ２４５株を提供する。胞子形成時にそれぞれの株によって産生される ＢｔＰＧＳＩ２０８及びＢｔＰＣＳＩ２４５結晶、結晶タンパク質、プロトキシ ン及び毒素、並びにＢｔＰＣＳＩ２０８及びＢｔＰＧＳＩ２４５プロトキシンの 殺虫効果部分はいずれも殺虫活性を有し、従って一般的には甲虫類、特定的には ／　ａ　Ｉ　ｎ　ｉ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃｉ　１ｕｔｅｏｌａ、　Ｈａｌｔｉｅ ａ　ｔｏｍｂａ−ｅｉｎａ、＾ｎｔｈｏｎｏｎｕｓ旺ｙ止ｌ、ちやいろこめのご みむしだましＴｅｎｅｂｒｉｏ　ｍｏｌｉｔｏｒ、　Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕ ｎｄｅｅｉｍ　ｕｎｅｔｓ＋ｔａｉびＴｒｉｂｏｌｕｅｎ　ｃａｓｔａｎｅｕｍ 、特に経済的に重要な作物の主な害虫であるコロラドハムシ１」１ヱｎｏｔａｒ ｓａ工ｄｅｃｅｓｌｉｎｅａｔａに対する殺虫剤組成物に配合することができる 。 本発明では更に、Ｍ￥Ｉ！Ａａｌ胞ゲノムを殺虫効果のあるｂｔｐｃｓｒｚｏｓ 又はｂｔＰにＳ＋２４５遺伝子部分、好ましくは切断ｂｔＰ（：５Ｉ２０８又は ｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子で形質転換する。この形質転換はｂｔＰＧｓＴ２０８ 又はｂｔＰＧｓＩ２４５キメラ遺伝子を用いて実施するのが好ましい、得られた 形質転換植物細胞は、植物に耐甲虫想性を付与すべく、植物組織の一部分又は全 体における植物細胞が、１）殺虫効果のあるｂｔＰ［：５Ｉ２０８又はｂｔＰｃ ｓＩ２４５遺伝子部分を安定挿入体としてゲノム中に含み、且つ２）対応すルＢ ｔＰＧＳＩ２０８又ハＢｔＰＧＳＩ２４５７　ロトキシンノ殺虫効果部分、好ま しくは対応するＢｔＰＧＳＩ２０８又はＢｔＰＧＳｉ２４５毒素を産生ずること により殺虫効果のあるｂｔＰＧｓＩ２０８又はｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子部分を 発現するような形質転換植物を製造するのに使用できる０本発明の形質転換植物 細胞は、このような殺虫ａｔタンパク質を回収するために産生ずる場合にも使用 できる。 本発明では更に、植物細胞ゲノムを殺虫効果のあるｂｔＰＧｓＩ２０８又はｂｔ ＰＧＳＩ２４５遺伝子部分、好ましくは切断ｂｔｐｃｓｒｚｏｓ又はｂｔＰ（： ５Ｉ２４５遺伝子で形質転換することにより、植物に耐甲虫類性を与える方法も 提供する。この場合、植物細胞はｂｔＰに５Ｉ２０８又はｂｔＰＧｓｒ２４５キ メラ遺伝子で形質転換するのが好ましい。 本発明では更に、ＢｔＰＧＳＩ２０８及びＢｔＰＧＳＩ２４５プロトキシン、こ れらプロトキシンの殺虫効果部分、ＢｔＰ（：５Ｉ２０８及びＢｔＰＧＳＩ２４ ５毒素、ｂｔＰＧｓＩ２０８及びｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子、殺虫効果のあるｂ ｔＰＧｓ１２０８及びｂｔＰｆ；５Ｉ２４５遺伝子部分、切断ｂｔＰにＳＩ−凶 且及びい」旦影■４５．違」Ｌ子〜、並びにキメラｂｔＰ（：５Ｉ２０８及びｂ ｔＰＧＳＩ２４５遺伝子も提供する。 本発明では更に、ＢｔＰ［；５Ｉ２０８又はＢｔＰＧＳＩ２４５プロトキシンの 全体又は殺虫効果部分をコードするｂｔＰＧＳＩ２０８又はｂｔＰＧＳＩ２４５ 遺伝子の全体又は一部分を運ぶベクターで、好ましくはエレクトロポレーション により、Ｂｔ株を形質転換する。 見回１４ｕｉ 本発明では、ＢｔＰ（：５１２０８及びＢｔＰＧＳＩ２４５プロトキシンを一般 的な方法でそれぞれＢｔＰＧＳＩ２０８株〈受託番号５１３１でＤＳＨに寄託） 及びＢｔＰＧＳ１２４５株（受託番号５１３２でＤＳＭに寄託）がち単離するこ とができる。例えば、Ｂｔｐｃｓｉｚｏｓ及びＢｔＰｆｌ：５Ｉ２４５結晶を対 応する株の胞子形成した培養物から単離しくＭａｈ　ｉ　ｌ　−１ｏｎ及びＤｅ ｌｅｏｕｒ、１９８４）、次いでＨｂｆｔｅら（１９８６）の方法によりこれら の結晶から対応するプロトキシン２単離し得る。 このプロトキシンは、これらのプロトキシンに特異的なモノクローナル又はポリ クローナル抗体を通常の方法で製造するのに使用できる（Ｈａｆｔｅら、１９８ ８）　、次いで、ＢｔＰＧＳＩ２０８プロトキシンから約５７個のＮ末端アミノ 酸を（例えばトリプシン消化によって）除去すれば、ＢｔＰに５Ｔ２０８毒素を 得ることができる。　ＢｔＰＧＳＩ２４５毒素は、（例えばトリプシン消化によ り）約５２個のＮ末端アミノ酸と約５０１個のＣ末端アミノ酸とをＢｔＰＧＳＩ ２４５プロトキシンから除去することによって得られる。 ｂｔＰｃ：５Ｉ２０８及びｂｔＰＧｓＩＺ４５遺伝子も通常の方法でそれぞれの 株から単離することができる。例えば、ｂｔＰＧｓＩ２０８又はｂｔＰ［；５Ｉ ２４５遺伝子は、１９８６年１月２２日に出願された米国特許出願第８２１，５ ８２号並びに欧州特許出願第８６／３００，２９１．１号及び第８８／４０２， １１５．５号（これらは本明細書に参考として包含される）に記載の方法を用い て、対応するＢｔＰＧＳＩ２０８又はＢｔＰＧＳ１２４５株中で同定することが できる。ｂｔＰｆ；５Ｉ２０８及び・ｂｔＰに５Ｉ２４５遺伝子の各々は、１種 類以上の制限酵素により対応するＢｔＰＩ；５Ｉ２０８及びＢｔＰＧＳ１２４５ 株から完全ＤＮＡを消化し、得られたＤＮＡフラグメントを５〜１０ＫｂのＤＮ Ａフラクションにサイズ分別し、これらのフラクションをクローニングベクター に連結し、このベクターで大腸菌（Ｅ、ｃｏ！ｉ）を形質転換し、クローンな適 当なりＮ＾プローブでスクリーニングすることによって同定するのが好ましい、 　ＤＮＡプローブは、１）甲虫類に対する別の結晶プロトキシンをコードするＢ ｔ遺伝子、例えば欧州特許出願第８８／４０２，１１５．５号及びＨａｆｔｅら （１９８７）によって記述されているｂｔ１３遺伝子が高度に保存された領域で 構成し得、又は２）対応するｂｔＰｃｓＩ２０８又は１」−ＧＳＩ−２４５遺伝 子によってコードされるプロトキシンのＮ末端アミノ酸配列をベースとして構成 し得る。前記アミノ酸配列は固定プロトキシンの気相配列決定によって決定し得 る（欧州特許出願第８８／４０２４１５．５号）。 あるいは、ＢｔＰＧＳ１２０８株又はＢｔＰＧＳ１２４５株の完全ＤＮ＾から調 製した５〜１０ｋＢフラグメントを適当な発現ベクター中に連結し、大腸菌中で 形質転換し、次いでクローンを通常のコロニーイムノブロービング法（Ｆｒｅｎ ｃｈら、１９８６）によりスクリーニングにかけて、ＢｔＰに５Ｉ２０８又はＢ ｔＰＧＳＩ２４５毒素をその毒素に対するモノクローナル又はポリクローナル抗 体により発現させるようにしてもよい。 このようにして同定したｂｔＰ（：５Ｉ２０８及びｂｔＰＧｓＴ２４５遺伝子は 次いで通常の方法（Ｍａｘａ−及びＧ１１ｂｅｒｔ、１９８０）で配列決定する と、第１図及び第２図にそれぞれ示すＤＮＡ配列が得られる・、第１図及び第２ 図に示すｂｔＰに５１２０８遺伝子及びｂｔＰｃｓＩ２４５遺伝子のヌクレオチ ド配列は、ＢｔＰＧＳＩ２０８及びＢｔＰに５Ｉ２４５１０トキシン及び毒素が 、甲虫類に対する活性をもつ先行技術のプロトキシン及び毒素（Ｈ６ｆｔｅ及び Ｗｈｉｔｅ−１ｅｙ、１９８９）とは異なるものであることを証明している。 対応するプロトキシンの殺虫効果部分をコードする配列決定した各遺伝子の殺虫 効果部分と、対応する毒素だけをコードする配列決定した各遺伝子の切断部分は 、遺伝子の配列決定後に各遺伝子から通常の方法で形成できる。 ＢｔＰＣＳＩ２０８及びＢｔＰＧＳＩ２４５プロトキシン及び毒素のアミノ酸配 列は、対応するｂｔＰＧＳ４２０８及びｂｔＰＧＳＩ２４５遺伝子並びに切断ｂ ｔＰＧＳＩ２０８及びｂｔＰＧＳＴ２４５遺伝子のＩＩＮ＾配列から決定し得る 。　ｂｔＰＧｓＩ２０８スはｂｔＰＧＳＴ２４５遺伝子の「殺虫効果部分」又は 「一部分」とは、アミノ酸数が対応するＢｔＰＧＳＩ２０８又はＢｔＰＧＳＩ２ ４５プロトキシンより少ないがそれでも甲虫類に対して毒性を示すポリペプチド をコードするＤＮＡ配列を意味する。　ｂｔＰに５Ｉ２０８又はＬ匹世団」転子 のこのような部分はプロトキシンの少なくとも１つのトリプシン開裂部位で切断 されたＢｔＰＣＳＩ２０８又はＢｔＰＧＳＩ２４５プロトキシンをコードし得る （米国特許出願第８２１．５８２号、欧州特許出願第８６７３００２９１．１号 ）。 ｂｔＰＧｓ１２０８遺伝子又はｂｔＰｃｓＩ２４５遺伝子の全体又は殺虫効果部 分を大腸菌及び植物中で発現するためには、適当な制限部位を各遺伝子又は遺伝 子部分の側に導入する。この操作は、良く知られた手順で、特定部位の突然変異 誘発により実施し得る（ＳｊＨｓｓｅｎｓら、１９８７　；　５ｔａｎｓｓｅｎ ｓら、１９８９）　。 対応するＢｔＰＣＳＩ２０８又はＢｔＰ［；５Ｉ２４５プロトキシンの殺虫効果 部分をコードする殺虫効果のあるｂｔＰｃｓＩ２０８又はｂｔＰＧＳＩ−ζ咥− 遺伝子部分は通常の方法で単一植物細胞の核ゲノム中に安定的に挿入し得、この ようにして形質転換された植物細胞は耐昆虫性をもつ形質転換植物を製造すべく 通常の方法で使用できる０例えば、鉦阻狂匡吐ηｔｕｍｅｆａｅｉｅｎｓの攻撃 性のない（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔｉプラスミド、即ち殺虫効果のあるｂｔＰＧＳ Ｉ２０８又はｂｔＰＧＳＩ２４５遺伝子部分を含んだＴｉプラスミドを用いて植 物細胞を形質転換し、その後、欧州特許公告第０．