JPH04505856A - 突然変異したスブチリシンプロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 突然変異したスプチリシンプロテアーゼ光里至光！ 本発明は、改良された洗浄性能を示す洗浄剤組成物の配合において有用な新規な 突然変異酵素または酵素変異体、前記酵素を含有するクリーンングおよび洗浄剤 組成物、適当な宿主の細胞または有機体の中に挿入したとき、前記酵素の発現の 遺伝情報をコードする突然変異した遺伝子、および親酵素の中の変化すべきアミ ノ酸残基を選択して、特定した条件下に所定の洗浄液体の中でよりよい性能を得 る方法に関する。

主ユ■宜景 洗浄剤工業において、酵素は多年にわたって洗浄配合物の中に利用されてきてい る。このような配合物において使用する酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミ ラーゼ、セルラーゼ、ならびに他の酵素、またはそれらの混合物からなる。プロ テアーゼは商業的に最も重要である。

プロテアーゼは洗浄剤工業において２０年以上の間使用されてきているが、どの 物理学的または化学的特性がプロテアーゼのすぐれた洗浄性能または能力の原因 となるかはまだ正確に知られていない。

現在使用されているプロテアーゼは、自然からプロテアーゼを分離し、そして洗 浄剤配合物中でそれらを試験することによって発見されてきている。

バチルス　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のプロテアーゼタンパク質の基質の中のアミド 結合を切断する酵素は、プロテアーゼ、または（互換的に）ペプチダーゼとして 分類される（参照、Ｗａｌｓｈ、　１９７９、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｒｅａｃｔ ｉｏｎ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　、、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍ ｐａｎｙ　、サンフランシスコ、第３章）。

バチルス属（Ｂａｃｉ　１ｌｕｓ）種のバクテリアはプロテアーゼの２つの細胞 外の種、中性またはメタロプロテアーゼ、および機能的にエンドペプチダーゼで あるアルカリ性プロテアーゼ、スブチリシンと呼ぶ、を分泌する。これらのプロ テアーゼの分泌は、バクテリアの成長サイクルに連結されてきており、定常期の 間に、胞子形成がまた起こるとき、プロテアーゼの発現は最大である。Ｊｏｌｉ ｆｆｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０、Ｊ、Ｂａｃｔｒｉａｌ　１４１：１１９９ −１２０８）は、バチルス属（Ｂａｃｉ　１ｌｕｓ）のプロテアーゼが細胞壁の ターンオーバーにおいて機能することを示唆した。

スブチリシン セリンプロテアーゼは、親酵素結合の加水分解を触媒しそしてその中に必須セリ ン残基が活性部位に存在する酵素である（Ｗｈｉｔｅ　、　Ｈａｎｄｉｅｒおよ びＳｍ１ｔｈ　、　１９７３、”Ｐｒｆｎｃｉｐｌｅ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙＳ”第５版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏａ＋ｐａｎｙ、− ’−Ｌ−ヨーク、ｐｐ、２７１−２７２）。

バクテリアのセリンプロテアーゼは２０，０００〜４５゜０００の範囲の分子量 を有する。それらはジイソプロピルヒスフェートにより阻害されるが、メタロプ ロテアーゼと対照的に、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に対して抵抗性で ある（が、それらはカルシウムイオンにより高温において安定化される）。それ らは簡単な末端のエステルを加水分解し、そして活性が真核生物のキモトリプシ ン、またセリンプロテアーゼに類似する。より狭い用語、アルカリ性ホスファタ ーゼ、はサブグループをカバーシ、セリンプロテアーゼのあるものの最適な高い ｐＨ，ｐＨ９，０〜１１．０を反映する（概観については、参照、Ｐｒ１ｅｓｔ 、　１９７７、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ。

４１ニア１ｌ−７５３）。

本発明に関して、スブチリシンはグラム陽性バクテリアまたは菌類により産生さ れるセリンプロテアーゼである。広範な種類のスブチリシンは同定されてきてお り、そしである数のスプチリシンのアミノ酸配列は決定された。これらは、次の ものを包含する：バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種からの少なくとも６つのス ブチリシン、すなわち、スプチリシン１６８、スプチリシンＢＰＮ”、スブチリ シン力ルスパーク（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、スブチリシンＤＹ、スブチリシンア ミロサッカリチクス、およびメセンテリコペブチダーゼ、（Ｋｕｒｉｈａｒａ　 ｅｔ　ａｌ、、１９７２゜Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４７：５６２９−５６３ １；Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３＋Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｔｄｓ　Ｒｅ ｓ、　１１ニア９１１−７９２５；　５ｔａｈｌおよびＦｅｒｒａｒｉ、１９８ ４．Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５９：８１１−８１９．Ｊａｃｏｂｓ　ａｔ　 ａｌ、、１９８５．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３：８９１３−８９２ ６；　Ｎｅｄｋｏｖ　ｅｔ　ａｌ、＋１９８５．８ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐ ｅ−Ｓｅｙｌｅｒ３６６：４２１−４３０．　５ｖｅｎｄｓｅｎ　ａｔ　ａｌ、 、１９８６．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　１９６：２２８−２３２）。

アクチノミセテスからの１つのスブチリシン、サーモアクチノミセス・ブルガリ ス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）からのサーミタ ーゼ（Ｍｅｌｏｕｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１９８３ ：１９５−２００）、および１つの菌のスブチリシン、トリチラキウム・アルブ ム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）（ＪａｎｙおよびＭａｙｅｒ　、 　１９８５、Ｂ１１ｏ１．Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ　３６６：５８ ４−４９２）。

スプチリシンは物理学的および化学的によく特性決定される。これらの酵素の主 な構造（アミノ酸配列）の知識に加えて、スブチリシンの５０を越える高い分解 能のＸ線構造が決定され、これらは基質の結合、転移の状態、産生物、少なくと も３つの異なるプロテアーゼ阻害因子を描写し、そして自然の変異型の構造の結 果を定める（Ｋｒａｕｔ　、　１９７７、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、４６：３３１−３５８）。

本発明に関して、スブチリシン変異体または突然変異したスブチリシンプロテア ーゼは、もとのまたは親の遺伝子をを有しかつ対応する親酵素を産生じた親の有 機体から誘導された突然変異の遺伝子を発現している有機体により産生されたス プチリシンを意味し、親の遺伝子は、適当な宿主の中で発現されるとき、前記突 然変異したスプチリシンブロテアーゼを産生ずる突然変異の遺伝子を産生ずるた めに、親の遺伝子は突然変異されている。

スブチリシン遺伝子のランダムまたは部位特異的突然変異は、酵素の物理学的お よび化学的性質の知識から生じかつスブチリシンの活性、基質の特異的、第３構 造などに関する情報に寄与した（Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４；１２１９−１２２３；Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ８６．Ｐｈ１１．　Ｔｒａｎｓ、Ｒ。

Ｓｏｃ、Ｌｏｎｄ、Ａ、３１７：４１５−４２３：Ｈｗａｎｇおよび−ａｒｓｈ ｅｌ　＋　１９８’Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

２６：２６６９−２６７３；Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｎａｔｕｒｅ　 ３２８：５５１−５５４）　。

スブチリシン遺伝子のことに部位特異的突然変異は非常に多くの注目を引き付け 、そして種々の突然変異は次の特許出願および特許に記載されている： 欧州特許発行第１３０７５６号（ＧＥＮＥＮＴＩＥＣＨ）　（米国特許第４，７ ６０．０２５号（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）対応する）、「カルポニルヒドロラゼ」 の中に部位特異的またはランダムに発生した突然変異および引き続く突然変異し た酵素の種々の性質、例えば、Ｋ　ｃ−ｔ　／　Ｋ　−比、ｐＨ活性のプロフィ ル、および酸化の安定性についてのスクリーニングに関する。部位特異的突然変 異が可能であり、そしである特定した位置、すなわち、−’Ｔｙｒ、　”Ａｓｐ 、　’　５ｓＡｓｎ＋＋　０４Ｔ　ｙｒ、　２１２％　ｅｔ、Ｉ　＆６Ｇ１　ｙ 、６４　旧Ｓ、　凰−１９Ｇ１　ｙ、Ｉ　１１９ｐ　ｈｅ、コ”Ｓｅｒ、”’Ｓ ｅ煤{ ！Ｉ？ｉｙｒ、ｌ５６ＧｌｕまたはＩｓ！Ａ１．におけるスブチリシンＢＰＮ’ の突然変異が変更した性質を示す酵素を提供したということの証明のほかに、こ の出願は所望の性質を有する酵素を得るために突然変異を導入するかどうかを決 定するという問題の解決に寄与しない。

欧州特許発行第２１４４３５号（ＨＥＮＫＥＬ）、スプチリシンカルスパーク（ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）およびその２つの突然変異のクローニングおよび発現に関 する。この出願において、１５１Ａｓｐから１５１１Ｓｅｒおよび＋６１選択か ら１６１　Ａｓｐへの突然変異のための理由は与えられていない。

国際特許公開第一０８７１０４４６１　（ＡＭＧＥＮ）において、親酵素の中に 存在するＡｓｎ−Ｇｌｙ配列の数を制限して、改良されたｐＨおよび熱安定性を 示す突然変異した酵素えることが提案されており、この出願において、スブチリ シンＢＰＮ’の中のｒ　１１９Ａｓｎおよび！＋１Ａｓｎ残基の除去、突然変異 、または修飾について強調されている。

国際特許公開第一０８７１０５０５０　（ＧＥＮＥＸ）は、ランダム突然変異お よび引き続くスブチリシンＢＰＮ“の多数の突然変異の改良された性質について のスクリーニングを開示している。この出願において、突然変異は位置””Ａｓ ｎ５　”’Ｇｌｙ、　”’Ｔｈｒ、”’Ａｌａ、　”’Ｓｅｔ、　”’Ｌｅｕ、 および”Ｓｅｔにおいて記載されている。

欧州特許出願第８７３０３７６１号（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）において、第１およ び第３の両者の構造のレベルにおける相同性の考察を、保存されたか否かにかか わらず同等のアミノ酸残基の同定に応用できる方法が記載されている。この情報 はスブチリシンＢＰＮ’の第３構造の発明者らの知識と一緒に、変更した性質を もつ突然変異を得ることを期待して、突然変異を受け易いある数の位置の選択に 発明者らを導く。そのように同定された位置は次の通りである：　’　！４Ｍｅ ｔ＋　””Ｍｅｔ＋　’　”Ｔｙｒ＋　’　”Ａ１ａ＋’　”Ｇｌｕ、’　６６ Ｇ１ｙ＋　’　ｂ９ＧＩｙ＋　’　”Ｐｈｅ、”　”Ｔｙｒ、Ａ１５ｏ　”　” Ａｓｎ、”　Ｔｙｒ、””Ｔｈｒ、　”Ｓｅｔ、”Ａｓｐ、３３Ｓｅｔ、”Ａｓ ｐ＋”Ｇ１ｙ＋”Ａｌａ、”Ｓｅｔ、”Ｍｅｔ。

フッＡｓｎ＋　＠フＳｅｒ、”Ｌｙｓ＋　”Ｖａｌ、”Ｌｅｕ、’　Ｏ？Ｉ　ｌ ｅ、”　’Ｇｌｙ、’　７０Ｌｙｓ、”　’Ｔｙｒ、　’　”Ｐｒｏ、　’　９ ７Ａｓｐ、　’　”Ｍｅｔ、　ｔ０’Ｓｅｔ＋　”　”　Ｌｙｓ、　ａｎｄ”　 ’Ｓｅｒ、これらの位置は酵素の種々の性質に影響を及ぼすことが期待されると して同定される。また、ある数の突然変異がこれらの示唆を支持すると例示され ている。これらの位置の単一の突然変異に加えて、発明者らは、また、ある数の 多重の突然変異を実施した。さらに、発明者らは！Ｉ５に１ｙ、”Ｌｅｕ　、　 ｌ３ｓＬｅｕ、およびセグメント９７−１０３．１２６−１２９．２１３−２１ ５　、および１５２−１７２内のアミノ酸残基を興味あるものとして同定してい るが、これらの位置における突然変異は例示されていない。

欧州特許発行第２６０１０５号（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）は、触媒のトリアド（ｔ ｒｉａｄ）を含有する酵素におけるある種の性質を触媒のトリアドから約１５オ ングストローム以内のアミノ酸残基を選択することによって修飾することを記載 しており、そして選択したアミノ酸残基を他の残基で置換している。この明細書 に記載されているスプチリシンの型の酵素は、触媒のトリアドを含有する酵素の クラスに属するとして特別に述べられている。置換において、位置２２２および ２１７は置換のために好ましい位置として示されている。

国際特許公開第一０８８１０６６２４（ＧＩＳＴＢＲＯＣＡＤＥＳＮＶ）　ハ、 スブチリシン３０９のアミノ酸配列に対してアミノ酸配列がほとんど１００相同 性であるＰＢ９２と表示するスブチリシンブロテアーゼのＤＮＡおよびアミノ酸 配列を開示している。

国際特許公開第一０８８１０７５７８　（ＧＥＮＥＮＴＥＣＵ）は、アミノ酸残 基の少なくとも１つの触媒の基の置換または修飾により、前駆体酵素から誘導さ れた突然変異した酵素をフレイムしている。

発明者らが述べているように、そのように実施することによって、修飾または置 換された触媒の基を含有する基質と反応性である突然変異した酵素が得られる（ 基質促進触媒反応）。

−ａの理論はバチルス・アミロリクエファシェンス（Ｂ。

ａｍｙｌｏｌ　１ｑｕｅｆａｃｅｎｓ）スブチリシン（ＢＰＮ’）に基づき、こ こで修飾は位置”Ｈｉｓにおいて記載されており、これは”Ａｌａ単独でまたは ５ｅｒ−２４−Ｃｙｓの「ヘルパー」突然変異と組み合わせえ修飾された。修飾 は、また、アミノ酸残基３２（４ｓｐ、および２　Ｚ　ｌ　５ｅｒ、およびＡｌ ａ−４８−Ｇｌｕの「ヘルパー」突然変異において示唆されている。

国際特許公開第４０８８１０８０２８　（ＧＥＮＥＸ）は、タンパク質の安定化 のために金属イオン結合部位付近で遺伝子操作することを開示している。この特 許は、また、スブチリシンＢＰＮ’を例として使用し、そして次のアミノ酸残基 を置換の候補として指摘している’　”Ｐｒｏ　（Ｐ１７２Ｄ、　Ｐ１７２Ｅ） 　、　”　’　Ｇｌｙ　（Ｇ１３１Ｄ）　＋　”Ａｓｎ（Ｎ７６Ｄ　；Ｎ７６Ｄ ＋Ｐ１７２Ｄ　（Ｅ）　）　、　”Ｓｅｔ　（Ｓ７８Ｄ）。さらに、示唆は次の 組み合わせた突然変異についてなされている。Ｎ７６Ｄ＋５７８Ｄ＋Ｇ１３１Ｄ ＋Ｐ１７２Ｄ（Ｅ）；Ｎ７６Ｄ＋Ｇ１３１Ｄ；５７８Ｄ＋Ｇ１３１Ｄ；５７８Ｄ ＋Ｐ１７２Ｄ（Ｅ）ＡＮＤ　５７８Ｄ＋Ｇ１３１Ｄ＋Ｐ１７２Ｄ　（Ｅ）。

国際特許公開第ＷＯ３８１０８０３３（ＡＭＧＥＮ）は、修飾したカルシウム結 合部位および分子の中に存在するＡｓｎ−Ｇｌｙ配列において置換されたＡｓｎ またはＧｌｙを有し、これにより改良された熱およびｐＨ安定性を示す酵素を得 る、ある数のスブチリシン類似体を開示している。カルシウム結合部位は、アミ ノ酸残基”Ａｓｐ、”Ｌｅｕ、　７ｂＡｓｎ＋　ツマＡｓｎ、”Ｓｅｔ＋　”Ｉ 　ｌｅ、”Ｇｌｙ、”　Ｖａｌ、”’Ｔｈｒ。

および！＋４７ｙ、を含むとして開示されている；他の潜在的カルシウム結合部 位は＋４６Ａｓｐ、および’　”Ｐｒｏ；　”　Ｐｒｏ、およびＺ’１ｌＧＩｎ 、および＋７２ｐｒｏおよび＋９５に１ｕまたはｌ’１７Ａｓｐであると示唆さ れている。また、＋　０９Ａｓｎおよび２′８＾ｓｎの位置の突然変異が示唆さ れている。産生された突然変異は、次の通りである：Ｎ１０９Ｓ、　Ｎ１０９Ｓ ＋Ｎ２１８Ｓ、　Ｎ７６Ｄ＋ＮｌＱ９５−＋Ｎ２１８Ｓ、　Ｎ７６Ｄ＋Ｎ７７Ｄ ＋Ｎ１０９Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ、Ｎ７６Ｄ＋ｌ７９Ｅ＋Ｎ１０９Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ　。

国際特許公開第一０８８１０８１６４　（ＡＭＧＥＮ）は、システィンで置換し て潜在的に安定化するジサルファイド結合形成を可能とすることができる残基を タンパク質の中で同定する方法を記載している。この方法はタンパク質の３次元 の構造の詳述された知識に基づき、そして位置の選択にコンピューターを使用す る。スブチリシンブロテアーゼに関して、スブチリシンＢＰＮ’をモデルの系と して使用した。スブチリシンＢＰＮ’についてこの方法を使用して、ジサルファ イド結合のために１１の候補を示唆した（１：Ｔ２２Ｃ＋５８７Ｇ、　２：Ｖ２ ６Ｃ＋Ｌ２３５Ｃ，３：Ｇ４７Ｃ＋Ｐ５７Ｃ，４：Ｍ５０Ｃ＋Ｎ１０９Ｇ、　５ ：Ｅ１５６Ｃ＋Ｔ１６４Ｃ，６：Ｖ１６５Ｃ＋に１７０Ｃ，７：Ｖ１６５Ｃ＋５ １９１Ｃ，８：Ｑ２０６Ｃ＋Ａ２１６Ｃ，９：Ａ２３０Ｃ＋Ｖ２７０Ｇ、１０： ｒ２３４ｃ＋Ａ２７４Ｃ，１１：Ｈ２３８Ｃ＋Ｗ２４１Ｃ）。これらのうちで、 ４つが産生され（１，２，４、および８）それらのうちで２は安定化効果を提供 しなかった（２および４）。これらの突然変異の２つを互いに組み合わせる、お よび１つを他の突然変異、すなわち、Ｔ２２Ｃ＋５８７Ｃ＋Ｎ２１８Ｓ　、およ び７２２Ｃ＋５８７Ｃ＋Ｑ２０６Ｃ＋Ａ２１６Ｇ　、ことによって、それ以上の 突然変異を産生した。また、ある数のそれ以上の不成功に終わった突然変異、す なわち、ＡＩＣ＋５７８Ｃ。

５２４Ｃ＋５８７Ｃ，Ｋ２７Ｃ＋５８９Ｃ，Ａ３５Ｃ＋Ａ２３２Ｃ，Ｉ　１２２ Ｃ＋Ｖ１４７Ｃ，５２４９Ｃ＋Ａ２７３Ｃ。

およびＴ２５３Ｃ＋Ａ２７３Ｃが産生された。

また、Ｔｈｏｍａｓ＋Ｒｕ５ｓｅｌ　ｓおよびＦｅｒｓｈｔ、Ｎａｔｕｒｅ　３ １８，３７５−３７６（１９８５）が示すように、スブチリシンＢＰＮ’　にお いて９９ＡＳｐの”Ｓｅｒへの交換は酵素のｐＨ依存性を変化させる。

引き続く文献Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．（１９８７）　１９３．８０３−８１３に おいて、同一の著者らは、また、１５６Ｇ１ｕの代わりに＋５６Ｓｅｔの置換を 論じている。

両者のこれらの突然変異は活性な６４Ｈｉｓからほぼ１５オングストロームの距 離内にある。

Ｎａｔｕｒｅ　３２８．４９６−５００　（１９８７）において、Ｒｕ５ｓｅｌ およびＦｅｒｓｈｔは、彼らの実験の結果を論じており、そして酵素を突然変異 させて表面電荷を変化させることによって、ｐＨ活性のプロフィルを変化させる ルールを表している。

ｔｉＬＬ匂し１．と 等電点、ｐ　Ｉｎ　、は、酵素分子の複合体（必要に応じて金属または他のイオ ンを結合して有する）が中性である、すなわち、複合体上の静電荷の合計（正味 の静電荷＝ＮＥＣ）がゼロに等しい、ｐＨ値として定義される。この合計におい て、もちろん、個々の静電荷の正または負の性質を考慮しなくてはならない。

等電点は、便利には、問題の酵素の中の種々の帯電した残基についてのｐＫ値を 使用する平衡の考察を使用し、次いで酵素分子のＮＥＣがゼロに等しいｐＨ値を 反復して見いだすことによって、計算される。

この計算を使用する１つの問題は、帯電した残基のｐＫ値がそれらの環境に依存 し、結局変動にさらされるということである。しかしながら、非常にすぐれた結 果は特別の近似した９に値を実際の値に無関係に帯電した残基に割り当てること によって得ることができる。また、部分的に環境を考慮して、より複雑な計算を 実施することができる。

ｐｌｏは、また、等電点電気泳動によるか、あるいは酵素を含有する溶液を滴定 することによって実験的に決定することができる。また、帯電した残基について の種々のｐＫ値は滴定により実験的に決定することができる。

スブチリシンの工　・・ プロテアーゼ、例えば、スブチリシンは、タンパク質の汚れの除去に有用である ので、工業、とくに洗浄剤の配合物において多くの実用性を見いだした。

現在、次のプロテアーゼは既知であり、そしてそれらの多くは世界の多数の国々 において大量に市販されている。

スブチリシンＢＰＮ’またはＮｏｖｏ、例えば、ＳＩＧＭＡ、米国セントルイス 、から入手可能である；スプチリシンカルスパーク（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、Ｎ ｏｖｏ−Ｎ。

ｒｄｉｓｋ　ａ／ｓ（デンマーク国）によりＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）とし て、およびＩＢＩＳ（オランダ国）によりＭＡＸＡＴＡＳＥ　（登録商標）とし て市販されている；バチルス・レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）ス ブチリシン、Ｎ０ＶＯＩＮＤＵＳＴＲＩ　Ａ　／Ｓ（デンマーク国）によりＳＡ Ｖ　ｌ５ＡＳＥ　（登録商標）として市販されている：５ＡＶＩＮＡＳＥ（登録 商標）に密接に類似する酵素、例えば、ＭＡＸＡＣＡＬ　（登録商標）、ＩＢＩ Ｓにより市販されている、および０ＰＴＩＣＬＥＡＮ　（登録商標）、ＭＴＬＥ Ｓ　ＫＡＬＩ　ＣＨＥＭＩＥ（ドイツ国）により市販されている； バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）スブチリシン、Ｎ。

ｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ　ａ／ｓ　（デンマーク国）によりＥＳＰＥＲＡＳＥ　（ 登録商標）として市販されている；ＫＡＺＵＳＡＳＥ　（登録商標）、昭和電工 （日本国）により市販されている。

しかしながら、有効であるためには、このような酵素は洗浄条件下に活性を示す ばかりでな（、かつま洗浄剤の製造および貯蔵の間にた他の洗浄剤の成分と適合 性でなくてはならない。

例えば、スブチリシンは他の基質に対して活性な他の酵素と組み合わせて使用す ることができ、そして選択したスブチリシンはこのような酵素に対する安定性を もつべきであり、そしてまた、選択したスブチリシンは好ましくは他の酵素の分 解を触媒すべきではない。また、選択したスブチリシンは洗浄剤配合物の中の他 の成分、例えば、漂白剤、酸化剤などからの活性に対して抵抗性であるべきであ り、とくに洗浄剤配合物の中に使用すべき酵素は、貯蔵の間の洗浄剤の中のおよ び洗浄の間の洗浄液の中の酵素以外の成分が発揮した酸化力、カルシウム結合性 質、およびｐＨに関して安定であるべきである。

例えば、洗浄の間に清浄すべき物体上に存在する種々の天然に存在する基質の分 解を触媒する酵素の能力は、しばしば、洗浄能力、洗浄性、または洗浄性能と呼 ばれる。この出願を通じて、用語洗浄性能をこの性質を包含するために使用する 。

天然に存在するスブチリシンは、パラメーター、例えば、ｐＨの変動下に、それ らの洗浄の力または能力に関して高度に価値ある性質を有する。上の市販されて いる洗浄剤のプロテアーゼのいくつかは、事実、約２０年前に市販されたものよ りすぐれた性能を有するが、最適な性能のために、各酵素は配合および洗浄の条 件、例えば、ｐＨ１温度、イオン強度（＝１）、活性系（テンシト（ｔｅｎｓｉ ｄｅｓ）、界面活性剤、漂白剤など）、ビルダーなどに関するそれ自体の特定の 条件を有する。

結局、低いｐＨおよび低いＩにおいて所望の性質を有する酵素はよりアルカリ性 の条件および高いＩにおいて魅力に劣るか、あるいは高いｐＨおよび高いＩにお いてすばらしい性質を示す酵素は低いｐＨ１低いＩの条件において魅力に劣るこ とが発見された。

組み換えＤＮＡ技術の出現および発展は、タンパク質化学の分野に強い影響を及 ぼした。

これらの技術はペプチドおよびタンパク質、例えば、酵素、およびホルモンを所 望の規格に従い設計することを可能とし、所望の性質を示す化合物の生産を可能 としたと考られた。

現在、所望のアミノ酸配列を有する酵素を構成することが可能であり、そして上 に示したように、かなりの量の研究が変更された性質をもつスブチリシンの設計 に捧げられてきている。提案の中には、欧州特許発行第１３０７５６号（ＧＥＮ ＥＮＴＥＣＨ）（米国特許第４，７６０．０２５号（ＧＥＮＥＮＣＯＲ）および 国際特許公開筒ｗｏ８７１０５０５０号（ＧＥＮＥＸ）に記載されているような 多数の突然変異した酵素を産生じそしてスクリーニングする技術は、自然の酵素 を分離しそしてそれらをそれらの性質についてスクリーニングする古典的方法に 相当するが、多数の異なる突然変異の酵素の存在の知識を通してより効率的であ る。

スブチリシン酵素は典型的には２７５アミノ酸残基からなり、各アミノ酸残基は ２０の可能な天然に存在するアミノ酸の中から１つであることができるので、１ つの非常に重大な欠点が存在する、すなわち、非常に多数の突然変異が発生し１ 、これらの突然変異を予備的にスクリーニングした後、最初のスクリーニングで 興味ある特性を示す選択した突然変異をさらに試験しなくてはならない。なぜな ら、問題の使用のために改良された性質をもつ所望の酵素を得るために、例えば 、この場合において洗浄液の特定した条件下に改良された洗浄性能を示す洗浄剤 組成物を配合するために、どのアミノ酸残基を変化させることを決定する指針が 存在しないからである。

これらの特許出願に概説されている手順は、結局、多年にわたって知られている 伝統的ランダム突然変異の手順よりわずかにすぐれるのみである。

他の既知の技術は、特定の性質、例えば、エステル交換および加水分解の速度（ 欧州特許発行第２６０１０５号（ＧＥＮＥＮＣＯＲ）　）、ｐｉ−活性のプロフ ィル（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ　、およびＦｅｒｓｈｔ。

