JPH04330285A - エンドウのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ 遺伝子及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ
　ｓａｔｉｖｕｍ　Ｌ．）のフェニルアラニンアンモニ
アリアーゼ（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　Ａｍｍｏｎ
ｉａ　Ｌｙａｓｅ，　以下「ＰＡＬ　」と略記する。）
　をコードする遺伝子（以下「ＰＡＬ　遺伝子」と略記
する。）及びその用途に関する。更に詳細には、植物に
とって重要な二次代謝物の生合成を活性化する酵素の遺
伝子であるエンドウＰＡＬ　遺伝子、該遺伝子を含む組
み換えプラスミド、該組み換えプラスミドで形質転換し
た大腸菌の形質転換体、及び該形質転換体を培養するこ
とを特徴とするエンドウＰＡＬ　の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＰＡＬ　は、植物及びある種の微生物に
存在し、フェニルアラニンを脱アミノしてｔｒａｎｓ−
ケイ皮酸を生成する反応を活性化する酵素である。この
反応は、植物にとって重要な二次代謝物の生合成経路の
最初の反応であるフェニルプロパノイド・イソフラボノ
イド合成経路の最初の反応であり、ＰＡＬ　は、この合
成経路の律速酵素となっていることが知られている（Ｅ
ｄｉｔｈ　Ｌ．Ｃａｍｍ　ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，　１２巻、９６１　頁、１９７３）。

【０００３】従来、多くの植物について、光や薬剤等に
よりこのＰＡＬ　の活性を高める方法が提案されてきた
（Ｄ．Ｃ．Ｌｏｓｃｈｋｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｓｉｃ
ａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，　２３　巻、
１６３頁、１９８３；Ｄ．Ｈ．Ｊｏｎｅｓ　ら、Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１１６　巻、１１７　頁、
１９８１；Ｎ．Ｆ．Ｈａａｒｄら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｓ
ｉｃａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，　８巻、
２０７　頁、１９７６；Ｗ．Ｎｏｅ　ら、Ｐｌａｎｔａ
，１５４　巻、４５４　頁、１９８２）　。更に、これ
らの方法を用いて、植物中のフェニルプロパノイド・イ
ソフラボノイド系のいくつかの有用物質の含量を高める
試みが行われている（Ｈ．Ｍｏｈｒ　ら、Ｐｌａｎｔａ
，　１４６　巻、３６９　頁、１９７９；Ｃ．Ｓａｎｄ
ｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａ　Ａｃｔａ，５６３巻、２７８　頁、１９７９）　
。

【０００４】また、最近の遺伝子工学の発達に伴い、数
種の植物及び微生物のＰＡＬ　遺伝子について、その塩
基配列が解明されてきている。例えば、植物については
、インゲン（Ｃ．Ｊ．Ｌａｍｂ　ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　８２　巻、６７３１頁
、１９８５）　、サツマイモ（Ｙ．Ｔａｎａｋａ　ら、
Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　９０巻、１４０３頁
、１９８９）　及びイネ（Ｅ．Ｍｉｎａｍｉ，　Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１８５巻、１９頁、１９８
９）　等のＰＡＬ　遺伝子の塩基配列が解明されている
。

【０００５】植物以外の分野においても、ＰＡＬ　は、
例えば工業の分野においてはｔｒａｎｓ−ケイ皮酸から
Ｌ−フェニルアラニンの合成に利用できること、また、
医薬の分野においてはフェニルケトン尿症の治療及び診
断に重要な役割をもつことなどから、真核微生物である
ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒ
ｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）　について、その
ＰＡＬ　遺伝子の塩基配列の解明及びその用途の開発が
行われている（特開昭６３−７１１７９号公報、特開昭
６３−１９６２９２　号公報、特開昭６３−２９１５８
３　号公報、特開昭６３−３１７０８６　号公報、公表
特許公報平１−５０３６７３号）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】植物中の有用物質の含
量を高める従来の方法である光や薬剤等によりＰＡＬ　
の活性を高める方法は、必ずしもＰＡＬ　の活性のみを
高める方法ではないので、植物の種類や生理状態等によ
って目的とする有用物質の生成量が異なり、実用化しう
る結果は未だ得られていない。

【０００７】そこで、上記したような遺伝子工学の発達
に伴い、直接ＰＡＬ　の活性を高めるためにＰＡＬ　遺
伝子を植物へ導入する方法が期待されるが、実用化され
ているものはない。特にエンドウについては、そのＰＡ
Ｌ　遺伝子の塩基配列について未だ解明されていない。 エンドウＰＡＬ　は、ポリエチレングリコール法や電気
穿孔法等の直接法、又は、アグロバクテリウムを介する
方法等の手段により種々の植物に導入可能であり、これ
により植物中のフェニルプロパノイド・イソフラボノイ
ド系の有用物質の含量を高めることができると考えられ
るが、特に具体的には、エンドウＰＡＬ　の活性化によ
り含量が高められる有用物質として、例えば、エンドウ
褐紋病菌（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｌｌａ　ｐｉｎｏｄｅｓ
）に対して抗菌活性を示すエンドウ中のファイトアレキ
シンの一つであるピサチンが考えられ、すなわち、寄生
菌の侵入による病気に対して耐性を示す品種の開発等の
面から、ＰＡＬ　遺伝子の解明が期待される。

【０００８】以上のことに鑑み、本発明者らは、エンド
ウの胚軸からＰＡＬ　遺伝子を得、該遺伝子を含む組み
換えプラスミドを得た後、該組み換えプラスミドで大腸
菌の形質転換を行い、得られた大腸菌の形質転換体を培
養してＰＡＬ　を製造すべく鋭意研究を行い、本発明を
完成するに至った。