１１６，７１８号及び第０． ２７０，８２２号、ＰＣＴ公告−０８４７０２，９１３号並びに欧州特許出願第 ８７／４００，５４４．０号（これらも本明細書に参考として包含される）に記 載のような方法を用いて形質転換植物細胞から形質転換植物を再生することがで きる。 得られた形質転換植物は、一般的な植物栽培（繁殖）方法で、同じ特性を有する 形質転換植物を更に製造するために、又は殺虫効果のあるｂｔＰｃ：５Ｉ２０８ もしくはｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子部分を同じもしくは関連した植物種の他の変 種に導入するために使用できる。形質転換植物から得られる種子は、殺虫効果の あるｂｔＰ（：Ｓ＋２０８又はｂｔＰ［：５Ｉ２４５遺伝子部分を安定なゲノム 挿入体として含む、形質転換Ｍ物の細胞は、甲虫類に対する一般的な殺虫剤組成 物に使用するために回収することができるＢｔＰＧＳ１２０８又はＢｔＰ（：５ Ｉ２４５プロトキシン、好ましくはそれぞれの毒素を製造すべく、通常の方法で 培養することができる（米国特許出願第８２１，５８２号、欧州特許出願第８６ ７３００２９１．１号）。 殺虫効果のあるｂｔＰＧｓＩ２０８又はｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子部分、好まし くは切断ｂｔＰｌ；５１２０８又はｂｔＰ（：５Ｉ２４５遺伝子部分は、遺伝子 の挿入部分が、植物細胞中での遺伝子部分の発現を制御し得るプロモーターの下 流（即ち３′）に位置し且つその制御下におかれるように、植物細胞ゲノム中に 挿入する。この操作は、ｂｔＰに５Ｔ２０８又はｂｔＰＧｓＩ２４５キメラ遺伝 子を植物細胞ゲノム中に挿入することによって実施するのが好ましい。 好ましいプロモーターとしては、単離体ＣＭ１８４１　（Ｇａｒｄｎｅｒら、１ ９８１）、ＣａｂｂＢ−Ｓ（Ｆｒａｎｃｋら、１９８０）及びＣａｂｂＢ−Ｊｌ （ｌｌｕｌｌ及びＨｏｗｅｌｌ、１９８７）のカリフラワーモザイクウィルスの 強力な構成性３５Ｓプロモーター（ｒ３５Ｓプロモーター」）、並びにＴ−ＤＮ への１゛遺伝子及び２°遺伝子をそれぞれ発現させるＴＲＩ°プロモーター及び ＴＲ２°プロモーター（ｒＴＲ１’プロモーター」及びｒＴＲ２’プロモーター 」）（Ｖｅｌｔｅｎら、１９８４）が挙げられる。 あるいは、構成性ではなく植物の組織又は器官の１つ以上（例えば葉及び／又は 根）に対して特異的であり、挿入されたｂｔＰＧｓＩ２０８又はｂｔＰＧｓＩ２ ４５遺伝子部分を１つ以上の特定のＭｉ織又は器官の細胞中でのみ発現させるプ ロモーターを使用することもできる０例えば、ｂｔＰＧｓ１２０Ｂ又はｂｔＰＧ ｓＩ２４５遺伝子部分は植物（例えばジャガイモ）の葉の中で、その遺伝子部分 をその植物又は別の植物、例えば米国特許出願第８２１．５８２号及び欧州特許 出願第８６／３００，２９１．１号に記載のようなエントウのりブロース−１， ５−ビホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーターのよ うな光誘導プロモーターの制御下におくことによって、選択的に発現させ得る。 あるいは、発現が〈例えば温度又は化学的要因によって）誘発されるプロモータ ーを使用してもよい。 殺虫効果のあるｂｔＰｃｓ１２０８又はｂｔＰ（：５Ｉ２４５遺伝子部分は、遺 伝子の挿入部分が適当な３゛転写調節シグナル（即ち転写終結及びポリアデニル 化シグナル）の上流（即ち５′）に位置するように、植物ゲノム中に挿入する。 この操作は、ｂｔＰＧｓＩ２０８又はｂｔＰｃｓＩ２４５キメラ遺伝子を植物細 胞ゲノム中に挿入することによって実施するのが好ましい、好ましいポリアデニ ル化及び転写終結シグナルとしては、オクトビン合成遺伝子（Ｇｉｅｌｅｎら、 １９８４）及びＴ−ＤＮ＾遺伝子７　（Ｖｅ　ｌ　ｔｅｎ及び５ｅｈｅｌｌ、１ ９８５）のシグナルが挙げられる。これらのシグナルは、形質転換植物細胞中で ３゛−非翻訳ＤＮＡ配列として機能する。 殺虫効果のあるｂｔＰ（，５ｒ２０８又はｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子部分は、選 択可能なマーカー遺伝子と同じ転写単位で且つ同じプロモーターの制御下で植物 ゲノム中に挿入するのが好ましい。 得られたハイブリッドｂｔｐｃｓｒｚｏｓ又はｂｔＰＧｓＴ２４５マーカー遺伝 子は、これにより、融合タンパク質として形質転換植物中に発現される（米国特 許出願第８２１，５８２号；欧州特許出願第８６７３００２９１．１号ＨＶａｅ ｅｋら、１９８７＞　、この結果は、マーカー遺伝子を含んだｂｔＰＧｓＩ２０ ８又はｂｔＰＧＳＩ２４５キメラ遺伝子を植物細胞ゲノム中に挿入することによ って得るのが好ましい、マーカー遺伝子としては、その発現を形質転換植物細胞 の選択に使用できる任意の一般的遺伝子を使用し得る。 適当な選択可能マーカー遺伝子の具体例としては、抗生物質耐性遺伝子、例えば カナマイシン耐性をコードするｎｅ。 遺伝子が挙げられる（Ｒｅｉｓｓら、１９８４　；欧州特許出願第８７７４００ ．５４４．０号；米国特許出願第８２１，５８２号；欧州特許出願第８６７３０ ０．２９１．１号）。このようにして、殺虫効果のあるＩヱ−ＧＳＩμｌ−又は ｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子部分及びマーカー遺伝子（例えばｂｔＰＧｓＩ２０８ −川又はｂｔＰｃｓＩＺ４５−肚且ハイブリッド遺伝子）が形質転換植物中に融 合タンパク質として発現される（米国特許出願第８２１．５８２号；欧州特許出 願第８６／３００，２９１．１号ＨＶａｅｅｋら、１９８７）　。 甲虫類毒素をコードするｂｔＰＧｓＩ２０８及びｂｔＰに５Ｉ２４５遺伝子の全 体又は一部分は、鱗翅類又は甲虫類に対して殺虫活性を示すＢ、ｔｈｕｒｉｎ工 １ｅｎｓｉｓ−のようなゲノム陽性菌の形質転換にも使用できる。このようにす れば、鱗翅類及び甲虫類双方の昆虫の害又は別の甲虫類昆虫の害に対処する上で 有用な形質転換Ｂｔ株を製造することができる。適当なりローニングベヒクル中 に組込んだｂｔＰＧｓ１２０８又はｂｔＰに５Ｉ２４５遺伝子の全体又は一部分 による細菌の形質転換は、好ましくは１９８９年１２月１１日出願のＰＣＴ特許 出願ＰＣＴ／ＥＰ８９１０１５３９号に記載のような一般的エレクトロボレーシ ョン技術を用いて、通常の方法で実施し得る。 ＢｔＰＣＳＩＺ０８株及びＢｔＰＧＳＩ２４５株はいずれも、通常の方法で発酵 させて、高収率で細胞が得られる（Ｄｕｌ輸ａｇｅ、１９８１）、　十分に解明 されている適当な条件（Ｄｕｌｎａｇｅ、１９８１）の下ではＢｔＰＧＳｒ２０ ８株もＢｔＰｆ；５１２４５株も胞子を形成して、それぞれＢｔＰＧＳｒ２０８ 結晶タンパク質及びＢｔＰＧＳＴ２４５結晶タンパク質を結晶タンパ土質る。 本発明の殺虫剤組成物は、ＢｔＰＧＳＩ２０８株もしくはＢｔＰＧＳＩ−２４５ 株、又は好ましくは対応する結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素及び／ 又は対応するプロトキシンの殺虫効果部分を活性成分として、適当なキャリヤー 、希釈剤、乳化剤及び／又は分散剤と一緒に用いて、通常の方法で調製し得る。 本発明の殺虫剤組成物は、水和剤、ペレット、顆粒もしくは粉末の形態、又は水 性もしくは非水性溶媒を用いた液体配合物、ムース、ゲル、懸濁液、濃縮液等の 形態に調製できる。　ＢｔＰＧＳＩ２０８もしくはＢｔＰ［；５ｒ２４５株、結 晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素及び／′又はプロトキシン部分の前記 組成物中の濃度は、組成物の種類と用途とに依存する０本発明の殺虫剤組成物は 一般的には、該組成物の適用毎にジャガイモ畑が２〜４週間にわたって甲虫類か ら防護されるように使用できる。より長期の（例えば成長期全体にわたる）防護 では、さらに組成物を定期的に適用しなければならない。 以下、添付図面を参照し、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。 第１図はｂｔＰＧｓ１２０＆遺伝子のＤＮＡ配列を示している。コードされたＢ ｔＰＧＳＩ２０８プロトキシンの誘導アミノ酸配列はこの配列の下に示されてい る。矢印はＮ末端の５７個のアミノ酸を、ＢｔＰＧＳ１２０Ｂ毒素をコードする Ｃ末端部分から分離している。　ＢｔＰＧＳＩ２０８毒素のみをコードする切断 ｂｔＰＧｓＩ２遺伝子はヌクレオチド位ｆｉ５１３（矢印９照）からヌクレオチ ド位置２２９５のＴＡＧ終結コドンまで延びている。 第２図はｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子のＤＮＡ配列を示している。コードされたＢ ｔＰＣＳＩ２４５プロトキシンの誘導アミノ酸配列はこの配列の下に示されてい る。