JPH04356197A - ＧｎＲＨデカペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】

本発明は、デカペプチド、特にＧｎＲＨＰｙｒ−Ｈｉｓ
−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　　　　　Ｉ〔式中Ｘａａ＝Ｄ
Ｐｈｅまたは別のＤ−アミノ酸を意味する。〕の新規製
造方法に関する。当該ペプチドは、受胎障害、前立腺癌
の治療のためにまたは排卵同期化のために使用される薬
物の製造に適する。本発明の適用領域は、人の医薬なら
びに獣医学の医薬にある。

【０００２】

【従来の技術】ＧｎＲＨおよびＧｎＲＨ類似体の合成は
、繰り返し開示されている。当該合成は、均一相におい
ても高分子担体上での形成によっても行われる。溶液中
での当該ペプチドの形成は、部分配列、例えばＰｙｒ−
Ｈｉｓ−ＮＨＮＨ２　、Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＯＨ
、Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＮＨＮＨ２　、Ｈ−Ｓｅｒ
（　ｔＢｕ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｈ−Ｔ
ｒｐ−Ｓｅｒ（　ｔＢｕ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
ＯＨ、Ｈ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　、Ｈ−Ａ
ｒｇ（ＮＯ２　）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　または　
Ｈ−Ａｒｇ（ＴＯＳ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　を介
して行われる（ＤＥ　２３　０７　０１０　、ＤＥ　２
４　２４　２８７、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ　４１，４０７１（１９７３）；Ｃｏｌｌ．　Ｃ
ｚｅｃｈ．　Ｃｈｅｍ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　　４２　２
０１８　（１９７６）；　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．
　１５，　２２２　（１９７２）；　Ｃｈｅｍ．　Ｐｈ
ａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．　２３，２２９　（１９７５）；
　Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａ
ｎｓ．　Ｉ，　１９７９，　３８９；　Ｈｅｌｖ．　Ｃ
ｈｅｍ．　Ａｃｔａ　５７，　２３１　（１９７４）；
　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．１７，　１０６０　（１
９７４）；　　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　１５，　
６２３　（１９７２）；　　　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅ
ｍ．　１８．　６１３（１９７５）；　ＵＳ　３　９５
３　４１６；　　Ｃｈｅｍ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ
．　２７，　１９０７　（１９７９）；　　Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ　１９７２　（Ｅｄ．　Ｈ．　Ｈａｎｓｏｎ，　
Ｈ．　Ｄ．　Ｊａｋｕｂｋｅ），　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏｌ
ｌａｎｄ　Ｐｕｂｌ．　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　１９７３
，　Ｓ．９３）。断片のカップリングは一部はアジド合
成を介してそして一部はＤＣＣ縮合を介して実行され、
その際２，３の著者によってラセミ化を減ずる試薬、例
えばＨＯＢｔ，　ＨＯＯＢｔ，　ＨＯＮＢ，　ＨＯＮＳ
ｕが添加される。部分配列、例えばＰｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔ
ｒｐ−ＯＨのカップリングはＤＣＣによって添加剤なし
で行われることも知られている（Ｈｅｌｖ．　Ｃｈｉｍ
．　Ａｃｔａ　５７，２３１　（１９７４）、ＵＳ　３
　９５３　４１６）　。Ｃ末端が活性化されたアミノ酸
でのラセミ化の程度についてはもちろん如何なる陳述も
行われていない。 Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＯＨのカップリングについて
の研究の際、全てのＤＣＣ／添加剤変化量において５〜
１５％のＤ−Ｔｒｐ−ペプチドが最終生成物中に見出さ
れた。ラセミ化の危険を回避するため、それ故別の著者
によってしばしば不満足な収率にもかかわらずアジド合
成がまたは１〜６個の断片の逐次合成が選択される。固
相によるＧｎＲＨペプチドの逐次合成の場合、ラセミ化
は同様に広く排除される。ヒスチジン誘導体についての
み、使用される側鎖保護に応じてラセミ化が予想される
。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】実施される固相合成の
際の欠点は、なかんずく生産規模における合成の際に、
とりわけトリプトファン残基の高い酸不安定性およびア
ルカリ適性により、２、３のヒスチジン誘導体の高いラ
セミ化傾向により、　Ｎｉｍ−保護基の

【０００４】

【外１】によりおよびＮ−境界における不完全なカップ
リングにより引き起こされる副反応である。これは、典
型的な方法により溶液中で製造されるトリペプチドを、
固相合成によって形成されるヘプタペプチドに、樹脂の
分離前にまたは分離後に（Ａｎｎ．　ｄ’　Ｅｎｄｃｒ
ｉｎｏｌ．　（Ｐａｒｉｓ）　３７，　２１５　（１９
７６））　縮合するという戦略に通ずる。この際欠点は
、もちろん再びＣ末端Ｔｒｐ　で観察されるラセミ化で
ある。

【０００５】さらに、ペプチド断片が酵素触媒によって
ラセミ化されることなく結合され得ることが知られてい
る　（Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．　
２４，８５　（１９８５））。