【０００９】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、（
１）分子中に配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む
ポリペプチドをコードするエンドウのフェニルアラニン
アンモニアリアーゼ遺伝子、（２）配列番号２に示され
る塩基配列で表される上記（１）のエンドウのフェニル
アラニンアンモニアリアーゼ遺伝子、（３）上記（１）
に記載されたエンドウのフェニルアラニンアンモニアリ
アーゼ遺伝子を含む組み換えプラスミド、（４）大腸菌
を上記（３）に記載された組み換えプラスミドで形質転
換した形質転換体微生物、（５）上記（４）に記載され
た形質転換体を培地中で培養し、培養物からエンドウの
フェニルアラニンアンモニアリアーゼをβ−ガラクトシ
ダーゼとの融合タンパクとして採取することを特徴とす
るエンドウフェニルアラニンアンモニアリアーゼの製造
方法、（６）上記（４）に記載された形質転換体を培地
中で培養し、培養物からエンドウのフェニルアラニンア
ンモニアリアーゼを採取することを特徴とするエンドウ
フェニルアラニンアンモニアリアーゼの製造方法、にあ
る。

【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）及び（２）の遺伝子 まず、エンドウ種子（　例えばエンドウアラスカ種の種
子）　を適当な条件下で約１週間培養して得られる胚軸
を切断し、その切断面を例えば下記に示すようなＰＡＬ
　遺伝子の発現を誘導する物質で処理し、ＰＡＬ遺伝子
の転写活性が高まる４時間から４時間３０分後に液体窒
素で固定して、公知の方法で全ＲＮＡ　を単離精製する
。培養胚軸は、ＰＡＬ　遺伝子の発現を誘導しやすく、
最も好ましく用いられる部分である。ＰＡＬ　遺伝子の
発現を誘導する物質としては、例えば、グルタチオン、
アクチノマイシンＤ等の代謝阻害剤；Ｃｕ２＋等の重金
属イオン等を挙げることができるが、好ましくは、エリ
シターで処理するとよい。エリシターは、植物の抵抗性
を誘導する物質で、病原菌の細胞壁成分であり、例えば
、エンドウ褐紋病菌の胞子発芽液中に存在する高分子糖
蛋白等を挙げることができる。ＲＮＡ　の単離方法とし
ては、ＳＤＳ−フェノール法（内宮博文ら、「植物遺伝
子工学マニュアル」　（講談社）　、３２頁、１９８４
）　、ＧＩＴ　法（Ｌｅｏｎａｒｄ　Ｇ．Ｄａｖｉｓら
、「Ｍｅｔｈｏｄｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ），　１３０頁、　１９８６）等が挙
げられる。得られた全ＲＮＡ　から、オリゴｄＴセルロ
ース、ポリＵセファローズ等を用いて、吸着カラムクロ
マトグラフィーあるいはバッチ法によりメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）　を分画精製する。

【００１１】次に、得られたｍＲＮＡを用いて相補的な
ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）　を合成する。この合成は、通常、
試験管内（ｉｎ　ｖｉｒｔｏ）で次のような方法で行う
ことができる。すなわち、ｍＲＮＡを鋳型に、オリゴｄ
Ｔをプライマーとして、デオキシリボヌクレオチド三リ
ン酸混合物（ｄＡＴＰ，　ｄＣＴＰ，　ｄＧＴＰ　及び
ｄＴＴＰ）　の存在下、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡと
相補的な単鎖ｃＤＮＡを合成し、得られた単鎖ｃＤＮＡ
を鋳型にしてＤＮＡ　ポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤ
ＮＡ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）　を合成する。

【００１２】こうして得られたｄｓ−ｃＤＮＡ　は、ベ
クターに組み込み可能にするため、その両端をＴ４ＤＮ
Ａ　ポリメラーゼ又はエキソヌクレアーゼで処理し、適
当なリンカーを接続する。このリンカーを接続したｄｓ
−ｃＤＮＡ　を、大腸菌で増殖が可能なベクターに組み
込む。大腸菌で増殖可能なベクターとしては、例えば、
λｇｔ１０等のファージベクターを挙げることができ、
これを適当な制限酵素で切断した後、上記のリンカーを
接続したｄｓ−ｃＤＮＡ　と混合し、ＤＮＡ　リガーゼ
を用いて組み込ませる。

【００１３】次に、得られた組み換え体ファージを大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に組み込み、
大腸菌の形質転換株を得る。大腸菌は主に対数増殖期に
ある細胞を集め、塩化マグネシウム又は硫酸マグネシウ
ム等のマグネシウムイオンで処理することによりファー
ジが感染しやすい状態にし、上記組み換え体ファージを
、λファージの外皮タンパクを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ
でファージ粒子の再構成を行った後に感染させる方法が
好ましく採用される。

【００１４】得られた大腸菌の形質転換株からエンドウ
ＰＡＬ　遺伝子を有する株を選別するには、プラークハ
イブリダイゼーションと称する方法が採用される。まず
、シャーレ上に形質転換株のプラークを形成させ、その
表面にニトロセルロース膜又はナイロン膜をのせて組み
換え体ファージを吸着させる。該膜をアルカリ処理しフ
ァージの外皮タンパクを変性させると共にｄｓ−ｃＤＮ
Ａ　を一本鎖に解離させる。次いで、エンドウＰＡＬ　
遺伝子と相同性の高い配列を持つと予想されるＤＮＡ　
断片、例えば、インゲンＰＡＬ　遺伝子をプローブとし
てハイブリダイゼーション（雑種形成）を行い、エンド
ウＰＡＬ　をコードすると思われるｃＤＮＡを保持する
形質転換株を選別する。すなわち、陽性プラークとして
得る。