矢印はＢｔＰＧＳＩ２４５プロトキシンのアミノ酸５４とアミノ酸６３８と の間のＢｔＰＧＳＩ２４５毒素の範囲を示している。　ＢｔＰに５Ｉ２４５遺伝 子のみをコードする切断ｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子はヌクレオチド位置３９９（ 矢印参照）からヌクレオチド位置２０９４（矢印参照）まで延びている。 第３図は胞子を形成したＢｔＰＧＳＩ２０８、ＢｔＰＧＳＩ２４５及び他のＢａ ｃｉｌｌ−ｕｓ培養物の５ＯＳ−ＰＡＧＥによる総タンパク質パターンを示して いる。比較用の株のうち、Ｂ、５ｕｂｔ、はＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ ＋Ｂ、ｃｅｒ、はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｅｅｒｅｕｓ、Ｂｔ　Ｄａｒ＋＊はＢａｃ ｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ！ｌ！ｌｉｄａｒｍｓｔａｄｉｅｎｓｉ ｓである。これら比較用の株は後出の表１に示す源から得たものである。「Ｉ」 は分子量マーカーを意味する。 第４Ａ図はＢｉ１２株及びＢｔＰＧＳＩ２０８株に由来する総タンパク質及びト リプシン処理結晶タンパク質のタンパク質プロッティングを示している。総タン パク質パターンはインディアンインキで染色し、結晶タンパク質はＢｔ１３毒素 に対する抗血清（「抗Ｃｒｙｌｌｌ＾」）で可視化した。ｒＨＭＪは分子量マー カーを意味する。 第４Ｂ図はＢｉ１２株、ＢｔＰＧＳＩ２４５株及びＢｔ　ＨＤ−１１０株に由来 する総タンパク質及びトリプシン処理結晶タンパク質のタンパク質プロッティン グを示している。総タンパク質パターンについてはその免疫反応性を、Ｂｔ１３ １！素に対する抗血清（「抗Ｃｒｙ−ＩＩＩ＾」）及びＢｔ２プロトキシンに対 する抗血清（「抗Ｃｒｙｒ＾（ｂ）Ｊ）で調べた。「ＬＭｌｌｌ」は分子量マー カーを意味する。 比較用の株）ＩＤ−１１０は、Ｃｏｔｔｏｎ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ。 Ｕ、Ｓ、Ｄ、＾、、Ｂｒｏｗｎｓｖｉｌｌｅ、Ｔｅｘａｓ、Ｌｌ、Ｓ、＾、のＤ ｒ、Ｈ，Ｄｕｌｍａｇｅから入手し力Ｂｔ　ＨＤ−１１０である。 以下の実施例では特に指示のない限り、組換え体ＤＮＡの形成及び操作はＭａｎ ｉａｔｉｓらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　−＾Ｉａｂｏｒａｔｏｒｔ 　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ（１９８２）に記載の標準化された手順に従って行なわれたと理解されたい。 １　：　ＢｔＰＧＳ１２０８　ＢｔＰＧＳＩ２４５　の、ＢｔＰＧＳ１２０８株 はベルギーで試料採取された穀物粉末から単離し、１９８９年１月１９日に受託 番号５１３１でＤＳＨに寄託した。 ＢｔＰＧＳ１２４５株は米国で試料採取された牛糞から単離し、１９８９年１月 １９日に受託番号５１３２でＤＳＨに寄託した。 各様は通常の標準的培地、好ましくはＬＢ培地（バクトドリブトン１０ｇ、＃、 酵母抽出物５ｇ／ｌ、　ＮａＣｌ　１０ｇ／ｌ、寒天１５ｇ、＃）を用いて好ま しくは２８℃で培養し得る。長期間貯蔵する場合は、グリセロールを５０％含む ＬＢ液体培地を一７０℃で又は凍結乾燥状態で使用する。胞子形成の場合は、Ｔ 、培地（トリプトン３ｇ／ｌ、トリプトース２ｇ／ｌ、酵母抽出物１．５ｇ＃、 ＮｎＣ１２５ｍｇ、０．０５Ｍ　Ｎａ１Ｐ０４（ｐＨ６，８）、寒天１．５％） を２８℃で２４時間使用し、次いで４℃で貯蔵するのが好ましい、　ＢｔＰＧＳ １２０８株及びＢｔＰＧＳＩ２４５株はいずれも生長段階は通性の嫌気性条件で も増殖し得るが、胞子形成は好気性条件でしか生起しない。 各様の殺菌は１２０℃（圧力１バール）で２０分間オートクレーブ処理すること によって行う。この処理は胞子と結晶ＢｔＰＧＳＩ２０８プロトキシン及びＢｔ ＰＧＳＩ２４５プロトキシンとを完全に失活させる。ＵＶ照射（２５４ｎ翔）は 胞子を失活させるがプロトキシンは失活させない。 普通寒天（ｒＨ＾、１、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉ ｔ、旧、ｔｌｓ＾）で−日培養すると、　ＢｔＰ［；５１２０８株及びＢｔＰＧ ＳＩ２４５株各々のコロニーが不規則なエツジを有する不透明な白色コロニーを 形成する。Ｎ＾で２８℃で３日間培養すると、各様の細胞（１，７〜２．４ｘ５ ．６〜７．７Ｂのグラム陽性ロッド）が胞子を形成する。 胞子形成中に産生された結晶タンパク質は、ＢｔＰに５Ｉ２０８株の場合には偏 平な菱形結晶にパッケージされ、ＢｔＰＧＳ１２４５株の場合には二重錐形結晶 にパッケージされる。 これら２つの株の生化学的特徴を調べるために、例えば５ｎｅａｔｈら（１９８ ６）によって記述されているような良く知られた方法を用いて下記の検査を行っ た。　ＮａＣｌを２％及び５％加えた普通ブイヨン（ｒ　ＮＢＪ　、Ｄｉｆｅｏ ）では増殖が観察された。 ７％のＮａＣＩの存在下ではＢｔＰに５１２０８株の増殖は全く見られず、Ｂｔ ＰＧＳ１２４５株の増殖はほんの僅かであった。１０％のＮａＣ１を加えた培地 ではどちらの株も増殖しなかった。 ＢｔＰ（：５１２０８株及びＢｔＰＣＳ１２４５株は、Ｎ＾で２０℃、２８℃及 び３７℃で培養すると良く増殖したが、４℃、１０℃（但しＢｔＰに５１２４５ 株はこの温度でゆっくり増殖した）、５０℃及び６０℃では増殖しなかった。ど ちらの株もｐＨ・５、ｐＨ・６及びｐＨ・７のＮＢ並びにＮＢ１ｍ１当たり１０ ０単位のリゾチーム（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋＊１ｃａｌ　Ｃｏｍ−ｐａｎｙ、Ｓ ｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ，ＵＳＡ）を含んだＮＢでは増殖した。嫌気生活ではＮ＾ での増殖は極めて低かった。 これら２種類の株の代謝特性を、＾Ｐｌ−２０Ｅテストストリップ（＾ＰＩ　Ｓ ｙｓｔｅｍｓ　Ｓ、＾、、Ｍｏｎｔａｌｉｅｕ−Ｖｅｒｃｉｅｕ、Ｆｒａｎｃｅ ）を用いて調べた。これらのアッセイの結果を次表１に示す。 」Ｌ　他のＢａｃｉｌｌｕｓ株と比較したＢｔＰｆｌ：５１２０８株及びＢｔｐ Ｈ：５ｌ−２４５株の代謝特性（＋＝陽性反応、−＝陰性反応、Ｗ＝弱反応、ｎ ｄ＝測定せず） ＯＮＰに　＝β−ガラクトシダーゼ活性＾Ｄ）Ｉ＝アルギニンジヒドロラーゼ活 性ＬＤＣ＝リシンデカルボキシラーゼ活性ＯＤＣ＝オルニチンデカルボキシラー ゼ活性ＣＩＴ＝唯一の炭素源としてのクエン酸塩の使用）１２Ｓ　＝チオスルフ ェートからのＦＩ２Ｓの形成ＵＲＥ＝ウレアーゼ活性 ＴＤＡ＝トリプトファンデアミナーゼ活性ＩＮＤ＝　トリプトファンからのイン ドールの形成ＶＰ＝ピルビン酸ナトリウムからのアセトインの形成にＥＬ＝ゼラ チンの液化 ＯＸ＝Ｘニオキシダーゼ Ｎ０２＝硝酸塩の亜硝酸塩への還元 ＮＺ＝硝酸塩からのＮ２ガスの生成 りＴＳＩ　＝　ＤＳＭから入手した受託番号４２８８のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈ ｕｒｉｎ−６↓刃互ＢｔＳ１゜ ＢＴＥＮ＝　ＤＳＭから入手した受託番号２８０３のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕ ｒｉｎ−７亜種ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ。 ＢＤＡＲ＝Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　ｆｉｉｒ　Ｌａｎｄｗｉｒｓｃｈａｆｔｌｉｃｈ ｅ　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅｕｎｃ！　Ｇｉｒｕｎｇｓｂｉｏｌｏｇｉｅ　 ｄｅｒ　Ｅｉｄｇｅｎ６ｓｓｉｃｈｅ　Ｔｅｅｈｏｉｓ−ｃｈｅ　Ｈｏｃｈｓｈ ｉｉｌｅ、Ｚｔｉｒｉｅｈ、５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ（ＬＢ（：”）がら入手し た受託番号４４４７のＢａｃｉｌｌｕｓ助上二画工１ｅｎｓ聾−亜種’ｄａｒｍ ｓｔａｄｉｅｎｓｉｓ。 ＢＣＥＲ＝Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕ端ｖｏｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ、 ＩＩ：ｅｎｔ、Ｂｅ１ｇ１ｕ＋＊（”ＬＮＧ″）から入手した受託番号２０９８ のＢａｃｉｌｌｕｓｅｅｒｅｕｓＩＩ ＢＳＵＢ＝＾ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１ｆｅｅｔｉｏｎ。 