５ｕｐｒａ）、および基質の特異性（国際特許公開第ＷＯ３８１０７５７８号（ ＧＥＮＥＮＴＥＣＵ）　）を変えることに関する。これらの刊行物のいずれも酵 素の洗浄性能の変化に関するものではない。

発生した他の技術は、ある種のアミノ酸を置換する潜在的結果を分析するための 、タンパク質の３次元の構造についての詳細な情報を使用することである。この アプローチは使用されてきており、そして欧州特許（ＢＰ）　２６０１０５号（ ＧＥＮＥＮＣＯＲ）、匈０８Ｂ１０７５７８　（ＧＥＮＥＮＴＥＣ）１）、罰８ ８１０８０８（ＧＥＮＥＸ）　、ＷＯ３８１０８０３３、および−０８８１０８ １６４（ＧＥＮＥＸ）に記載されている。

こうして、上に示したように、酵素のよく定められた性質、例えば、前述の性質 と酵素の洗浄性能との間の関係はまだ同定されていない。

未公開の国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ８８１００００２号（ＮＯＶＯＩＮＤＵＳＴ ＲＩＡ／Ｓ）において、突然変異のためにどのアミノ酸位置を選択すべきである か、および洗浄性能において所望の変化を得るためにどのアミノ酸をこれらの位 置において置換すべきであるかを決定するために、相同性の比較の概説を使用す ることが提案されている。

このような手順を使用することによって、発生する突然変異の数は非常に小さい ので、スクリーニングの仕事は劇的に減少するが、その手順では、親酵素および 比較に使用する酵素の組み合わせた有用な性質を示す酵素を得るすることができ ることが予想されるだけである。

問題は、非常に多（の研究が酵素の活性のメカニズムの明らかにするために向け られてきているが、酵素の洗浄性能に関して酵素の性質を決定する構造およびア ミノ酸残基の組み合わせにおけるファクターについてまだほんのわずかしか知ら れていない。

結局、酵素を洗浄系に対してさらに改良および調整し、ならびにクリーニンまた は洗浄剤組成物の実際の使用におけるプロテアーゼの作用のメカニズムのよりよ い理解のための必要性がなお存在する。このような理解は、合理的な程度の確実 さをもって、洗浄液の中の特定した条件下に改良された洗浄性能を示す酵素を生 ずるであろう。突然変異の選択に応用することができるルールを生ずることがで きる。

光ユ■要旌 これらの問題についてのそれ以上の研究により、今回、驚くべきことには、洗浄 剤組成物におけるスブチリシン酵素の使用において重要な因子の１つは、基質、 すなわち、テキスタイルから除去すべき物質、硬い表面または清浄すべき他の物 質への酵素の吸着であることが示された。

結局、本発明は突然変異したスブチリシン遺伝子により発現される突然変異のス ブチリシンの性質を変化するスブチリシン遺伝子の突然変異に関し、これにより 前記突然変異スブチリシン酵素は洗浄剤組成物において改良された挙動を示す。

突然変異は、スブチリシン酵素の中の特定の位置における特定のアミノ酸の発現 の原因となる親スブチリシン遺伝子の中の特定の核酸において発生する。

本発明は、また、突然変異すべき位置およびアミノ酸、これによりムタチス・ム タンジス（ｍｕｔａｔｉｓ　ｍｕｔａｄｉｓ）　、すなわち、問題のスプチリシ ン遺伝子において変化すべき核酸を選択する方法に関する。

本発明は、一部分、スブチリシン３０９およびスブチリシン力ルスバーグ（Ｃａ ｒｌｓｂｅｒｇ）の遺伝子の突然変異、およびｐＨ値が変動する洗浄液を生ずる 異なる洗浄剤組成物において改良された洗浄性能を示す、突然変異のスブチリシ ン３０９およびカルスバーブ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）の酵素を保証することに関 するが、これらに限定されない。

表−上 々のプロテアーゼについてのアミノ　配置の　・ａ＝　スブチリシンＢＰＮ’（ Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８３．５ｕｐｒａ）ｂ＝　スプチリシンアミ ロサツカリチクス（Ｋｕｒｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、、１９７２．５ｕｐｒａ） Ｃ＝　スブチリシン１６８（ＳｔａｈｌおよびＦｅｒｒａｒｉ　、　１９８４． ５ｕｐｒａ）ｄ＝　スプチリシンメセンテリコペプチダーゼ（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ 　ｅｔａｔ＋、１９８６．５ｕｐｒａ） ｅ＝　スブチリシンＤＹ（Ｎｅｄｋｏｖ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．５ｕｐｒａ ）ｆ＝　スプチリシンカルスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ 　ａｌ、、１９６８、ｓｕｐｒａ） ｇ＝　スブチリシンカルスバーグ（ＣａｒｌｓｂｅｒｇＸｊａｃｏｂｓ　ｅｔ　 ａｌ、、１９８５．５ｕｐｒａ） ｈ＝　スブチリシン３０９（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ８Ｂ１００００２号）ｉ ＝　スブチリシン１４７（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ８８１００００２号）ｊ＝ 　サーミターゼ（Ｍｅｌｏｕｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５　．５ｕｐｒａ）ｋ＝ 　プロテアーゼＫ（Ｂｅｔｚｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８８、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ。

１７８：１５５ｆｆ）、およびＧｕｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９、Ｅｕ ｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅａ＋、１７９：１８５ｆｆ）ｌ＝　アクアリジン（Ｋｉｖｏｎ　ｅ ｔ　ａｌ、、１９８８、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７３：４９１ｆｆ） ｍ＝　バチルス属（Ｂａｃｉ　１１ｕｓ）　ＰＢ９２プロテアーゼ（欧州特許発 行第０２８３０７５号） ｎ＝　プロテアーゼＴＷ７（）リチラキウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉ ｕｍ　ａｌｂｕｍ）　（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ８８１０１０４０号）０＝　 プロテアーゼＴＷ３（１−リチラキウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｔ＋ ａ＋　ａｌｂｕｍ）（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ８８１０１０４０号）＊＝　割 り当てた欠失 ・・・表Ｉ続く Ｎｏ：　ｌ　１０ ５　ａ）　嚢−＊−嚢一＊−貴−＊−嚢−Ａ−Ｑ−５−嚢−Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｇ−Ｖ −５−Ｑ−Ｉ−に−☆−★−＊−”−＊−Ａ−Ｐ−Ａ−１））　”−”−”−” −”−”−”−Ａ−Ｑ−Ｓ−”−Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｇ−ニー５−Ｑ−Ｉ−に−”−嚢 −★−★−☆−八−Ｐ−Ａへｃ）　＊−＊−”−嚢−會ｊ−＊−Ａ−Ｑ−５−斎 −Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｑ（−に−嚢一＊−憂−轟−★−Ａ−Ｐ−Ａ−ｄ） 　＊−貴−＊−脅−”−★−”−Ａ−Ｑ−５−’−Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｇ−工−５−Ｑ −ニーに一嚢−査−貴−査−肴−Ａ−ｐ−Ａ−ｅ）★−☆−☆−☆−査一☆−嚢 −Ａ−Ｑ−Ｔ−査−Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｇ−ニーＰ−Ｌ−ニーに一☆−嚢−慟−嚢−嚢 −Ａ−Ｄ−に−１０ｙ）　＊−嚢−＊−＊−嚢−六−★−Ａ−Ｑ−Ｔ−＊−Ｖ− Ｐ−Ｙ−Ｇ−ニーＰ−Ｌ−ニーに一＊−六−＊−☆−☆−へ−Ｄ−に−ｑ）　＊ −＊−会−査−査−＊−肴−Ａ−Ｑ−Ｔ−自−Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｇ−ニーＰ−Ｌ−ニ ーに一☆−嚢−★−★−會−Ａ−Ｄ−に−ｈ）★−嚢−★−★−嚢−☆−☆−Ａ −Ｑ−Ｓ−嚢−Ｖ−Ｐ＝ｌＪ−Ｇ４−５−Ｒ−Ｖ−Ｑ−☆−嚢−☆−嚢−☆−Ａ −Ｐ−Ａ−１）査−嚢一嚢−六−査一☆−☆−★−Ｑ−Ｔ−★−Ｖ−Ｐ−Ｑ−Ｇ −ニー５−Ｆ−Ｉ−Ｎ−☆−☆−嚢一☆−☆−Ｔ−Ｑ−Ｑ−１）　☆−肴−嚢− ☆−★−☆−Ａ−Ｔ−Ｑ−Ｓ−Ｐ−八−Ｐ−Ｗ−Ｇ−Ｉ、−Ｄ−Ｒ（−Ｄ−Ｑ− Ｒ−Ｄ−Ｌ−Ｐ−Ｌ−Ｓ−Ｎ−Ｂ）　＊−＊−嚢−＊−嚢−＊−嚢、Ａ−Ｑ−５ −嚢−Ｖ−Ｐ−Ｗ−Ｇ−ニー５−Ｒ−Ｖ−Ｑ−☆−☆−嚢一★−★−Ａ−Ｐ−八 −ｎへ　＊−★−★−☆−☆−★−Ａ−Ｔ−Ｑ−Ｅ−Ｄ−八−Ｐ−１ｆ−Ｇ−Ｌ −Ａ−Ｒ−ニーＳ−５−Ｑ−Ｅ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−０）４に一嚢一★−嚢− ☆−嚢−Ａ−Ｅ−Ｑ−Ｒ−Ｎ−Ａ−ｐ−＋ｖ−ｃ−Ｌ−Ａ−Ｒ：ｌ−５−５−Ｔ −Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｔ−５−Ｔ−Ｎｏ：　２０　３０　４０ ａ）　Ｌ−Ｈ−５−Ｑ−Ｇ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−５−Ｎ−Ｖ−に−Ｖ−Ａ−Ｖ−ニーＤ −、５−Ｇ−ニーＤ−５−５−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−★−ｂ）　、Ｌ−Ｈ−５−Ｑ− Ｇ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−５−Ｎ−Ｖ−に−Ｖ−Ａ−Ｖ−工−Ｄ−５’−Ｇ−１−Ｄ−５ −５−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−”−ｅ）　Ｌ−Ｈ−５−Ｑ−Ｇ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−５−Ｎ− Ｖ−に−Ｖ−へ一■−ニーＤ−５−Ｇ−ニーＤ−５−５−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｉ、−☆ −２５ｄ）　Ｌ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｇ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−５−Ｎ−Ｑ−に−Ｖ−Ａ−Ｖ− Ｉ−Ｄ−５−Ｇ−工−Ｄ−５−５−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｉ、−”−ａ）　Ｖ−Ｑ−Ａ− Ｑ−Ｇ−Ｙ−に−Ｇ−Ａ−Ｎ−Ｖ−に−Ｖ−Ｇ（−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−ニーｘ−ｘ −ｓ−Ｈ−Ｔ−ｏ−Ｌ−＊−ｈ）　Ａ−Ｈ−Ｎ−Ｒ−Ｇ−Ｌ−Ｔ−Ｇ−５−Ｇ− Ｖ−に−Ｖ−八−Ｖ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−Ｉ−☆’−５−Ｔ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−＊ −３０ｉ）　Ａ−Ｈ−Ｎ−Ｒ−Ｇ（−Ｆ−Ｇ−Ｎ−：Ｇ−ＬＡ−Ｒ−Ｖ−Ａ−ｖ −Ｌ−Ｄ−Ｔ−に一エー貞−Ａ−５−１４−Ｐ−Ｄ−Ｌ−”−ｊ）　Ａ−Ｗ−” −０４−Ａ−Ｅ−Ｇ−５−Ｇ−Ａ−に−工−ＩＡ−Ｉ−Ｖ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−Ｖ−Ｑ −５−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−Ａ−ｋ）　Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｄ−Ｅ−５−Ａ−Ｇ−Ｑ− Ｇ−５−Ｃ−Ｖ−Ｙ−Ｖ−ニーｏ−Ｔ−ｃ；−工−Ｅ−Ａ−５−Ｈ−Ｐ−Ｅ−Ｆ −＊−１）　５−Ｙ−Ｔ−Ｙ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｖ−Ｙ−Ｖ− 工−Ｄ−Ｔ−Ｇ−工−Ｒ−Ｔ−Ｔ−Ｈ−Ｒ−Ｅ−Ｆ−”−ｍ）　Ａ−Ｈ−Ｎ−Ｒ −Ｇ−Ｌ−Ｔ−Ｇ−５−Ｇ−Ｖ−に−ｖ−Ａ−ｖ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−■−★−５ −Ｔ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−”−３５ｎ）　Ｙ−Ｔ−Ｙ−Ｄ−Ｄ−９−へ−Ｇ−Ｔ− Ｇ−Ｔ−Ｃ−へ−Ｙ−ニーニーＤ−Ｔ−Ｇ−ニーＹ−Ｔ−Ｎ−Ｈ−Ｔ−Ｄ−Ｆ− ”−ｏ）　Ｙ−Ｒ−Ｙ−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｖ−Ｙ−Ｖ−工 −Ｄ−Ｔ−Ｇ−Ｖ−Ｅ−Ａ−５−Ｈ−Ｐ−Ｅ−Ｆ−”−続く・・・ ・・・表■続く ５　ａ）　＊−に−Ｖ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｍ−Ｖ−Ｐ−５−Ｅ−Ｔ−Ｎ−Ｐ −Ｆ−＊−嚢−Ｑ−Ｄ−Ｎ−Ｎ−５−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−ｂ）　＊−Ｎ−Ｖ− Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ａ−５−Ｆ−Ｖ−Ｐ−Ｓ＝Ｅ−Ｔ−Ｎ−Ｐ−Ｙ−★−☆−Ｑ−Ｄ− Ｇ−５−Ｓ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−ｃ）　（ｊ−Ｎ−Ｖ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−八−５− Ｆ−Ｖ−Ｐ−５−Ｅ−Ｔ−Ｎ−Ｐ−Ｙ−嚢−六−Ｑ−Ｄ−Ｇ−５−５−Ｈ−Ｇ− Ｔ−Ｈ−Ｖ−ｄｌ　嚢−Ｎ−Ｖ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ａ−５−Ｆ−Ｖ−Ｐ−５−Ｅ−Ｔ −Ｎ−Ｐ−Ｙ−嚢一六−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−ｅ）　＊− に−Ｖ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｆ−Ｖ−５−Ｇ−Ｅ−５−六−Ｙ−Ｎ−嚢−＊− Ｔ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−１０ｆ）　”−Ｎ−Ｖ−Ｖ−Ｇ−Ｇ −Ａ−Ｓ−Ｆ−Ｖ−へ−Ｇ−Ｅ−Ａ−＊−Ｙ−Ｎ−★−嚢−Ｔ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ −Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−ｇ）　４に−Ｎ−Ｖ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ａ−５−Ｆ−Ｖ−Ａ −Ｇ−Ｅ−Ａ−”−Ｙ−Ｎ−★−青−Ｔ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ −ｈ）　＊−Ｎ−Ｉ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｆ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−貴−９− Ｔ−★−嚢−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ，Ｖ−ｉ）　＊−Ｒ−Ｉ−Ａ −Ｇ−Ｇ”ｋ−５−Ｆ−Ｘ−５−９−Ｅ−Ｐ−＊−５−Ｙ−１に一査−Ｈ−Ｄ− Ｎ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−う）　Ｇ−に−Ｖ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｗ−Ｄ−Ｆ −Ｖ−Ｄ−Ｎ−Ｄ−Ｓ−Ｔ−Ｐ−＊−★−☆−Ｑ−Ｎ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ −Ｈ−Ｃ−１５ｋｌ　”−”−”−Ｅ−Ｇ−Ｒ＝Ａ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−に−Ｔ−Ｙ− Ｙ−Ｙ−５−５−”−★−Ｒ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｃ−１）　＊ −六−＊−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｙ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−＊ −Ｑ−Ｄ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−ｍ）　＊−Ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｇ−Ｇ− Ａ−５−Ｆ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−に−５−Ｔ−嚢−＊’−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ −Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−ｎ）＊−嚢−★−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ａ−に−Ｆ−Ｌ−に−Ｎ −Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｑ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−ｏ ）　＊−＊−＊−Ｅ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−に−Ｔ−Ｙ−Ｙ−Ａ−５−５− ★−肴−Ｒ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｃ−ａ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ａ −八−Ｌ−★−Ｎ−Ｎ−９−ニーＧ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｐ−５−八−５−Ｌ −Ｙ−Ａ−Ｖ−に−Ｖ−ｂ）　Ａ−Ｇ−Ｔ（−Ａ−Ａ−Ｌ−＊−Ｎ−Ｎ−Ｓ−ニ ーＧ−Ｖ７Ｌ−Ｇ−Ｖ−へ−Ｐ−５−Ａ−５−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−に−Ｖ−ｃ）　 Ａ−Ｇ−Ｔ−ニーＡ−へ−Ｌ−嚢−Ｎ−Ｎ−５−工−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−５− Ｐ−５−Ａ−５−ｒ、−Ｙ−Ａ−Ｖ−に−Ｖ−２５ｄ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−工−Ａ− へ−Ｌ−＊−Ｎ−Ｎ−５−ニーＧ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｐ−５−Ａ−５−Ｌ− Ｙ−Ａ−Ｖ−に−Ｖ−ｅ）　Ａ−Ｇ−Ｔ、−Ｖ−Ａ−八−Ｌ−嚢−Ｄ−Ｎ−Ｔ− Ｔ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｐ−Ｎ−Ｖ−５−Ｌ−Ｙ−Ａ−工−に−Ｖ−ｆ） 　Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−＊−Ｄ−Ｎ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ａ −Ｐ−５−Ｖ−９−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−に−Ｖ−ｇ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−八−Ａ− Ｌ−嚢−Ｄ−Ｎ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｐ−５−Ｖ−５−Ｌ−Ｙ− Ａ−Ｖ−に−Ｖ−ｈ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−工−Ａ−Ａ−Ｌ−☆−Ｎ−Ｎ−５−工−Ｇ −Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−八−Ｐ−５−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−に−Ｖ−３０ｉ）　 Ａ−Ｇ−Ｔ−工−Ａ−Ａ−Ｌ−肴−Ｎ−Ｎ−５−Ｉ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ａ− Ｐ−５−Ａ−Ｄ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−に−ｖ−５）　Ａ−Ｇ−ニーＡ−Ａ−Ａ−Ｖ −Ｔ−Ｎ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−工−へ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｐ−に−Ａ−９（−Ｌ−Ａ− Ｖ−Ｒ−Ｖ−ｋ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｇ−Ｓ−＋に−Ｒ−六−＊−＊−＊−１１ −Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−八−に−に−Ｔ−Ｑ−Ｉ、−Ｆ−Ｇ−Ｖ−に−Ｖ−１）　Ａ −Ｇ−Ｔ−工−Ｇ−Ｇ−Ｖ−★−＊−＊−＊−★−嚢−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−八−に −Ａ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｖ−ｍ）Ａ−Ｇ−Ｔ−ニーＡ−へ−Ｌ−” −Ｎ−Ｎ−Ｓ−ニーＧ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｐ−Ｎ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ −に−Ｖ−３５ｎ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−に−六−肴−＊−に−嚢− Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−八−に−に−Ｔ−５−Ｌ−Ｆ−Ａ−Ｖ−に−Ｖ−ｏ）　Ａ−Ｇ −Ｔ−ニーＧ−５−★−Ｒ−★−嚢−肴一嚢−★−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−八一に−に −Ｔ−ＱへニーＦ−Ｇ−Ｖ−に−Ｖ−続く・・・ ・・・表Ｉ続く Ｎｏ：　１００　１１０　１２０ ５　ａ）Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−ｔＪ−Ｉ−エーＮ−Ｇ一エ ーＥ−＋？−★−Ａ一エーＡ−★一Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｄ−★一ｂ）Ｌ−Ｄ−Ｓ−Ｔ− Ｇ−５−・Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｗ−エーエーＮ−Ｇ一エーＥ−Ｗ−査一八一■−Ａ 一査−Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｄ一喬一ｃ）Ｌ−Ｄ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｗ −エーエーＮ−Ｇ−エーＥ−Ｗ−☆−Ａ一エーＡ−命−Ｎ−Ｎ＝Ｍ−Ｄ−嚢−ｄ ）　Ｌ−Ｄ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−讐−Ｘ−ＩＴＮ−Ｇ−エーＥ− Ｗ−喬−Ａ−工−八一★−Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｄ−嚢一ｅ）　Ｌ−Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｓ −Ｇ−Ｔ−Ｙ−５−八−Ｉ−Ｖ−Ｓ−Ｇ−ｒ−Ｅ−Ｗ−☆一Ａ−Ｔ−Ｑ−☆−Ｎ −Ｇ−Ｌ−Ｄ−”−１Ｏ　ｆ）Ｌ−Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｇ− Ｉ−Ｖ−Ｓ−Ｇ｛−Ｅ−Ｗ−＊−Ａ−Ｔ−Ｔ−”−Ｎ−Ｇ−Ｍ−Ｄ−嚢−ｇ）Ｌ −Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ｙ−Ｓ−Ｇ−Ｘ−Ｖ−Ｓ−Ｇ−エーＥ＝Ｗ−嚢 −Ａ−Ｔ−Ｔ−＊−Ｎ−Ｇ−Ｍ−Ｄ−”−ｈ）Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ −Ｖ−Ｓ−Ｓ｛−Ａ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｗ−”−Ａ−Ｇ−Ｎ−＊−Ｎ−Ｇ−Ｍ− Ｈ−”−ｉ）　Ｌ−Ｄ−Ｒ−Ｎ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｌ−八−Ｓ−Ｖ−Ａ−Ｑ−Ｇ −工−Ｅ−Ｗ−査−Ａ−工−Ｎ−＊−Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｈ−嚢−う）　Ｌ−Ｄ−Ｎ− Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ｗ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ａ−Ｎ−Ｇ−エーＴ−Ｙ一★−八−Ａ− Ｄ−＊−Ｑ−Ｇ−Ａ−Ｋ”−１５　ｋ）Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｎ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｑ−Ｙ− Ｓ−Ｔ−Ｉ｛−Ａ−Ｇ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｖ−Ａ−Ｓ−Ｄ−Ｋ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｎ−Ｃ −１）Ｌ−Ｄ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｉ−Ａ−Ｇ−Ｖ−Ｄ −Ｗ−Ｖ−＊−Ｔ−貞−Ｒ−Ｎ−Ｈ−Ｒ−Ｒ−Ｐ−ｍ）　Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｇ− Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｉ−Ａ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｉ４−嚢一Ａ−Ｇ−Ｎ−☆ −Ｎ−Ｇ−Ｍ−Ｈ一★一ｎ）Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｎ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｓ−Ｇ−Ｖ −Ｉ−Ａ−Ｇ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｖ−Ｔ−Ｋ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｑ−Ｎ−Ｃ−ｏ）Ｌ −Ｎ−Ｄ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｔ｛−■−Ｓ−Ｇ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｖ− Ａ−Ｎ−Ｄ−Ｙ−Ｒ−Ｎ−Ｒ−Ｎ−Ｃ−Ｎロ：　１３０　１４０ ａ）　４ｋ−＊−＊−＊−Ｖ−Ｘ−Ｎ−Ｍ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｓ− Ａ−Ａ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｖ−Ｄ−Ｋ−Ａ−Ｖ−Ａ−ｂ）　＊−＊７”−＊−Ｖ −Ｉ−Ｎ−Ｍ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｇ，Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ｋ−Ｔ−Ｖ−Ｖ −Ｄ−Ｋ−Ａ−Ｖ−Ｓ−Ｃ）．＊−＊−嚢−４ｋ−Ｖ−Ｉ＝Ｎ−｝ｉ−Ｓ−Ｌ− Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｔ−Ｇ−’Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ｋ−Ｔ−Ｖ−Ｖ−Ｄ−Ｋ−Ａ−Ｖ−Ｓ −２５　ｄ）．．＊−肴−５−＊−Ｖ｛−Ｎ−Ｍ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｔ−Ｇ 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第１図は、ブラスミドｐ　ＳＸ８　８の構成を示す．第２図は、プラスミドｐｓ Ｘ８８の制限地図を示す．第３図は、本発明の酵素を発現する突然変異のスブチ リシン３０９遺伝子の構成を例示する。

第４図は、プラスミドｐｓＸ９２の制限地図を示す。

第５図は、本発明の突然変異の酵素の最大の性能と計算したｐｉとの間の関係を グラフで実証する。

光更■困風困規凱 前述したように、本発明は、生ずる酵素の表面の上にまたはそれに密接して位置 のアミノ酸の発現の原因となるコドンにおいて、修飾しようとする、スブチリシ ン酵素の遺伝子を突然変異させることによってアミノ酸配列が変化している、突 然変異したスブチリシンに関する。

本発明に関して、スブチリシンはダラム陽性のバクテリアまたは菌カビ類により 産生されたセリンプロテアーゼとして定義される。本発明の多数の実施態様に適 用可能な、より狭い意味において、スブチリシンはまたグラム陽性バクテリアの セリンプロテアーゼを意味する。他の定義に従い、スブチリシンは、触媒のトリ アドの中にアミノ酸残基の比較的順序がＡｓｐ−Ｈｉｓ−３ｅｒ　（位置３２． ６４、および２２１）である、セリンプロテアーゼである。なおより特定の意味 において、本発明の実施態様の多くは、スブチリシンが上の表工に列挙されてい る、それらの−次構造において実質的に明瞭な相同性とすることができる、グラ ム陽性バクテリアのセリンプロテアーゼに関する。

ある数の他の既知のスブチリシンのアミノ酸配列と整列した上の表■に示す、ス ブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列から由来する番号を付すシステムを使用する と、スプチリシン酵素の中のアミノ酸残基の位置を明瞭に示すことができる。

スブチリシンＢＰＮ“の中のアミノ酸残基数１の前の位置は、負の数、例えば、 サーミターゼの中のＮ末端Ｙについて−６が割り当てられるか、あるいはプロテ アーゼにの中のＮ末端Ａについて０が割り当てられる。スブチリシンＢＰＮ’　 に関するインサートであるアミノ酸残基は、スブチリシンＢＰＮ°の数に先行す るアルファベットの文字の付加により番号を付され、例えば、Ｉ　Ｚ　３　ｅ　 ｒと”Ｔｈｒとの間のプロティナ１２ｂ、１２ｄ、１２ｅである。