【００１５】得られた陽性プラークの由来する組み換え
体ファージから常法に従いｃＤＮＡを回収し、適当な制
限酵素を用いることにより、上記形質転換株に組み込ま
れた挿入ｃＤＮＡ断片を切り出すことができ、本発明の
目的とするＰＡＬ　遺伝子を得ることができる。 （３）の組み換えプラスミド β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するｐＵＣ　１９等の
プラスミドを、マルチクローニングサイトの適当な制限
酵素で切断し、上記で得たｃＤＮＡ断片と混合してＤＮ
Ａ　リガーゼで接続することにより、β−ガラクトシダ
ーゼとＰＡＬ　が結合した融合タンパクをコードする遺
伝子を含む組み換えプラスミドを得ることができる。

【００１６】（４）の大腸菌の形質転換体次いで、（３
）の組み換えプラスミドにより大腸菌の形質転換体を得
る。大腸菌は主に対数増殖期にある細胞を集め、塩化カ
ルシウムで処理することにより自然にＤＮＡ　を取り込
みやすい状態にしてから行う。塩化マグネシウム又は塩
化ルビジウムを共存させると形質転換の効率が一層増加
するので好ましい。

【００１７】（５）のエンドウＰＡＬ　の製造方法及び
その確認 （４）の形質転換体をイソプロピルチオ−β−ガラクト
サイド（ＩＰＴＧ）等のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発
現誘導物質存在下で培養すれば、β−ガラクトシダーゼ
との融合タンパクとして目的とするＤＮＡ　の発現産物
、すなわちエンドウＰＡＬ　を得ることができる。培地
としては、ＬＢ培地（　トリプトン１％、食塩１％、酵
母エキス０．５％を含有する培地）　が好ましく用いら
れ、また、培養時間は、８　〜１２時間とするのが好ま
しい。この融合タンパクは、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分画することによって得ることができる。次い
でニトロセルロース膜又はナイロン膜に移し、常法に従
ってエンドウＰＡＬ　抗体を用いて抗原抗体反応を行え
ば、（１）で得られたｃＤＮＡ断片が、実際にエンドウ
ＰＡＬ　をコードするかどうか確認することができる。

【００１８】（６）のエンドウＰＡＬ　の製造方法上記
確認されたｃＤＮＡ断片は、（３）の組み換えプラスミ
ドを得る段階で、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する
プラスミド以外のＰＡＬ　発現可能なプラスミドを用い
て、以下同様に大腸菌の形質転換体を得てＬＢ培地等で
培養すれば、β−　ガラクトシダーゼの融合タンパクで
なく単独のＰＡＬとして得ることができる。

【００１９】エンドウＰＡＬ　遺伝子の構造解析上記の
ように確認されたエンドウＰＡＬ　遺伝子の構造は、ダ
イデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｓｍｉｔｈ　Ａ．Ｊ
．Ｈ．，　Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，　８５巻、４９９
　頁、１９８０）　等を用いる常法により決定すること
ができる。

【００２０】

【実施例】以下、実施例を掲げて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が
限定されるものではない。

【００２１】

【実施例１】ｍＲＮＡの分画精製 エンドウアラスカ種の種子をバーミキュライトに播種し
、暗黒下２０℃で７日間放置して平均７ｃｍの実生を得
た。この実生の根基部と葉部のそれぞれ１ｃｍを切除し
た胚軸部分を縦に二分し、その切断面を、エリシター溶
液（エンドウ褐紋病菌の胞子発芽液上清を限外濾過（分
画分子量１０，０００）して得られる高分子画分を、グ
ルコース換算値で１，０００ｐｐｍに調製したもの、Ｓ
ｈｉｒａｉｓｈｉ　ら、日本植物病理学会報、４４巻、
６５９　頁、１９７８に記載の方法による）に数秒浸漬
した後、暗黒下２０℃湿状態で放置してＰＡＬ　遺伝子
の発現を誘導した。４時間３０分後に、胚軸を液体窒素
で固定して、ＧＩＴ　（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｉｓｏｔ
ｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）法（Ｌｅｏｎａｒｄ　Ｇ．Ｄａ
ｖｉｓら、「Ｍｅｔｈｏｄｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ　」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），　１３０頁、１９８６）
　により全ＲＮＡ　の単離精製を行った。

【００２２】すなわち、胚軸３０ｇ　を液体窒素中で磨
砕し、ＧＩＴ　緩衝液（グアニジンイソチオシアネート
４Ｍ　、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２５ｍＭ
　、２−メルカプトエタノール１２０ｍＭ　）３０ｍｌ
に懸濁し、５０℃で４０分間振とうすることにより抽出
し、遠心分離を行って上清を得た。得られた上清を上層
に、等容量の塩化セシウム緩衝液（　塩化セシウム５．
７Ｍ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２５ｍＭ）
を下層にして、２００，０００　×ｇで２４時間遠心分
離を行って全ＲＮＡ　を沈澱させた。この全ＲＮＡ　を
ＴＥＳＳ緩衝液（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
１０ｍＭ　、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１ｍ
Ｍ　、食塩１００ｍＭ　、２−メルカプトエタノール１
％）１００　μＬに懸濁し、フェノール処理（　水飽和
フェノールを加えて振とう後、遠心分離を行い水層を得
る、以下同様）　の後エタノール沈澱（　約２．５　倍
容量のエタノールを加えて約−２０　℃に冷却後、遠心
分離を行い沈澱物を乾燥して得る、以下同様）　により
濃縮精製し、全ＲＮＡ　を１０ｍｇ得た。