【０００６】従って、ＧｎＲＨ合成は、ほぼ独占的に酵
素によるカップリング段階に依存していると記述されて
いる（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　１９８６；　Ｅｄ．Ｄ．　Ｔ
ｈｅｏｄｏｒｏｐｏｕｌｏｓ，　Ｗ．　ｄｅ　Ｇｒｕｙ
ｔｅｒ，　Ｂｅｒｌｉｎ　１９８７，　Ｓ．　１８３）
：Ｎ末端トリペプチドエステルＰｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ
−ＯＭｅ　はキモトリプシンおよびセリンエチルエステ
ルによりテトラペプチドＰｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−ＯＥｔ　に延長される。続くカップリング段階にお
いてカルボキシペプチダーゼＹ、カルボキシペプチダー
ゼＹＭ、ポストプロリン特異的エンドプロテアーゼおよ
びキロストリパイン（これらはもちろんキモトリプシン
と比較して非常に高価である）が使用される。このもっ
ぱら酵素的なカップリング戦略を使用する際の欠点は、
５つの使用される酵素の全てが、カップリングおよび開
裂のための様々な反応条件を必要とするので、なにより
もまず望ましくないペプチド開裂の回避のために最善の
状態にする高い費用である。

【０００７】本発明の目的は、ＧｎＲＨペプチド，式Ｉ
の工業的な製造のための簡単かつ経済的な方法を開発す
ることである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】

本発明の課題は、ＧｎＲＨペプチド，式ＩＰｙｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　　　　　Ｉの簡単な製造方
法を開発することであり、それによればペプチドを同様
に工業的規模で高い収率および純度でラセミ化なしに製
造できる。この課題は、それ自体公知の方法により製造
される式ＩＩおよびＩＩＩＰｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｏ
Ｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ＩＩＨ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｘａａ
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ　２　　　　
　　　　　　　　　　ＩＩＩ〔式中Ｒ　は脂肪族または
芳香族残基、好ましくは　−ＣＨ３　、−Ｃ２　　Ｈ５
　を意味しそしてＸａａ　であるＤ−アミノ酸、好まし
くはＤ−Ｐｈｅ　、Ｄ−Ａｌａ　、Ｄ−Ｔｒｐ　、Ｄ−
Ｌｅｕ　、Ｄ−β−Ｎａｌ、Ｄ−Ｓｅｒ（　ｔＢｕ）を
意味する。〕で表される部分断片を本発明によりキモト
リプシンを用いてカップリングすることにより解決され
る。

【０００９】酵素触媒によるセグメント合成は、ジメチ
ルホルムアミドおよび水からなる混合物中で行われるの
が好ましく、その際、当該反応は、３０〜６０％のＤＭ
Ｆからなる溶剤混合物において−１０℃〜３５℃の温度
でかつ７．８〜８．９のｐＨ値で行われる。反応速度は
、選択された温度範囲および使用した酵素量によって決
定され、その際反応時間は、２日まで、好ましくは４〜
８時間である。

【００１０】本発明による方法は、ＧｎＲＨデカペプチ
ドを高い収率および純度でラセミ化なく製造することを
保証する。酵素性のペプチド合成の際、特にペプチド断
片のカップリングの際に、生ずる付随的な開裂による予
想される困難は生じない。芳香族アミノ酸のカルボキシ
ル基での反応に対するキモトリプシンの既知の特異性の
故に、本発明によるカップリングの際にＴｙｒ−Ｘａａ
−ペプチド結合がキモトリプシンにより加水分解されな
いことは驚くべきことである。

【００１１】本発明は、一連のその他の利点を示す：断
片は当該デカペプチド合成の基礎になっており、その断
片は典型的な合成方法により溶液中で（断片ＩＩ：例え
ば、ＤＥ　２３　０７　０１０）および固相合成により
（断片ＩＩＩ、例えばＤＤ　１３５　０７８）良好に製
造できる。従って、ヘプタペプチドＩＩＩは、

【００１２】

【外２】保護アミノ酸、Ａｒｇ（ＮＯ２　）、ベンズヒ
ドロキシアミン樹脂で側鎖保護したＳｅｒ（Ｂｚｌ）を
用いてＤＣＣ／ＨＯＢｔによって問題なく５０〜１，０
００ｇの樹脂規模で合成されそしてＨＦ分離後８５〜９
０％の粗ペプチド純度で得られる。酸不安定なＴｒｐ残
基は、３＋７戦略が続く場合、危険なＨＦ分離処理を受
けない。