Ｐｅｏｒｉａ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、ＵＳ＾から入手した受託番号ＮＲＲＬＢ−２ ３７のＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ。 前記２種類の株は、５ｎｅａｔｈらのテスト（１９８６）において、脱脂乳寒天 でカゼインを急速に分解し且つフェニルアラニンを脱アミン化することが判明し た。 これら２種類の株による種々の糖からの酸の生成を、＾Ｐ１−５０ＣＨＢテスト ストリップ（＾ＰＩ　Ｓｙｓｔｍｅｓ　Ｓ＾）を用いて調べた。結果を次表２に 示す。 表２：他のＢａｃｉ　ｌ　Ｉ　ｉと比較したＢｔＰＧＳＩ２０８株及びＢｔＰＧ ＳＩ２４５株による酸の生成（＋＝陽性反応、−＝陰性反応、Ｗ＝弱反応）。 種々の抗生物質に対する前記２種類の株の感度を０ｘｏｉｄＳｕｓｃｅｐｔｉｂ ｉｌｉｔｙ　Ｔｅ５ｔ　Ｄｉｓｃｓを用いて０ｘｏｉｄ　ｌ５ｏｓｅｎｓｉｔｅ ｓｔ寒天（ｒｃＭ４７１」、０ｘｏｉｄ　Ｌｔｄ、、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、 　ｌＴａ＊ｐｓｈｉｒｅ。 Ｅｎｇｌａｎｄ）で調べた。結果を次表３に示す。 表３：種々のｂａｅｉｌｌｉを播種した抗生物質含有寒天で２４時間後に観察さ れた阻止ゾーンの直径（ｍｓ）で示す抗生物質感度（Ｒ＝耐性コロニー又は増殖 検出されず）拡張ＡＰＩ−ＺＹＭストリップ（＾ＰＩ　５ｙｓｔｅｓ　Ｓ、＾、 ）を用いてＢｔＰＧＳＩ２０８株及びＢｔＰＧＳＩ２４５株の酵素スペクトルを 調べた。 結果を次表４に示す、エステラーゼテストストリップ、ペプチダーゼテストスト リップ（＾Ｐ１、＾Ｐ２、＾Ｐ３、＾Ｐ４、＾Ｐ５及び＾Ｐ６テストストリツプ ）及びオシダーゼテストストリップには５０−１細胞懸濁液（１０’ｅｆｕ／ｍ ｌ）を植え付けた。オシダーゼ反応は２５．１の０．１Ｎ　Ｎａ０ＦＩと一緒に ４時間（２８℃）インキュベートした後で現れた。他の総ての反応は２５，１の ＺＹＭ＾及びＺＹＭ　Ｂ試薬（＾ＰＩ　ｎｏ、７０４８）で現れた。 表４：他の２つのＢｔ株と比較したＢｔＰＧＳ！２０８株及びＢｔＰＣＳＩ２４ ５株の酵素スペクトル（０＝使用基質は加水分解されず、１，２，３，４．５＝ それぞれ５，１０，２０．３０及び≧４０ナノモルの基質が加水分解された）！ １Ｊｕｌｉ：　ＢｔＰＧＳＩ２０８　びＢｔＰ（，５Ｉ２４５　）。 ＢｔＰＧ念１２０８株及びＢｔＰＧＳ１２４５株をＴ３培地で２８℃で４８〜７ ２時間増殖させた。胞子形成後、胞子及び結晶をＴｒｉｈａｌｓｋｉスパチュラ での掻取りによりリン酸塩！！衝生理食塩水（ｒＰＢＳ、、０ｘｏｉｄ　Ｌｔｄ 、製）中に回収した。得られた胞子−結晶懸濁水を遠心分離にかけ、ベレットを ５０−ＨのＮａ２ＣＯ３と５ＢＭのジチオトレイトール（ｒＤＴＴＪ）とを含む ｐＨ１０の水溶液中に再懸濁させて一晩インキユベートした。遠心分１１１ｆ＆ 、それぞれの結晶タンパク質を含む上滑を回収した。 ＢｔＰＣＳｒ２０８プロトキシン及び毒素並びにＢｔＰに５Ｔ２４５毒素は第４ 図に示すようにＢｔ１３毒素に対するポリクローナル抗血清とだけ反応する。こ れに対し、ＢｔＰ（：５Ｉ２４５プロトキシンは第４図に示すようにＢｔＳｌ又 はＢｔ１３毒素（欧州特許出願第８８／４０２１１５．５号）及びＢｔ２プロト キシン（米国特許出願第８２１゜５８２号、欧州特許出願第８６／３００，２９ １．１号）に対するポリクローナル抗血清と反応する。 ＢｔＰｌ；５１２０８株及びＢｔＰＧＳＩ２４５株の総タンパク質パターンを他 のＢａｃｉｌｌｕｓ株と比較して第３図に示した。この比較のために、各棟の結 晶タンパク質を１２，５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析しくＬａｅｍｍｌｉ、 １９７０）、且つＬａ５ｉｂｅｒｔら（１９８７）に従ってクーマシーブリリア ントブルーＲ−２５０で染色した。前記胞子−結晶混合物を一晩３７℃で５０１ ６８　Ｎ１１２ＣＯ３（ＧＩＨＩＯ）、５ＩＩＭＤＴＴに暴露することにより結 晶タンパク質を溶解させた。ｐｌ＋を０．５ＭＨＣｌで９．０に調整し且つトリ プシン化（ｌｕｇウシトリプシン７２５μｇタンパク質）を行って、溶解した結 晶タンパク質を消化した。　ＢｔＰに５１２０８結晶タンパク質及びＢｔＰに５ Ｉ２４５結晶タンパク質のトリプシン消化を３７℃で一晩行うと、それぞれ６８ ｋＤａ及び６６ｋＤａのトリプシンフラグメントの存在が明らかになった（第４ 図）、　Ｐｅｆｅｒｏｅｎ（１９８８）の方法に従い、８０３毒素及びＢｔ２プ ロトキシンに対するポリクローナル抗血清を用いてイムノブロッティング実験を 行ったところ、第４Ａ図及び第４Ｂ図に示すように、ＢｔＰＧＳＩ２０８及びＢ ｔＰ（：５Ｉ２４５プロトキシン及び毒素はＢｔ１３毒素と免疫学的に関係があ ることが判明した。また、第４Ｂ図に示すように、ＢｔＰ［；５ＩＺ４５毒素は 免疫学的にＢｔ２プロトキシンとも関係があることが判明した。プロッティング 後、これらのタンパク質をインディアンインキで染色して（Ｓｕｔｂｅｒｌａｎ ｄ及び５ｋｅｒｒｉｔｔ、１９８６）免疫反応性タンパク質及び非免疫反応性タ ンパク質の両方を明らかにした（第４図）。 天」１穫」二ＢｔＰｆ；５Ｉ２０８結。タンパク質　びＢｔＰＧＳＩ２４５結晶 タンパ　の　Ｓ 実施例２と同様に、前記２種類の株をＴ、培地で２８℃で４８〜７２時間増殖さ せた。胞子形成後、Ｔｒｉｈａｌｓｋｉスパチュラで胞子及び結晶をＰＢＳ（ｐ ｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）中に回収した。得られた 胞子−結晶懸濁液を遠心分離にかけ、ベレットを実施例２と同様のＮａｚＣＯ− 及びＤＴＴ水溶液中に再懸濁させて一晩インキユベートした。遠心分離後、上清 を回収し、前記２種類の株のそれぞれの結晶タンパク質の含量を測定した。 ジャガイモの葉を前記上清溶液の水性希釈物に浸し、次いで２時間風乾した。こ のようにして処理した葉の上に第二齢のコロラドハムシ幼虫を配置し、３日後の 幼虫の死亡率を測定した。その結果を、対照としてＢｔ　ＨＤ−１の可溶化結晶 タンパク質（’Ｂｔ　Ｋｕｒｓｔａｋｉ　Ｄｉｐｅｌ」、＾ｂｂｏｔｔ　Ｌａｂ ｏｒａ−ｔｏ　ｉ　ｒｅｓ　、＾ｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃ ａｇｏ、Ｉｌｌ、、ＵＳ＾）で処理した葉を与えた幼虫の死亡率と比較した。１ １当たりの可溶化結晶タンパク質量ｌＩｇで表されるＬｅ５．をＰｒｏｂ　ｉ　 を分析（Ｆｉｎｎｅｙ。 １９７１）によって計算した。結果を次表５にまとめた。 表５　：　Ｌｅ　ｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｃｌｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ幼虫に対す るＢｔＰＧＳ１２０８株−ＢｔＰＧＳＩ２４５株及びＢｔＨＤ１株（対照）由来 の可溶化結晶タンパク質の毒性の比較 ＢｔＰＧＳＩ２０８株に由来するＢｔＰＧＳ１２０８プロトキシンを−Ｂｔ１３ 甲虫類毒素に対するポリクローナル抗血清を用いて（Ｈａｆｔｅら、１９８７） 、ＥＬＩＳ＾により検出した（Ｅｎｇｖａ　ｌ　Ｉ及びＰｅ５ｅｅ、１９７８） 、　ＢｔＰＣＳｒ２０８株の完全［ＩＮ八を調製し、このＤＮＡを制限酵素Ｈｉ ｎｄｌｌ＋、ＥｃｏＲＩ及びＣ１ａｌで消化することによって、ｂｔＰＧｓ１２ ０８遺伝子をＢｔＰＧＳＩ２０８株内で同定した。このように消化したＤＮＡは 、ｂｔ１３遺伝子を含むＢｔＳ１株（欧州特許出願第８８／４０２，１１５．５ 号）のゲノムに由来するニックトランスレーションした２、９ｋｂＨｉｎｄＩＩ Ｉフラグメントをプローブとして用いて、サザンブロッティングで分析した。プ ローブとのハイブリダイゼーション後、プロットを低ストリンジエンシー条件下 で洗浄（２χ５ＳＣ５０、］％ＳＤＳ、６８℃、２×１０分間）すると、防鼠遺 伝子に関連したｂｔＰｌ；５Ｉ２０８遺伝子の存在が判明した。プローブとのハ イブリダイゼーションパターンは更に、ｂｔＰＩｌ：５Ｉ２０８遺伝子が１４遺 伝子とは明らかに異なるものであることも明示しな。 ｂｔＰＧｓＩ２０８遺伝子を単離すべく　、ＢｔＰＧＳＩ２０８株から完全ＤＮ Ａを調製した。この完全ＤＮＡ調製物をれ且３＾で部分的に消化し、ショ糖勾配 でサイズ分画した。　５ｋｂ〜１０ｋｂのＤＮＡを含むフラクションを、む土Ｉ ＩＩで消化し且つウシアルカリホスファターゼ（ｒＢＡＰＪ）で処理したクロー ニングベクターｐＥｅｏＲ２５１（１９８８年７月１３日に受託番号ＤＳＭ４７ １１でＤＳＭに寄託）に連結した。このベクターを含む組換え体大腸菌クローン を、プローブとしてｂｔ１３遺伝子を含む２．９ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ　ＤＮＡ フラグメントを用いてスクリーニングにかけ、ｂｔＰＣ，５Ｉ２０８遺伝子を含 むクローンのＤＮＡフラグメントを同定した。このようにして同定したＤＮＡフ ラグメントをＭａｘａｍ及びに１ｌ−ｂｅｒｔ（１９８０）の方法で配列決定し た（第１図）。 