【００２３】次いで、得られた全ＲＮＡ　から、ｏｌｉ
ｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０（日本ロシュ株式会社製）を
用いてバッチ法によりｍＲＮＡの分画精製を行った。す
なわち、まずｏｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０を５００
　μＬと全ＲＮＡ　２　ｍｇを混和し、６５℃で５　分
間加熱した後急冷し、１／１０容量の食塩を添加して３
７℃で１０分間放置した。遠心分離後上清を除去し、新
たに同容量の滅菌水を加えて再度加熱急冷を行った後、
遠心分離後上清にｍＲＮＡ画分を得た。これをエタノー
ル沈澱により濃縮し、ｍＲＮＡを３０μｇ得た。

【００２４】ｍＲＮＡからｄｓ−ｃＤＮＡ　の合成上記
で得たｍＲＮＡ１０μｇから、ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社
製）のキットを用いてｉｎ　ｖｉｒｔｏでｃＤＮＡの合
成を行った。すなわち、鋳型とするｍＲＮＡに、上記キ
ットの第１鎖合成用緩衝液６　μＬ、ピロリン酸ナトリ
ウム溶液１．５　μＬ、ヒト胎盤リボヌクレアーゼイン
ヒビター１００　ユニット、デオキシリボヌクレオチド
三リン酸混合物１ｍＭ　、オリゴｄＴプライマー１６μ
ｇ及び逆転写酵素（２１ユニット／μＬ）３μＬを混合
し、４２℃で２　時間反応させて単鎖ｃＤＮＡを合成し
た。

【００２５】引き続き、上記キットの第２鎖合成用緩衝
液５６．５μＬ、リボヌクレアーゼＨ　を６　ユニット
及びＤＮＡ　ポリメラーゼクレノウフラグメント３２０
　ユニットを加え１２℃で１　時間、２２℃で１　時間
反応させてｄｓ−ｃＤＮＡ　を合成した。７０℃１０分
間の熱処理により用いた酵素を失活させ、最後に　Ｔ４
　ＤＮＡ　ポリメラーゼ　２ユニットでｄｓ−ｃＤＮＡ
の両末端を平滑化した。以上の合成反応終了後、フェノ
ール処理を１回、クロロホルム処理を１回行い、エタノ
ール沈澱としてｄｓ−ｃＤＮＡ　４．３　μｇを回収し
た。

【００２６】ｄｓ−ｃＤＮＡ　へのリンカーの接続リン
カーを接続するためのＥｃｏＲＩ消化反応に対して、ｃ
ＤＮＡの内在ＥｃｏＲＩ切断部位を保護するために、Ｔ
ｒｉｓ−Ｃｌ　緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＭ　、ＥＤ
ＴＡ５０ｍＭ、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）２
０　μＭ　、上記で得たｄｓ−ｃＤＮＡ　及びＥｃｏＲ
Ｉメチラーゼ（宝酒造株式会社製）２０ユニットを混ぜ
３７℃で１時間反応させた後、６８℃５分間の熱処理で
反応を停止した。

【００２７】引き続きこの反応液にＴｒｉｓ−Ｃｌ　緩
衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＭ　、塩化マグネシウム１０
ｍＭ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）１０ｍＭ　、アデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）１ｍＭ、ＥｃｏＲＩリンカー
（１２　塩基対、宝酒造株式会社製）２μｇ、Ｔ４　Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｒｉ
ｍ社製）１４　ユニットを添加して２０℃で１　時間、
４　℃で１６時間反応させた後、６８℃５　分間の熱処
理で反応を停止した。

【００２８】更に、上記反応液にＴｒｉｓ−Ｃｌ　緩衝
液（ｐＨ７．５）　１０ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍ
Ｍ、食塩１００ｍＭ　及びＥｃｏＲＩ（宝酒造株式会社
製）２１０　ユニットを加え、３７℃で７　時間反応さ
せ、ｄｓ−ｃＤＮＡ　の両末端にＥｃｏＲＩ粘着末端を
創設した。以上の反応を終えたｃＤＮＡは、Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　社製）　
のカラムに通し未反応のリンカーや小分子ｃＤＮＡを除
き、０．５ｋｂ　以上の画分を採集してエタノール沈澱
により濃縮した。以上の操作により、ベクターに組み込
み可能なようにリンカーを接続したｄｓ−ｃＤＮＡ　が
２．９　μｇ得られた。

【００２９】組み換え体ファージの製造得られたｄｓ−
ｃＤＮＡ　を用いてファージベクターλｇｔ１０への組
み込みを行った。すなわち、ｃＤＮＡ３５０ｎｇ　、λ
ｇｔ１０　ＥｃｏＲ　Ｉａｒｍｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ
Ｅ　社製）５００ｎｇ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ　緩衝液（ｐＨ
７．５）１０ｍＭ　、塩化マグネシウム１０ｍＭ、ＤＴ
Ｔ１０ｍＭ　、ＡＴＰ１ｍＭ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｒｉｍ社製）２ユニ
ットを加え、２０℃で１　時間、４　℃で１６時間反応
させた後、６８℃５　分間の熱処理で反応を停止した。

【００３０】組み換え体ファージによる大腸菌の形質転
換株の製造 まず、上記で得られた組み換えλファージを、λファー
ジの外皮タンパク（ｉｎｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎ
ｇ　ｋｉｔ　、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）　と混和し、２
０℃で２　時間放置することにより、ファージ粒子の再
構成を行った。一方、大腸菌７１１８株を２０ｍｌのＬ
ＢＭＭ培地（　トリプトン１％、食塩１％、酵母エキス
０．５％、硫酸マグネシウム１０ｍＭ、マルトース０．
４％を含有する培地）　に接種し、３０℃で１０時間振
とう培養した。培養後、菌体を遠心分離により集め、あ
らかじめ４　℃に冷却しておいた１０ｍＭ硫酸マグネシ
ウム溶液１０ｍｌに懸濁して、ファージが感染しやすい
状態とした。こうして得られた大腸菌に上記組み換えλ
ファージを混和後、３７℃で２５分間放置して組み込ま
せ、０．７％の寒天を含むＬＢＭＭ培地に懸濁した。次
いで、１．５％の寒天を含むＬＢＭＭ培地上に広げ、３
７℃で１２時間培養した。