【００１３】３＋７縮合がＤＣＣ　またはＤＣＣ　添加
剤によって行われる他の製造方法と著しく異なって、本
発明による方法においてはカップリングがキモトリプシ
ンを用いて行われ、それによって　Ｔｒｐ３　−　残基
のラセミ化が除外される。それに対して、ＤＣＣ／添加
剤を用いて行われる縮合の場合は、５〜１５％の　Ｔｒ
ｐ３　−ラセミ化が観察される。カップリングがトリペ
プチド−アジドを介して行われるならば、ラセミ化は１
％未満まで低くされうる。しかし、この方法の場合の収
率は、２０〜５０％であり（例えばＤＥ　２３　０７　
０１０参照）、一方、本発明による酵素性の結合の場合
は、１．３当量過剰のトリペプチドの使用で、使用した
ヘプタペプチドの定量的な反応が達成される。酵素性の
カップリングは、それ以上に、保護されていないペプチ
ド側鎖でのアシル化があり得ずかつデカペプチド−粗生
成物の純度がもっぱら使用される断片ＩＩおよびＩＩＩ
の純度次第であるという利点を有する。 得られた粗生成物の最終的な精製は、それ故、簡単な方
法で可能であり、特に断片ＩＩおよび酵素性の合成の際
に形成されるトリペプチド酸の分離は、イオン交換クロ
マトグラフィーによっても疎水性のポリマーでの逆相ク
ロマトグラフィーによっても問題がない。

【００１４】

【実施例】

実施例Ｉ Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＰｈｅ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ　２　の製造 Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＯＥｔ　２１ｇ（４３．７０
ｍＭｏｌ）および　Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＰｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　２０ｇ（２３
．８７ｍＭｏｌ）を攪拌下に室温で６６ｍｌのＤＭＦお
よび７０．５ｍｌの水の中に懸濁しそしてｐＨを２Ｎの
ＫＯＨで８．０に調整する。さらに、５０ｍｇのα−キ
モトリプシン溶液４５０μｌ（ＳＥＲＶＡ、４５Ｕ／ｍ
ｇ）を１ｍｌの１・１０−３ＮのＨＣｌ中に加える。酵
素の投与を２時間後に繰り返す。ｐＨ静止条件下で（２
ＮのＫＯＨを用いてｐＨ８．０）６．５時間後にヘプタ
ペプチドアミドのほぼ定量的な反応に達し（ＨＰＬＣ検
査）そして酵素反応を１０ｍｌの酢酸を添加することに
よって中断する。 ３×５０ｍのメタノールを用いて減圧下に濃縮しそして
油状の残留物を３ｌのアセトン中でかき混ぜる。

【００１５】沈澱した合成生成物を吸引濾過し；アセト
ンおよびエーテルで洗浄しそして乾燥する。

【００１６】収量：２４．５ｇ。

【００１７】過剰に使用したＰｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−
ＯＥｔ　は、生成物の沈澱物のアセトン上澄みから濃縮
によってそして生じたＰｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＯＨを
酸性炭酸塩溶液を用いて洗い流した後単離されそして再
利用される。

【００１８】実施例２ 実施例１と同様に行う。但し、α−キモトリプシン（Ｓ
ＥＲＶＡ、４５Ｕ／ｍｇ）の代わりにＶＥＢ　　Ｂｅｒ
ｌｉｎ−Ｃｈｅｍｉｅのα−キモトリプシン（２７５Ｕ
／ｍｇ、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンエチルエステル）
を用いる。

【００１９】収量：２４．４ｇ。

【００２０】実施例３ 実施例１と同様に行う。但し、２３．８７ｍＭｏｌの代
わりに、０．７５ｍＭｏｌのヘプタペプチドアミドを使
用しかつ合成したＰｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＯＥｔ　の
代わりに再生したＰｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＯＥｔ　を
用いる。

【００２１】収量：０．７９ｇ。

【００２２】実施例４ 実施例１と同様に行う。但し、４５０μｌ（２２．５ｍ
ｇ）の溶解したα−キモトリプシンの代わりに２００ｍ
ｇの固定したα−キモトリプシン（２０Ｕ／ｍｇ、Ｎ−
アセチル−Ｌ−チロシンエチルエステル、ｐＨ８．０、
２５℃）を用いる。

【００２３】収量：２４．２ｇ。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　式Ｉ Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｌ
   ｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　　　　　Ｉ〔
   式中Ｘａａ＝ＤＰｈｅまたは別のＤ−アミノ酸を意味す
   る。〕で表されるＧｎＲＨデカペプチドの合成が、式Ｉ
   ＩおよびＩＩＩ Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＯＲ　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＩＩ
   Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
   −Ｇｌｙ−ＮＨ　２　　　　　　　　　　　　　　ＩＩ
   Ｉ〔式中Ｒ　はアルキル基またはアリール基を意味しそ
   してＸａａ　は上述の意味を有する。〕で表される断片
   から、キモトリプシン触媒カップリングにより行われる
   ことを特徴とする、ＧｎＲＨデカペプチドの製造方法。
2. 【請求項２】　　反応が、−１０℃〜３５℃の間の温度
   で行われる、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　有機溶剤として、ジメチルホルムアミ
   ドが用いられる、請求項１または２記載の方法。
4. 【請求項４】　　断片が水／ＤＭＦ混合物中でｐＨ＝８
   ．５に合わせられ、反応が酵素の添加により開始されそ
   して２時間の間にさらに酵素が添加される、請求項１〜
   ３のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】　　高分子担体に結合されたキモトリプシ
   ンが使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の
   方法。