ｂｔｐｃｓｒｚｏｓ遺伝子のＤＮＡ配列の分析に基づいてこの遺伝子を適当な制 限酵素で切断し、約６８ｋＤａのＢｔＰＧＳＩ２０８毒素をコードする切断ｂｔ ＰＧＳＩ２０８遺伝子を得た。 えＩ九５　：　ｂｔＰＧｓＩ２４５　−　の口　び　ローニンＢｔＰＣＳ１２４ ５株に由来するＢｔＰにＳ＋２４５プロトキシンを、Ｂｔ１３甲虫類毒素に対す るポリクローナル抗血清を用いてＥＬＩＳ＾により検出した（Ｅｎｇｖａｌｌ及 びＰｅ５ｃｅ、１９７８）。ＢｔＰＧＳ１２４５株のコロニーハイブリダイゼー ションと、防鼠遺伝子を含む２．９ｋｂＨｉｎｄｌｌＩ　ＤＮＡフラグメントで プローブし且つ前述の低ストリンジエンシー条件下で洗浄したＢｔＰＧＳＩ２４ ５完全ＤＮ＾のサザンブロッティングとの結果、ハイブリダイジングＤＮＡは観 察されなかった。 ｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子を単離すべく　、ＢｔＰＧＳ１２４５株から完全ＤＮ Ａを調製し、５ａｕ３＾で部分的に消化した。消化したＤＮＡを＾ ショ糖勾配でサイズ分別し、５ｋｂ〜１０ｋｂのフラグメントを、Ｂａｇ）ＩＩ で消化し且つＢ＾Ｐで処理したクローニングベクターｐＵｃ１８に連結した（Ｙ ａｎｎｉｓｅｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５）、このベクターを含む組換え体ク ローンを、ｂＨ３毒素に対する抗血清でのコロニーイムノプロービングによりス クリーニングした（Ｆｒｅｒ＋ｃｈら、１９８６）　、陽性コロニーを精製し、 総タンパク質調製物をＢＨ３毒素に対する抗血清でのイムノブロッティングによ って再分析した。　ＢｔＰに５Ｉ２４５プロトキシンを発現するクローンに由来 するＢＬＰＧＳＩ２４５遺伝子を含むＤＮＡフラグメントをＮａｘａｍ及びに１ ｌｂｅｒｔ（１９８０）の方法で配列決定した（第２図）。 ｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子のＤＮＡ配列の分析に基づいて、この遺伝子を適当な 制限酵素で切断し、約６６ｋＤａのＢｔＰＣＳＩ２４５毒素をコードする切断ｂ ｔＰＧｓＴ２４５遺伝子を得た。 及１１虹：　ｂｔＰＧｓＩ２０８−ｎｅｏバイブ１ツド　−　びｂｔＰＧＳＴ− ２４５−ｎｅｏハイブト・ド　−　の 米国特許出願第８２１，５８２号並びに欧州特許出願第８８／４０２　。 １１５．５号及び第８６／３００２９１．１号に記載の方法に従い、それぞれ実 施例４及び５で得た切断ｂｔＰｃｓＩ２０８遺伝子及び切断ｂｔＰＧｓＩ２４５ 遺伝子を二速転子と融合して、対応するハイブリッド遺伝子を構築する。 天」１残１−：　ｂｔＰｃｓＩ２０８　−　ｂｔＰＧｓＩ２４５　−ｂｔＰＧＳ Ｉ２０８　ｂｔＰＧｓＩ２４５　−　ｂｔＰｃｓＩ２０８−ｎｅ。 バイブｌド　−　ｂｔＰｃｓＩ２４５−ｎｅｏバイブ）ラド　−の　への　・び に　ｂｔＰに５Ｉ２０８　−　切断ｂｔＰＩ；５Ｉ２４５゛−ｂｔＰＧｓＩ２０ ８−ｎｅｏハイブリッド遺−びｂｔＰＧｓＩ２４５−ｎｅｏバイブｂド　のジャ ガイモ　へのＫ ｂｔｐｃｓｒｚｏｓ及びｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子、実施例４及び５の切断ｂｔ ＰＧｓＩ２０８及びｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子、並びに実施例６のｂｔＰＧｓｉ η）８−ｎｅｏ及びｂｔＰＧｓＩ２４５−ｎｅｏハイブリッド遺伝子の各々を、 Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ及びＺａｂｅａｕ　（１９８７）によって記述されている大 腸菌発現ベクターを用いて、通常の方法で、種々の大腸菌に挿入し発現させる。 これらの遺伝子を大腸菌内及び植物中で発現させるために、種々の遺伝子カセッ トを形成する。 Ｂａａ）ＩＩ制限部位を特定部位の突然変異誘発によりｂｔＰＧｓＩ２０８遺伝 子の＾ＴＧ開始コドンに導入する（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓら、１９８８　。 ５ｔａｎｓｓｅｎｓら、１９８９）、　ｂｔＰＧｓＴ２０８遺伝子の４番目のヌ クレオチドがＡからＧに変化して唯一の石Ｈ１部位が得られる。 ’　Ｋｏｚａｋの法則Ｊ　（Ｋｏｚａｋ　、　１９８６）によれば、この突然変 異は植物細胞における翻訳開始も最適化する筈である。このようにして、＾ｓｎ をコードする＾＾Ｔコドン（第２コドン）が＾ｓｐをコードするＧＡＴコドンに 変わる。同様にして、ＮｃｏｌをｂｔＰ（：５Ｉ２４５遺伝子のへＴＧ翻訳開始 コドンに挿入する。 大腸菌（ｂｔＰＧｓＩ２０８遺伝子で形質転換）中で産生されたＢｔＰＧＳＩ２ ０８プロトキシンのコロラドハムシ第二齢幼虫に対する殺虫活性を表６に示す、 毒性は５０％致死濃度（ｐｇ／ｍｌ）で表し、９５％信頼範囲及びプロビットラ インのスロープも示した。 弄コＬ １．０＜０．６〜１．８）　２．３ 大腸菌中で産生じたＢｔＰ［；５１２０８プロトキシンの毒性は、ＢｔＰＧＳＩ ２０８株によって産生したＢｔＰＧＳＩ２０８プロトキシンの毒性の約５倍以上 であった。大腸菌中で産生したＢｔＰＣＳＩ２０８プロトキシンをトリプシンで 消化すると、やはりコロラドハムシに対して活性のＢｔＰＣ：５Ｉ２０８毒素が 得られた。 米国特許出願第８２１．５８２号並びに欧州特許出願第８６／３００　。 ２９１１号及び第８８／４０２，１１５．５号に記載の方法を用いて、切断ｂｔ ＰＧｓＴ２０８及びｂｔＰ（：５Ｉ２４５遺伝子並びにｂｔＰＧｓＩ２０８−駐 車及びｂｔＰＧｓＩ２４５−ｎｅｏハイブリッド遺伝子を単離し、中間Ｔ−ＤＮ ＡベクターであるｐＧｓＨ１６０（Ｄｅｂ　ｌ　ａｅｒｅら、１９８８）のＴ− ＤＮＡ末端ボーダー反復配列の間に挿入する。植物中で主要発現が得られるよう に、前記ハイブリッド遺伝子及び切断遺伝子を強力な構成性プロモーターである Ｃａｂｂ−ＪＩ　３５Ｓプロモーター（Ｈｕｌｌ及びＨｏｖｅｌ　ｌ　、１９８ ７）又はＴＲ２°プロモーター（Ｖｅ　ｌ　ｔｅｎら、１９８４）の制御下にお き、オクトビン合成遺伝子（Ｇｉｅｌｅｎら、１９８４）の転写終結及びポリア デニル化シグナルと融合する。 標準的な方法（Ｄｅｂｌａｅｒｅら、１９８５）により、切断ｂｔＰＧｓＩ２０ ８及びｂｔＰｃｓ１２４５遺伝子並びにｂｔＰＧｓ１２０８−ヱ及びｂｔＰＧＳ Ｉ２４５−ｎｅｏハイブリッド遺伝子を含む中間植物発現ベクターを、攻撃性の ないＴｉ−１ラスミドｐＧＶ２２６０を担持する〜７−」株Ｃ５８ＣＩ　Ｒｉｆ ’（米国特許出願第８２１．５８２号、欧州特許出願第８６７３００，２９１． １号）に移す。スペクチノマイシン耐性を選択すると−ｐｃＶ２２６０とそれぞ れの中間植物発現ベクターとからなる同時組込み（ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ） プラスミドが得られる。これらの各組換えム■ｏｂａｃｔｅｒエリエ株を用いて 、切断ｂｔｐｃｓｒｚｏｓ遺伝子、切断い」旦影ド４５遠」Ｌ子−１ｂｔＰＣＳ Ｉ２０８−ｎｅｏハイブリッド遺伝子及びｂｔＰＧＳＩ２４５−ｎｅｏハイブリ ・ラド遺伝子が種々のジャガイモ植物細胞中に含まれ且つ発現されるように種々 のジャガイモ植物（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕ端）を形質転換する。 ノζ−左Ｅ−戸Ｕミー：　ｂｔＰＧｓＩ２０８遺　−七　ｂｔＰＧｓＩ２４５　 −ｂｔＰＧＳ１２０８−ｎｅｏバイブ１　ラド　ｂｔＰＧＳＩ２４５−ｎｅｏバ イブＩツド　のジャ　イモ　′の 実施例７の形質転換ジャガイモ植物細胞から発生した形質転換ジャガイモ植物の 葉における切断ｂｔＰＣＳＩ２０８及び旺口Ｊ転子並びにｂｔＰＧＳＩ２０８− ｎｅ且及びｂｔＰＧＳＩ２４５−二ハイブリッド遺伝子の発現産生物が甲虫類に 対して示す殺生活性を、これらの葉で飼育した１匹組蛙ａｒｓａ　ｄｅｅｅｍｌ ｉ−ｎｅａｔ工幼虫の成長率及び死亡率を記録することによって調べる。その結 果を、非形質転換ジャガイモ植物の葉で飼育した幼虫の成長率と比較する。毒性 アッセイは欧州特許出願第８８／４０２，１１５．５号、米国特許出願第８２１ ．５８２号及び欧州特許出願第８６７３００，２９１．１号に記載のように実施 する。切断ｂｔＰ（：５１２０８遺伝子、切断ｂｔＰＧｓ１２４５遺伝子、ｂｔ ＰＧｓＩ２０８−ｎｅ。 ハイブリッド遺伝子又はｂｔＰＧｓＩ２４５−ｎｅｏハイブリッド遺伝子を含む 形質転換ジャガイモ植物の葉で飼育した幼虫の死亡率は、非形質転換植物の葉で 飼育した幼虫の死亡率よりかなり高い。 実」直１：　ｂ　ｔ　ｐ　ｃ　ｓ　ｒ　ｚ　ｏ　ｓ　−に　ａｔ　の　′殺虫ス ペクトルを向上させるべ（、ＢｔＳ１７４＾株（Ｎａｈｉｌｌｏｎら、１９８９ ）をプラスミドｐＡＭｂｔ２１Ｒ１を用いてエレクトロポレーションにかける。 　ｐＡＭｂｔ２１Ｒ１は、プラスミドｐＪＬ２１の５．４ｋｂの石Ｉフラグメン トをシャトルベクターｐ＾８４０１（Ｉｌｉｒｔｈら、１９８７）のテトラサイ クリン耐性遺伝子のＥｅｏＲＶ部位にクローニングすることによって得られる。 