【００３１】形質転換株の選別 上記により得られた計８枚のプレート上の約５６００個
のプラークについて、プラークハイブリダイゼーション
を行い、エンドウＰＡＬ　遺伝子を有する株の選別を行
った。各プレートに１枚、計８枚のナイロン膜（Ｈｙｂ
ｏｎｄ−Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）　を用意し、プラ
ークが現れたＬＢＭＭ寒天培地上に載せ１分間放置した
後、プラーク吸着面を上側にして変成溶液（　食塩１．
５Ｍ、水酸化ナトリウム０．５Ｍ）　を浸透させた濾紙
（３ＭＭペーパー、Ｗｈａｔｍａｎ　社製）　上に置き
７　分間放置した。次いで中和溶液（　食塩１．５Ｍ、
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ　緩衝液（ｐＨ７．２）０．５Ｍ）を浸
透させた濾紙上に同様に置き７分間放置した。この中和
処理を更に１　回行った後、２　倍量ＳＳＣ　溶液（　
食塩３００ｍＭ　、クエン酸ナトリウム３０ｍＭ）　で
ナイロン膜を洗浄し、８０℃で２　時間放置して組み換
えλファージのＤＮＡの固定を行った。

【００３２】得られたナイロン膜を用いて、ラジオアイ
ソトープでラベルしたインゲンＰＡＬのｃＤＮＡをプロ
ーブとしたハイブリダイゼーションを行った。プローブ
のラベル反応は、ＤＮＡ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｒｉｍ社製）　を用
いランダムプライマーラベリング法（Ｆｅｉｎｂｅｒ　
Ａ．Ｐ．　ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１３２
巻、６　頁、１９８３）　で行った。また、ハイブリダ
イゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）　セクション２．１１
４　〜２．１１７　、１９８９に従った。

【００３３】プラークハイブリダイゼーションの結果か
ら、６個の陽性プラーク（＃２１，＃２２，＃４１，＃
４２，＃４３，＃５１　と識別する。）が得られた。 陽性プラークからｃＤＮＡ断片の製造 上記で得た陽性プラークから、常法に従い組み換えλフ
ァージのＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切除し
た後、１．６％アガロースゲル電気泳動で挿入ｃＤＮＡ
断片を得た。

【００３４】この結果、＃４１　に最長の約２．８ｋｂ
　のｃＤＮＡ断片が含まれており、エンドウＰＡＬ　の
推定分子量が約８０，０００であることから（Ｌｏｓｃ
ｈｋｅ　Ｄ．Ｃ．　ら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｌｏｇ
ｙ　、６８巻、６８０　頁、１９８１参照）　、この＃
４１　のＤＮＡ断片はエンドウＰＡＬ　遺伝子の全長を
含んでいると考えられた。 組み換えプラスミドの製造 上記で得た組み換えλファージ＃４１のＤＮＡ３μｇに
対してＴｒｉｓ−Ｃｌ　緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＭ
　、塩化マグネシウム１０ｍＭ、食塩１００ｍＭ　、Ｅ
ｃｏＲＩ（　宝酒造株式会社製）９０　ユニットを加え
、３７℃で２　時間反応させた後、フェノール処理及び
クロロホルム処理を各１　回行い、次いでエタノール沈
澱により精製した。

【００３５】一方、ベクターとして、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を有し、また、その内部にマルチクローニン
グサイトをもつプラスミドであるｐＧＥＭ４Ｚ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ社製）　も上記組み換えλファージ　＃４１の
ＤＮＡと同様に反応及び精製を行った。精製したｐＧＥ
Ｍ４Ｚと組み換えλファージ　＃４１のＤＮＡを混和し
て、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ　緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＭ　
、塩化マグネシウム１０ｍＭ、ＤＴＴ１０ｍＭ　、ＡＴ
Ｐ１ｍＭ、及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｒｉｍ社製）２ユニットを加えて、
１６℃で３　時間反応させることにより両者を接続し、
組み換えプラスミドを得た。

【００３６】組み換えプラスミドによる大腸菌の形質転
換体の製造 大腸菌７１１８株をＬＢ培地（　トリプトン１％、食塩
０．５％、酵母エキス１％を含有する培地）　５ｍｌに
接種し、３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液
０．５　ｍｌを新たにＬＢ培地２０ｍｌに接種し、培養
液の６００ｎｍ　における吸光度がおよそ０．１５にな
るまで３７℃で振とう培養した。培養終了後、菌体を遠
心分離により集め溶液Ａ（ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０
）１０ｍＭ　、塩化ルビジウム１０ｍＭ）１０　ｍｌで
洗浄し、次いで、溶液Ｂ（ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５
）１００ｍＭ、塩化ルビジウム１０ｍＭ、塩化カルシウ
ム５０ｍＭ）１０　ｍｌに懸濁して氷上で２　時間放置
した後、再度遠心分離により菌体を集め、１　ｍｌの溶
液Ｂ　に懸濁した。この懸濁液０．１　ｍｌに上記の組
み換えプラスミドを入れ、氷上で３０分間放置した後、
ＬＢ培地０．８　ｍｌを加え３７℃で１　時間培養した
。得られた培養液を４０ｍｇ／Ｌのアンピシリン及び１
．５％の寒天を含むＬＢ培地上に一面に塗抹し、３７℃
で一晩培養し、大腸菌の形質転換体を得た。