上の番号を付すシステムを使用すると、問題の位置は次の通りである： １、、２．３．４．６．９．１０．１２．１４．１５．　：Ｌ７．１８．１．９ ．２０．２１．２２．２４゜２５、２７．３６．３７．３Ｂ、　４０．４１．４ ３．４４．４５．４６．４９．５０．５１．５２゜５３、５４．５５．５６．５ ７．５Ｂ、　５９；　６０．６１．６２．７５．７６、７７、７Ｂ、　７９゜８ ７、８．９．９１．９４．９７．９Ｂ、　９９．　］−００，１０１，１０３， １０４，１０５，１０６，、１０７゜１０８、１０９．１１２．１１：ｌ、　１ １．５．１１６．１１７．１８．１２０．１２６．１２８．１２９゜］ｊ０．１ ３１．．１３３．１：１４．１３６．１ｍ１７．１４０．１４１．１４３．１４ ４．１４５．１４６゜１５５、．１５６．・１５８．１５９．１６０．１６１． １６２．１６３．１６４．１６５．１６６、１６７゜１７０、　１７１．　１７ ２．　１７３．　１８１．　１８２．　１８３．　１８４．　１８５．　１８６ ．　１８８．　１８９゜１９１、１９２．１９４．１９５．１９７．２０４，２ ０６．２０９．２１０．２１１．２１２．２１３゜２１４、２１５．２１６．２ ］−７，２１８，２：１５．２３６．２３７．２３８．２３９．２４０．２４１ ゜２４２、２４３．２４４．２４５．２４７．２４８．２４９．２５１．２５２ ．２５３．２５４．２５５゜２５６、２５７．２５９．２６０．２６１．２６２ ．２６３．２６５．２６９．２７１．２７２．２７５゜等１孟」」」」」− 洗浄条件下の基質が酵素のそれと反対の静電荷を有すると仮定すると、基質への 酵素の吸着、こうして洗浄性能は酵素の正味の静電荷、ＮＥＣ１を増加すること によって改良されることを期待することができるであろう。

しかしながら、驚くべきことには、このような環境下の酵素のＮＥＣの減少は酵 素の洗浄性能を改良することができることが発見された。

換言すると、より低いｐＨに近付く方向の酵素の等電点、ＰＩｏ、の変化は、ま た、酵素の最適な洗浄性能のｐＨをより低い値にシフトすることが発見され、こ れが意味するように、酵素が活性であるべき低いｐＨの洗浄液に対する酵素を設 計するためには、既知のスプチリシン酵素の洗浄性能の改良は、より低いｐｉ。

を有する突然変異の酵素を得るように既知のスブチリシン酵素のための遺伝子を 突然変異させることによって得ることができる。

この発見は反対がまた可能であることを示す実験に導いた。

これが意味するように、既知のスブチリシン酵素を、また、そのｐＩ。をより高 い値にシフトし、これにより酵素に最適な洗浄性能のｐＨをより高いｐＨ値にシ フトすることによって高いｐＨの洗浄剤において使用するために設計出来る。

したがって、本発明は、１つの面において、正味の静電荷が同−ｐＨにおいて親 のプロテアーゼに比較して変化しており、そして突然変異したスブチリシンブロ テアーゼの中に、前記親のプロテアーゼに関して、より少ないまたはより多い正 に帯電したアミノ酸残基および／またはより多いまたはより少ない負に帯電した アミノ酸残基、またはより多いまたはより少ない正の帯電したアミノ酸残基およ び／またはより少ないまたはより多い負に帯電したアミノ酸残基が、アミノ酸残 基の間で、１または２以上の位置 １、２．３．４．６．９．１０．１２．１４．１５．１７．１Ｂ、　１９．２０ ．２１．２２．２４゜２５、２７．３６．３７．３Ｂ、、４０．４１．４３．４ ４．４５．４６．４９．５０．５１．５２゜５３、５４．５５．５６．５７．５ Ｂ、　５９．６０．．６１．６２．７５．７６、７７、７Ｂ、　７９゜１３０、 　１３１．　１３３．　ｌコ４．　１：３６．　１３７．．１４０．　１４１． 　１４３．　１４４．　１４５．　１４６゜：Ｌ５５．１５６．１５８．１５９ ．１６０．１６１．１６２．１６３．１６４．１６５．１６６、１６７゜１７０ 、１７１．１７２．１７：ｌ、　１８１．　］−８２，１８：ｌ、　１８４．１ ８５．１８６．１８８．１８９゜ｘ９１．１９２．１９４．１９５．１９７．２ ０４．２０６°、　２０９．２１０．２１１．２１２．２１：３゜に存在し、そ してこれにより前記スブチリシンプロテアーゼは、前記親のプロテアーゼのそれ より、それぞれ、低いか、あるいは高い等電点ｐＨ（ＰＩ。）を有する、突然変 異したスブチリシンプロテアーゼに関する。

好ましい実施態様において、本発明は、ＮＥＣが同−ｐＨにおいて親のプロテア ーゼに比較して変化しており、そして突然変異したスプチリシンプロテアーゼの 中に、前記親のプロテアーゼに関して、より少ないまたはより多い正に帯電した アミノ酸残基および／またはより多いまたはより少ない負に帯電したアミノ酸残 基、またはより多いまたはより少ない正に帯電したアミノ酸残基および／または より少ないまたはより多い負に帯電したアミノ酸残基が、アミノ酸残基の間で、 １または２以上の位置 １、２．−３．４．１４，４５．’　１７；　１Ｂ、　２０．２７．．４０．４ １，４］、　４４．４５，４６゜５１．　５２．　６０．　６１．　６２．　７ ５．　７６、　７８．　７９．　９１．　９４．　９７．　１００．　１０５． 　１０６゜１０８、１１２．　１１３．　ｌ：１７．　１１８．　１．２９．、 　１３０．　ｌ：１３．　１３４．　１１６．　：Ｌ１２．　１４１゜１４：ｌ 、１４４．　１４５．　１４６．　１６５．　１７：ｌ、１８１．　１８３．　 １８４．　１８５．　１９１．　］−９２゜２０６、２０９．２．１０．２１１ ．２１２．２１６．２３９．２４０．２４２．２４３．２４４．２４５゜２４７ 、２４８．２４９．２５１．２５２．２５３．２５５．２５６．２５７．２５９ ．２６：ｌ、　２６９゜２’Ｈ，２７２゜ に存在し、そしてこれにより前記スブチリシンプロテアーゼは、前記親のプロテ アーゼのそれより、それぞれ、低いか、あるいは高い等電点ｐＨ（ｐＩｏ）を有 する、突然変異したスプチリシンプロテアーゼに関する。

他の好ましい実施態様において、本発明は、ＮＥＣが同−ｐＨにおいて親のプロ テアーゼに比較して変化しており、そして突然変異したスプチリシンプロテアー ゼの中に、前記親のプロテアーゼに関して、より少ないまたはより多い正に帯電 したアミノ酸残基および／またはより多いまたはより少ない負に帯電したアミノ 酸残基、またはより多いまたはより少ない正に帯電したアミノ酸残基および／ま たはより少ないまたはより多い負に帯電したアミノ酸残基が、アミノ酸残基の間 で、１または２以上の位置 １４ｍ１．１４４．１４５．１４６．１６５．１７３．１８１．　ＩＥＩ３．１ ８４．１８５．１９１．１９２゜２０６、２０９．２１０．２１１．２１２．２ １６．２３９．２４０．２４２．２４３．２４４．２４５゜２４７、２４８．２ ４９．２５１．２５２．２５３．２５５，２５６．２５７．２５９．２６３．２ ６９゜２７１、２７２゜ に存在し、そして位置 １９１、１９２．１９４．１９５．１９７．２０４．２’０６．２０９．．２１ ．０．２１１．２１２．２１”！。

の群から構成される装置を占有するアミノ酸残基に影響を与える少なくとも１つ のそれ以上の突然変異が存在し、そしてこれにより前記スブチリシンプロテアー ゼは、前記親のプロテアーゼのそれより、それぞれ、低いが、あるいは高い等電 点ｐＨ（ｐＩ。）を有する、突然変異したスブチリシンプロテアーゼに関する。

これらの面において、本発明は、簡単に述べると、突然変異のプロテアーゼのｐ ｌｏが親のプロテアーゼのｐｌ。より低く、そして最適な洗浄性能のためのｐＨ が、また、親のプロテアーゼの最適なｐＦＩより低い突然変異のプロテアーゼ； または突然変異のプロテアーゼのＰＩＧが親のプロテアーゼのｐｌ。より高く、 そして最適な洗浄性能のためのｐｒｌが、また、親のプロテアーゼの最適なｐｒ ｌより高い突然変異のプロテアーゼに関する。

一般に、反応速度論の性質は酵素の中の活性部位の付近における表面静電荷を変 化させることによって影響を及ぼすことができるとと信じられる（Ｔｈｏｍａｓ 、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ　、およびＦｅｒｓｈｔ、　５ｕｐｒａ）が、今回、驚くべ きことには、酵素の反応速度論の変化は、また、活性部位から遠い表面電荷を変 更することによって発生させることができることが発見された。

結局、本発明は、また、突然変異のスブチリシン酵素の触媒のトリアドから１５ オングストロ一ム以上の距離にある１または２以上のアミノ酸残基がその親酵素 のアミノ酸配列に比較して変化されており、こうして酵素の最適な洗浄性能のた めのｐＨをシフトしようとするのと同一方向にシフトされた等電点（＝ｐＩ。） を有する突然変異のプロテアーゼを提供する、突然変異のスブチリシン酵素を包 含すると考えられ、前記最適なｐＨは、前記突然変異のプロテアーゼの使用を意 図する、洗浄液のｐｉに出来るだけ近くあるべきである。

本発明のいくつかの実施態様に従い、突然変異のプロテアーゼが、例えば、負に 帯電したアミノ酸残基（例えば、ＤまたはＥ）または中性の極性残基（例えば、 Ａ、Ｑ、またはＮ）または正のアミノ酸残基、例えば、ＲまたはＫを挿入するた めに、位置３６に挿入突然変異を含有する、突然変異のプロテアーゼおよび洗浄 剤組成物が提供される。

これは、とくに、例えば、スブチリシン３０９および１４７およびＰＢ９２、お よびそれがスプチリシンＢＰＮ’の配列に関して位置３６におけるアミノ酸残基 の損失を自然に有することを相同性を示す、任意の他の配列に適用可能である。

位置３６における挿入突然変異は、それ以上の突然変異、例えば、位置１２０． １７０．１９５．２３５および／または２５１の１または２以上に、および／ま たは位置７６に突然変異を有することができる。

位置７６における適当な突然変異は、例えば、負に帯電した残基、例えば、Ｎ７ ６ＤまたはＮ７６Ｅである。

位置３６における突然変異（ことに負または極性中性の残基）および位置７６に おける突然変異（負に帯電した残基による置換）は、しばしば、突然変異のプロ テアーゼへの安定化効果を有することができ、そして組み合わせて使用すること ができる０例えば、位１１２０．１７０，１９５．２３５および２５１の１また は２以上における突然変異は、酵素活性の増加に関連することが発見された。後 者の突然変異が安定性の損失に個々に関連する場合でさえ、それらを位置３６お よび７６の一方または両者における突然変異と組み合わせることは許容されかつ 有用であることがある。

このようなプロテアーゼ突然変異の有用な例は、次の突然変異を有するものであ る： ある条件下に、分子の中のどこかに正の電荷を挿入するために、位置３６に負の アミノ酸残基の挿入を有する突然変異のプロテアーゼの中にそれ以上の突然変異 を配置することは有利であることがある。

これは、生ずる突然変異のプロテアーゼ、例えば、それ以上の突然変異が正の電 荷、例えば、位置２１３における正に帯電した残基を提供する、例えば、Ｔ２１ ３Ｋ、の水安定性を増加することができる。

本発明に従い、さらに、突然変異のスブチリシン酵素は、スブチリシンＢＰＮ’ 、スブチリシンアミロサッカリチクス、スジチリシフ１６日、スブチリシンメセ ンテリコペプチダーゼ、スブチリシン力ルスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）　、 スプチリシンＤＹ、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７、サーミターゼ、 バチルス属（Ｂａｃｉ　ｆｌｕｓ）　ＰＢ９２プロテアーゼ、およびプロテイナ ーゼに、好ましくはスブチリシン３０９、スブチリシン１４７、スブチリシン力 ルスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、アクアリシン、プロテアーゼＴＷ７、また はプロテアーゼＴＷ３である。

さらに好ましい実施態様は、１または２以上の突然変異を含有するスプチリシン 酵素からなる： Ｒ１０Ｆ、　ＲＩＯＬ、　Ｒ１０Ｆ＋Ｒ４５Ａ＋Ｅ８９Ｓ＋Ｅ１］６（ｉ＋Ｒ１ ４５Ａ＋Ｄ１８１Ｎ＋Ｒ１８６Ｐ＋Ｅ２７１Ｑ。

Ｒ１０Ｆ＋Ｒ１９Ｑ＋Ｅ８９Ｓ＋Ｅ１３６Ｑ＋Ｒ１４５Ａ＋Ｄ１８１Ｎ＋Ｅ２７ １Ｑ＋Ｒ２７５Ｑ、Ｑ１２に、Ｑ１２Ｒ。

Ｑ１２１ＧＰ１．４Ｄ＋Ｔ２２に＋Ｎ４］Ｒ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋ ５９９Ｄ＋５１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋八１７２Ｄ＋Ｎ１７コに＋Ｔ２１３Ｒ＋Ｎ ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ十八２７２Ｒ，Ｑ１２Ｒ＋Ｐ： Ｌ４Ｄ＋Ｔ２乏Ｒ＋Ｎ４３Ｒ＋Ｑ５９Ｅ＋ｒ７７６Ｄ十八９８Ｒ＋５９９Ｄ＋５ １５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ十八１７２Ｄ＋Ｎ１７３に＋Ｔ２１：ｌＲ＋Ｎ２４８Ｄ＋ Ｔ２５５Ｅ{ ５２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，Ｑ１２に＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２に＋Ｔ］Ｂ Ｋ＋Ｎ４コＲ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋５１５６Ｅ＋Ａ１５ ８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７コに＋Ｔ２１コＲ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５ ６ｘ＋５２５９＋Ａ２７２Ｒ，’　Ｑ１２Ｒ＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２Ｒ＋Ｔ２８Ｒ＋ Ｎ４：ｌＲ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋５１５６Ｅ＋Ａ１５８ Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３に＋Ｔ２１コＲ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６ に＋５２５（！Ｄ＋Ａ２７２Ｒ；　Ｑ１２に＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２に＋Ｔ：１８に ＋Ｎ４コＲ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０ Ｄ＋５１４１Ｒ＋５１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３に＋Ｔ２１： ｌＲ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ。

Ｑ１２Ｒ＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２Ｒ＋Ｔ３８Ｒ＋Ｎ４３Ｒ＋Ｑ５９Ｅ＋ｔＪ７６Ｄ＋ Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋５１４１Ｒ＋５１５６Ｅ＋Ａ１ ５８Ｒ十八１７２Ｄ＋Ｎ１７：ｌＫ＋Ｔ２１コＲ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５ ２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，Ｒ１４Ｄ、Ｒ１４，に、Ｒ１４に＋貴コロ Ｄ、Ｒ１４に＋Ｎ２１８Ｄ、Ｒ１４に＋Ｐ１２９Ｄ、Ａ１５Ｋ。

Ｎ４３Ｒ，Ｎ４：ｌＫ、Ｒ４５Ａ、Ｅ５３Ｒ，Ｅ５３に、Ｅ５３Ｇ＋に２コ５Ｌ 、Ｅ５４Ｇ、Ｅ５４Ｙ、Ｑ５９Ｅ。

Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ十八９８Ｒ＋５９９Ｄ＋５１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２ Ｄ＋Ｎ１７］Ｋ＋Ｔ２１：ＩＲ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５ ９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ、Ｄ６ＯＮ、Ｎ７６Ｄ、Ｅ８９Ｓ、Ｅ８９Ｓ＋に２５１Ｎ、Ｙ ９１Ｆ。

Ｇ１９５Ｅ＋に２］５Ｌ、　Ｎ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２］５Ｌ ＋に２５１Ｅ、　Ｐ１２９Ｄ、　Ｅｌ：１６Ｑ。

Ｅ１３６に、Ｅ１３６Ｒ，Ｅｌ：１６Ｑ＋Ｒ１０Ｌ、Ｎ１４０Ｄ、Ｎ１４０に、 Ｎ１４０Ｒ，５１４１に、５１４１Ｒ。

Ｒ１４５Ａ、　５１５６Ｅ、　５１５６Ｅ十八１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋ＮＬ７３ に、　５１５６Ｅ＋　Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７コに＋Ｔ２１３Ｒ，５１ ５６Ｅ十八１５ＢＲ＋Ａ１１２Ｄ＋ＮＬ７３に＋Ｔ２１．３Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，Ａ１５８Ｒ，Ａ１５８に、Ｙ １６７Ｖ、Ｒ１７０Ｙ、Ｔｕ７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ。

Ｒ１７０Ｙ＋に２５１Ｅ、　Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２５１Ｅ、　Ｒ１７０ Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２コ５Ｌ、　Ｙ１７１Ｅ。

Ｙ１７１Ｔ、八１７２Ｄ、Ｎ１７］Ｋ、ＤｌＢｌＮ、Ｎ１８４に、Ｎ１８４Ｒ， Ｎ１８５Ｄ、Ｒ１８６Ｐ、Ｙ１９２Ｖ。

Ｙ１９２Ｖ、Ａ、Ｇ１９５Ｅ、Ｇ１９５Ｄ、Ｇ１９５Ｅ＋Ｔ２１コＲ，Ｇ１９５ Ｅ＋に２５１Ｅ、Ｇ１９５Ｅ＋に２：１５Ｌ。

Ｄ１９７Ｎ、Ｄｌ９７に、Ｄ１９７Ｅ、Ｑ２０（５Ｄ、Ｑ２０６Ｅ、Ｙ２Ｏ９Ｌ 、Ｔ２１：ＩＲ，Ｔ２１３に、Ｙ２１４Ｔ。

Ｙ２１４Ｓ、Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｓ、Ｋ２３５Ｌ、に２３５Ｒ，Ｋ２］７Ｒ， Ｗ２４１Ｙ、Ｉ、、Ｗ２４１Ｙ＋Ｈ２４９Ｒ。

Ｗ２４１Ｌ＋Ｈ２４９Ｒ，Ｎ２４８Ｄ、Ｎ２４９Ｒ，に２５１Ｒ，に２５１Ｅ、 に２５１Ｎ、Ｔ２５５Ｅ、５２５６Ｒ。

５２５６に、５２５９Ｌ、５２５９Ｄ、Ｙ２Ｇ］’、弓　５２６５に、５２６５ Ｒ，Ｅ２７１Ｑ、Ｅ２７１Ｇ、Ｅ２７１Ｇ＋に２７Ｖ、Ｅ２７１Ｑ、Ｇ、Ａ２７ ２Ｒ，Ａ２７２Ｒ，Ｒ２７５Ｑ。

Ｄｌ４に、Ｄｌ４に＋Ｄ１２０に、ｔｎｌＫ＋Ｄ１２０に＋Ｄ１４０に、Ｄｌ４ に＋Ｄ１２ＯＫ＋Ｄ１４０に＋Ｄ１７２Ｋ。

Ｋ２７Ｄ、　Ｋ２７Ｄ＋Ｄ１２ＯＫ、　Ｅ５４Ｔ、　Ｅ５４Ｙ、　Ｎ９７Ｄ、　 Ｎ９７Ｄ＋５９８Ｄ、　Ｎ９７Ｄ＋Ｔ２１コＤ。

５９８Ｄ、５９８Ｄ＋Ｔ２１コＤ、Ｄｌ２０に、Ｄｌ４０に、５１５６Ｅ、０１ ７２に、Ｔ２１コＤ、Ｎ２１８Ｄ。

さらに特別に好ましい実施態様は、１または２以上の突然変異を含有する突然変 異したスブチリシンプロテアーゼからなる： ５ＯＯＩ）　Ｇ１９５Ｅ ５００２）　Ｇ１９５Ｄ ＳＯＯコ）　Ｒ１７ｏＹ ＳＯＯ４）　Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ ５００５）　Ｋ２５１Ｅ ５００６）　Ｎ１２０Ｄ ５００８）　Ｈ：Ｌ２０Ｄ＋Ｇ１９５ＥＳＯＯ９）　’Ｔ７１Ｄ Ｓｏｌｏ）　Ｔ７１Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ Ｓｏｉｌ）　Ｒ１７０Ｙ＋に２５１Ｅ ５０１２）　Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５１Ｅ’、　Ｋ２５１Ｅｓｏ１：＋、）　Ｔ７ ｉＤ＋Ｒ１７ｏｙ＝に２ｓｕ：５Ｏ１４）　Ｔ７１Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ二Ｇ１９５Ｅ ＋に２５１ＥＳＯ１５）　Ｋ２３５Ｌ Ｓ０１６）Ｎ１２０Ｄ十に２３５Ｌ ＳＯ１７）　）（１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２］５ＬＳＯ１Ｂ）　に１９５Ｅ＋ に２５１Ｅ ＳＯ１９）　Ｎ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２コ５Ｌ５０２０）　Ｎ １２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２］５Ｌ＋に２５１ＥＳ０２１）　嚢３ ６Ｄ′ ５０２２）　＊’３６Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２５１Ｅ５０２３）　＊ ：１６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３５ＬＳ０２４）　★コ ロＤ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３５Ｌ＋に２５１ＥＳ０２５ ）　＊３６Ｄ＋Ｈ］−２０Ｄ÷Ｇ］−９５Ｅ＋に２３５ＬＳ０２６）　Ｅｌ：３ ６Ｒ ＳＯ２７）　Ｅ８９Ｓ ５０２８）　ＤｌＢｌＮ ５０２９）　Ｅ８９Ｓ＋ＥｌコロＰ。

５Ｏ３０）　Ｅ８９Ｓ＋Ｄ１８１ｔ＋ ＳＯコ１）　Ｄ］−９７Ｎ＋Ｅ２７１Ｑ５０３２）　Ｄ１９７Ｎ ＳＯ３］）　Ｅ２７１Ｑ ＳＯコ５）　六１６Ｄ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２コ５ＬＳ０４ １）　Ｇ１９５Ｆ Ｓ２０１）　）Ｊ７６Ｄ Ｓ２０２）　Ｎ７６Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ ｓ２０３）　Ｎ７６Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５ＥＳ２０４）　Ｎ１２０Ｄ十Ｇ１ ９５Ｅ＋に２コ５Ｌ＋に２５１ＥＳ２２３）　Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ十八９８Ｒ＋ ５９９Ｄ＋Ｔ２１３に＋Ｙ、２３５Ｌ＋Ｎ２４ＢＤ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋ ！９２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ５２２４）　、Ｑ５．９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ十八９８Ｒ＋５ ９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋５１４１Ｒ＋に２３ＳＬ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２ ５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２ＲＳ２２５）　肴３６Ｄ＋Ｑ５９Ｅ ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋５１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１ ７２Ｄ＋Ｎ１７コＲ＋に２：＋５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５ ２５９Ｄ＋　Ａ２７２ＲＳ２２６）　＊３６Ｑ Ｓ２２７）　★３６Ｄ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ十八９８Ｒ＋５９９Ｄ＋１（１２０ Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋５１４１Ｒ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２コ５Ｌ＋ｒＪ２４ ８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６１に＋５２５９Ｄ＋　Ａ２７２Ｒ９２５６に＋５２ ５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ ５２２９）　Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ十八９ＳＲ＋５９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０ Ｄ＋５１４１Ｒ＋５１５６Ｅ＋Ａ１５ｓＲ＋ｘ１７２ｏ＋Ｎ１７：＋ｘ＋ｘ２： ＋ｓＬ＋Ｎ２４ａｏ＋Ｔ２ｓｓＥ＋５２ｓ６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ ５２３４）　Ｑ２０６Ｄ ５２：１５）　＊３６０＋Ｎ７６Ｄ Ｓ２４２）　責コロＱ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３５ＬＣｏｏ ：Ｌ）　Ｄ１４Ｋ ＣＯＯ２）　Ｄ１２０Ｋ Ｃｏｏ：ｌ）　Ｄ１４０Ｋ ＣＯＯ４）　Ｄｌ、４に＋Ｄ１２０Ｋ ＣＯＯ５）　Ｋ２７Ｄ ＣＯＯ６）　Ｋ２７Ｄ＋Ｄ１２０に ＣＯＯ８）　Ｄ１７２Ｋ ＣＯＯ９）　Ｃ１４に＋ＤＩ２ＣＩＫ＋Ｄ１４０ＫＣＯＩＯ）　Ｃ１４に＋Ｄ１ ２０に＋ＤＩ４０に＋Ｄ１７２ＫＣＯＬ３）　Ｎ９７Ｄ ＣＯ１４）　５９８Ｄ ＣＯ１５）　Ｔ２１コＤ ＣＯ１７）　５１５６Ｅ ＣＯ１Ｂ）　Ｎ９７Ｄ＋５９８Ｄ ＣＯ１９）　Ｎ９７Ｄ＋Ｔ２１．コＤ ＣＯ２２）　５９８Ｄ＋Ｔ２１コＤ ＣＯ２８）　Ｎ２１８Ｄ Ｃ１００）　Ｖ５１Ｄ ＣＩＯＬ）　Ｅ５４Ｔ Ｃ１０２）　Ｅ５４Ｙ 本発明のそれ以上の面において、ｐｌａについての上の考察は、親酵素の中のア ミノ酸についての欠失、置換または挿入すべき１または２以上の位置および１ま たは２以上のアミノ酸を決定または選択し、ここで生ずる突然変異の酵素の中の 計算した正味の静電荷（＝ＮＥＣ）が同−ｐＨ値において計算した選択の親酵素 の中のＮＥＣに比較して変化している方法で、選択を実施する方法において、さ らに、利用される。

本発明によりカバーされるこの原理を表す他の方法は、酵素の最適な洗浄性能の ためのｐＨをシフトしようとするのと同一方向にシフトされた等電点（＝ＰＩ。

）を有する突然変異のプロテアーゼを提供する方法で、生ずる突然変異の酵素の 中の電荷の合計の数または合計の電荷含量（−ＴＣＣ）、および／またはＮＥＣ が変化される方法で、前記親酵素の中のアミノ酸のために欠失、置換または挿入 すべき１または２以上の位置および１または２以上のアミノ酸を選択することで あり、最適なｐＨは前記突然変異のプロテアーゼの使用を意図する、洗浄液のｐ ｔｒに出来切るだけ近くあるべきである。

上に示したように、巨大分子、例えば、酵素のＰｌｏは分子ＮＥＣがゼロに等し いｐＨとして計算される。この手順は下の実施例に例示するが、原理はここにお いてより詳細に記載する。

ｐＫ値は各潜在的に帯電するアミノ酸残基に割り当てられる。

次いで、帯電または非帯電の形態の所定のｐｎにおけるアミノ酸残基の存在の比 （帯電／非帯電、Ｃ／Ｕ（ｉ））は、式１ａおよびＩｂを使用することによって 、両者の負の電荷および正の電荷について計算する： それぞれ Ｃ／Ｕ（ｉ）＝ｅｘｐ（Ｉｎ＋ｏ（ｐＨ−ｐＫｔ））　（負の電荷）　（Ｉａ） Ｃ／Ｕ（ｉ）＝ｅｘｐ（Ｉｎ＋ｏ（ｐＫｔ−ｐＨ））　（正の電荷）　（Ｉｂ） 式ＩａおよびＩｂから理解されるように、ＰＫｉに等しいｐＨにおいて、Ｃ／Ｕ （ｉ）は１に等しい。

次いで、相対的電荷、Ｑ、（ｉ）、または各帯電した残基に割り当てられる電荷 の寄与は式ＩＩａおよびｆｉｂを使用して計算される： Ｑ、　（ｉ）＝Ｃ／Ｕ　（ｉ）／　（１＋Ｃ／Ｕ　（ｉ））　（負の電荷）　（ ＩＩａ）Ｑ、（ｉ）・−Ｃ／Ｕ（ｉ）／（１＋Ｃ／Ｕ（ｉ））　（正の電荷）　 （ＩＩｂ）帯電した残基からのすべての電荷の寄与の合計がゼロに等しいｐＨ値 は、十分に密なｐＨ−電荷の合計の表における反復または補間により見いだされ る。