プラスミドｐＪＬ２１は、ＢｔＰＣＳＩ２０８株に由来すルｂｔＰＧｓＩ２０８ １１　転子ヲ含ｔＪ　６ｋｂ　７　ラクメントをプラスミドｐＥｃｏＲ２５１（ ＤＳＭ受託番号４７１１）のＢＬＬＩ　１部位にクローニングすることによって 得られる。 エレクトロポレーションはＰＣ丁特許出願ＰＣＴ／ＥＰ８９１０１５３９号に記 載の方法で行う、　ｐＡＭｂｔ２１Ｒ１で形質転換したＢｔＳ１フ４＾株は鱗翅 類に対する殺虫活性を保持し、採肉でのｂｔＰに５Ｉ２０８遺伝子の発現に起因 して新たに獲得した対甲虫類殺虫活性を示す。 言うまでもなく、本発明はＢｔＰにＳＩ２０８（ＤＳＭ５１３１）株及びＢｔＰ ＧＳＩ２４５（ＤＳＭ５１３２）株には限定されない０本発明の範囲には、Ｂｔ ＰＣＳ１２０８又はＢｔＰＧＳＩ２４５結晶、結晶タンパク質、プロトキシン又 は毒素と実質的に同じ性質を有する結晶、結晶タンパク質、１０トキシン又は毒 素を産生ずる任意のＢｔＰに５Ｉ−２０８又はＢｔＰＧＳＩ２４５株突然変位体 又は変株が含まれる。ちなミニ、ＢｔＰに５１２０８株及びＢｔＰＧＳＩ２４５ 株の変株は、総タンハク質パターンが第３図に示すＢｔＰＧＳ１２０８株又はＢ ｔＰＧＳＩ２４５株のタンパク質パターンと実質的に同じである変株を含む。 本発明は切断ｂｔＰＧＳＩ２０８遺伝子又は切断ｂｔＰＧＳＩ２４５遺伝子で形 質転換したジャガイモ植物には限定されない０本発明の範囲には、トマト、タバ コ、菜種、アルファルファ、ヒマワリ、木綿、コーン、大豆、アブラナ、テンサ イその他の野菜のような任意の植物をｂｔｐｃｓｒｚｏｓ遺伝子又はｂｔＰにＳ ｌひΣ遺伝子の殺虫効果部分で形質転換したものが含まれる。 本発明はまた、殺虫効果のあるｂｔＰＧｓＩ２０８又はｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝 子部分での植物細胞の形質転換における江阻■ｅｔｅｒニｕｓ　ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓ　Ｔｉ−プラミドの使用にも限定されない。他の公知の植物細胞形質転 換方法、例えばリポソームを用いる方法、エレクトロポレーションによる方法又 は植物ウィルスもしくは花粉をベースとするベクターシステムを用いる方法も、 このような遺伝子部分での単子葉植物及び双子葉植物の形質転換に使用できる。 また、ｂｔＰＧｓｒ２０８遺伝子及ヒ切断ｂｔＰ（：５１２０８遺伝子ニツいテ 第１７２　ニ示Ｌ　且ツｂｔＰＣＳｒ２４５遺伝子及ヒ切断ｂｔＰＣＳＩ２４５ 遺伝子について第２図に示したようなりＮＡ配列以外のＤＮＡ配列も植物及び細 菌の形質転換に使用できる。ちなみに、第１図又は第２図のＤＮＡ配列は、１） 成るコドンを同じアミノ酸又は別のアミノ酸をコードする別のコドンで置換し、 及び／又は２）幾つかのコドンを除去もしくは添加することによって修飾できる 。但し、この種の修飾はＢｔＰに５１２０８もしくはＢｔＰに５Ｉ２４５プロト キシン又は毒素のコードされた殺虫効果を有する部分の性質を変化させるような ものであってはならない。 前述のＤＮＡ配列を他の外来ＤＮ＾、特に植物及び大腸菌以外の微生物の形質転 換に適したベクターのＤＮＡと組合わせて含む他のＤＮＡ組換え体も本発明の範 囲内に含まれる。ちなみに、本発明は前述したｂｔＰＧｓＩ２０８及びｂｔＰｃ ｓＩ２４５遺伝子又はその一部分を含む特定のプラスミドには限定されず、これ らと等価のＤＮＡ配列を含む任意のＤＮＡ組換え体を包含する。 本発明はまた、ｂｔＰに５１２０８遺伝子又ハｂｔＰｃｓＩ２４５遺伝子ノ全体 又は一部分を含むＤＮＡ組換え体であって、微生物（例えば植物に関係のあるＢ ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ−Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　びＸａｎｔｈｏ ＋ａｏｎａｓのような細菌又は５ｔｒｅ　ｔｏｗ　ｃｅｓ　’ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅのような酵母）を、遺伝子の全体もしくは一部分を発現させ得ると共に前記 微生物がら回収するがあるいは植物細胞に移すことができる条件下で、形質転換 するのに適している総てのＤＮＡ組換え体に係わる。 下露乙の人ｆｖ、Ｈ６月庫困↓

【二３１用ご代ｆｚ力ので′ゐるニー　Ｂｏｔｔ ｅｒｍａｎ　ａｎｄ　Ｚａｂｅａｕ、ＤＮＡ　ｆｌ、５８３−５９１　（１９８ ７）−Ｄａｂｌａｅｒｅ、Ｒ，、Ｂｉｊｔｅｂｉｅｒ、　Ｂ、　Ｄａ　Ｇｒａｖ ｅ　、　Ｈ，、Ｄｅｂｏｃｋ、　Ｆ、。 ５ｃｈａｌｌ、Ｊ、、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、Ｍ、ａｎｄ　Ｌｅｅｍａｎｓ、 Ｊ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ入ａｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　工、ｌ、４７７７−４７ ８８　（１９８５）。 −Ｄｅｂｌａ＠ｒａ、Ｒ，、Ｒｅｙｎａａｒｔｓ　入、、Ｈ６ｆｔｅ　Ｈ，、Ｈ ｅｒｎａｌｓｔａｅｎｓＪ、−Ｐ、、Ｌａａｍａｎｓ　Ｊ、ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｍ ｏｎｔａｇｕ　Ｍ、、Ｍａｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　以、　、２ ７７−２９２　（１９８Ｂ）　。 −Ｄｕｌｍａｇｅ、Ｈ，Ｔ、、”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉ ａ　ｆｏｒ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｉｎ５ｅｃｔｓ”　 ｉｎ　’　ｔｏ　’　ＣＥｘｓｂ包は山川、　Ｅｄ、Ｐａｐａｒｉｚａｓ、Ｄ、 Ｃ，、Ｏｓｍｕｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。 Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ、Ｊ、、ＵＳ入、ｐｐ、１２９−１４１　（１９８１）。 −Ｅｌｌａｒ、　Ｄ、Ｊ、、肋ｏｗｌｅｓ、Ｂ、１（、、Ｄｒｏｂｎｉｅｖｓｋ ｉ、ｓ、λ、ａｎｄＨａｉｄｅｒ、Ｍ、Ｚ、、ｉｎ　’Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ 　ａｎｄλｐｐｌｉｅｄ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆＩｎｖｅｒｔａｂｒａ七ａ　Ｐ ａｔｈｏＬｏｇｙ’、　Ｅｄ、Ｓａｍｓｏｎ、Ｒ，入、、Ｖｌａｋ、Ｊ、Ｈ。 ａｎｄ　Ｐｅｔａｒｓ、　Ｄ、　（１９８６）　ｐｐ、　７−１０．　Ｗａｇｅ ｎｉｎｇｅｎ、　Ｆｏｕｎｃｉａｔｉｏｎｏｆ　ｔｈａ　ｆｏｕｒｔｈ　工ｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＣＣｏ１１ｏｑｉｕ　ｏｆ　工ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ。 −Ｅｎｇｖａｌｌ　ａｎｄ　Ｐｅ５ｃｅ、　５ｃａｎｄ、　ニーｕｎｏ１．５ｕ ｐｐ１．７　（１９７８）−Ｆｉｎｎｅｙ、　Ｐｒｏｂｉｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ 、　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒ ｅｓｓ　（１９７１）−Ｆｒａｎｃｋ、Ｇｕｉｌｌｅｙ、Ｊｏｎａｒｄ、Ｒｉｃ ｈａｒｄｓａｎｄＨｌｒｔｈ、　Ｃｅ１１２１ｚ−Ｆｒｅｎｃｈ、Ｂ、Ｔ、、Ｍ ａｕｌ、　Ｈ，Ｎ、　ａｎｄ　Ｍａｕｌ、　Ｇ、Ｇ、、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ。 耳瓜、４１７４２：ｌ　（１９８６） −Ｇａｒｄｎａｒ、　Ｈｏｗａｒｔｈ、　Ｈａｈｎ、　Ｂｒｏｗｎ−Ｌｕａｄｉ 、５ｈｅｐａｒｄ　ａｎｄＭｅｓｓｉｎｇ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　９．　２８７１−２８８７　（１９８１）−Ｇｉａｌｅｎ、Ｊ、 、Ｄｅ　Ｂｅｕｋｅｌｅａｒ、Ｍ、、　５ｅｕｒｉｎｃｋ、　、？、、　Ｄｅｂ ｏａｃｋ。 Ｆ、、Ｄａ　Ｇｒａｖｅ、Ｈ，、Ｌｅｍｍａｒｓ、Ｍ、、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇ ｕ、　Ｍ、　ａｎｄＳｃｈｅｌｌ、　Ｊ、、　ＥＸＢＯＪ　、ｌ、　８３５−８ ４５　（１９８４）。 −Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｒ，Ｂ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２ｉＱ、１４６０−１４ ６７　（１９８Ｂ）−Ｈ６ｆｔｅ、Ｈ，、Ｄａ　Ｇｒａｖａ、Ｈ，、５ｅｕｒｉ ｎｃｋ、　Ｊ、、　Ｊａｎｓｅｎｓ、　Ｓ、。 