【００３７】形質転換体の培養及びエンドウＰＡＬ　の
確認上記において得られたコロニーから無作為に２０コ
ロニーを選びだし、４０ｍｇ／Ｌのアンピシリン含むＬ
Ｂ培地２　ｍｌにそれぞれ接種し３７℃で８　時間培養
した。こうして増幅された組み換えプラスミドのｃＤＮ
Ａを常法に従って精製した。＃４１　のｃＤＮＡ断片は
内部にＨｉｎｄ　ＩＩＩ切断部位を一箇所有し、Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩＩによっておよそ１．２ｋｂ　と１．６ｋｂ　
に切断されたので、この切断の後、アガロースゲル電気
泳動で分析することによって＃４１　のｃＤＮＡのβ−
　ガラクトシダーゼ遺伝子の転写に対する方向を確認し
た。

【００３８】この結果、β−　ガラクトシダーゼ遺伝子
の転写の方向に対してＨｉｎｄ　ＩＩＩ切断部位が上流
にある組み換えプラスミド（ｐＫＴ４１と識別する。）
　とその逆向きの組み換えプラスミド（ｐＫＴ４１ＲＶ
と識別する。）　が得られた。 各々の組み換えプラスミドを有する大腸菌の形質転換体
７１１８（ｐＫＴ４１）　株と７１１８（ｐＫＴ４１Ｒ
Ｖ）　株を得、更に対照区としてｐＧＥＭ４Ｚを有する
大腸菌の形質転換体７１１８（ｐＧＥＭ４Ｚ）株を得た
。これらの形質転換体を４０ｍｇ／Ｌのアンピシリン含
むＬＢ培地２０ｍｌで８　時間培養した後、イソプロピ
ルチオ−　β−　ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）５０μＬ
を添加して更に２　時間培養を行った。

【００３９】培養後遠心分離により菌体を集め、Ｔｒｉ
ｓ−Ｃｌ　緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＭ　に懸濁して
超音波破砕機で菌体を破壊した後、飽和硫酸アンモニウ
ムを用いてタンパクを沈澱させた。得られたタンパク３
０μｇをドデシル硫酸ナトリウム−　ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分画した。次いでゲル内に分画された
タンパクをホライズブロットＡＥ−６６７０（ＡＴＴＯ
社製）　を用いてナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ　、Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ社製）　に移し、エンドウＰＡＬ　抗体
を用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｅｅｎ　ＴＭ　（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社製）　により抗原抗体反応を行った。

【００４０】すなわち、まずナイロン膜上の非特異敵な
タンパクをブロックするため、２％ウシ血清アルブミン
を含むＴＢＳ　緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液１０ｍＭ、食塩
１５０ｍＭ　、ｐＨ７．４）に浸漬し室温で１　時間放
置した。次いで、ウサギの血清から得られた抗エンドウ
ＰＡＬ抗体を０．２％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ
　緩衝液で希釈したものに浸漬し室温で１　時間抗原抗
体反応を行った。エンドウＰＡＬ　抗体は、ワシントン
州立大学のＤｒ．Ｈａｄｗｉｇｅｒから分譲されたもの
を用いた。抗原抗体反応後、０．０５％　ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ　緩衝液
で洗浄した。次いで、パーオキシダーゼを結合させた抗
ウサギグロブリン抗体を０．２％ウシ血清アルブミンを
含むＴＢＳ　緩衝液で希釈したものに浸漬し室温で１　
時間反応させて再び洗浄を行った後、３，３’−　ジア
ミノベンジジンと過酸化水素を含む溶液に約１０秒浸漬
して発色させた。

【００４１】以上の結果ｐＫＴ４１ＲＶ　の発現産物に
のみエンドウＰＡＬ　抗体との反応が検出された。すな
わち、＃４１　に含まれる約２．８ｋｂ　のｃＤＮＡ断
片は、エンドウＰＡＬ　をコードする遺伝子であること
が証明された。こうして証明されたエンドウＰＡＬ　遺
伝子を含む組み換えプラスミドｐＫＴ４１ＲＶ　で形質
転換した大腸菌の形質転換体７１１８（ｐＫＴ４１ＲＶ
）株は、工業技術院微生物工業研究所に微工研菌寄第１
２０９５　号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１２０９５）として寄託
している。

【００４２】尚、上記形質転換体７１１８（ｐＫＴ４１
ＲＶ）　株は、ＬＢ培地では非形質転換株と同様の生育
増殖が見られるが、ＩＰＴＧ存在下すなわちβ−　ガラ
クトシダーゼとの融合タンパクの状態で発現させると明
らかに生育が阻害された。イネのＰＡＬ　遺伝子におい
て、同様のβ−　ガラクトシダーゼとの融合タンパクが
、大腸菌内でＰＡＬ　活性を有し、その反応産物である
ケイ皮酸の過剰蓄積により大腸菌の生育が阻害された例
があることから、エンドウＰＡＬ　遺伝子の場合も、上
記のβ−　ガラクトシダーゼとの融合タンパクの状態で
ＰＡＬ　活性を有していると考えられた。