″然・　の　素を１　するゞ゛ 本発明は、また、クリーニンおよび洗浄剤組成物における本発明の突然変異の酵 素の使用および突然変異のスブチリシン酵素からなるこのような組成物からなる 。

本発明の前の面のいずれかに従う突然変異のスブチリシン酵素の１または２以上 の単独または当業者によく知られているこのような組成物にを含まれる通常の成 分のいずれとの組み合わせからなる。

このような成分は、ビルダー、例えば、ホスフェートまたはゼオライトのビルダ ー、界面活性剤、例えば、アニオン、カチオンまたは非イオン型界面活性剤、ポ リマー、例えば、アクリルまたは同等のポリマー、漂白系、例えば、パーボレー ト−またはアミノ−含有漂白前駆体またはアクチベーター、構造因子（ｓｔｒｕ ｃｔｕｒａｎｔ）、例えば、シリケートの構造因子、アルカリまたは酸のｐＨ調 節剤、吸湿剤、および／または中性の無機塩からなる。

いくつかの有用な実施態様において、洗浄剤組成物は次のようにして配合するこ とができる： ａ）ホスフェートのビルダー、アニオン型界面活性剤、非イオン型界面活性剤、 アクリルまたは同等のポリマー、パーボレートの漂白前駆体、アミノを含有する 漂白アクチベーター、シリケートまたは他の構造因子、使用において所望のｐＨ を調節するためのアルカリ、および中性の無機塩を含有する粉末として配合され た洗浄剤組成物。

ｂ）ゼロライトのビルダー、アニオン型界面活性剤、非イオン型界面活性剤、ア クリルまたは同等のポリマー、パーボレートの漂白前駆体、アミノを含有する漂 白アクチベーター、シリケートまたは他の構造因子、使用において所望のｐＨを 調節するためのアルカリ、および中性の無機塩を含有する粉末として配合された 洗浄剤組成物。

Ｃ）アニオン型界面活性剤、非イオン型界面活性剤、吸湿剤、有機酸、苛性アル カリ、ｐＨを９〜１０に調節する、からなる水性洗浄剤液として配合された洗浄 剤組成物。

ｄ）線状アルコキシル化第１アルコールから本質的に成る液状非イオン型界面活 性剤、トリアセチン、ナトリウムトリホスフェート、苛性アルカリ、バーボレー トモノハイドレートの漂白前駆体、および第３アミンの漂白アクチベーター、ｐ Ｈを約９〜１０に調節する、からなる水性洗浄剤液として配合された洗浄剤組成 物。

ｅ）少な（とも５５０ｇ／ｌ、例えば、少なくとも６００ｇ／ｌのかさ密度を有 し、アニオンおよび非イオン型界面活性剤、例えば、アニオン型界面活性剤およ び約７および約３のそれぞれのアルコキシル化度をもつ非イオン型界面活性剤の 混合物、低いまたは実質的にゼロの中性の無機塩、ホスフェートのビルダー、パ ーボレートの漂白前駆体、第３アミンおよび湿分を含有する、粒体の形態の洗浄 剤粉末として配合された洗浄剤組成物。

ｆ）少なくとも６００ｇ／ｌのかさ密度を有し、アニオン型界面活性剤および約 ７および約３のそれぞれのアルコキシル化度をもつ非イオン型界面活性剤の混合 物、低いまたは実質的にゼロの中性の無機塩、ゼオライトのビルダー、パーポレ ートの漂白前駆体、第３アミンの漂白アクチベーター、ケイ酸ナトリウム、およ び少量物質および湿分を含有する、粒体の形態の洗浄剤粉末として配合された洗 浄剤組成物。

ｇ）アニオン型界面活性剤、非イオン型界面活性剤、アク゛　リルポリマー、脂 肪酸石鹸、炭酸ナトリウム、アミンを含むか、あるいは含まない粘度粒子、バー ボレートの漂白前駆体、第３アミンの漂白アクチベーター、ケイ酸ナトリウム、 および少量物質および湿分を含有する、洗浄剤の粉末として配合された洗浄剤組 成物。

ｈ）タロウおよびココナツツオイルのハン鹸化混合物に基づく石鹸、オリトリン 酸で中和し、プロテアーゼと混合し、またギ酸ナトリウム、硼砂、プロピレング リコールおよび硫酸ナトリウムと混合し、次いで石鹸製造ライン上に圧出した、 を含有する洗浄剤（石鹸）の棒として配合された洗浄剤組成物。

ｊ）０．４〜０．８ｇ／ｌの界面活性剤に相当する速度で使用するとき、９また はそれより小さい洗浄液のｐＨを得るように配合した酵素の洗浄剤組成物。

ｋ）０．４〜０．８　ｇ　／　１の界面活性剤に相当する速度で使用するとき、 ８．５またはそれ以上の洗浄液のｐＨを得るように配合した酵素の洗浄剤組成物 。

１）０．４〜０．８　ｇ　／　１の界面活性剤に相当する得度で使用するとき、 ０．０３またはそれより小さい、例えば、０．０２またはそれより小さい洗浄液 のイオン強度を得るように配合した酵素の洗浄剤組成物。

ｍ）０．４〜０．８　ｇ　／　１の界面活性剤に相当する速度で使用するとき、 ０．０１またはそれより大きい、例えば、０．０２またはそれより大きい洗浄液 のイオン強度を得るように配合した酵素の洗浄剤組成物。

リパーゼと　み人わせて７然゛　の　、からなる組驚くべきことには、等電点、 ｐＩ、の減少、それゆえ洗浄条件下のスブチリシン型プロテアーゼの正味電荷の 減少は、酵素の洗浄性能を改良するばかりでなく、かつまたリパーゼとの適合性 を改良することができることが発見された。

また、驚くべきことには、プロテアーゼとリパーゼとの適合性はｐｌによるばか りでなく、かつまたプロテアーゼの活性部位に関して電荷が位置する位置により 影響を及ぼされることが発見された：活性部位により密接した負の電荷の導入ま たは正の電荷の除去は、プロテアーゼとリパーゼとの適合性のより強く改良する 。

したがって、本発明のある種の実施態様は、リパーゼからなりそしてまた突然変 異したスブチリシンブロテアーゼからなる、酵素の洗浄剤組成物を提供し、ここ で突然変異したプロテアーゼの正味の分子の静電荷は親のプロテアーゼに比較し てアミノ酸残基の挿入、欠失または置換により変化しており、そしてここで、前 記プロテアーゼの中に、前記親酵素に関して、より少ない正に帯電したアミノ酸 残基および／またはより多い負に帯電したアミノ酸残基が存在し、これにより前 記スブチリシンブロテアーゼは前記親酵素のそれより低い等電点（Ｐ　ＩＯ）を 有する。

このような使用のための１つの好ましいクラスはグラム陰性バクテリアから由来 し、そして欧州特許（ＥＰ）０２０５２０８号および欧州特許（ＥＰ）０２０６ ３９０号（両者はＵｎｉｌｉｖｅｒ）　（ここに引用によって加える）において 定義された群のリパーゼの酵素を包含し、ある種のＰｓ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ ｃｅ　、　Ｐ、ｇｌａｄｉｏｌｉおよびクロモバクター（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃ　 ｔｅｒ）種からのちに免疫学的に関係するリパーゼを包含する。

前述のリパーゼと組み合わせて使用するための突然変異したスブチリシンブロテ アーゼ酵素の好ましい実施態様は、活性部位、ことに、例えば、位置１７０．１ ２０、または１９５から約１５Ａ−２０Ａの範囲内に位置するアミノ酸残基の部 位に１または２以上の突然変異を有する。

リパーゼは、有用には、脂肪分解酵素と担体物質（例えば、欧州特許（ＢＰ）　 ２５８０６８号（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ）およびＮｏｖｏ　Ｎｏｒ ｄｉｓｋ　Ａ／Ｓの５ａｖｉｎａｓｅ　（登録商標）およびＬｉｐｏｌａｓｅ　 （登録商標製品）との粒状組成物（あるいは溶液またはスラリー）の形態で添加 することができる。

リパーゼの添加量は、広い限界内、例えば、５０〜３，０００ＬＵ／ｇの界面活 性剤系または洗浄剤組成物、例えば、しばしば少なくとも１００ＬＵ／ｇ、非常 に有用には少なくとも５００ＬＵ／ｇ、時には好ましい１００以上、２０００Ｌ 　Ｕ　／　ｇ以上または４０００ＬＵ／ｇ以上内、こうして非常に範囲５０〜４ ０００ＬＵ／ｇおよび可能ならば範囲２００〜１００ＯＬＵ／ｇ内で選択するこ とができる。この規格において、リパーゼの単位は欧州特許（ＥＰ）　２５８０ ６８号におけるように定義される。

脂肪分解酵素は広い範囲のリパーゼの中から選択することができる：とくに、例 えば、次の特許明細書、欧州特許（ＢＰ）２１４７６１号（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄ ｉｓｋ　Ａ／Ｓ）、欧州特許（ＥＰ）０２５８０６８号に記載されているリパー ゼおよびことにサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｗｙｃｅｓ　ｌａｎ ｕｇｉｎｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ２２０７０からのリパーゼに対してレイズされた抗 血清との免疫学的交差反応性を示すリパーゼ、欧州特許（ＨＰ）０２０５２０８ 号および欧州特許（ＥＰ）０２０６３９０号およびクロモバクター・ビスコスム ・パル・リポリチクム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｗ　ｖａｒ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ）　Ｎ　ＲＲＬ　Ｂ　−３６７３に対して、またはアル カリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｐ　Ｌ　−６７９、ＡＴＣＣ３１３７ １およびＦＥＲＭ−Ｐ３７８３に対してレイズされた抗血清と免疫学的に交差反 応性のリパーゼ、また、明細書−０８７１００８５９（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄ ｅｓ）および欧州特許（ＥＰ）　０２０４２８４号（サラポロ醸造会社）。とく に、例えば、次の商業的に入手可能なリパーゼ調製物はに示すである：Ｎｏｖｏ 　Ｌｐｏｌａｓｅ（登録商標）、アマノ（Ａｓａｎｏ）　リパーゼＣＥ、Ｐ、Ｂ 、ＡＰ、Ｍ−ＡＰ、ＡＭＬ、およびＣＥＳ、およびメイト（Ｍｅｉ　ｔｏ）すパ ーゼＭＹ−３０、ＯＦ、およびＰＬ、またＥｓｔｅｒａｓｅ（登録商標）ＭＭ、 Ｌｉｐｏｚｙｍ　（登録商標）、５Ｐ２２５．５ｊ２８５、サイケン（Ｓａｉｋ ｅｎ）リパーゼ、エンゼコ（Ｅｎｚｅｃｏ）リパーゼ、東洋醸造リパーゼおよび ジオシンス（Ｄｆ。

ｓｙｎ　ｔｈ）リパーゼ（商標）。

酵素の遺伝子工学は、適当なリパーゼ遺伝子、例えば、サーモミセス−ラヌギノ スス（Ｔｈｅｒｍｏｓ＋ｙｃｅｓ　Ｉａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）またはその突然変 異からのリパーゼの遺伝子を抽出し、そして遺伝子またはその誘導体を適当な産 生体の有機体、例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の中に導 入しそして発現させることによって達成することができる。−０８８１０２７７ ５（Ｎ　ｏ　ｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ）、欧州特許（ＥＰ）０２４３３３ ８号（Ｌａｂｏｆｉｎａ）、欧州特許（ＢＰ）０２６８４５２号（Ｇｅｎｅｎｃ ｏｒ）および顕著には欧州特許（ＢＰ）０３０５２１６号（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄ ｉｓｋ　Ａ／Ｓ）、または欧州特許（ＢＰ）０２８３０７５号（Ｇｉｓｔ−Ｂｒ ｏｃａｄｅｓ）に記載されている技術を適用および適合させることができる。

同様な考察は、また、存在することができる、他の酵素の場合においてムタチス ・ムタンジス（ｍｕｔａｔｉｓ　ｍｕｔａｄｉｓ）を適用する。制限なしに、ア ミラーゼは、例えば、洗浄剤組成物の１ｇ当たり約１〜約１００ＭＵ（マルトー ス単位）（または０．０１４〜１．４、例えば、０．０７〜０．７、ＫＮＵ／ｇ （Ｎ。

ｖＯ単位）の範囲の量で存在するとき、使用することができる。セルラーゼは、 例えば、洗浄剤組成物の１ｇ当たり約０．３〜約３５ＣＥＶＵ単位の範囲の量で 存在するとき、使用することができる。

洗浄剤組成物は、さらに、次の通常の洗浄剤の成分を通常の量で含むことができ る。それらはビルトまたはアンビルトであることができ、そしてゼローＰ型（す なわち、リンを含有するビルダーを含有しない）であることができる。こうして 、組成物は凝集した形態で１〜５０重量％、例えば、少なくとも５重量％および 約３５〜４０重量％の１または２以上の有機および／または無機のビルダーを含 有することができる。

このようなビルダーの典型的な例は、上に既に述べたものを包含し、より広くア ルカリ金属のオルト、ピロ、およびトリポリホスフェート、アルカリ金属のカー ボネートを、単独でまたはカルサイト、アルカリ金属のクエン酸塩、アルカリ金 属のニトロトリアセテート、カルボキシメチルオキシスクシネート、ゼオライト 、オリアセタールカルボキシレートなどを包含する。

さらに、洗浄剤組成物は１〜３５％の漂白剤または漂白前駆体または漂白剤およ び／または前駆体とそのアクチベーターとからなる系を含有することができる。

それ以上の任意の成分は、泡ブースター、泡抑制剤、腐食防止剤、汚れ懸濁剤、 金属封鎖剤、汚れ再付着防止剤、香料、色素、酵素の安定剤などである。

組成物はテキスタイル材料、ことに限定されないが綿およびポリエステルに基づ くテキスタイルおよびそれらの混合物の洗浄に使用することができる。例えば、 約６０〜６５°Ｃ以下、例えば、約３０°Ｃ〜３５°Ｃ以下の温度においてが疑 われるする洗浄法はことに適当である。洗浄液の中に、例えば、０．４〜０．８ 　ｇ　／　１の界面活性剤を提供するために十分な速度で組成物を使用すること は非常に適当であるが、もちろん必要に応じてこれより少ないか、あるいは多い 量で使用することができる。制限なしに、例えば、洗浄剤配合物の約３ｇ／ｌか ら約６ｇ／ｌの使用割合は、配合物が実施例におけるようなときの場合における 使用に適当であると、述べることができる。

スフ゛チリシン゛　云　の　で７然゛　を　る遺伝子の中に突然変異を導入する 多数の方法はこの分野においてよく知られている。スプチリシン遺伝子のクロー ニングの簡単な説明後、スプチリシン遺伝子内の両者のランダム部位および特定 の部位を論する。

スブチリシン゛　−のクローニンゲ スブチリシンをコードする遺伝子は、この分野においてよく知られている種々の 方法により、ゲノム陽性のバクテリアまたは菌類からクローニングすることがで きる。まず、ＤＮＡのゲノムおよび／またはｃＤＮＡのライブラリーを研究すべ きスプチリシンを産生ずる有機体由来の染色体のＤＮＡまたはメツセンジャーＲ ＮＡを使用して構築することができる。

次いで、スブチリシンのアミノ酸配列が既知である場合、相同性の標識したオリ ゴヌクレオチドのプローブを合成し、そしてバクテリアのＤＮＡのゲノムのライ ブラリーからか、あるいは菌類のｃＤＮＡライブラリーから、スブチリシンをコ ードするクローンを同定するために使用することができる。

あるいは、バクテリアまたはＭ類の他の菌株からのスブチリシンに対して相同性 の物質を含有する標識したオリゴヌクレオチドのプローブを、より低い厳密さの ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を使用して、スプチリシンをコードす るクローンを同定する。

スブチリシンを産生ずる同定するなお他の方法は、ゲノムのＤＮＡの断片を発現 ベクター、例えば、プラスミドの中に挿入し、プロテアーゼ陰性のバクテリアを 生ずるゲノムのＤＮＡライブラリーで形質転換し、次いで形質転換されたバクテ リアをスブチリシンのための基質、例えば、スキムミルクを含有する寒天の上に プレイティングすることを包含する。

スプチリシンを有するプラスミドを含有するバクテリアは、分泌したスブチリシ ンによりスキムミルクの消化のために、透明な寒天のハローにより取り囲まれた コロニーを産生ずる。

スブチリシン′　云　の　のランダム部位然゛　のいったんスブチリシン遺伝子 が適当なベクター、例えば、プラスミドの中にクローニングされたら、いくつか の方法を使用してランダム突然変異を遺伝子の中に導入することができる。

１ツノ方法はクローニングしたスブチリシン遺伝子を、回転可能なベクターの一 部分として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の突然変異の株の中に 組み込むことであろう。

他の方法は、スブチリシン遺伝子の単一の［ｌＩＳ！の形態を発生し、次いでス ブチリシン遺伝子を他のＤＮＡ断片とともに含有するＤＮＡの断片をアニーリン グし、こうしてスプチリシン遺伝子の一部分が一本鎖で止まるようにすることを 包含する。次いで、この明確な、−末鎖の領域はある数の突然変異誘発因子のい ずれかに暴露し、これらの因子は、次のものを包含するが、これらに限定されな い二重亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、ギ酸、またはヒドララ ジン。このランダム突然変異を発生する方法の特定の例は、５ｈｏｒｔｌｅおよ びＮａｔｈａｎｓ（１９７８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 、、７５：２１７０−２１７４）により記載された。５ｈｏｒｔｌｅおよびＮａ 　ｔｈａｎｓの方法に従い、スブチリシン遺伝子を有するプラスミドは遺伝子内 で切断する制限酵素により切り込まれる。このニックはＤＮＡポリメラーゼ■の エキソヌクレアーゼ作用を使用してギャップに広くされるであろう。次いで、生 ずる一本鎖のギャップを前述の突然変異誘発因子のいずれか１つを使用して突然 変異誘発することができるであろう。

あるいは、自然のプロモーターおよび他のコントロール配列を包含する、バチル ス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種からのスブチリシためのレプリコン、ヘルパーファ ージＩＲＩにょる重怒染のとき一本鎖のプラスミドＤＮＡの産生のための選択可 能な表現型のマーカーおよびＭ１３由来を含有するプラスミドの中にクローニン グすることができるであろう。クローニングしたスプチリシン遺伝子を含有する 一本鎖のプラスミドＤＮＡを分離し、スブチリシンのベクター配列を含有するが 、解読領域を含有しないＤＮＡ断片とアニーリングし、ギャップド二重らせん分 子を生ずる。突然変異を、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸またはギ酸を使用するか 、あるいは前述したように、Ｅ、ｃｏｌｉの突然変異部位の中の複製により、ス ブチリシン遺伝子の中に導入する。重亜硫酸ナトリウムは一本鎖ＤＮＡの中のシ トシンともっばら反応するので、この突然変異原でつくった突然変異は解読領域 によみ制限される。反応時間および重亜硫酸塩を異なる実験において変化させ、 こうして平均してスプチリシン遺伝子当たり１〜５つの突然変異がつくられる。

１０ｘのギャップドニ重らせんＤＮＡを４モルの重亜硫酸ナトリウム、ｐＨ６， ０の中で３７℃において９分間インキュベーションすると、−末鎖の領域の中の 約１％のシトシンを実証する。成熟したスブチリシンの解読領域は、ＤＮＡの鎖 に依存して、約２００のシトシンを含有する。有利には、反応時間は４分（２０ ０の中で約１の突然変異の頻度を生成するために）から約２０分（２００の中で 約５）まで変化させることができる。

突然変異誘発後、ギャップド分子をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）で試 験管内処理して、完全に二本鎖の分子および６つの突然変異をつくる。次いで、 能力Ｅ、ｃｏｌｉを突然変異誘発したＤＮＡで形質転換して、突然変異のスブチ リシンの増幅したライブラリーを産生ずる。増幅した突然変異のライブラリーは 、また、その誤まりがちなりＮＡポリメラーゼのために突然変異のための領域を 増加するＥ、ｃｏｌｉのＭｕｔＤ株の中でプラスミドＤＮＡを成長させることに よってつくることができる。

突然変異原の亜硝酸およびギ酸を、また、使用して突然変異のライブラリーを生 成することができる。これらの化学物質は重亜硫酸ナトリウムはど一本鎖ＤＮＡ に対して特異的でないので、突然変異誘発反応は次の手順に従い実施する。スブ チリシン遺伝子の解読部分を、Ｍ１３ファージの中で、標準の方法および調製さ れた一本鎖のファージＤＮＡによりクローニングする。次いで、−末鎖ＤＮＡを １モル亜硝酸ｐＨ４，３と１５〜１６分間２３°Ｃにおいて反応させるか、ある いは２．４モルのギ酸と１〜５分間２３℃において反応させる。

これらの反応時間の範囲は、１０００の中で１から１０００の中で５までの突然 変異の頻度を生成する。突然変異誘発後、汎用プライマーをＭ２ＳのＤＮＡに対 してアニーリングし、そして二重らせんＤＮＡ鋳型として突然変異誘発した一本 鎖ＤＮＡを使用して合成し、こうしてスブチリシン遺伝子の解読部分は完全に二 本鎖となるようにする。この時点において、解読領域はＭ１３ベクターから制限 酵素で切り出し、そして突然変異誘発しない発現ベクターの中に結合し、こうし て突然変異が制限断片においてのみ起こるようにする。（Ｍｙｅｒｓｅｔ　ａｌ 、、５ｃｉｅｃｅ　２２９：２４２−２５７（１９８５））。

スフ゛チリシン゛　云　の　の。亡　・７然゛　のいったんスブチリシン遺伝子 がクローニングされ、そして突然変異のために望ましい部位が同定されると、こ れらの突然変異は合成オリゴヌクレオチドを使用して導入することができる。こ れらのオリゴヌクレオチドは所望の突然変異部位をフランキングするヌクレオチ ド配列を含有する；突然変異のヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの合成の間に 挿入する。

好ましい方法において、ＤＮＡの一本鎖、スブチリシン遺伝子の架橋、を−末鎖 ＤＮＡの相同性部分にアニーリングする。

次いで、残りのギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー断片）によりフィ ルインし、そして構成体をＴ４リガーゼを使用して結合する。この方法の特定の 実施例はモリナガら（１９８４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２：６４６−６ ３９）に記載されている。モリナガらに従い、遺伝子内の断片は制限エンドヌク レアーゼを使用して除去する。次いで、ベクター／遺伝子、ここでギャップを含 有する、を変性し、そしてギャップの代わりに、ギャップの中に含まれる区域の 外側の部位において他の制限エンドヌクレアーゼで切断したベクター／遺伝子に ハイブリダイゼーションする。次いで、遺伝子の一本ｍ　？ｉｉ域を突然変異し たオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために利用可能であり、残 りのギャップはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片によりフィルインし、挿入 をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、そして、１サイクルの複製後、所望の突然変異 を有する二本鎖のプラスミドを産生ずる。モリナガの方法を新しい制限部位を構 成する追加の操作を排除し、したがって、多重部位における突然変異の発生を促 進する。米国特許第４，７６０，０２５号、Ｅｓｔｅｌｌｅｔ　ａｌ、、１９８ ８年７月２６日発行、は、カセットの小さい変更を実施することによって多重突 然変異を有するオリゴヌクレオチドを導入し、しかしながら、なおより大きい種 々の突然変異は任意の１つの時間にモリナガの方法により導入することができる 。なぜなら、種々の長さの１つの長さのオリゴヌクレオチドを導入することがで きるからである。

スプチリシン７然゛　の 本発明に従い、前述の方法、またはこの分野において知られている任意の別の方 法により産生された突然変異した遺伝子は、酵素の形態で、発現ベクターを使用 して発現させることができる。発現ベクターは一般にクリーニンベクターの定義 下に入る。なぜなら、発現ベクターは通常典型的なりリーニンの成分、すなわち 、微生物のゲノムに無関係のメカニズムでベクターの自律的複製を可能とする要 素、および選択の目的で１または２以上の表現型のマーカーを包含するからであ る。発現ベクターはプロモーター、オペレーター、リポソーム結合部位、翻訳開 始シグナルをエンコードするコントロール配列、および、リプレッサー遺伝子ま たは種々のアクチベーター遺伝子を包含する。発現されたタンパク質の分泌を可 能とするために、「シグナル配列」をコードするヌクレオチドを遺伝子の解読配 列の前に挿入することができる。コントロール配列の指令下の発現のために、本 発明に従い処理すべき標的遺伝子を適切なリーディングフレームの中のコントロ ール配列に操作的に結合する。プラスミドベクターの中に組み込むことができ、 そして突然変異スブチリシン遺伝子の転写を支持することができるプロモーター 配列は、次のものを包含するが、これらに限定されない：原核生物のβ−ラクタ ムプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ、　ｅｔ　ａｔ、、１９８７、 Ｐｒｏｃ。

２ｌ−２５）。それ以上の参考文献は、また、”Ｕｓｅｆｕｌｌ　ｐｒｏｔｅｉ ｎｓｆｒｏｍ　ｒｅｃａ＋ｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ”、５ｃｉｅｎｔｉ ｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　、　１９８０．２４２ニア４−９４に見いだすこと ができる。

１つの実施態様に従い、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓを突然変異したＤＮＡを有する発 現ベクターにより形質転換される。発現は分泌する微生物、例えば、Ｂ、５ｕｂ ｔｉｌｉｓの中で実施する場合、シグナル配列は翻訳開始シグナルに従いそして 問題のＤＮＡ配列に先行する。シグナル配列は発現産生物を細胞壁に輸送し、こ こでそれは分泌のとき産生物から切断される。上に定義した用語「コントロール 配列」は、それが存在するとき、シグナルｓｑを包含する。

１１五 スフ゛チリシン゛　云　の１．ｌ亡　・′然　は　な　をも林料圭孟グ方迭 五文孟ユヱ■抹 Ｂ、５ｕｂｔｉｌｔｓ３０９および１４７は、ＮＣＩＢに受託されそして受け入 れ番号ＮＣｌＢ１０１４７およびＮＣｌＢ１０３０９を与えられ、そして米国特 許第３．７２３，２５０号、１９７３年３月２７日に発行（ここに引用によって 加える）に記載されている、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔ ｕｓ）の変異型である。

Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＤＮ４９７は、米国特許出願第０３９，２９８号、１９ ８７年４月１７日発行、欧州特許発行第２４２．２２０号に相当する（ここに引 用によって加える）に記載されており、そして５Ｌ４３日からの染色体のＤＮＡ をもつＲＵＢ２００のａｒｏ＋形質転換体、バイオゲン（Ｂｉｏｇｅｎ）のキム ・バーディ（Ｋｉｍ　Ｈａｒｄｙ）博士から得た胞子形成およびプロテアーゼ欠 乏株である。

Ｅ、ｃｏｌｉ、　ＭＣ１０００ｒ−”＋（Ｃａｓａｄａｂａｎ、　Ｍ、Ｊ、およ びＣｏｈｅｎ　、、Ｓ、Ｎ。

（１９８０）、ＪｌＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、　１３８　：１７９−２０７）は、慣用 方法によりｒ−＋とされそして、また、米国特許出願第０３９　、２９８号に記 載されている。

Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＤＢ１０５は、次の文献に記載されているニカワムラ、 Ｆｏ、トイ、ＲｏＨ，（１９８４）、細胞外のアルカリ性および中性ホスファタ ーゼに欠乏する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｆｓ）の二重突然変異 の構成、Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ、　１６０（２）、４４２−４４４゜プラスミド ｐｓＸ５０　（米国特許出願第０３９，２９８号に記載されており、そしてここ に引用によって加える）は、プロモーター−オペレーターＰ＋　Ｏ＋　、Ｂ、ｐ ｕｍｉｌｕｓ　ｘｙｎ　Ｂ遺伝子およびＢ、５ｕｂｔｔｌｉｓｘｙｌ　Ｒ遺伝子 からなるプラスミドｐＤＮ１０５０の誘導体である。

ｐＳＸ６２　（米国特許出願第０３９．２９８号、５ｕｐｒａに記載されている ）は、子牛プロキモシン遺伝子およびｐｓＸ５０（ｓｕｐｒａ）の中に挿入され た３、ｐｕｍｉｌｕｓ　ｘｙｎ　Ｂ遺伝子からなる、Ｐ　Ｓ　Ｘ　５２　（ｉｂ ｉｄ）の誘導体である。ｐＳＸ６２はＥ、ｃｏｌｉｒｒｎ　Ｂターミネータ−を ｐＳＸ５２の中のプロキモシン遺伝子の背後に挿入することによって発生させた 。

ｐＳＸ６５　（米国特許出願第０３９，２９８号、５ｕｐｒａに記載されている ）は、プロモーター−オペレーターｐｇ　０２　、　Ｂ。

ｐｕｗｉｌｕｓ　ｘｙｎ　Ｂ遺伝子およびＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　ｘｙｌ　Ｒ遺 伝子からなるプラスミドｐＤＮ１０５０の誘導体である。

ｐＳＸ８８　（未発行の国際特許公開第ＰＣＴ／ＤＫ８８１００００２号（ＮＯ ＶＯＩＮＤＵＳＴＲＩ　Ａ／Ｓ）は、スジチリシン３０９遺伝子からなるｐｓＸ ５０の誘導体である。

ｐＳＸ９２は、スブチリシン３０９をＣ１ａＩおよびＨｉｎｄｌＩＩで切断した プラスミドｐ　Ｓ　Ｘ　６２　（ｓｕｐｒａ）の中に挿入し、ＣＩａＩをフィル インし、次いでクリーニンしたスジチリシン３０９遺伝子から断片ＤｒａＩ−Ｎ ｈｅＩおよびＮｈｅＩ−ＨｉｎｄｌＩＩを挿入することによって産生した。

ｐｓＸ９３、第３図に示す、は、ポリリンカー配列の中に挿入したターミネータ −を包含するスジチリシン３０９遺伝子の０．７　ｋ　ｂのＸｂａ　Ｉ−Ｈｔｎ ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片からなるｐＵＣ１３（ＶｔｅｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ　、 　１９８２、Ｇｅｎｅ１９：　：２５９−２６８）である。

ｐｓＸ１１９（未発行の国際特許公開第ＰＣＴ／ＤＫ８８１００００２号（ＮＯ ＶＯＩ　ＮＤＵＳＴＲＩ　Ａ／Ｓ）　は、ホリリンカ−の中に挿入されたスジチ リシン３０９遺伝子のＥｃ　ｏＲ１−Ｘｂａｌ断片を収容するｐＵｃ１３である 。

ｐｓＸ１２０は、ｐｓＸ８Ｂからのスジチリシン３０９遺伝子をもつＨｐａ　ｌ −Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片がｐＤＮ１６８１上のＥｃ　ｏＲＶ−Ｈｉｎｄ　Ｉ 　Ｉ　Ｉの中に挿入し、こうしてプロテアーゼ遺伝子をａｍｙＭおよびａｍｙＱ プロモーターにより発現させた、プラスミドである。ｐＤＮ１６８１は、プロモ ーターをもつａｍｙＱ遺伝子を有するＢ、ａｍｙｌｏｌｔｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ からの挿入された２、８５ｂＰのＣ１ａＩ断片をもツｐＤＮ　１３８０　（Ｄｉ ｄｅｒｉｃｈｓｅｎ　、　Ｂ、およびＣｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、　Ｌ、：１９ ８８、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　５６：５３−６ ０）から得られる（Ｔａｋｋｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ ＋、２５８：１００７ｆｆ）。

ｐＵｃ１３は、Ｖｉｅｔｒａ、　Ｊ、およびＭｅｓｓｉｎｇ　、　Ｊ、：Ｇｅｎ ｅ　１９：２５９−２６８に記載されている。

ｐＵｃ１９は、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ、Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、お よびＭｅＵｓｉｎｇ　、　Ｊ、：Ｇｅｎｅ　３３：１０３−１１９に記載されて いる。

ｐＵＢｌｌｏは、次の文献に記載されている：　Ｌａｃｅｙ　、　Ｒ，Ｗ、、Ｃ ｈｏｐｒａ、　Ｊ、（１９７４）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ ｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の多重抵抗性株の遺伝学的研究、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、７．２８５−２９７およびＺｙｐｒｉａｎ　、　Ｅ、、Ｍａｔｚｕｒ ａ　、　Ｈ，（１９８６）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　 ａｕｒｅｕｓ）のプラスミドｐＵＢ１１０へのシグナル促進遺伝子の発現の特性 決定およびダラム陽性発現ベクター系の開発、ＤＮＡ　５　（３）、２１９−２ ２５゜」Ｊ【五 種々のスプチリシンのための遺伝子は、前述の文献の中にに記載されているよう にして得た。とくに、スブチリシン３０９および１４７酵素のための遺伝子は、 未発行の国際特許公開第ＰＣＴ／ＤＫ８８１００００２号（ＮＯＶＯＩＮＤＵＳ ＴＲＩ　Ａ／Ｓ）（その全体をここに引用によって加える）に記載するようにし て得た。

スフ゛チリシンカルスバーグ　Ｃａｒｌｓｂｅｒ　）”ｍ　Ｏ：）構合成遺伝子 を、成熟スブチリシン力ルスバーグのプロテアーゼおよび転写ターミネータ−の 解読配列に基づいて設計しくＪａｃｏｂｓ、　Ｍ、、Ｅｌｉａｓｓｏｎ、、Ｍ、 、Ｕｈｌｅｎ　、　Ｍ、、Ｆｌｏｃｋ　、　Ｊ、−Ｉ。

（１９８５）、バチルス・レンッス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）からの スブチリシンカルスバーグのクリーニン、配列決定および発現、Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３（２４）、８９１３−８９２６）、スブチリシンＢ ＰＮ′プロテアーゼのｐｒｅおよびｐｒｏ解読配列に結合した（Ｗｅｌｌｓ　、 　Ｊ、Ａ、、Ｆｅｒｒａｒｆ　ＳＥ、、Ｈｅｎｎｅｒ、　Ｄ、Ｊ、、Ｅｓｔｅｌ ｌ、　Ｄ。

Ａ１、Ｃｈｅｎ、Ｅ、Ｙ、（１９８３）　、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓの中のＢａｃ ｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのスブチリシンのクリーニン 、配列決定および分泌、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１１（２２）、 ７９１１−７９２５）。遺伝子を１２７〜３１３塩基対の範囲の長さの７つの断 片に再分割し、各断片は１６〜７７ヌクレオチドの化学的に合成したオリゴから 構成した。２つの鎖のオリゴの間のオーバーラツプを最適化して、各断片の１工 程のアニーリングを促進した（ＭｕｌｌｅｎｂａｃｈＳＧ、Ｔ、、Ｔａｂｒｉｚ ｉ　、　Ａ、、ｂｌａｃｈｅｒ　、　Ｒ，Ｗ、、５ｔｅｉｎ＋ｒｅ　、　Ｋ。

Ｓｌ、ペプチド−ＩＩＩを活性化する結合組織をエンコードする遺伝子の酵母菌 の中の化学的合成および発現、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１（２）、７１９ −７２２）。各断片をＥ、ｃｏｌｉのクリーニンおよび配列決定ベクターの中に でアセンブリングおよびクリーニンした。次いで、断片のすべてをｐＵＢｌｌｏ の中でアセンブリングおよびクリーニンしくＬａｃｅｙ　、　Ｒ，Ｗｏ、Ｃｈｏ ｐｒａ、　Ｊ、（１９７４）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ 　ａｕｒｅｕｓ）の多重抵抗性株の遺伝学的研究、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ、７．２８５−２９７）そしてＢ、５ｕｂｔｉ１ｉｓの中に入れた（カワム ラ、Ｆｏ、トイ、Ｒ，Ｈ，（１９８４）、細胞外のアルカリ性および中性のホス ファターゼに欠乏する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の二重突 然変異体の構築、Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ、　１６０（２）、４４２−４４４）。

遺伝子の転写は、ｐＵＢ１１０プラスミドベクターのＨｐａＩＩプロモーターに より開始した（Ｚｙｐｒｉａｎ　、　Ｅ、、Ｍａｔｚｕｒａ　、　Ｈ，（１９８ ６）、黄色ブドウ球菌（Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のプ ラスミドｐＵＢ１１０へのシグナル促進遺伝子の発現の特性決定およびダラム陽 性発現ベクター系の開発、ＤＮＡ　５　（３）、２１９−２２５）。遺伝子の構 築のプロセスにおいて、一番長い断片（＃５；３１３塩基対の長さ）は、このむ しろ長い断片のアセンブリーを使用する問題を回避するために、それ以上の断片 化（断片＃８および＃９）を必要とした。

ヌクレオチド配列から推定したアミノ酸配列は、早期に発表された位置１２９． １５７．１６１および２１２におけるスブチリシンカルスバーグ配列と異なる（ Ｓｍｉｔｈ　、　Ｅ、Ｌ、、ＤｅＬａｎｇｅ　、　Ｒ，Ｊ、、Ｅｖａｎｓ　、、 Ｗ、Ｈ，、Ｌａｎｄｏｎ、Ｗ、　、Ｍａｒｋｌａｎｄ、、Ｆ、Ｓ。

（１９６Ｂ）、スブチリシンカルスバーグ■。完全な配列ニスブチリシンＢＰＮ ’　との比較；発展的関係、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４３（９）、２１８４ −２１９１）。Ｊａｃｏｂｓｅｔ　ａｌ、（１９８５）により報告される第５の 変更は、ここに記載するカルスバーブのクローンにおいて確証することができな かった。

一占　Ｉ。　のｉ スブチリシン３０９の野生型酵素（３０００）の等電点の計算を、使用する手順 を明らかにするために下に例示する。

同一手順は、もちろん、酵素が突然変異の酵素か否かにかかわらず、酵素の計算 に適用可能である。

ｐＫ値は各潜在的に帯電したアミノ酸残基（Ｔｙｒ、Ａｓｐ、ＧｌｕＳＣｙｓ、 Ａｒｇ、Ｈｉ　ｓ、Ｌｙｓ、Ｎ末端、Ｃ末端のＣａ　”）に割り当てた。この場 合において、環境を考慮し、これにより異なるｐＫ値をその付近に依存して同一 アミノ酸残基のために使用する。割り当てた値を表■に示す。

次いで、帯電または非帯電の形態における所定のｐｌ’ｌにおけるアミノ酸残基 の存在の比（帯電／非帯電、Ｃ／Ｕ（ｉ））を、負および正の帯電の両者につい て、それぞれ、式ＩａおよびＩｂを使用することによって計算した。表ＩＩにお いて、この比はＰｌｏに等しいｐｉについてのみ示す。

引き続いて、相対的電荷、Ｑｒ　（ｉ）、または各帯電した残基に割り当てた電 荷の寄与を、式ＩＩａおよびＩＩｂに使用することによって計算した： 犬−」− ３０００スブチリシン３０９についての　占の１Ｃ／Ｕ（ｉ）”の数　Ｑ−（ｉ ）　Ｑ、（ｉ）　Ｑ、、（ｉ）突然変異　ｐＫ　残基　ｐＨ８，３ｐＨ１０，０ ｐＨ・ｐＴ。

Ｔｙｒ　９．９　３　２．５１Ｅ−０２−０，０７−ＬＳＩ　−１，７７Ｔｙｒ 　１１６　２　５．０ＩＥ−０４０，００−０，０５−０，０６Ｔｙｒ　１１５ 　２　６．コＩＥ−０５０，００−０，０１−０，０１Ａｓｐ　３．５　５　６ ．コｌＥ＋０４　−５．００　−５．００　−５．００Ｇｌｕ　４　５　２．Ｏ ＯＥ＋０４　−５．００　−５．００　−５．００Ｃ−ｔｅｒｍ（八ｒｇ）３　 １　２．ＯＯＥ＋０５　−１．００　−１．００　（，００Ｃｙｓ　９ｊ　Ｏ１ ，０ＯＥ−０１０，０００，００・Ｏ，ＯＯＡｒｇ　１２．８　Ｂ　：１．１６ ε＋０４　８．００　７．９９　７．９９Ｈｉｓ　６−４　７　１．２６Ｅ−０ ２０，０９０−０００，００Ｌｙｓ、　１０　５　５．ＯＬＥ＋０１　４．９０ 　２．５０　２．３４Ｃａｌｃｉｕｍ　２０　：Ｌ、２５　５．０１Ｅ＋１１　 ２．５０　２．５０　２．５ＯＮ−ｔａｒｎ（Ａｌａ）　８　１　５．０ＬＥ− ０１°０．コ３　０．０１　０−０１正味の電荷　４．７５　０．２７　０．０ ＊　Ｅ−０２＝１０−” 上および表■に示したように、各アミノ酸に割り当てたｐＫ値は、環境の中の局 所的変動を考慮すると、異なった。これは計算における増大した精度をはじめて 生ずるが、経験により、一定の推定したｐＫ値は、所定の突然変異の酵素につい てのＰＩｏが親の酵素のＰｒｏに比較して動く方向を示すとき、有用であること が示された。これは表■に示されており、ここで推定したｐＫ値についてのＰＩ ｏ値が示されている。

種々の酵素および突然変異の酵素を比較するために、下に詳細に記載する洗浄試 験を実施した。表■に、親の酵素およびスブチリシン３０９からの突然変異の酵 素（Ｓ　ＯＯＯなどと表示する）およびスブチリシンカルスバーグ（ＣＯＯＯな どと表示する）を使用するこれらの試験からの結果を記載して、使用した洗浄液 の異なるｐＨ値における、ｐＬと洗浄性能との間の相関関係を実証する。洗浄試 験において、洗浄剤の実施例Ｄ７に従うｐＨ８，３の低い塩の液状洗浄剤配合物 、および洗浄剤の実施例Ｄ２に従うｐＨ１０，２の通常の塩の粉末状洗浄剤を使 用した。

表■において、野生型の酵素と比較して相対的抵抗性として結果を示す（それぞ れ、５０００およびＣｏ　ＯＯ）。また、酵素についての計算したｐＩｏおよび 観測されたＰＩｏが示されている。

なる１１育におしる　゛ 突然変異　Ｌ土−改良ヱＵ叉二 計　夏　観　測　洗浄剤のｐＨ ８、コ　１０．２ Ｓ０００　１０．０２　９．７　１　１５００３　９．８６　９．４．　２．０ 　１５００４　’　９．６８　９．１　３．９１Ｓ００５　９．７１　９．１　 １．５　１Ｓ０２０　６．７１　７．９．　８．８　０．５Ｓ０２３　Ｂ−０５ −・９．８　０．２５０２４　６．８６　−　、？、ＯＯ，：ｊ５０２５　８． ９４　６．９　０．６ ＳＯコ１　１０．５３　−　０．４　０．７５０３２　１０．２８　０．７　− ５Ｏコ５　８．０７　−　８．０　０．６Ｓ２０１　９．８５　２．０　０．７ Ｓ２０２　９．６２　−　４．３　０ＪＳ２０３　９．２７’　−９，００，５ ＣＯＯＯ８，８７１１ Ｃｏｏｌ　９．３８　＋、　０．２　１．５ＣＯＯ２９，コ３　−　０．８　１ ．９Ｃｏｏ：ｌ　９．３８　−　０．４　１．１ＣＯＯ４９，６４−０，２１， ８ ＣＯＤ８　９．３８　−　０．２　１５表■から理解されるように、ｐＩ。をよ り低い値にシフトする（Ｓ−系列）と、低いｐＨ（ｐＨ＝　８．３　）において 洗浄性能が改良され、これに対してｐＩｏの上方のシフ）（Ｃ−系列）は高いｐ Ｈ（＋）Ｈ＝　１０．２　）における洗浄性能を改良する。

こうして、等電点の概念は、親の酵素の中の変化すべきアミノ酸の位置の選択に おいて、非常に有用であることが発見された。

一般に、酵素分子の表面にまたはその付近に位置するアミノ酸に相当するコドン の中で実施し、これにより親の酵素の内部構造を出来るだけ多（保持すべきであ ることが発見された。

スブチリシンの　１ この手順は、スジチリシン１４フ酵素、スジチリシン３０９酵素またはそれらの 突然変異の１０リツトル規模の発酵の典型的な精製に関する。

はぼ８リツトルの発酵ブロスを１リツトルのビーカーの中で５００Ｏｒｐｍで３ ５分間遠心した。上澄み液を１０％の酢酸でｐＨ６，５に調節し、そしてサイプ ・スプラ（Ｓｅｉｔｚ　５ｕｐｒａ）ｓｉｏｏフィルタープレートで濾過した。

濾液を、アミコン（Ａｓ＋１ｃｏｎ）　５ＩＹＩＯＵＦカートリツジを装備した アミコンＣＨ２Ａ　ＵＦユニットを使用して、はぼ４００ｍ１に濃縮した。ＵＦ Ｉ縮物を遠心し、そして濾過した後、バシトラシン（Ｂａｃｉ　ｔｒａｃｉｎ） 親和カラムでｐＨ１、室温において吸収すせた。プロテアーゼをバシトラシンカ ラムから室温において、０．０１ジメチルグルタル酸、０．１モルのホウ酸およ びＯ，ＯＯ２モルの塩化カルシウム、ｐＨ１、を含む緩衝液中の２５％の２−プ ロパツールおよび１モルの塩化ナトリウムを使用して溶離した。

バシトラシン精製工程からのプロテアーゼ活性をもつ分画を一緒にし、そして０ ．０１ジメチルグルタル酸、０．２モルのホウ酸およびＯ，ＯＯ２モルの塩化カ ルシウム、ｐＨ６，５、を含有する緩衝液と平衡化した、７５０ｍ１のセファデ ックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ２５カラム（５Ｃ１１の直径）に適用した。

セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　２５カラムからのタンパク質分解活性を もつ分画を一緒にし、そして０．０１モルのジメチルグルタル酸、０．２モルの ホウ酸およびＯ，ＯＯ２モルの塩化カルシウム、ｐＨ６，５、を含有する緩衝液 と平衡化した、１５０ｍ１のセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ６Ｂカ チオン交換カラム（５ｃｍの直径）に適用した。

２リツトルの同一緩衝液中の０〜０．１モルの塩化ナトリウム（スプチリシン１ ４７の場合において０．〜０．２モルの塩化ナトリウム）の直線の勾配を使用し て、プロテアーゼを溶離した。

最後の精製工程において、ＣＭセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムから のプロテアーゼを含有するプロテアーゼを一緒にし、そしてＧＲ８１ＰＰ膜を装 備したアミコン限外濾過セル（Ｄａｎｉｓｈ　Ｓｕｇａｒ　Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ 　Ｉｎｃ、から）の中で濃縮した。

スブチリシン３０９および突然変異 Ｇｌｙ　１９５　Ｇｌｕ　（Ｇ１９５Ｅ　（５００１））：Ａｒｇ　１７０　Ｔ ｙｒ　（Ｒ１７０Ｙ　（Ｓｏｏｎ））：Ａｒｇ１７０　Ｔｙｒ　＋　Ｇｌｙ　１ ９５　Ｇｌｕ　（Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ］−９５Ｅ　（Ｓ００４））　：Ｌｙｓ　２５ １　Ｇｌｕ　（Ｋ２５１Ｅ　（５００５））：Ｈｉｓ　１２０　Ａｓｐ　（Ｈ１ ２０Ｄ　（ＳＯＯ６））：Ａｒｇ　１７０　Ｔｙｒ　＋　Ｇｌｙ　１９５　Ｇｌ ｕ　＋　Ｌｙｓ　２５１　Ｇｌｕ（Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２５１．Ｅ　（ ＳＯ１２））二Ｌｙｓ　２３５　Ｌｅｕ　（Ｋ２コ５Ｌ　（Ｓ０１５））：Ｈｉ ｓ　１２０　Ａｓｐ　＋　Ｇｌｙ　１９５　Ｇｌｕ　＋　Ｌｙｓ　２］５　Ｌｅ ｕ　（Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３５Ｌ、（５０１７））： Ｈｉｓ　１２０　Ａｓｐ　＋　Ａｒｇ　１７０　Ｔｙｒ　＋　＜；ｌｙ　１９５ 　Ｇｌｕ　＋　Ｌｙｓ　２３５Ｌｅｕ　（１（１，２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９ ５Ｅ＋に２３５Ｌ　（Ｓｏ：Ｌ９））　：Ｈｉｓ　１２０　Ａｓｐ　＋　Ａｒｇ 　１７０　Ｔｙｒ　＋　Ｇｌｙ　１９５　Ｇｌｕ　＋　Ｌｙｓ　２３５　Ｉ、ｅ ｕ＋　Ｌｙｓ　２５１　Ｇｌｕ　（Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２ ３５Ｌ＋に２５１Ｅ　（５０２０）：を、この手順により精製した。

″′然゛　スプチｉシンカルスバーグのプローアーゼの製 発酵媒質を直接バシトラシン親和カラム（５ｃｍの直径×１５ｃｍ；１０ミリモ ルのトリス／ＨＣｌ１ｉ１ｉ衝液ｐＨ７，９ｉ流速はぼ１００ｍｌ／時間）上に 適用するか、あるいはネフロス・アンダンテ（Ｎｅｐｈｒｏｓｓ　Ａｎｄａｎｔ ｅ）１１．Ｆ、透析装置（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｃｈｎｋａ）により１０〜１２ ｐｓｉの背圧および外側回路の中に脱イオン水を使用して５００ｍ１に濃縮した 。後者の場合におし１て、６００ｇ／ｌの硫酸アンモニウムの添加により、プロ テアーゼを濃縮物から沈澱させた。沈澱を遠心により集め、そしてほぼ５００ｍ １の脱イオン水の中に再溶解した。前述したのと同一の透析装置を使用して、硫 酸アンモニウムをプロテアーゼの溶液から形成した。最後の体積はほぼ３００ｍ １であるが、ｐｔ＋をｐＨ６，０に調節した。プロテアーゼをバクドラジンカラ ム（前述のもの）から２．７モルのＮａＣ１および１８％のイソプロパツールを 含有する１０ミリモルのトリス緩衝液（ｐＨ７，９）を使用して溶離した。

バクドラジン精製したまたは濃縮したプロテアーゼ物質の透析後、ＣＭ−１−リ スアシルイオン交換カラム（直径５Ｃ１１１×１５　ｃｍ　；　０．０３モルの リン酸ナトリウムｐｕｓ、ｏと平衡化した）に２００＋ａｌ／時間の流速を使用 して適用することによって達成した。プロテアーゼをカラムからリン酸塩緩衝液 中のＯ〜０．３モルのＮａＣ１（２Ｘ５００ｍｌ）の直線の勾配で溶離した。プ ロテアーゼ活性が含有する分画をプールし、そして凍結乾燥後、−２０°Ｃにお いて緩衝塩の存在下に貯蔵した。

オリゴヌクレオチドのＡ すべての不一致のプライマーをアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２８０ＡのＤＮＡ合成装置で合成し、そしてポリアク リルアミドゲルの電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製した。

タンパク　２性についてのアッセイ 突然変異の酵素のタンパク質分解活性をアッセイして、酵素の活性がどこまで保 持されるかを決定した。決定はジメチルカゼイン（ＤＭＣ）法により実施し、こ の方法はＮ０ＶＯパブリケイシヨンＡＦ２２０−ｇｐ　（または後の版）に記載 されており、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　ａ／ｓ、デンマーク国バグバード、か ら入手可能であり、その刊行物をここに引用によって加える。

ゞ　についてのア・・セイ Ａ： 草のジュースを含有するマチス・ウオツシング・アントドライング・ユニット（ Ｍａｔｈｉｓ　Ｗａｓｈｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｒｙｉｎｇ　Ｕｎｔｔ）ＴＨ型（Ｗ ｅｒｎｅｒ　Ｍａｔｈｉｓ　ＡＧ　、スイス国チューリ・ンヒ）の中の容器に、 脱サイズ剤した綿（１００％の綿、ＤＳ７１）クロスを通すことによって、試験 クロス（２，２ＣＩＩＸ２．２ＣＩｌ）、はぼｏ、ｉｇ）を製造した。

最後に、このクロスを強い空気流の中で室温において乾燥し、室温において３週 間貯蔵し、引き続いて使用の前に一１８°Ｃに保持した。

すべての試験はモデルのミニウォッシュシステムにおいて実施した。この系にお いて、６枚の試験クロスを６０ｍ１の洗浄剤溶液を含有する１５０ｍ１のビーカ ーの中で洗浄した。ビーカーを３０°Ｃのサーモスタツーの水浴の中に磁気的に 撹拌しながら保持する。

洗浄剤として、次の標準の液状洗浄剤を使用した：ＡＥ、Ｂｅｒｏｌ　１６０　 １５％ ＬＡＳ、Ｎａ５ａ　１１６９／Ｐ　１０％ヤシ脂肪酸　９％ オレイン酸　１％ トリエタノールアミン　９％ グリセロール　１０．５％ エタノール　１．５％ トリ・Ｎａ・シトレート・２Ｈ，０８％ＣａＣ１・２Ｈｚ　ＯＯ，１％ ＮａＯＨ１％ ＬＡＳからの水　２３．３％ グリセロールからの水　１．５％ 水を加えて　３４．９％ 記載する百分率は活性含量の百分率である。

ｐＨをＩＮのＮａＯＨで８．１４に調節した。使用する水は約６°ｄｆ（（ドイ ツ硬度）であった。

試験は０，１．０ｍｇの酵素タンパク！／１および１０．０ｍｇの酵素タンパク 質／１の酵素濃度で実施し、そして試験の２つの独立の組を突然変異の各々につ いて実施した。下に示す結果はこれらの試験の意味である。

洗浄は６０分間実施し、洗浄に引き続いてクロスを流れる水道水でバケツのの中 で２５分間フラッシュした。

次いで、クロスを一夜空気乾燥しく日光に対して保護した）そしてレミッション （ｒｅｍｆｓｓｉｏｎ）、Ｒ１を、ＥＬＲＥＰＨＯ２０００フオトメーター（Ｄ ａｔａｃｏｌｏｒ　Ｓ、Ａ、　、スイス国ディトキコンから）で４６０ｎｍにお いて決定した。