Ｍａｈｉｌｌｏｎ、Ｊ、、Ａｍｐｓ、Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ、　Ｊ、　 Ｖａｎｄｅｒｂｒｕｇｇｅｎ。 Ｈ，、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、、Ｚａｂｅａｕ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｖａ ａｃｋ、　Ｍ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ。 Ｂｉｏｃｈａｍ、ｌｊＪ、２７３−２８０　（１９８６）−Ｈ６ｆｔａ、Ｈ，、 ５ａｕｒｉｎｃｋ、Ｊ’、、Ｖａｎ　Ｈｏｕｔｖａｎ入、ａｎｄ　Ｖａｅｃｋ、 Ｍ、。 Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａ５ｅａｒｃｈ　３Ｊ、７１８３　（１９８７ ）−Ｈ６ｆｔａ、　Ｈ，、Ｄｉｓｓａｒｔａｔｉｏｎ　ｔｈｅｓｉｓ　ａｔ　ｔ ｈｅ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｇｈｅｎｔ、　Ｂｅｌｇｉｕｍ 　（１９８８）。 −］（６ｆｔａ、Ｈ，、Ｖａｎ　Ｒｉａ、Ｊ、、Ｊａｎｓｅｎｓ、Ｓ、、Ｖａｎ 　Ｈｏｕｔｖａｎ、入、。 Ｖｅｒｂｒｕｇｇａｎ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｖａｅｃｋ、Ｍ、、入ｐｐｌｉｅｄ　ａ ｎｄ　ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５ｊｌ、　２０ １０−２０１７　（１９８８）−Ｈ６ｆｔａ　Ｈ，ａｎｄ　Ｗｈｉｔａｌｅｙ　 Ｈ，Ｒ，、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒａｖｉｅｗ　ｇ。 ２４２−２５５　（１９Ｂ９）。 −Ｈｕｌｌ　ａｎｄ　Ｈｏｗａｌｌ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　ｕ、４８２−４９３ 　（１９８７）−Ｋｏｚａｋ　Ｈ，、Ｃｅ１ｌ土Ｌ　２８３−２９２　（１９８ ６）。 −ｌＫｕｈｌｅｍｅｉｅｒ、Ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　Ｃｈｕａ、ｉｎｎ、　Ｒｅｖ 、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ。 …、２２１−２５７　（１９８７） −Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｖ、、Ｎａｔｕｒｅ　、、Ｊ、６８０−６８５　（１９７０ ）−Ｌａｍｂｅｒｔ、Ｂ、、Ｌｅｙｎｓ、Ｆ、、Ｖａｎ　Ｒｏｏｙｅｎ、　Ｌ、 、　Ｇｏｓｓｅｌｊ、　Ｆ、。 Ｐａｐｏｎ、Ｙ、ａｎｄ　Ｓｗｉｎｇｓ、Ｊ、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄＥｎｖｉ ｒｏｎｍａｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　云、１８６６−１８７１　（１ ９８７）−Ｍａｈｉｌｌｏｎ、Ｊ、ａｎｄ　Ｄｅｌｃｏｕｒ、　Ｊ、、　、７． 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｍａｔｈｏｄｓ　、ｌ。 ６９−７３　（１９８リ −Ｍａｈｉｌｌｏｎ　ａｔ　ａｌ、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌａ ｔｔａｒｓ　ｆｄ、　２０５−２１０−Ｍａｘａｍ、　入、Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１ １ｂｅｒｔ、Ｗ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、支足。 ４９９−５６０　（１９８０）。 −０ｄｅｌｌ、Ｊ、Ｔ、、Ｎａｇｙ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｃｈｕａ、Ｎ、、Ｎａｔｕ ｒｅ　ｎＬ８１０−８１２　（１９８５）。 −Ｐｅｆｅｒｏｅｎ、Ｍ、ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、　３　：Ｎｅｗ　Ｐｒｏｔａｉｎ　Ｔａｃｈｎｉｑ ｕａｓ、　ｐ、　３９５−４０２．　Ｅｄ、　Ｊｏｈｎ　Ｍ、　Ｗａｌｋｅｒ。 Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８８）。 −Ｒｅ１ｓｓ、Ｂ、、Ｓｐｒａｎｇｅｌ、Ｒ，、Ｗｉｌｌ、Ｈ，ａｎｄｓｃｈａ ｌｌａｒ、　Ｈ，。 Ｇｅｎｅ　３ｊＱ、２１７−２２：ｌ　（１９８４）−５ｎａａｔｈ、Ｐ、、Ｍ ａｉｒ、Ｎ、、　５ｈａｒｐｅ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｍｏ１ｔ、　Ｊ、、　（１９ ８６）ｉｎ　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　２゜ｐｐ、１１０４（１３９，Ｅｄｓ 、　ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ。 ＬｏｎｄＯｎ。 −５ｔａｎｓｓａｎｓ　Ｐ、、ＭｃＫｅｏｗｎ　Ｙ、、Ｆｒ１ｅｄｒｉｃｈ　Ｌ 　ａｎｄ　Ｆｒｉｎｚ　Ｈ，Ｊ。 （１９８Ｂ）、　”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄａ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｃｏ ｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇａｐｐｅｄ 　ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｏｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅｐＫＡ／ｃ　ｐｌ ａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ’、　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ工ｎ　ｔｈｅ　ｃｏｌｌ ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｐｒｏ ｃｅｄｕｒｅｓ　ｃｌｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ａｔ　ｔｈｅＤｌＢｏｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　ｃｏｕｒｓａ　ｏｎ　’Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ ｓ　ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ″　ｉｎ　Ｊｕｌｙ、１９ １１７　ａｔ　ｔｈｅ　Ｈａｘ　ＰｌａｎｃｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｔ１ｒ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、　Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｃｉ、　Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｐ ｕｂｌｉｃｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙ。 −５ｔａｎｓｓｅｎｓ　Ｐ、、　Ｏｐｓｏｍａｒ　Ｃ，、ＭｃＫｅｏｗｎ　Ｙ、 、　Ｋｒａｍａｒ　Ｗ、、ＺａｂａａｕＭ、　ａｎｄ　Ｆｒ１ｔｚ　Ｈ，Ｊ、、 Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｌｌ、４４４１−４４５４（ １９８９）。 −５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ、　ｘ、ｗ、　ａｎｄ　５ｋｅｒｒｉｔｔ、Ｊ、Ｍ、、 Ｅｌａｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ。 ヱ、４０１−４０６　（１９８６） −Ｖａｅｃｋ、Ｍ、、Ｒｅｙｎａｅｒｔｓ、入、、Ｈ６ｆｔａ、Ｈ，、Ｊａｎｓ ｅｎｓ、Ｓ、、ＤａＢｅｕｃｋｅｌｅｅｒ、Ｍ、、Ｄｅａｎ、Ｃ，、Ｚａｂｅａ ｕ、Ｍ、、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、Ｍ。 ａｎｄ　Ｌｅｅｍａｎｓ、　Ｊ、、　Ｎａｔｕｒｅ　ｎＬ３３−４７（１９８７ ）。 −Ｖｅｌｔｅｎ、Ｊ、、　Ｖｅｌｔｅｎ、Ｌ、、　Ｈａｉｎ、　Ｒ，ａｎｄ　５ ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、、ＥＭＢＯＪＪｌ、２７２：ｌ−２７３０（１９８４）。 −Ｖｅｌｔｅｎ、　Ｊ、　ａｎｄ　５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、ＮｕｃｌａｉｃＡｃｉ ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　ユ】□６９８１−６９９８　（１９＋３５） −Ｍｉｒｔｈ、Ｒ，、Ａｎ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ、　ｉｎ 　”５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＧｅｎａｔｉｃｓ”　（Ｆｅｒｒｅｔｉ　：１ ．Ｊ、ａｎｄ　Ｃｕｒｔｉｓｓ　工ＩＩ、Ｒ，、ｅｄｓ、Ｌ　Ｐｐ。 ２５−２７．　Ａｎｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｙ、　）ｌａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ、Ｃ，（１９８７）。 −Ｙａｎｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，ｒ　Ｖｉｅｒｒａ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｍ ｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、　ＧｅｎｅΣし　１０３−１９　（１９８５）。 Ｆ工ＧＵＲＥ　Ｉ ＡＡＡＡＧＴＧＴＡＴ黒ＣＡＡＣＴＩ’ＡにＡじＷ窺慕Ａ縦哀思Ｇ品Ｔ黒Ｆ工Ｇ ＵＲＥ　１　（続きの１　） Ｆ工ＧＵＲＥ　１　（続きの２　） Ｆ工ＧＵＲＥ　１　（続きの３　） Ｆ工ＧＵＲＥ　１　（続きの５　） Ｆ工ＧＵＲＥ　１　（続きの６　） Ｆ工ＧＵＲＥ　１　（続きの７　） Ｆ工ＧＵＲＥ　２ Ｆ工ＧＯＲＥ　２　（続きの１　） Ｆ工ＧＵＲＥ　２　（続きの２　） Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　 Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ＴｙｒＦ工ＧＵＲＥ　２　（続きの３　） Ｆ工ＧＵＲＥ　２　（続きの４　） Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　’Ｉ’ｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｓ ｐ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。 Ｆ工ＧＵＲＥ　２　（続きの５　） Ｆ工ＧＵＲＥ　２　（続きの６　） Ｆ工ＧＵＲＥ　２　（続きの７　） Ｓｅｒ　’ｒｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　入ｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ 　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　ＡｓｐＦ工ＧＵＲＥ　２　（続きの８　） Ｆ工ＧＵＲＥ　２　（−続きの９　） Ｆ工ＧＵＲＥ　２　（続キＣＤ　１０　）Ｆ工ＧＵＲＥ　２　（続きの　１１　 ）Ｆ工ＧＵＲＥ　２　（続きの１２　） 胞子を形成したバチルス類の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる総タンパク質パターン ＢｔＳｌ及びＰＧＳＩ２０８タンパク質及びトリプシン処理結晶タンパク質のタ ンパク質プロッティングＨＤＩＩＯ１ＰＧＳＴ２４５及びＢｔＳｌの可溶化した 並びにトリプシン処理した結晶タンパク質のタンノ々り質ブロッティング国際調 査報告 ｔｍｍｍａ−−ｍｍＰＣＴ／ＥＰ　９０１００２４４−’−国際調査報告 εＰ　９０００２４４ Ｓ＾　３４２６６

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ＢｔＰＣＳＩ２０８株又はＢｔＰＣＳＩ２４５株。
2. ２．ＢｔＰＣＳＩ２０８もしくはＢｔＰＣＳＩ２４５結晶、結晶タンパク質、プ ロトキシン又は毒素、特にＢｔＰＧＳＩ２０８毒素又はＢｔＰＣＳＩ２４５結晶 、結晶タンパク質、プロトキシンもしくは毒素。
3. ３．ｂｔＰＧＳＩ２０８遺伝子、ｂｔＰＧＳＩ２４５遺伝子、殺虫効果のあるｂ ｔＰＧＳＩ２０８もしくはｂｔＰＧＳＩ２４５遺伝子部分、切断ｂｔＰＧＳＩ２ ０８もしくはｂｔＰＧＳＩ２４５遺伝子、ｂｔＰＧＳＩ２０８もしくはｂｔＰＧ ＳＩ２４５キメラ遺伝子、又はこれらとｎｅｏ遺伝子のような選択可能マーカー 遺伝子とのハイブリッド。
4. ４．特に甲虫類に対する殺虫剤組成物であって、ＢｔＰＧＳＩ２０８もしくはＢ ｔＰＧＳＩ２４５株、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン及び毒素並びにＢｔ ＰＣＳＩ２０８もしくはＢｔＰＧＳＩ２４５プロトキシンの殺虫効果部分、特に ＢｔＰＧＳＩ２０８毒素、ＢｔＰＧＳＩ２０８プロトキシンの殺虫効果部分、Ｂ ｔＰＧＳＩ２４５株、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン及び毒素並びにＢｔ ＰＧＳＩ２４５プロトキシンの殺虫効果部分から選択した活性成分を含む殺虫剤 組成物。
5. ５．請求項３に記載の遺伝子、遺伝子部分、切断遺伝子、キメラ遺伝子又はハイ ブリッドを特徴とする形質転換微生物特に大腸菌。
6. ６．殺虫効果のあるｂｔＰＧＳＩ２０８もしくはｂｔＰＧＳＩ２４５遺伝子部分 、切断ｂｔＰＧＳＩ２０８もしくはｂｔＰＧＳＩ２４５遺伝子、ｂｔＰＧＳＩ２ ０８もしくはｂｔＰＧＳＩ２４５キメラ遺伝子、又はこれらとｎｅｏ遺伝子のよ うな選択可能マーカー遺伝子とのハイブリッドを特徴とする形質転換植物細胞。
7. ７．請求項６に記載の植物細胞からなる植物又はその種子。
8. ８．請求項６に記載の遺伝子部分、切断遺伝子、キメラ遺伝子又はハイブリッド が組込まれている植物ゲノム。
9. ９．細胞が請求項８に記載の植物ゲノムを有する植物組織。
10. １０．植物に甲虫類耐性を付与するための方法であって、植物に請求項８に記載 の植物ゲノムを与えることを特徴とする方法。
11. １１．昆虫に対するタンパク質毒素の形態で発現できる異種遺伝子物質がゲノム 中に安定して組込まれている植物とその植物の生殖物質例えば種子とを製造する 方法であって、ａ）前記タンパク質を発現しない出発植物細胞又は植物組織から 前記異種遺伝子物質を含む形質転換植物細胞又は植物組織を製造し、ｂ）前記異 種遺伝子物質を含む前記形質転換植物細胞又は植物組織から再生植物もしくは該 植物の生殖物質又はその両方を製造する非生物学的ステップを含み、ｃ）任意に 、前記再生植物もしくは生殖物質又はその両方を生物学的に複製するステップも 含み、前記異種遺伝子物質を含む前記形質転換植物細胞又は植物組織を製造する 前記ステップが、前記出発植物細胞又は植物組織を請求項６に記載の遺伝子部分 、切断遺伝子又はハイブリッド並びにこれらの遺伝子部分、切断遺伝子又はハイ ブリッドを前記植物細胞又は植物組織中で発現させることができる調節エレメン トで形質転換して、前記遺伝子部分、切断遺伝子又はハイブリッドを形質転換植 物細胞又は植物組織並びにこれらから世代を通して形成される前記植物及びその 生殖物質に安定的に組込ませることを特徴とする方法。
12. １２．害虫、特に甲虫類、中でもＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎ ｅ−ａｔａ、Ａｇｅｌａｓｔｉａｃａ　ａｌｎｉ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｌｕ ｔｅｏｌａ、Ｈａｌｔｉｃａｔｏｍｂａｃｉｎａ、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ　ｇｒ ａｎｄｉｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ　ｍｏｌｉｔｏｒ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎ ｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ及びＴｒｉｂｏｌｅｕｍ　ｃａｓｔａｎｅｕｍを防 除するための方法であって、害虫を請求項４に記載の殺虫剤組成物に接触させる ことを特徴とする方法。
13. １３．ｂｔＰＧＳＩ２０８遺伝子で形質転換した大腸菌によって産生したＢｔＰ ＧＳＩ２０８プロトキシン。
14. １４．好ましくはエレクトロポレーションにより、請求項３に記載の遺伝子、遺 伝子部分又は切断遺伝子で形質転換したバチルスチュリンギエンシス（Ｂ．ｔｈ ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）。