【００４３】エンドウＰＡＬ　遺伝子の構造解析ｃＤＮ
Ａ断片を６　種の制限酵素（ＢａｍＨ　Ｉ、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ　、ＨｉｎｃＩＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｂｇｌ　ＩＩ、Ｐ
ｖｕ　ＩＩ）　を用いて小断片化し、それぞれをベクタ
ーＭ１３　の適当な制限酵素切断部位に挿入した。これ
で大腸菌７１１８株を形質転換し、得られた形質転換株
からＭｅｓｓｉｎｇ　らの方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　１０１巻、２０頁、１９８３
）　に従い１　本鎖ＤＮＡ　を調製し、得られた１　本
鎖ＤＮＡ　について、ダイデオキシヌクレオチド鎖終結
法の原理に基づくＳＥＱＥＲＡＳＥＲ　ｖｅｒｓｉｏｎ
２．０（Ｕ．Ｓ．Ｂ社製）　を用い、上記Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ　らの方法に従って塩基配列を決定した。この塩基配
列を配列番号２に示す。

【００４４】上記塩基配列をもとに遺伝子解析ソフトＤ
ＮＡＳＩＳ（　日立ソフトウエアエンジニアリング株式
会社製）　を用いてアミノ酸配列を推定したところ、エ
ンドウＰＡＬ　遺伝子は７１０　個のアミノ酸残基をコ
ードしていると考えられた。このアミノ酸配列をを配列
番号１に示す。このアミノ酸配列から、エンドウＰＡＬ
　の分子量は７９，２２９と推定された。

【００４５】尚、参考までに、このエンドウＰＡＬ　遺
伝子から推定されたアミノ酸配列を、インゲンＰＡＬ　
遺伝子（配列番号３）、サツマイモＰＡＬ　遺伝子、イ
ネＰＡＬ　遺伝子から推定されたアミノ酸配列と比較し
たところ、それぞれ、８８．３％，　７８．７％，　６
６．４％　の相同性を示した。

【００４６】

【発明の効果】本発明によれば、エンドウＰＡＬ　の大
量製造が可能である。この遺伝子を植物に導入すれば、
ＰＡＬ　の活性が高められ、それに伴い、植物にとって
重要な二次代謝物の生合成経路であるフェニルプロパノ
イド・イソフラボノイド合成経路が活性化され、それに
よってフェニルプロパノイド・イソフラボノイドを多く
含んだ品種を得ることができる。