洗浄性能の測度として、微分のレミッション、デルタＲ１を使用し、これは酵素 を添加して洗浄後のレミッションー酵素を添加しないで洗浄後のレミッションに 等しい。

Ｂ： 種々の突然変異の洗浄性能を、前述の方法に従い、草のジュースで汚れた綿のク ロスに対して試験した。

２、０　ｇ　／　１の商業的ＵＳ液状洗浄剤を使用した。

洗浄剤をイオン交換した水中の０．００５モルのエタノールアミン中に溶解した 。ｐＨをＮａＯＨ／ＨＣＩで、それぞれ、ｐＨ８，０，９，０，１０，０および １１．０に調節した。

温度を３０°Ｃの等温に１０分間保持した。

突然変異の各々を０．２５−ｇの酵素タンパク質／１で投与した。

Ｃ： 下の洗浄剤の実施例において例示する洗浄剤組成物を使用する洗浄試験を、顔料 、脂肪、およびタンパク１１′（カゼイン）を含有する綿に基づく試験クロスを 利用するミニウオッシャ−の中で実施した。条件は次の通りであった：ａ）６° ｆＨの水中の５ｇ／ｌの洗浄剤Ｄ３．ｐＨ８，３、またはｂ）１５°ｆＨの水中 の５ｇ／ｌの洗浄剤Ｄ２、ｐＨ１０，２゜リンスおよび乾燥後、４６０ｎｍにお ける反射を測定した。

改良ファクターを投与量応答曲線、および問題の野生型酵素（Ｓ　０００および Ｃ００Ｏ）に比較して所定のデルタＲを得るために必要な酵素の量に対する関係 から計算し、２の改良ファクターは同一デルタＲ値を得るために半分の酵素のみ が必要であることを示すことを意味する。

これらの試験の結果を、上の表■に示す。

Ｄ： リパーゼ安定性の実験的試験を、例えば、次の物質を使用して、実施した： ＩＬＵ／ｍｌのシュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａ ｃｉａ）のリパーゼを、２つの型０およびＷ（下に記載する）の各々の洗浄液の 中でインキュベーションした。アリコートを間隔をおいて取り、そしてリパーゼ 活性について試験した。

プロテアーゼを使用しないか、あるいは下に記載する種々の型のプロテアーゼを 使用して、平行のインキュベーションを実施して、野生型プロテアーゼを２０Ｇ Ｕ／ｍｌにおいて試験し、突然変異したプロテアーゼを０．５■／ｍｌにおいて 試験した。

、・　）゛なる゛ 洗浄剤Ｄ１： ホスフェートのビルダーを含有する本発明の実施態様に従う洗浄剤粉末を、次の 成分を含有するように配合した：合計の活性洗浄剤、約１６％、アニオン型洗浄 剤、約９％、非イオン型洗浄剤、約６％、ホスフェートを含有するビルダー、約 ２０％、アクリルまたは同等のポリマー、約３．５％（あるいは、約２％に低下 する）、パーボレートの漂白前駆体、約６〜１８％、アミノを含有する漂白アク チベーター、約２％、シリケートまたは他の構造因子、約３．５％、あるいは約 ８％まで、約８グリシンユニツト／Ｉｍｇ活性の酵素、使用のときアルカリで所 望のｐＨに調節する、および中性の無機塩、および酵素（約０．５％、各酵素） 。

アニオン型洗浄剤は、ナトリウムドデシル−ベンゼンスルホネート、または線状 アルキル−ベンゼン−スルホネート、６％、および第１アルキルサルフエート、 ３％の混合物である。非イオン型洗浄剤は、７工トキシレート残基１モルをもつ ほぼＣ１３−Ｃｌ３第１アルコールのエトキシレートである。ポリマーはポリア クリル酸、またはアクリル／マレイン酸コポリマーである。パーボレートの漂白 前駆体は、ナトリウムテトラボレートテトラハイドレートまたはモノハイドレー トである。アクチベーターはテトラ−アセチル−エチレン−ジアミンである。構 造因子はケイ酸ナトリウムである。中性の無機塩は硫酸ナトリウムである。

酵素は、突然変異５００１に従うプロテアーゼ、あるいはプロテアーゼ５００３ ．５００４．５ＯＯ５、Ｃ００Ｉ、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４、Ｃ００５、 ＣＯＯ８，５ＱＬ５．５０１７．５０２１．５２２６．５２２３．５２２４、ま たは５２２５からなる。

洗浄剤Ｄｌａ　： ホスフェートのビルダーを含有する本発明の実施態様に従う洗浄剤粉末を、次の 成分を含有するように配合した二合計の活性洗浄剤、約１５％、アニオン型洗浄 剤、約７％、非イオン型洗浄剤、約６％、ホスフェートを含有するビルダー、約 ２５％、アクリルまたは同等のポリマー、約０．５％、パーボレートの漂白前駆 体、約１０％、アミノを含有する漂白アクチベーター、約２％、シリケートまた は他の構造因子、約６％、約８グリシンユニツト／ｍｇ活性のプロテアーゼ酵素 、使用のときアルカリで所望のｐＨに調節する、および中性の無機塩、および酵 素（約０．５％、各酵素）。

アニオン型洗浄剤は、ナトリウム線状アルキル−ベンゼン−スルホネートある。

非イオン型洗浄剤は、７工トキシレート残基１モルをもつほぼＣ１３−Ｃｌ３第 １アルコールのエトキシレートまたはこれと２残基１モル程度にエトキシル化さ れた対応するアルコールとの混合物である。ホスフェートのビルダーはナトリウ ムトリポリホスフェートである。バーボレートまたは過酸の漂白前駆体は、ナト リウムテトラボレートテトラハイドレートである。アクチベーターはテトラ−ア セチル−エチレン−ジアミンである。構造因子はケイ酸ナトリウムである。中性 の無機塩は硫酸ナトリウムである。酵素は、突然変異５００１に従うプロテアー ゼ、あるいはプロテアーゼ５００３．５００４．５００５、Ｃ００１、ＣＯＯ２ 、Ｃ００３、Ｃ００４、Ｃ００５、Ｃ００８，５０１５，５０１７，５Ｏ２１， ５２２６からなる。

洗浄剤Ｄ２： ゼオライトのビルダーを含有する本発明の実施態様に従う洗浄剤粉末を、次の成 分を含有するように配合した二合計の活性洗浄剤、約１６％、アニオン型洗浄剤 、約９％、非イオン型洗浄剤、約６％、ゼオライトを含有するビルダー、約２０ ％、アクリルまたは同等のポリマー、約３．５％、バーボレートの漂白前駆体、 約６〜１８％、アミノを含有する漂白アクチベーター、約２％、シリケートまた は他の構造因子、約３．５％、あるいは約２．５％まで低下する、約８（あるい は約１５）グリシンユニット／ｒａｇグレード、使用のときアルカリで所望のｐ Ｈに調節する、および中性の無機塩、および酵素（約０．５％、各酵素）。

アニオン型洗浄剤は、ナトリウムドデシル−ベンゼンスルホネート、または線状 アルキル−ベンゼン−スルホネート、６％、および第１アルキルサルフエート、 ３％の混合物である。非イオン型洗浄剤は、７工トキシレート残基１モルをもつ ほぼＣ１３−Ｃｌ３第１アルコールのエトキシレートである。ポリマーはポリア クリル酸である。バーボレートの漂白前駆体は、ナトリウムテトラボレートテト ラハイドレートまたはモノハイドレートである。アクチベーターはテトラ−アセ チル−エチレン−ジアミンである。構造因子はケイ酸ナトリウムである。中性の 無機塩は硫酸ナトリウムである。酵素は、突然変異５００１に従うプロテアーゼ 、あるいはプロテアーゼ５００３．５００４．５００５、Ｃ００１、ＣＯＯ２、 Ｃ００３、Ｃ００４、Ｃ００５、ＣＯＯ８，５Ｏ１５，５０１７，５Ｏ２１，５ ２２６からなる。

洗浄剤Ｄ２ａ： ゼオライトのビルダーを含有する本発明の実施態様に従う洗浄剤粉末を、次の成 分を含有するように配合した二合計の活性洗浄剤、約１４％、アニオン型洗浄剤 、約７％、非イオン型洗浄剤、約７％、ゼオライトを含有するビルダー、約２５ ％、アクリルまたは同等のポリマー、約３％、バーボレートまたは過酸の漂白前 駆体、約１０％、アミノを含有する漂白アクチベーター、約２％、シリケートま たは他の構造因子、約０．５％、約６グリシンユニツ）／ａ＋ｇ活性のグレード 、使用のときアルカリで所望のｐｎに調節する、および中性の無機塩、および酵 素（約０．５％、各酵素）。

アニオン型洗浄剤は、ナトリウム線状アルキル−ベンゼン−スルホネートである 。非イオン型洗浄剤は、それぞれ、７および３工トキシレート残基１モルをもつ ほぼＣ１３−Ｃｌ３第１アルコールのエトキシレート混合物である。ゼオライト のビルダーはＡ型ゼオライトである。ポリマーはアクリル／マレイン酸コポリマ ーである。バーボレートまたは過酸の漂白前駆体は、ナトリウムテトラボレート モノハイドレートである。アクチベーターはテトラ−アセチル−エチレン−ジア ミンである。構造因子はケイ酸ナトリウムである。中性の無機塩は硫酸ナトリウ ムである。酵素は、突然変異５００１に従うプロテアーゼ、あるいはプロテアー ゼ５００３．５００４．３００５、Ｃｏｏｌ、Ｃ００２、Ｃ００３、ＣＯＯ４、 Ｃ００５、Ｃ００８，５０１５，３０１７、Ｓ０２１．５２２６からなる。

洗浄剤Ｄ３： 本発明の実施態様に従う水性洗浄剤液体を、次の成分を含有するように配合した ：合計の活性洗浄剤１６％、Ｃ１２−Ｃｌ３線状アルコールと７モル１モルのエ オレンオキシドとの縮合物２％、モノエタノールアミン２％、クエン酸６．５％ 、ナトリウムキシレンスルホネート６％、水酸化ナトリウム約４．１％、プロテ アーゼ０．５％、少量物質および水で１００％。

ｐＨを９〜１０の値に調節する。酵素は、突然変異５０２０、あるいは５０１９ ．５０１２．５００４．５００１．５ＯＯ２，３００３，５００４，５００５， ５０１５，５０１７，５０２１，５０２２，５０２５，５Ｏ３５，５２０１，５ ２２３，５２２４，５２２６および５２３５からなる。

洗浄剤Ｄ４： 本発明の実施態様に従う水性洗浄剤液体を、次の成分を配合することによって配 合する：３８．５％の４．９モル１モルのエオレンオキシドおよび２．７モル１ モルのプロピレンオキシド、５％のトリアセチン、３０％のナトリウムトリホス フェート、４％のソーダ灰、１５．５％の小さい比率のオキソボレートを含有す るナトリウムパーボレートモノハイドレート、４％のＴＡＥＤ、０．２５％のＥ ＤＴＡ、その０．１％はリン酸として、エーロシル（Ａｅｒｏｓｉｌ）　０．６ ％、ＳＣＭＣ１％、および６％のｐＨを９〜１０の値に調節する。酵素は、突然 変異５００１、あるいは５００３または５ＯＯ４，５Ｏ２１、Ｓ。

３５．５２０１．５２２５．５２２６、または５２３５からなる。

洗浄剤Ｄ５： 本発明の実施態様に従う洗浄剤の粉末を、少なくとも６００ｇ／ｌのかさ密度を 有し、次の成分を含有する粒体の形態で配合する：約２０重量％の界面活性剤、 その約１０％はドデシル硫酸ナトリウムであり、そして残部はシンペロニック（ Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ）　Ａ７およびシンペロニックＡ３（約５．５％〜４．５ ％）の混合物である、およびゼロ中性の無機塩（例えば、硫酸ナトリウム）、＋ ホスフェートのビルダー約３３％、ナトリウムパーボレートテトラハイドレート 約１６％、ＴＡＤＥアクチベーター約４．５％、ケイ酸ナトリウム約６％、およ び炭酸ナトリウムを包含する少量物質的２％、および湿分的１０％、酵素は、突 然変異３００１に従うプロテアーゼ、あるいはプロテアーゼ５００３．５００４ ．３００５、Ｃ００１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４、Ｃ００５、ＣＯＯ８， ５２２３，５２２４，５２２５，５２２６または５２３５からなる。

洗浄剤Ｄ６： 本発明の実施態様に従う洗浄剤の粉末を、少なくとも６００ｇ／ｌ、あるいは約 ５５０　ｇ　／　１のかさ密度を有し、次の成分を含有する粒体の形態で配合す る：約２０重量％、あるいは約１６重量％までに低下する、の界面活性剤、その 約９％、あるいは７％はドデシル硫酸ナトリウム、あるいはナトリウム線状アル キルベンゼンスルホネートであり、そして残部はシンペロニック（Ｓｙｎｐｅｒ ｏｎｉｃ）＾７およびシンペロニックＡ３　（または同様なエトキシレート）（ それぞれ、約５％および６％、あるいは約４％〜７％）の混合物である、および ゼロ中性の無機塩（例えば、硫酸ナトリウム）、＋ゼオライトのビルダー約３０ ％、あるいは約２５％、ナトリウムバーポレートテトラハイドレート、あるいは 七ツバイドレート、約１４％または１５％、ＴＡＤＥアクチベーター約３．６％ 、および炭酸ナトリウムを包含する少量物質的９％、あるいは１５％まで、Ｄｅ ｑｕｅｓｔ”　２０４７約０．７％、および湿分的１０％。酵素は、突然変異５ ００１、あるいは５００３．５ＯＯ４，５００５、Ｃ００１、Ｃ００２、Ｃ００ ３、Ｃ００４、Ｃ００５、Ｃ００８，５２２３，５２２４，５２２５，５２２６ または５２３５に従うプロテアーゼからなる。

洗浄剤Ｄ６ａ： 本発明の実施態様に従う洗浄剤の粉末を、少なくとも６００ｇ／ｌのかさ密度を 有し、次の成分を含有する粒体の形態で配合する：約１５重量％の界面活性剤、 その約７％はナトリウム線状アルキルベンゼンスルホネート、２％の第１アルコ ールサルフエートであり、そして残部はシンペロニック（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ ）　Ａ７または同様なエトキシレート、およびゼロ中性の無機塩（例えば、硫酸 ナトリウム）、＋ゼオライトのビルダー約２２％、ナトリウムパーボレートテト ラハイドレート約１５％、ＴＡＤＥアクチベーター約７％、および炭酸ナトリウ ムを包含する少量物質的１５％までＤｅｑｕｅｓｔ”　２０４７約０．７％、お よび湿分的１０％。酵素は、突然変異５ＯＯＩ、あるいは５００３．３００４． ５００５、Ｃ００１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４、ＣＯＯ５、ｃｏｏｓ、５ ２２３．５２２４．５２２５．５２２６または５２３５に従うプロテアーゼから なる。

洗浄剤Ｄ７： 本発明の実施、ｌ！！様に従う洗浄剤の粉末を、次の成分を含有するように配合 することによって配合するニドデシルベンゼンスルホン酸約６％、Ｃ１２−Ｃｌ ３線状アルコールと７モル１モルのエチレンオキシドとの縮合物、脂肪酸石鹸３ ％、５ｏｋｏｌａｎ”　ＣＰ５ポリマー３％、ゼオライトＡ２２％、炭酸ナトリ ウム１０％、硫酸ナトリウム１７％、粘土粒子８％、ナトリウムパーボレートテ トラハイドレート１３％、テトラアセチル−エチレンジアミン２％、プロテアー ゼ０．５％、少量物質的および水１００％まで、　ｐＨを９〜１０の値に調節す る。

酵素は、突然変異５ｏｏｉ、あるいは３００３．５００４．５００５、Ｃ００１ 、Ｃ００２、ＣＯＯ３、ＣＯＯ４、Ｃ００５、Ｃ００８，５２２３，５２２４， ５２２５，５２２６または５２３５に従うプロテアーゼからなる。

洗浄剤Ｄ８： 本発明の実施Ｓ様に従う洗浄剤（石鹸）の棒を次のように配合する：パン鹸化し た８２％タロウに基づく石鹸、１８％のココナツツオイル、０．１５％のオルト リン酸で中和し、プロテアーゼ（組成物のｌｏｎｇ当たり約８ＧＵ）と混合しそ してギ酸＋トリウム２％、硼砂２％、プロピレングリコール２％および硫酸ナト リウム１％と混合した、を石鹸製造ライン上で圧縮する。酵素は、突然変異５０ ０１、あるいは５００３．５ＯＯ４，５００５、Ｃｏｏｌ、ＣＯＯ２、ＣＯＯ３ 、Ｃ００４、Ｃ００５、ｃｏｏｓ、５０２１．５０２５．５０３５．５２０１． ５２０２．５２２３．５２２４．５２２５．５２２６または５２３５に従うプロ テアーゼからなる。

洗浄剤Ｄ９： 構造化（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）液体洗浄剤は、例えば、ここに記載するプロテ アーゼに加えて、２〜１５％の非イオン界面活性剤、５〜４０％の合計の界面活 性剤、これは非イオンおよび必要に応じてアニオン界面活性剤からなる、５〜３ ５％のホスフェートを含有するか、あるいは含有しないビルダー、０．２〜０． ８％のポリマーの増粘剤、例えば、分子量１０６以上の架橋したアクリルポリマ ー、所望のｐＨ，好ましくはｐＨ９〜１０またはそれ以上、例えば、ｐｎｔｔに 調節するための少なくとも１０％のケイ酸ナトリウム、例えば、中性の水ガラス 、アルカリ（例えば、カリウムを含有するアルカリ）、ナトリウムカチオン：ケ イ素アニオン（遊離シリカとして）（重量による）の比は０．７：１以下であり 、そして粘度は０．３〜３０Ｐａｓ（２０℃および２０ｓ−１において）である 。

適当な実施例は、約５％の非イオン界面活性剤の約５ＥＯ基１モルおよび約２． ７　Ｐ　Ｏ基１モルのでアルコキシル化したＣ１３−Ｃｌ３アルコール、１５〜 ２３％の中性の水ガラス、シリカおよびナトリウムオキシドの重量比３．５．１ ３〜１９％のＫＯＨ，８２３％の５ＴＰＰ、０〜１１％の炭酸ナトリウム、０． ５％のＣａｒｂｏｐｏｌ”　９４１を含有する。

プロテアーゼ（例えば、０．５％）は、突然変異５００１、あるいは３０２１． ５０２５．５０３５．５２０１．５２０２．５２２３．５２２４．５２２５．５ ２２６または５２３５に従うプロテアーゼを包含する。

洗浄剤ＤＩＯ 洗濯の使用に適当な構造化、粘性、水性液体洗浄剤は、次のように配合する（重 量％）： クエン酸　２．５ 硼砂（１０ａ　ｑ）　４ ＮａＯＨ２ グリセロール　５ Ｃ１４−Ｃ１５線状アルキルベンゼン。

スルホネート、またはＣ１４−Ｃｌ３ 第１アルコールサルフエート　６．５ シンベロニツク（Ｓｎｙｐｅｒｏｎｉｃ）Ａ３非イオン性Ｃ１２−Ｃｌ３　３Ｅ Ｏ１，２シンペロニツクＡ７ 非イオン性Ｃ１２−Ｃｌ３　７ＥＯ３，６ゼオライト　２０ プロテアーゼ　０．５ アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ”　３００ＬＤＸ）　０．２少量物質および水　 １００％となる量 ｐＨは９〜１０の値に調節することができる。酵素は、プロテアーゼ突然変異５ ０２０、あるいは３０１９．５Ｏ１２，５００４，５００１，５Ｏ０３，５００ ５，５Ｏ２１，５Ｏ３５，５２０１，５２２３，５２２４，５２２５，５２２６ または５２３５からなる。

洗浄剤Ｄｌｌ 洗濯の使用に適当な等方性水性液体洗浄剤は、次のように配合する（重量％）： クエン酸　２ ホウ酸　ｌ ＮａＯＨ３ Ｋ　ＯＨ４，５ グリセロール　１０ エタノール　６．５ 非イオン性界面活性剤 （Ｃ１２−アルＤ−／Ｉ／６．５ＥＯ エトキシレート基１モル）または ナトリウム第１アルコールサルフエート１０オレイン酸　１６ ココナツツオイル（Ｃ’１２）石鹸　１１ｐＨは９〜１０の値に調節することが できる。酵素は、プロテアーゼ突然変異５０２０、あるいは５ＯＬ９．５０１２ ．３００４．３００１．５００３．５００５．５０２１．５Ｏ２５，５０３５， ５２０１，５２２３，５２２４，５２２５，３０２２６または５２３５からなる 。

洗浄剤ＤＩ２ 水性液体洗浄剤組成物を次の成分を含有するように配合する： ナトリウムアルキルベンゼンスルホネート１４．５Ｃ１８ナトリウム石鹸　２ 非イオン型洗浄剤（ＣＩ２−Ｃ１５６ＥＯ）　９脂肪酸（オレイン酸）４．５ ナトリウムアルケニルスクシネート　１１プロパンジオール　１．５ エタノール　３．６ クエン酸ナトリウム　３．２ 錯化荊、例えば、Ｄｅｑｕｅｓｔ２０６０　０−７プロテアーゼ　０．５ アミラーゼ　０．１ 塩化ナトリウム　０．５ 少量物質および水　１００％となる量 ｐｕは９〜１０の値に調節することができる。酵素は、プロテアーゼ突然変異３ ０２０、あるいは３０１９．３０１２．５００４．５００１．５００３．５００ ５．５Ｏ２１，５２０５，５０３５，５２０１，５２０２，５２２３，５２２４ ，５２２５，５０２２６または５２３５からなる。

洗浄剤Ｄ１３ 水性液体洗浄剤組成物を次の成分を含有するように配合する： ナトリウムアルキルベンゼンスルホネート　８非イオン型洗浄剤６．５ＥＯ１０ オレイン酸ジエチルアミド　１０ 脂肪酸（Ｃ１２／Ｃ１８７５：２５）　１Ｂクエン酸ナトリウム　１ トリエタノールアミン　５ Ｄｅｑｕｅｓｔ２０６０　０．５ プロテアーゼ　０．５ アミラーゼ　０．１ 塩化ナトリウム　０．５ 少量物質および水　１００％となる量 ｐＨは９〜１０の値に調節することができる。酵素は、プロテアーゼ突然変異５ ０２０、あるいは５０１９．５Ｏ１２，５００４，５００１，５００３，５００ ５，３０２１，５２０５，５０３５，５２０１，５２０２，５２２３，５２２４ ，５２２５，５Ｏ２２６または５２３５からなる。

洗浄剤０１４ 非水性液体洗浄剤組成物を次の成分を含有するように配合する： 液状非イオン型洗浄剤 （ＣＩＯ−１２，６，２ＥＯ）　４１ トリアセチン　５ 線状アルキルベンゼンスルホン酸６ 酸化マグネシウム安定剤　１ 炭酸ナトリウムビルダー／塩基　１８ 炭酸カルシウムビルダー　８ 漂白７り−Ｆ−Ｃ−ター’Ｔ’ＡＥＤ　３．５漂白前駆体パーボレートモノハイ ドレート　１０．５部分的疎水性のシリカ　２ プロテアーゼ　０．４ リパーゼ（Ｌｉｏｌａｓｅ”）　３ 少量物質または追加の液状非イオン型 洗浄剤（水なし）　１００％となる量 この組成物の配合において、液状非イオン型洗浄剤およびトリアセチンをまず添 加し、次いで酸化マグネシウム、次いで酵素を除外した他の成分を添加する。こ の混合物をコロイドミルで粉砕し、冷却し、最後に酵素および他の熱感受性少量 勧賞を添加する。

酵素は、プロテアーゼ突然変異５０２０、あるいは５０１９．５０１２．５００ ４．５００１．５ＯＯ３，５００５，５Ｏ２１，５０２５，５Ｏ３５，３２０１ ，５２０２，５２２３，５２２４，５２２５，３０２２６または５２３５からな る。

また、欧州特許（ＢＰ）０３４２１７７号に記載されかつ例示されている洗浄剤 配合物の任意の１つを使用することができる。

また、欧州特許（ＥＰ）０３４２１７７号に例示されている洗浄剤配合物と、洗 浄剤Ｄ３についてのような突然変異と組み合わせて使用することができる。

スフ゛チリシン３０９゛　云　の。立　・７然゛　の部位特異的突然変異は、モ リナガら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　、、　５ｕｐｒａ）の方法により実施 した。突然変異の導入に次のオリゴヌクレオチドを使用した： ａ　）　Ｇ１１９５Ｇｌｕ（Ｇ１９５Ｅ（５００１））：２７マーの不一致のプ ライマー、Ｎｏｒ−２３７、これはまた新規な５ａｃＩ制限部位を発生する：５ ’　ＣＡＣＡＧＴＡＴＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＧＣＡＣ ＣＡＧＧ　３’Ｎｏｒ−２３７５’　ＧＴＡＴＧＧＣＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＡＣ ＡＴＴＴＧＴＣＧＣ３’ａｃ　Ｉ ｂ　）　Ａｒ　１７０　Ｔ　ｒ　（Ｒ１７０Ｙ　（５００３）　：２５マーの不 一致プライマー、Ｎｏｒ−５７７、これはＨａｅＩＩＩ部位を破壊する。

Ｈ並置Ｉ ５’　ＧＣＴＡＴＣＣＧＧＣＣＣＧＴＴＡＴＧＣＧＡＡＣＧＣ３’Ｎｏｒ−５７ ７５’　ＣＧＡＴＡＧＧＣＣＧＴＡＴＡＡＴＡＣＧＣＴＴＧＣＧ　５’ｃ　）　 Ｉｔｓ　１２０　Ａｓ　（Ｈ１２０Ｄユ５ＯＯ６）　）　：３２マーの不一致プ ライマー、Ｎｏｒ−７３５、これは５ｐｈＩ部位を破壊する。

釦ｈＩ−− ５’　ＡＧＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＧＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＡ　 ３’Ｎｏｒ−７３５５’　ＡＧＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＴＴＧＣ ＴＡＡＴＴＴＧＡ　３’ｄ　）　Ｌ　ｓ　２５１　Ｇｌｕ　（Ｋ２５１Ｅ　（Ｓ ＯＯ５））：３２マーの不一致プライマー、Ｎｏｒ−７３６、これはＸｈｏＩ部 位を破壊する。

５’　ＣＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＣ３ ’Ｎｏｒ−７３６５’　ＣＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＴＣＡＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＡ ＣＧＧＣＡＡＣ３’ｈｏ　１ ｅ　）　Ｌ　ｓ　２３　Ｌｅｕ　（Ｋ２３５Ｌ　（Ｓ０１５））：２４７−の不 一致プライマー、Ｎｏｒ７７−８５６、これはＰｓｔＩ部位を破壊する： ５’ＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＡ　３’Ｎｏｒ−８５６ ５’　ＧＣＣＣＴＴＧＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＣＡ　３’５ｔＩ ｆ　）　Ａ、ｒ　１７０　Ｔ　ｒ；Ｇｌ　１９５　Ｇｌｕ（Ｒ１７０Ｙ；Ｇ１９ ５Ｅ（ＳＯＯ４））：Ｎｏｒ−５７７およびＮｏｒ−２３７の組み合わせを上の ように実施した。

ｇ　）　Ｇｌ　１９５　Ｇｌｕ；２５１　Ｇｌｕ　（Ｇ１９５Ｅ；に２５１Ｂ（ ５０１８））：Ｎｏｒ−２３７およびＮｏｒ−７３６の組み合わせを上のように 実施した。

ｈ　）　Ａｒ　１７０　Ｔ　ｒ；Ｌ　ｓ　２５１　Ｇ１１ｌ　（Ｒ１７０Ｙ；に ２５１Ｅ（Ｓｏｉｌ））：Ｎｏｒ−５７７およびＮｏｒ−７３６の組み合わせを 上のように実施した。

Ｎｏｒ−５７７、Ｎｏｒ−２３７およびＮｏｒ−７３６の組み合わせを上のよう に実施した。

ｊ　）　Ｇｌ　１９５　Ｇｌｕ；Ｌ　ｓ　２３５　Ｌｅｕ　（Ｇ１９５Ｅ：に２ ３５Ｌ）：Ｎｏｒ−２３７およびＮｏｒ−８５６の組み合わせを上のように実施 した。

Ｎｏｒ−５７７、Ｎｏｒ−２３７およびＮｏｒ−８５６の組み合わせを上のよう に実施した。

１　）　Ｈｉｓ　１２０　Ａｓ　：　Ｌ　ｓ　２３５　Ｌｅｕ　（Ｈ１２０Ｄ； に２３５Ｌ　（ＳＯ１６））：Ｎｏｒ−７３５およびＮｏｒ−８５６の組み合わ せを上のように実施した。

Ｎｏｒ−７３５、Ｎｏｒ−２３７およびＮｏｒ−８５６の組み合わせを上のよう に実施した。

Ｎｏｒ−７３５、Ｎｏｒ−５７７、Ｎｏｒ−２３７およびＮｏｒ−８５６の組み 合わせを上のように実施した。

Ｎｏｒ−７３５、Ｎｏｒ−５７７、Ｎｏｒ−２３７、Ｎ。

ｒ−８５６およびＮｏｒ−７３６の組み合わせを上のように実施した。

ギャップド二重らせん突然変異誘発をプラスミドｐｓＸ９３、ｐｓＸ１１９、お よびｐｓＸ１２０を使用して実施した。

ｐＳＸ９３は第３図に示し、そしてポリリンカーの中に挿入されたターミネータ −を包含するスジチリシン３０９遺伝子の０．７ｋｂのＸｂａ　ｌ−Ｈｌ　ｎｄ 　Ｉ　Ｉ　Ｉを収容するｐＵｃ１３　（Ｖｉｅｒａ　、　Ｊ、およびＭｅｓｓｉ ｎｇ　、　Ｊ、：Ｇｎｅｎｅ　１９：２５９−２６８）である。

酵素のＮ末端の中に突然変異を導入するために、プラスミドｐｓＸ１１９を使用 した。ｐｓＸ１１９は、ポリリンカーの中に挿入されたスジチリシン３０９遺伝 子のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ　Ｉ断片を収容するｐＵｃ１３である。次いで、鋳型Ｐ ＳＸ９３およびｐｓＸ１１９はスジチリシン３０９遺伝子の全体をカバーする。

ｐｓＸ１２０は、プロテアーゼがａｍｙＭおよびａｍｙＱプロモーターにより発 現される方法で、ｐＤＮ１６８１上のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉの中に、 ｐＳＸ８８からのスジチリシン３０９遺伝子をもつＨｐａ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　 Ｉ　Ｉが挿入された、プラスミドである。ｐＤＮ１６８１は、ａｍｙＱをプロモ ーターとともに有するＢ、ａｓ＋ｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓがらの挿入さ れた２、　８５　ｂｐのＣ１ａＩ断片（ｔａｋｋｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｊ 。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：１００７ｆｆ）をもつｐ　Ｄ　Ｎ　１３８０　（ Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ。

Ｂ、およびＣｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、　Ｌ、：ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　５６：５３−６０）から得られる。ｐｓＸ１２０の構 築は第１図に概説されており、ｐＤＮ１６８１をＥｃｏＲ５およびＨｉｎｄＩＩ Ｉで、ｐｓｘｓｓをＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａｌで切断し、その後結合はａｍ ｙＭおよびａｍｙＱプロモーターにより調節されるＰＳＸ１２０を生ずる。

４つのそれ以上のｐｓＸ１７０、ｐｓＸ１７２、ｐｓＸ１７３、およびｐｓＸ１ ８６を、スジチリシン３０９遺伝子のギャップドニ重らせん突然変異誘発のため に構成した：ＰＳＸ１７０：　５ｐｈｌ−Ｋｐｎｌ、ｐＵｃ１９の中に挿入され たｐｓＸ１２０からの７００ｂｐＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ、成熟スプチリシン３０９ の中のアミノ酸残基１７０からのターミネータ−へ。

−ｐｓＸ１７２：　ＥｃｏＲＩ−３ｐｈｌ、ｐＵｃ１９の中に挿入されたｐｓＸ １２０からの１３６ｂｐ ＥｃｏＲＩ−３ｐｈｌ、成熟スブチリシン３０９の中のプロモーターからアミノ 酸残基１７０へ。

−ｐｓＸ１７３：　ｐｓＸ１７０に似るが、０１９５Ｅをもつ。

ＰＳＸ１８６：　ＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩ、ｐＵｃ１９の中に挿入されたｐｓＸ １２０からの４１ｐｂ ＨｉｎｃＩ−ＥｃｏＲＩ、成熟スブチリシン３０９の中のアミノ酸残基１５から アミノ酸残基２０６へ。

第２図は、ｐｓＸ１２０の多少の詳細な制限地図を示し、プラスミドｐｓＸ１７ ０、ｐｓＸ１７２、ｐｓＸ１７３、およびｐｓＸ１８６の構成にどのプラスミド を使用したかを示す。

突然変異ａ）は、第３図に示しそして節「スブチリシン遺伝子の中の部位特異的 突然変異の発生」および未発行の国際特許公開筒ＰＣＴ／ＤＫ８Ｂ１００００２ 号（ＮＯＶＯＩＮＤＵＳＴＲＩＡ／Ｓ）に記載するような、Ｘｂａ　ＩおよびＣ １ａｌでＰＳＸ９３を切断することによって実施した。

突然変異ｂ）、ｄ）およびｅ）は、対応してｐｓＸ１７０を５ｐｈｌおよびＫｐ ｎｌで切断することによって実施した。

突然変異ｆ）およびｇ）は、上に類似するが、ｐｓＸ１７０の代わりにｐｓＸ１ ７３を使用して実施した。

突然変異Ｃ）は、対応してｐＳＸ１８６をＰｓｔｌおよびＥｃｏＲＩで切断する ことによって実施した。

突然変異ｈ）〜０）はをＤＮＡ断片を単一のまたは二重の突然変異ａ）〜ｇ）と 、制限部位Ｎｈｅ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、Ｃ１ａＩ、Ａｖａ　Ｉ　Ｉ、およびＫｐｎ ｌを適当に使用して、組み合わせることによって構成した。

それ以上の突然変異は、同様な方法または文献から知られている一般の方法を使 用して生成した。

スブチリシンカルスバーグの”林゛ この明細書中で述べたスプチリシンカルスバーグの中の突然変異のある種の実施 例のために、遺伝子のヌクレオチド配列における次の変化を導入した： Ａｓｐ　１４　Ｌｙｓ　（Ｄ１４Ｋ　（Ｃｏｏｌ））　（ＧＡＴ　−＞　ＭＧ） Ａｓｐ　１２０　Ｌｙｓ　（Ｄ１２ＯＫ　（ＣＯＯ２））　（ＧＡＴ　−＞　Ｍ Ａ）Ａｓｐ　１４０　Ｌｙｓ　（ＤＩ４０Ｋ　（ＣＯＯ３）　）　（ＧＡＣ−＞ 　Ｎμ）Ｌｙｓ　２７Ａｓｐ　＋　Ａｓｐ　：Ｌ２０　Ｌｙｓ　（Ｋ２７Ｄ＋Ｄ １２０Ｋ　（ＣＯＯ６））Ａｓｐ　１７２　Ｌｙｓ　（Ｄ１７２Ｋ　（ＣＯＯ８ ））　（ＧＡＣ−＞　ＡＡＡ）Ａｓｐ　１４　Ｌｙｓ　＋　Ａｓｐ　１２０　Ｌ ｙｓ　＋　Ａｓｐ　１４０　Ｉ、ｙｓ　、＋　Ａｓｐ　１７２　Ｌｙｓ（Ｄ１４ に＋Ｄ１２０に＋Ｄ１４０に＋Ｄ１７２Ｋ　（ＣＯＩＯ））Ｖａｌ　５１　Ａｓ ｐ　（Ｖ５１Ｄ　（Ｃ１００））Ｇｌｕ　５４　Ｔｈｒ、（Ｅ５４Ｔ　（ＣＩＯ Ｉ））　（ＧＧＧ　−＞　八ＣＡ）Ｇｌｕ　５４　Ｔｙｒ　（Ｅ５４Ｙ　（Ｃ１ ０２））　（ＧにＧ　−＞　ＴＡＴ）これらの変化は、問題の断片の中の対応す るオリゴを変化させることによって導入した。新しい配列の正しさを確証し、そ の後もとのオリゴをこれらの新しい配列と置換し、そして新しいＤＮＡ断片の中 にアセンブリングした。最後に、断片を新しいスブチリシンカルスバーグ遺伝子 の中に再アセンブリングした。

六然゛　のスブチリシンの 正しい突然変異の配列の確証に引き続いて、突然変異したＤＮＡ断片をプラスミ ドｐＳＸ９２またはｐｓＸ１２０の中に挿入しこれらを突然変異の産生に使用し た。

ｐｓＸ９２を第４図に示し、そして５ｕｂ１０９遺伝子をＣｆａ！で切断したプ ラスミドｐＳＸ６２の中にクリーニンすることによって生成し、ＤＮＡポリメラ ーゼＩのクレノー断片をフィルインし、そしてＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、ク リーニンした５ｕｂ１０９遺伝子からの断片ＤｒａＩ−ＮｈｅＩおよびＮｈｅ　 ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉを挿入した。

突然変異を発現するために、突然変異した断片（Ｘｂａｌ−Ｃ１ａ　Ｉ、Ｘｂａ 　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ、またはＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ）を、それぞれ、適 当な突然変異のプラスミドｐＳＸ９３、ｐｓＸ１１９、ｐｓＸ１７０、ｐｓＸ１ ７２、ｐＳ　Ｘ　］、　７３、およびｐｓＸ１８６から切除し、そしてｐＳＸ９ ２、またはｐｓＸ１２０の中に挿入し、種々の突然変異を発現することができる プラスミドを得た。

次いで、突然変異したｐＳＸ９２またはｐｓＸ１２０を使用して、Ｂ、５ｕｂｔ ｉｌｉｓ　ＤＮ４９７を形質転換した。

次いで、形質転換した細胞を、１０ミリモルのホスフェート、ｐＨ７，６，ｓ／ ｍｌのクロランフェニコール、および０．２％のキシロースを含むＬＢ寒天プレ ート上に広げて、プラスミドの中でｘｙｎ−プロモーターを誘発した。プレート は、また、１％のスキムミルクを含有して、形質転換体を産生ずるプロテアーゼ がスキムミルクが分解した明瞭なハローにより検出することができるようにした 。

適当な成長後、突然変異した酵素を回収し、そして精製した。

スブチリシンカルスバーグ　の 前述したようにＢＰＮ’のための突然変異遺伝子を有する微生物を基礎とするプ ロテアーゼ酵素を産生ずるために、８つの平らなブレードのインペラーおよび８ リツトルの有効体積をもつルシュトン（Ｒｕｓｈｔｏｎ）型ケモファーム（Ｃｈ ｅｍｏｆｅｒｌｌ）発酵器を使用した。ＶＭＴについての安定な安全性と合致す るように発酵器の形状を調製し、そして次の成分から成っていた： ａ　）　０．１バ一ル以上の過圧空気供給をカットオフする圧力コントローラー （４−３１２２型、Ｂｅ１ｌ　＆　Ｈｏｗａｌｌ）。これは排気フィルターの詰 まりを防止するために実施した。

ｂ）底に泡防止を有する２０リツトルの吸引容器から作られたガス出口の泡トラ ツプ。

Ｃ）冷却水またはドアツブ水ドレインの汚染を防止するために、シールをもたな い冷却水ジャケット。

ｄ）絶対的排気フィルターを使用する（Ｇｅｌｍａｎ　ａｃｒｏ　５０．０．４ ５ミクロン）。

ｅ）小さい内部体積をもつサンプリングポンプｄｖｃを経るサンプリング。

コントロール 質量流れメーターを使用して気体の流れをコントロールした（　Ｂｒｏｏｋｓ、 ５８５２型、範囲０〜ＪＯリツトル）。

ハートマン・アンド・ブラウン（Ｈａｒｔｍａｒｉｎ　ａｎｄ　Ｂｒａｕｎ）　 トランスミツターおよびフィルラプス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）のコントローラー（Ｗ 　ｉ　ｔｒｏｔａａ　ｔ）を使用して、ｐＨをコントロールした。濃Ｎａ０Ｈ（ ３モル）を中和剤として使用した。

ウノム（Ｕｎｏｒ）　４Ｎ　（ＣＯ２）およびオキシゴール（Ｏｘｙｇｏｒ）　 ７Ｎ　（０２）（Ｍａｉｈａｋ　、　Ｗｅｓｔｉｎｇｈｏｕｓｅから）を使用し て、排気ガスを分析した。工業的ボラログラフの滅菌可能な酸素プローブ（Ｉｎ ｇｏｌｄ３２２７５６７０２型）を使用して、培地の中の酸素のテンションを決 定した。

ＰＴＩＯＱセンサーおよびハネウェル（Ｈｏｎｅｙｗｅｌ　Ｉ）温度コントロー ラー（クラス８４）を使用して、培地の温度をモニターした０発泡は接触電極を 使用して許容されうるレベルに保持し、その間レベルスイッチは泡防止投与ポン プを作動させた。

すべての外部のコントロールは、ヘラレット・バラカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐ ａｃｋａｒｄ）マイクロコンピュータ−（ＨＰ２２０）のシントロール下に配置 した。

培養条件 回転震盪器（ＬＨ発酵器、ＭＫｘ型）の中で２５　Ｏｒｐｓ＋および３０°Ｃに おいて、震盪フラスコの培養物を１６時間インキュベーションすることによって 、接種物を調製した。実際の発酵器条件（ｐＨ７，０，３０″Ｃ：空気の流れ３ ．５１／分、撹拌機４０００〜４５００ｒｐｍ）においてコンディショニングし ている８リツトルの培地のために、３００ｍ＋１の接種物を使用した。溶解した 酸素の濃度を空気の飽和より２５％上に保持した。使用した発泡防止剤はシリコ ーン油に基づく物質であった（Ｒｈｏｄｏｒｓｔｌ　Ｒ４２６、Ｒｈｏｎｅ　Ｐ ｏｕｌｅｎｃ）。

スブチリシンブロテアーゼの産生 遺伝子の構成下に前述の突然変異遺伝子を含有するＢ、５ｕｂｔｉ１ｉｓ　０８ １０５株を使用して、（突然変異）プロテアーゼを産生じた。培地は次の成分か ら成る：８ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ：４ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４；　４ｇ／ｌのに２Ｈ ＰＯ４；　２Ｐ０４ｇ／ｌのスクロース；；ｐＨ７，０そして１２０℃において ４５分滅菌した。滅菌後、２５ｍｇ／ｌのトリプトファン；２０Ｂ／１のネオマ イシンを添加した。２０〜３０時間後、発酵を停止した。遠心により培地から細 胞を取り出した。

”慾−ｘ−ｙ’チリシンのタンパク　”種々の突然変異のタンパク質分解活性を 、ＤＭＣ法ｓｕｐｒａに従い、タンパク譬ｉｔとしてカゼインに対して試験した 。

結果を表ｖｒに記載する。

この表から理解されるように、突然変異（３００５）は親（３０００）と比較し てわずかに増大しまた活性を示すが、これに対して残りの突然変異はわずかに減 少した活性を示す。

表ユし 又型車１λブｌニシンのタンパク　町 突然変異　反応性 なしく５ＯＯＯ）　１００ ＳＯＯＩ　９５ ０Ｏ３９０ ＳＯ０４８５ ＳＯＯ６１００ Ｓ０１２　８０ ＳＯ１９７０ ＳＯ２０７５ Ｓ０２４　７０ ″′然゛　スブチｉシンのパ′ Ａ： ｐＨ８，１４の標準の液体洗浄剤の中の種々の突然変異の洗浄性能を、上に詳述 した方法に従い、草のジュースに対して、モデル系において試験した。結果を表 ■に記載する。

１、Ｏｔａｇ／　ｌ　１０．ＯＢ／　ｌ５ｏｏｏ　４．０　１０．７ ＳＯＯＩ　５．９　１２．８ ＳＯＯ３６，０１３，５ ５００４５，８１３，０ ＳＯ１２４，２９，６ Ｓ０１９　１０．５　１９．４ ｓ０２０　９．４　１８．に の表から理解されるように、試験した突然変異のすべては、野生型の親の酵素と 比較して改良されたまたは等しい性能を示した。突然変異３０１９および３０２ ０の洗浄性能は改良されるので、１．０　ｗａｇ／　１のこれらの酵素はおおよ そ１０゜（１＋ｇ／ｌの野生型親酵素の代わりに使用され、これにより本発明の 突然変異の酵素についての洗浄性能の実質的な改良を示す。

Ｂ： モデルの系中の種々のｐＨ値における変更した商業的ＵＳ液体洗浄剤中の本発明 の酵素変異型のあるものの試験からの結果を、表Ｖｌに示す。

１−豆 なるＩＩにおしる２゛　脂 突然変異　デルタＲ ｐ工。ｐＨ８，０９，０１０，０１１，０ＳＯＯＯ１０，０２１４２，６３，１ １０，１Ｓ００１　９．８６　２．１　４．０　６．６　１４．０５００３　９ ．８６　２．＞　５．０　８．１　１４．１５００４　９．６８　４．１　９． ７　１ｍ、７　１０．９Ｓ００５　．９．７１　２．２　４．３　６．３　１３ ＪＳ０１２　９．０９　５．７　１１．９　１１８　６．３５０１９　９．０９ 　６．４　１０．７　１２．２　３．１５０２０　６、）ｌ　７．８　１０．６ 　Ｌ５　２．４結果が明瞭に示すように、酵素の洗浄性能のために最適なｐＨを シフトさせて洗浄液のｐＨに近付けようとする方向に、酵素のｐｒをシフトとさ せると、酵素の洗浄性能は改良される。

種々の突然変異の洗浄性能は、アッセイＡに記載する方法に従い、草のジュース で汚した綿のクロスに対して試験した。

２、０　ｇ　／　ｌの液体洗浄剤（洗浄剤Ｄ３）を使用した。洗浄剤をイオン交 換した水中に溶解した。ｐＨをＮａＯＨ／ＨＣＩで９．１に調節した。

温度を２０°Ｃの等温に１０分間保持した。

突然変異は０．２５　；　０．５　；　１．０　；　２．０　；　５．０　；お よび１０゜０ｍｇの酵素タンパク質／ｌ各々で投与した。

試験の突然変異の安定性は、差動走査熱量計、ＤＳＣにより変性温度（最大の過 剰の熱量）を測定することによって決定した。

安定性は、その組成がアッセイＡに記載されている、９１％の標準の液体洗浄剤 の中にほぼ２Ｂ／ｍｌの突然変異を含有する溶液の中で試験した。この溶液は、 １００ｍ１の酵素溶液（０，０１モルのジメチルグルタル酸、０．００２モルの ＣａＣ１！、０．２モルのＨ，ＢＯ，および０〜０．１モルのＮａＣ１の緩衝液 、ｐＨ６，５、の中のほぼ２０ａ＋ｇの酵素／＋＋＋１）を１０００μｌの標準 の液体洗浄剤と混合することによってつくった。

スブチリシン３０９の突然変異の群の範囲内で、ＤＳＣにより得られた安定性の 結果は、伝統的貯蔵安定性の試験により得られた安定性と一致する。

結果 液体洗浄剤の中の種々の突然変異の洗浄性能を表ＶＩＩに記載されている。結果 は野生型の親の酵素に関する改良ファクターとして示されている。改良ファクタ ーはアッセイＣにおけるように定義される。

また、表■に、ＤＳＣによる標準の液体洗浄剤の中の変性温度、および野生型の 親の酵素の変性温度と問題の突然変異のそれとの間の差が示されている。

ｌ」旦 ５０００　１０．０６　１　６５．２　０．０Ｓ　０２０　７．３０　７．６　 ５８．２　−７．０Ｓ　０２１　９．８５　１．３　６９．２　＋４．０Ｓ　０ ２２　８．０７　９．３　６１．９　−３．３Ｓ　０２３　８．０５　Ｂ、８　 ６３．５　−１．７Ｓ　０２４　６．８６　３．９　６０．６　−４．６Ｓ　０ ２５　８．９４　６，７　６９．１　＋３．９Ｓ　０３５　８．０７　７．０　 ７２．５　＋７．３Ｓ　２０１　９．８５　１．４　６９．４　＋４．２表ＶＩ Ｉから理解されるように、試験した突然変異のすべての野生型の親の酵素と比較 して改良された洗浄性能を示す。

最良の洗浄性能は、洗浄溶液のｐＨに等しいか、あるいはそれよりちょうど低い ＰＩ６を有する突然変異により達成される。

ＤＳＣによる変性温度が示すように、単一の突然変異５０２１（＋３６Ｄ）およ び５２０１　（Ｎ７６Ｄ）の安定性は、野生型の親の酵素に関して、それぞれ、 ４．０°Ｃおよび４．２　”Ｃだけ増加する。

表Ｖｌｌに記載されている突然変異の１または２以上を組み込んだ突然変異の間 で、突然変異Ｒ１７０Ｙおよびに２５１Ｅは突然変異を野生型の親の酵素に関し て脱安定化するが、これに対して突然変異　Ｈ１２０Ｄ、Ｇ１９５Ｅおよびに２ ３５Ｌは安定性に関して普通である。

表ＶＩＩから理解されるように、１つの脱安定性突然変異を含有する突然変異は 、安定化突然変異を含める場合においてさえ、脱安定化される。

＊３６ＤおよびＮ７６Ｄの安定化効果は加法的である。これは突然変異５Ｏ２５ および５Ｏ３５により示される。５Ｏ２５は安定性および安定化突然変異＊３６ Ｄに対して普通である、３つの突然変異を含有する。５０２５についての変性温 度は、野生型の親の酵素のそれに関して３．９°Ｃだけ増加し、これは単一の＊ ３６Ｄ、５Ｏ２１について測定した増加に等しい。５０３５は同一突然変異Ｎ７ ６Ｄを含有する。５Ｏ３５についての変性温度は、野生型の親の酵素に関して７ ．３℃だけ増加し、これは、実験誤差の範囲内で、単一の突然変異＊３６Ｄ、５ Ｏ２１およびＮ７６Ｄ、５２０１について測定した増加の合計に等しい。

Ｅ。

３つの突然変異の洗浄性能を、アッセイＡに記載する方法に従い、草のジュース で汚した綿のクロスに対して試験した。

２．０ｇ／ｌの液体洗浄剤Ｄ３を使用した。洗浄剤をイオン交換した水中に溶解 した。ｐＨをＮａＯＨ／ＨＣＩで９．１に調節した。

温度を３０℃の等温に１０分間保持した。突然変異は１．０および１０．０ｍｇ の酵素タンパク質／ｌ各々で投与した。

結果 商業的ＵＳ液体洗浄剤の中の３つの突然変異の洗浄性能を表ＶＩＩＩに記載され ている。

表ＶＩＩＩ Ｓ　０００　１０．０６　４．５　１３．６Ｓ　００３　９．７５　９．４　１ ８．０Ｓ　００４　９．５４　１３．７　１８．１Ｓ　００６　９．８５　６． ０　１５．６表ＶＩＩＩから理解されるように、突然変異のすべては野生型の親 の酵素と比較して改良された洗浄性能を示す。さらに、理解されるように、最良 の洗浄性能は、洗浄溶液のｐＨに最も近いｐＩ。を有する突然変異により達成さ れる。

置 洗浄剤Ｄ３の中の２つの突然変異の洗浄性能を、草のジェす。

鷹−」Ｎ Ｓ　０００　１０．０６　５．８　１５．３Ｓ　０１５　９．９５　Ｂ、４　２ ０．０Ｓ　０１７　９．４０　１？、０　２０．８表ＩＸから理解されるように 、突然変異のすべては野生型の親の酵素と比較して改良された洗浄性能を示す。

さらに、理解されるように、最良の洗浄性能は、洗浄溶液のｐＨに最も近いＰＩ ｏを有する突然変異により達成される。

Ｇ。

種々の突然変異の洗浄性能を、アッセイＡに記載する方法に従い、草のジュース で汚した綿のクロスに対して試験した。

２．０ｇ／ｌの液体洗浄剤Ｄ３を使用した。

洗浄剤を緩衝液（イオン交換した水中で調製した０、　００２５モルのホウ酸お よび０．００１モルの２ナトリウム水素ホスフエート）中に溶解した。　ｐＨを ＮａＯＨ／ＨＣＩで、それぞれ、７．０．８．０．９．０および１０．０に調節 した。温度を３０℃の等温に１０分間保持した。

突然変異は０．２ａ＋ｇの酵素タンパク質／１各々で投与した。

結果 モデル系の中の種々のｐＨ値において本発明の酵素変異型のいくつかの洗浄性能 を表Ｘに示す。

変異体　突然変異　デルタＲ ５０１５Ｋ２３５Ｌ　９．９５　１．３　２．４　６．０８−８Ｓ０２１　★コ ロＤ　９．８５　２．１　３−２　・５．６　８．３に２１５Ｌ　、　８．９５ 　４．コ　９．５　１３．９１：１．１５０２３　＊３６Ｄ、Ｔ（１２００，Ｒ １７０Ｙ。

Ｇ１９５Ｅ、に２］５Ｌ　８．０５　９．６　１コ、０　１２．４９．２５０２ ４　＊３６Ｄ、）（１２００，Ｒ１７０Ｙ。

Ｇ１９５Ｅ、’に２コ５１，４２５］−Ｅ　６．８６　９’、４　１．０．４　 ６．７　４．８表Ｘから明瞭に理解されるように、プロテアーゼのｐｒを洗浄液 のｐＨに向けてシフトさせると、プロテアーゼの洗浄性能を改良する。

結果が、また、示すように、試験したすべての変異型はｐＨ１０，０以下におい て野生型の親の酵素と比較して改良された性能を有する。

Ｈｏ 種々の突然変異の洗浄性能を、アッセイＡに記載する方法に従い、草のジュース で汚した綿のクロスに対して試験した。

２、０　ｇ　／　Ｉの液体洗浄剤Ｄ３を使用した。洗浄剤をイオン交換した水中 で調製した０、　００５モルのグリシン中に溶解した。ｐＨをＮａＯＨで、それ ぞれ、１０．０．１０．２５．１０．５０．１０．７５．１１．０．１１．５、 および１２．０に調節した。

温度を３０°Ｃの等温に１０分間保持した。

突然変異は０．２ｍｇの酵素タンパクｉｔ／ｌ各々で投与した。

結果 モデル系の中の種々のｐＨ値において本発明の酵素変異体のいくつかの洗浄性能 を表ＸＩに示す。この場合において、野生型の親の酵素よりわずかに高いｐｌを もつ変異体を研究した。

ｐＨ１０，０〜１２．０のｐＨ範囲を、前の実施例より詳細に研究する。

１−９は ５ＯＯＯ１０，０６７，０８，７１０，５ＳＯ２７Ｅ８９Ｓ　１０．２８　６． ０　Ｂ、５　９．８ＳＯ２８Ｄ１８１Ｎ　１０．２８　６．９　９，８　１０． ６ＳＯ３２０１９７Ｎ　１０．２８　４．７　９．２　１０．８Ｓ０３３　Ｅ２ ７ＩＱ　１０．２８　７．１　６．７　７．８ＳＯ３１０１９７Ｎ、Ｅ２７１Ｑ 　１０．５３　４．７　７．２　７．０変異体　突然変異　デルタＲ ｐＩｏ　ｐＨ１０，７５１１，０１１，５１２，０３０００１０，０６１２，５ １４，４１０，６３，８ＳＯ２７Ｅ８９Ｓ　１０．２８　１１．９　１４．３　 １２．８　５．０５０２８　Ｄ１８１Ｎ　１０．２８　１３．０　１４．４　１ ０．７　４．６Ｓ０３２　Ｄ１９７Ｎ　１０．２８　１３．８　１３．５　１１ ．３　５．０ＳＯ３３Ｅ２７１Ｑ　１０．２８　１０．４　１３．７　１３．３ 　６．３ＳＯ３１０１９７Ｎ、Ｅ２７１Ｑ１０．５３　１０．７　１３．０　１ ４．４　８．７表ＸＩ中のデータが示すように、高いｐＨ値において、最大の性 能は計算したｐＩよりわずかに上のｐＨ値において達成される。プロテアーゼの ｐＴのなお増加すると、最大の性能のｐＨは増加する。効果は、低いｐＨ値（ア ッセイＢおよびＧ）において見られるほど顕著ではない。

Ｉ　ニ プロテアーゼの等電点とプロテアーゼがその最大の性能を有するｐＨとの間の相 関関係を可視化するために、実施例８１Ｇ、およびＨからの結果を使用して、研 究した変異型（および野生型の親の酵素）の各々がその最大の性能を有するｐＨ を見いだす。第５図において、このｐＨ＋＊ａｘは計算したＰＩＧの関数として 示す。

ｐＨ範囲を１．０のｐＨ値のステップで研究することを考慮すると、相関関係は 明らかである。

本発明の突然変異とリパーゼとの組み合わせに関すると、実験結果は次の実際的 結論に導いた： リパーゼは０型の洗浄液中で３７°Ｃにおいて１時間安定であった。５ａｖｉｎ ａｓｅ”　ｎｏ存在は急速に不活性化にに導いた。　Ｋａｚｕｓａｓｅ”は試験 期間にわたってリパーゼの実質的に少ない不活性化にに導いた。

プロテアーゼには、５ａｖｉｎａｓｅ”より攻撃的でないが、Ｋａｚｕｓａｅ” より攻撃的である。しかしながら、スプチリシンＢＰＮ’　はこれらの条件下に リパーゼをまったく不活性化しなかった。

例えば、０型で表される洗浄組成物中のリパーゼと組み合わせて、使用するため に好ましいプロテアーゼは、突然変異５００１．５００３．５Ｏ０４，５０１２ ，５０１９，５Ｏ２０，５０２１，５０２５，５０３５，５２３５である。

０型洗浄液は、次の洗浄剤の配合（重量％）から誘導された、３７°Ｃの５　ｇ 　／　ｌの溶液であった：アニオン性界面活性剤　６ 非イオン性界面活性剤　５ 脂肪酸　２．８ アクリルポリマー　３ ゼオライト　２２ 炭酸塩　１０ 硫酸塩　１７．５ 粘土　８ 第３アミン　２ パーボレートモノハイドレート　１３ 少量物質および水を添加して　１００ 例えば、Ｗ型で表される洗浄組成物中のリパーゼと組み合わせて、使用するため に好ましいプロテアーゼは、突然変異５０２０．５０２１．５０２５．５０３５ ．５２３５である。

Ｗ型洗浄液は、次の液体洗浄剤の配合（重量％）から誘導された、３７°Ｃの２ ｇ／ｌの溶液であった：アニオン性界面活性剤　１６ 非イオン性界面活性剤　７ ヒドロトロープ　６ クエン酸　６．５ Ｎ　ａ　ＯＨ４，１ モノエタノールアミン　２ 少量物質および水を添加して　１００ 本発明をその種々の特定の実施態様に関して論じそして例示したが、本発明はそ の応用およびその開示に限定されると解釈すべきでなく、上にならびに添付した 請求の範囲において述べかつ記載した特徴のすべての組み合わせおよび下位の組 み合わせに拡張される。

浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 手続補正書（方式） ％式％ ■、事件の表示 ＰＣＴ／ＤＫ９０１０　Ｏ１６４ λ　発明の名称 突然変異したスブチリシンプロテアーゼ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ノボノルディスクアクティーゼルスカブ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話３５０ ４−０７２１５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （３）委任状 （４）図面の翻訳文 ７、補正の内容 （ＩＮ３）別紙の通り （２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （４）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１　通 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各　１　通（３）委任状及びその翻訳文 　各　１　通（４）図面の翻訳文　１　通 国際調査報告 、□−７−１．。、、ｌｌｍ−＋１．−．１−ｈ−ＰＣＴ／ｆｆＦ　９０１００ １６４国際調査報告 Ｔｈ□１ｔＩＩＩＩｏｒ１１１１１１ｈＰｅ＋＋ｅ＋Ｉｊａｍ−喝ｖｍｅｍｂｐ ＋ｖｒｅ釉＋：ｎ＠ｔｏ＋ｈｅｏｗｐｍｍｘｕｖｈｅ＋＋書窒■{畷ｔｄ−ｎ＋ ＋ｖａゎ−ＩＶｌｌ１１ｅｌｌ管噂＋１＠ｄ１ｍｌ＋＋＋ｓｉＭｊｌＮｅｙｒｈ ＋ｅｐｅｒ＋ＩＭ　ＩＩｌｍｂｔｌｌ　８１１８１　Ｌ６ＮａｌＲＮ　Ｉｎ　Ｉ ＮＩ　Ｓｗｅｄｌｌｈ　Ｐａ！、−＋ｏ＋＋、、−ｔｏｐ＋、−，，９Ｏ|０８ −２８ Ｔｈｅ　＄＋ｔｄｌｌｈｊｌｌｔ−ｎｌ　０１ｌｌＣｆ　ＩＮ　１６　Ｒｅ　ｗ ａｙ　ｌ＋Ｉｂｌ＃　ｌｏ＜　＋ｍｉｔ　＊ａｒｂ＋ｔ＋ｎ香@５ｌｕｓｈ　８ １９１１菅＋ｅｌｙ　＠ｌ＋ｅＭ　１６１１Ｍ　Ｍ＋１１１１１１１　ｏｌ　１ ＮＩ６ｊＭ訃ｅａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．正味の静電荷が同一ｐＨにおいて親のプロテアーゼに比較して変化している 、例えば、突然変異したスプチリシンプロテアーゼの中に、前記親のプロテアー ゼに関して、より少ないまたはより多い正に帯電したアミノ酸残基および／また はより多いまたはより少ない負に帯電したアミノ酸残基が、アミノ酸残基の間で 、１または２以上の位置；１．２．３．４．６．９．１０．１２．１４．１５． １７．１８．１９．２０．２１．２２．２４．２５．２７．３６．３７．３８． ４０．４１．４３．４４．４５．４６．４９．５０．５１．５２．５３．５４． ５５．５６．５７．５８．５９．６０．６１．６２．７５．７６．７７．７８． ７９．８７．８９．９１．９４．９７．９８．９９．１００．１０１．１０３． １０４．１０５．１０６．１０７．１０８．１０９．１１２．１１３．１１５． １１６．１１７．１１８．１２０．１２６．１２８．１２９．１３０．１３１． １３３．１３４．１３６．１３７．１４０．１４１．１４３．１４４．１４５． １４６．１５５．１５６．１５８．１５９．１６０．１６１．１６２．１６３． １６４．１６５．１６６．１６７．１７０．１７１．１７２．１７３．１８１． １８２．１８３，１８４．１８５．１８６，１８８．１８９．１９１．１９２． １９４．１９５．１９７．２０４．２０６．２０９．２１０．２１１．２１２． ２１３．２１４．２１５．２１６．２１７．２１８．２３５．２３６．２３７． ２３８．２３９．２４０．２４１．２４２．２４３．２４４．２４５．２４７． ２４８．２４９．２５１．２５２．２５３．２５４．２５５．２５６．２５７． ２５９．２６０．２６１．２６２．２６３．２６５．２６９．２７１．２７２． ２７５． に、示した位置に隣接する欠失、置換または押入（単一または多数）により、存 在し、これにより前記スブチリシンプロテアーゼは前記親のプロテアーゼのそれ より低い等電点（ｐＩｏ）を有することを特徴とする、突然変異したスプチリシ ンプロテアーゼ。 ２．正味の静電荷が同一ｐＨにおいて親のプロテアーゼに比較して変化している 、例えば、突然変異したスブチリシンプロテアーゼの中に、前記親のプロテアー ゼに関して、より多いまたはより少ない正に帯電したアミノ酸残基および／また はより少ないまたはより多い負に帯電したアミノ酸残基が、アミノ酸残基の間で 、１または２以上の位置；１．２．３．４．６．９．１０．１２．１４．１５． １７．１８．１９．２０．２１．２２．２４．２５．２７．３６．３７．３８． ４０．４１．４３．４４．４５．４６．４９．５０．５１．５２．５３．５４． ５５．５６．５７．５８．５９．６０．６１．６２．７５．７６．７７．７８． ７９．８７．８９．９１．９４．９７．９８．９９．１００．１０１．１０３． １０４．１０５．１０６．１０７．１０８．１０９．１１２．１１３．１１５． １１６．１１７．１１８．１２０．１２６．１２８．１２９．１３０．１３１． １３３．１３４．１３６．１３７．１４０．１４１．１４３．１４４．１４５． １４６．１５５．１５６．１５８．１５９．１６０．１６１．１６２．１６３． １６４．１６５．１６６．１６７．１７０．１７１．１７２．１７３．１８１． １８２．１８３．１８４．１８５．１８６．１８８．１８９．１９１．１９２． １９４．１９５，１９７．２０４．２０６．２０９．２１０．２１１．２１２． ２１３．２１４．２１５．２１６．２１７．２１８．２３５．２３６．２３７． ２３８．２３９．２４０．２４１．２４２．２４３．２４４．２４５．２４７． ２４８．２４９．２５１，２５２．２５３．２５４．２５５．２５６．２５７． ２５９．２６０．２６１．２６２．２６３．２６５．２６９．２７１．２７２． ２７５． に、示した位置に隣接する欠失、置換または挿入（単一または多重）により、存 在し、これにより前記スブチリシンプロテアーゼは前記親のプロテアーゼのそれ より低い等電点（ｐＩｏ）を有することを特徴とする、突然変異したスブチリシ ンプロテアーゼ。 ３．位置の群 １．２．３．４．１４．１５．１７．１８．２０．２７．４０．４１．４３．４ ４．４５．４６．５１．５２．６０．６１．６２．７５．７６．７８．７９．９ １．９４．９７．１００．１０５．１０６．１０８．１１２．１１３．１１７． １１８．１２９．１３０．１３３．１３４．１３６．１３７．１４１．１４３． １４４．１４５．１４６．１６５．１７３．１８１．１８３．１８４．１８５． １９１．１９２．２０６．２０９．２１０．２１１．２１２．２１６．２３９． ２４０．２４２．２４３．２４４．２４５．２４７．２４８．２４９．２５１． ２５２．２５３．２５５．２５６．２５７．２５９．２６３．２６９．２７１． ２７２．から選択される１つの位置を占有するアミノ酸残基に影響を与える少な くとも１つの突然変異を有することを特徴とする、請求の範囲第１または２項記 載の記載のプロテアーゼ。 ４．位置の群 １．２．３．４．１４．１５．１７．１８．２０．２７．４０．４１．４３．４ ４．４５．４６．５１．５２．６０．６１．６２．７５．７６．７８．７９．９ １．９４．９７．１００．１０５．１０６．１０８．１１２．１１３．１１７． １１８．１２９．１３０．１３３．１３４．１３６．１３７．１４１．１４３． １４４．１４５．１４６．１６５．１７３．１８１．１８３．１８４．１８５． １９１．１９２．２０６．２０９．２１０．２１１．２１２．２１６．２３９． ２４０．２４２．２４３．２４４．２４５．２４７．２４８．２４９．２５１． ２５２．２５３．２５５．２５６．２５７．２５９．２６３．２６９．２７１． ２７２．から選択される１つの位置を占有するアミノ酸残基に影響を与える少な くとも１つの突然変異および位置の群１．２．３．４．６．９．１０．１２．１ ４．１５．１７．１８．１９．２０．２１．２２．２４．２５．２７．３６．３ ７．３８．４０．４１．４３．４４．４５．４６．４９．５０．５１．５２．５ ３．５４．５５．５６．５７．５８．５９．６０．６１．６２．７５．７６．７ ７．７８．７９．８７．８９．９１．９４．９７．９８．９９．１００．１０１ ．１０３．１０４．１０５．１０６．１０７．１０８．１０９．１１２．１１３ ．１１５．１１６．１１７．１１８．１２０．１２６．１２８．１２９．１３０ ．１３１．１３３．１３４．１３６．１３７．１４０．１４１．１４３．１４４ ．１４５．１４６．１５５．１５６．１５８．１５９．１６０．１６１．１６２ ．１６３．１６４．１６５．１６６．１６７．１７０．１７１．１７２．１７３ ．１８１．１８２．１８３．１８４．１８５．１８６．１８８．１８９．１９１ ．１９２．１９４．１９５．１９７．２０４．２０６，２０９．２１０．２１１ ．２１２．２１３．２１４．２１５．２１６．２１７．２１８．２３５．２３６ ．２３７．２３８．２３９．２４０．２４１．２４２．２４３．２４４．２４５ ．２４７．２４８．２４９．２５１．２５２．２５３．２５４．２５５．２５６ ．２５７．２５９．２６０．２６１．２６２．２６３．２６５．２６９．２７１ ．２７２．２７５． から選択される１つの位置を占有するアミノ酸残基に影響を与える少なくとも１ つのそれ以上の突然変異を有することを特徴とする、請求の範囲第１〜３項のい ずれかに記載のプロテアーゼ。 ５．突然変異： ▲数式、化学式、表等があります▼ の１または２以上を含有することをさら特徴とする、請求の範囲第１〜４項のい ずれかに記載のプロテアーゼ。 ６．突然変異したスブチリシンプロテトゼは突然変異：▲数式、化学式、表等が あります▼の１または２以上からなることをさらに特徴とする、請求の範囲第１ 〜６項のいずれかに記載のプロテアーゼ。 ７．位置３６に挿入突然変異を有することを特徴とする、突然変異したスブチリ シンプロテアーゼ。 ８．位置３６に負に帯電したアミノ酸残基、例えば、＊３６Ｄまたは＊３６Ｅを 与える挿入突然変異を有することを特徴とする、請求の範囲第７項記載のプロテ アーゼ。 ９．挿入突然変異は中性のアミノ酸残基、例えば、中性の極性残基、例えば、＊ ３６Ａ、＊３６Ｑ、または＋３６Ｎ、または正に帯電したアミノ酸残基、例えば 、＊３６Ｒまたは＊３６Ｋを提供することを特徴とする、請求の範囲第７項記載 のプロテアーゼ。 １０．位置１２０、１７０、１９５、２３５、および２５１の１または２以上に それ以上の突然変異、例えば、＊３６ＤおよびＨ１２０Ｄ、Ｒ１７０Ｙ、Ｇ１９ ５Ｅ、Ｋ２３５Ｌ、およびＫ２５１Ｅの１または２以上；または＊３６Ｇまたは ＊３６ＥおよびＨ１２０Ｄ、Ｒ１７０Ｙ、Ｇ１９５Ｅ、Ｋ２３５Ｌ、およびＫ２ ５１Ｅの１または２以上を有することを特徴とする、請求の範囲第７項記載のプ ロテアーゼ。 １１．位置７６にそれ以上の突然変異を有して、例えば、位置７６における負に 帯電したアミノ酸残基、例えば、Ｎ７６ＤまたはＮ７６Ｅを置換することを特徴 とする、請求の範囲第７項記載のプロテアーゼ。 １２．位置１２０、１７０、１９５、２３５、および２５１の１または２以上に それ以上の突然変異、例えば、＊３６Ｄ十Ｎ７６ＤおよびＨ１２０Ｄ、Ｒ１７０ Ｙ、Ｇ１９５Ｅ、Ｋ２３５Ｌ、およびＫ２５１Ｅの１または２以上；または＊３ ６Ｑ＋Ｎ７６Ｄまたは＊３６Ｅ＋Ｎ７６ＤおよびＨ１２０Ｄ、Ｒ１７０Ｙ、Ｇ１ ９５Ｅ、Ｋ２３５Ｌ、およびＫ２５１Ｅの１または２以上を有することを特徴と する、請求の範囲第１１項記載のプロテアーゼ。 １３．プロテアーゼ分子の中のどこかに、例えば、位置２１３に正の帯電を与え るそれ以上の突然変異、例えば、Ｔ２１３Ｋを有することをさらに特徴とする、 請求の範囲第７項記載のプロテアーゼ。 １４．突然変異したスブチリシンプロテアーゼの触媒のトリアドから１５オング ストロームより大きい距離にある１または２以上のアミノ酸残基は、その親の酵 素のアミノ酸配列と比較して、かつ、等電点、ｐＩｏ、を有する突然変異のプロ テアーゼを提供する方法で、変化しており、前記等電点、ｐＩｏ、は前記突然変 異したプロテアーゼの洗浄性能について最適にｐＨをシフトしようとするのと同 一方向にシフトしている、ことを特徴とする、突然変異したスブチリシンプロテ アーゼ。 １５．親のプロテアーゼのそれより小さい等電点（ｐＩｏ）を有し、そして親の プロテアーゼに関して、活性部位、ことに位置１７０、１２０、または１９５に おける活性部位、から抗体１５〜２０オングストロームの領域内に位置する少な くとも１つのアミノ酸残基の部位に、正に帯電したアミノ酸残基の除去または負 に帯電したアミノ酸残基の添加に等しい１または２以上の突然変異を有する、こ とを特徴とする、請求の範囲第１〜１４項のいずれかに記載のプロテアーゼ。 １６．スブチリシンＢＰＮ′、スブチリシンアミロサッカリチクス、スブチリシ ン１６８、スブチリシンメセンテリコペプチダーゼ、スブチリシンカルスバーグ （Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、スブチリシンＤＹ、スブチリシン３０９、スブチリシ ン１４７、サーミターゼ、アクアリシン、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＰＢ ９２プロテアーゼ、プロテアーゼＫ、プロテアーゼＴＷ７、およびプロテアーゼ ＴＷ３から選択される親酵素の突然変異を表す、ことをさらに特徴とする、請求 の範囲第１〜１５項のいずれかに記載のプロテアーゼ。 １７．親スブチリシンはスブチリシン３０９である、ことをさらに特徴とする、 請求の範囲第１６項記載のプロテアーゼ。 １８．親スブチリシンはスブチリシン１４７である、ことをさらに特徴とする、 請求の範囲第１６項記載のプロテアーゼ。 １９．親スブチリシンはスブチリシンカルスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）であ る、ことをさらに特徴とする、請求の範囲第１６項記載のプロテアーゼ。 ２０．親スブチリシンはバチルス属（Ｂａｃｉ１１ｕｓ）ＰＢ９２プロテアーゼ である、ことをさらに特徴とする、請求の範囲第１６項記載のプロテアーゼ。 ２１．考える突然変異酵素の中の計算した正味の静電荷（＝ＮＥＣ）が同一ｐＨ 値において計算した選択の親酵素の中のＮＥＣに比較して変化していることを特 徴とする、親酵素の中の１または２以上のアミノ酸のために欠失、置換または挿 入すべき１または２以上の位置および１または２以上のアミノ酸を決定または選 択する方法。 ２２．選択するアミノ酸残基は前記親酵素の表面にまたはその付近に位置する、 ことをさらに特徴とする、請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３．選択するアミノ酸残基は、位置 １．２．３．４．６．９．１０．１２．１４．１５．１７．１８．１９．２０． ２１．２２．２４．２５．２７．３６．３７．３８．４０．４１．４３．４４． ４５．４６．４９．５０．５１．５２．５３．５４．５５．５６．５７．５８． ５９．６０．６１．６２．７５．７６．７７．７８．７９．８７．８９．９１． ９４．９７．９８．９９．１００．１０１．１０３．１０４．１０５．１０６． １０７．１０８．１０９．１１１２．１１３．１１５．１１６．１１７．１１８ ．１２０．１２６．１２８．１２９．１３０．１３１．１３３．１３４．１３６ ．１３７．１４０．１４１．１４３．１４４．１４５．１４６．１５５．１５６ ．１５８．１５９．１６０．１６１．１６２．１６３．１６４．１６５．１６６ ．１６７．１７０．１７１．１７２．１７３．１８１．１８２．１８３．１８４ ．１８５．１８６．１８８．１８９．１９１．１９２．１９４．１９５．１９７ ．２０４．２０６．２０９．２１０．２１１．２１２．２１３．２１４．２１５ ．２１６．２１７．２１８．２３５．２３６．２３７．２３８．２３９．２４０ ．２４１．２４２，２４３．２４４．２４５．２４７．２４８．２４９．２５１ ．２５２．２５３．２５４．２５５．２５６．２５７．２５９．２６０．２６１ ．２６２．２６３．２６５．２６９．２７１．２７２．２７５． の１または２以上におけるアミノ酸残基の中から選択する、ことをさらに特徴と する、請求の範囲第２１または２２項記載の方法。 ２４．選択するアミノ酸残基は、位置 １．２．３．４．６．９．１０．１２．１４．１５．１７．１８．１９．２０． ２１．２２．２４．２５．２７．３６．３７．３８．４０．４１．４３．４４． ４５．４６．４９．５０．５１．５２．５３．５４．５５．５６．５７．５８． ５９．６０．６１．６２．７５．７６．７７．７８．７９．８７．８９．９１． ９４．９７．９８．９９．１００．１０１．１０３．１０４．１０５．１０６． １０７．１０８．１０９．１１２．１１３．１１５．１１６．１１７．１１８． １２０．１２６．１２８．１２９．１３０．１３１．１３３．１３４．１３６． １３７．１４０．１４１．１４３．１４４．１４５．１４６．１５５．１５６， １５８．１５９．１６０．１６１．１６２．１６３．１６４．１６５．１６６． １６７．１７０．１７１．１７２．１７３．１８１．１８２．１８３．１８４． １８５．１８６．１８８．１８９．１９１．１９２．１９４．１９５．１９７． ２０４．２０６．２０９．２１０．２１１．２１２．２１３．２１４．２１５． ２１６．２１７．２１８．２３５．２３６．２３７．２３８．２３９．２４０． ２４１．２４２．２４３．２４４．２４５．２４７．２４８．２４９．２５１． ２５２．２５３．２５４．２５５．２５６．２５７．２５９．２６０．２６１． ２６２．２６３．２６５．２６９．２７１．２７２．２７５． の１または２以上におけるアミノ酸残基の中から選択する、ことをさらに特徴と する、請求の範囲第２１〜２３項のいずれかに記載の方法。 ２５．選択するアミノ酸残基は、位置 １．２．３．４．１４．１５．１７．１８．２０．２７．４０．４１．４３．４ ４．４５．４６．５１．５２．６０．６１．６２．７５．７６．７８．７９．９ １．９４．９７．１００．１０５．１０６．１０８．１１２．１１３．１１７． １１８．１２９．１３０．１３３．１３４．１３６．１３７．１４１．１４３． １４４．１４５．１４６．１６５．１７３．１８１．１８３．１８４．１８５． １９１．１９２．２０６．２０９．２１０．２１１．２１２．２１６．２３９． ２４０．２４２．２４３．２４４．２４５．２４７．２４８．２４９．２５１． ２５２．２５３．２５５．２５６．２５７．２５９．２６３．２６９．２７１． ２７２．の群から選択される位置を占有するアミノ酸残基に影響を与えるように 選択され、そして位置 １．２．３．４．６．９．１０．１２．１４．１５．１７．１８．１９．２０． ２１．２２．２４．２５．２７．３６．３７．３８．４０．４１．４３．４４． ４５．４６．４９．５０．５１．５２．５３．５４．５５．５６．５７．５８． ５９．６０．６１．６２．７５．７６．７７．７８．７９．８７．８９．９１． ９４．９７．９８．９９．１００．１０１．１０３．１０４．１０５．１０６． １０７．１０８．１０９．１１２．１１３．１１５．１１６．１１７．１１８． １２０．１２６．１２８．１２９．１３０．１３１．１３３．１３４．１３６． １３７．１４０．１４１．１４３．１４４．１４５．１４６．１５５．１５６． １５８．１５９．１６０．１６１．１６２．１６３．１６４．１６５．１６６． １６７．１７０．１７１．１７２．１７３．１８１．１８２．１８３．１８４． １８５．１８６．１８８．１８９．１９１．１９２．１９４．１９５．１９７． ２０４．２０６．２０９．２１０．２１１．２１２．２１３．２１４．２１５． ２１６．２１７．２１８．２３５．２３６．２３７．２３８．２３９．２４０． ２４１．２４２．２４３．２４４．２４５．２４７．２４８．２４９．２５１． ２５２．２５３．２５４．２５５．２５６．２５７．２５９．２６０．２６１． ２６２．２６３．２６５．２６９．２７１．２７２．２７５． の群から選択される位置を占有するアミノ酸残基にさらに影響を与える少なくと も１つである、ことをさらに特徴とする請求の範囲第２１〜２４項のいずれかに 記載の方法。 ２６．親酵素は、スブチリシンＢＰＮ′、スブチリシンアミロサッカリチクス、 スブチリシン１６８、スブチリシンメセンテリコペプチダーゼ、スブチリシンカ ルスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、スブチリシンＤＹ、スブチリシン３０９、 スブチリシン１４７、サーミターゼ、アクアリシン、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ）ＰＢ９２プロテアーゼ、プロテアーゼＫ、プロテアーゼＴＷ７、およびプ ロテアーゼＴＷ３から選択される親酵素の突然変異を表す、ことをさらに特徴と する、請求の範囲第１〜２５項のいずれかに記載の方法。 ２７．親スブチリシンはスブチリシン３０９である、ことをさらに特徴とする、 請求の範囲第２６項記載の方法。 ２８．親スブチリシンはスブチリシン１４７である、ことをさらに特徴とする、 請求の範囲第２６項記載の方法。 ２９．親スブチリシンはスブチリシンカルスバーグ（ＣａｒＩｓｂｅｒｇ）であ る、ことをさらに特徴とする、請求の範囲第２６項記載の方法。 ３０．親スブチリシンはバチルス属（Ｂａｃｉｎｕｓ）ＰＢ９２プロテアーゼで ある、ことをさらに特徴とする、請求の範囲第２６項記載の方法。