【００４７】

【配列表】配列番号：　　１ 配列の長さ：７７６ 配列の型：　　アミノ酸 配列の種類：タンパク トポロジー：直鎖 起源：エンドウ 配列の特徴：エンドウフェニルアラニンアンモニアリア
ーゼ 配列： ＭｅｔＩｌｅＴｒｐＣｙｓＨｉｓＣｙｓＨｉｓＳｅｒＨ
ｉｓＨｉｓＰｒｏＩｌｅＧｌｕＧｌｙＬｙｓＶａｌＧｌ
ｕＧｌｎＣｙｓＧｌｕＶａｌＨｉｓＬｙｓＡｓｎＡｒｇ
ＴｙｒＧｌｎＡｒｇＩｌｅＳｅｒＬｅｕＡｒｇＳｅｒＳ
ｅｒＧｌｎＰｈｅＬｅｕＧｌｎＰｒｏＩｌｅＬｅｕＡｓ
ｎＬｙｓＧｌｕＴｈｒＬｅｕＶａｌＴｈｒＬｅｕＶａｌ
ＳｅｒＩｌｅＬｙｓＭｅｔＧｌｕＴｈｒＶａｌＡｌａＡ
ｌａＡｌａＩｌｅＴｈｒＬｙｓＡｓｎＡｓｎＧｌｙＴｙ
ｒＧｌｕＳｅｒＰｈｅＣｙｓＶａｌＴｈｒＡｓｎＡｌａ
ＬｙｓＡｓｎＡｓｎＡｓｎＭｅｔＬｙｓＶａｌＡｓｎＳ
ｅｒＡｌａＡｓｐＰｒｏＬｅｕＡｓｎＴｒｐＧｌｙＶａ
ｌＡｌａＡｌａＡｌａＶａｌＬｙｓＧｌｙＳｅｒＨｉｓ
ＬｅｕＡｓｐＧｌｕＶａｌＬｙｓＡｒｇＭｅｔＶａｌＧ
ｌｕＧｌｕＴｙｒＡｒｇＬｙｓＰｒｏＶａｌＧｌｙＳｅ
ｒＰｒｏＧｌｙＶａｌＡｒｇＡｓｐＴｈｒＡｓｐＡｓｐ
ＰｈｅＳｅｒＧｌｙＴｒｐＬｅｕＰｒｏＬｅｕＰｒｏＨ
ｉｓＭｅｔＩｌｅＭｅｔＣｙｓＬｙｓＶａｌＧｌｕＬｅ
ｕＳｅｒＧｌｕＳｅｒＡｌａＡｒｇＡｌａＧｌｙＶａｌ
ＬｙｓＡｌａＳｅｒＳｅｒＡｓｐＴｒｐＶａｌＭｅｔＧ
ｌｕＳｅｒＭｅｔＡｓｎＬｙｓＧｌｙＴｈｒＡｒｇＧｌ
ｎＬｅｕＡｒｇＣｙｓＴｙｒＴｙｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙ
ＡｌａＴｈｒＳｅｒＨｉｓＡｒｇＡｒｇＴｈｒＬｙｓＧ
ｌｎＧｌｙＧｌｙＡｌａＬｅｕＧｌｎＬｙｓＧｌｕＬｅ
ｕＩｌｅＡｒｇＰｈｅＬｅｕＡｓｎＡｌａＧｌｙＩｌｅ
ＰｈｅＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｈｒＧｌｕＳｅｒＳｅｒＨ
ｉｓＴｈｒＬｅｕＰｒｏＨｉｓＴｈｒＡｌａＴｈｒＡｒ
ｇＡｌａＡｌａＭｅｔＬｅｕＶａｌＡｒｇＩｌｅＡｓｎ
ＴｈｒＬｅｕＬｅｕＧｌｎＧｌｙＴｙｒＳｅｒＧｌｙＩ
ｌｅＡｒｇＰｈｅＧｌｕＩｌｅＬｅｕＧｌｕＡｌａＩｌ
ｅＴｈｒＬｙｓＬｅｕＩｌｅＡｓｎＡｓｎＡｓｎＶａｌ
ＴｈｒＰｒｏＣｙｓＬｅｕＬｅｕＳｅｒＧｌｙＴｈｒＩ
ｌｅＴｈｒＡｌａＳｅｒＧｌｙＡｓｐＬｅｕＶａｌＰｒ
ｏＬｅｕＳｅｒＴｙｒＩｌｅＡｌａＧｌｙＬｅｕＬｅｕ
ＴｈｒＧｌｙＡｒｇＰｒｏＡｓｎＳｅｒＬｙｓＡｌａＨ
ｉｓＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＬｙｓＰｈｅＰｈｅＡｓ
ｎＡｌａＬｙｓＧｌｕＡｌａＰｈｅＧｌｎＳｅｒＡｌａ
ＧｌｕＩｌｅＡｓｎＡｓｐＧｌｙＰｈｅＰｈｅＧｌｕＬ
ｅｕＧｌｎＰｒｏＬｙｓＧｌｕＧｌｙＬｅｕＡｌａＬｅ
ｕＶａｌＡｓｎＧｌｙＴｈｒＡｌａＶａｌＧｌｙＳｅｒ
ＧｌｙＬｅｕＡｌａＳｅｒＩｌｅＶａｌＬｅｕＰｈｅＧ
ｌｕＡｌａＡｓｎＩｌｅＬｅｕＡｌａＶａｌＬｅｕＳｅ
ｒＧｌｕＶａｌＬｅｕＳｅｒＡｌａＩｌｅＰｈｅＡｌａ
ＧｌｕＶａｌＭｅｔＧｌｎＧｌｙＬｙｓＰｒｏＧｌｕＰ
ｈｅＴｈｒＡｓｐＨｉｓＬｅｕＴｈｒＨｉｓＬｙｓＬｅ
ｕＬｙｓＨｉｓＨｉｓＰｒｏＧｌｙＧｌｎＩｌｅＧｌｕ
ＡｌａＡｌａＡｌａＩｌｅＭｅｔＧｌｕＨｉｓＩｌｅＬ
ｅｕＡｓｐＧｌｙＳｅｒＡｌａＴｙｒＶａｌＬｙｓＡｌ
ａＡｌａＬｙｓＬｙｓＬｅｕＨｉｓＧｌｕＭｅｔＡｓｐ
ＰｒｏＬｅｕＧｌｎＬｙｓＰｒｏＬｙｓＧｌｎＡｓｐＡ
ｒｇＴｙｒＡｌａＬｅｕＡｒｇＴｈｒＳｅｒＰｒｏＧｌ
ｎＴｒｐＬｅｕＧｌｙＰｒｏＬｅｕＩｌｅＧｌｕＶａｌ
ＩｌｅＡｒｇＰｈｅＳｅｒＴｈｒＬｙｓＳｅｒＩｌｅＧ
ｌｕＡｒｇＧｌｕＩｌｅＡｓｎＳｅｒＶａｌＡｓｎＡｓ
ｐＡｓｎＰｒｏＬｅｕＩｌｅＡｓｐＶａｌＳｅｒＡｒｇ
ＡｓｎＬｙｓＡｌａＬｅｕＨｉｓＧｌｙＧｌｙＡｓｎＰ
ｈｅＧｌｎＧｌｙＴｈｒＰｒｏＩｌｅＧｌｙＶａｌＳｅ
ｒＭｅｔＡｓｐＡｓｎＴｈｒＡｒｇＬｅｕＡｌａＬｅｕ
ＡｌａＳｅｒＩｌｅＧｌｙＬｙｓＬｅｕＬｅｕＰｈｅＡ
ｌａＧｌｎＰｈｅＳｅｒＧｌｕＬｅｕＶａｌＡｓｎＡｓ
ｐＰｈｅＴｙｒＡｓｎＡｓｎＧｌｙＬｅｕＰｒｏＳｅｒ
ＡｓｎＬｅｕＳｅｒＡｌａＳｅｒＡｒｇＡｓｎＰｒｏＳ
ｅｒＬｅｕＡｓｐＴｙｒＧｌｙＰｈｅＬｙｓＧｌｙＳｅ
ｒＧｌｕＩｌｅＡｌａＭｅｔＡｌａＳｅｒＴｙｒＣｙｓ
ＳｅｒＧｌｕＬｅｕＧｌｎＴｙｒＬｅｕＡｌａＡｓｎＰ
ｒｏＶａｌＴｈｒＴｈｒＨｉｓＶａｌＧｌｎＳｅｒＡｌ
ａＧｌｕＧｌｎＧｌｎＨｉｓＡｓｎＧｌｎＡｓｐＶａｌ
ＡｓｎＳｅｒＬｅｕＧｌｙＬｅｕＩｌｅＳｅｒＳｅｒＡ
ｒｇＬｙｓＴｈｒＴｙｒＧｌｕＡｌａＩｌｅＧｌｕＩｌ
ｅＬｅｕＧｌｎＬｅｕＭｅｔＳｅｒＳｅｒＴｈｒＰｈｅ
ＬｅｕＩｌｅＡｌａＬｅｕＣｙｓＧｌｎＡｌａＶａｌＡ
ｓｐＬｅｕＡｒｇＨｉｓＬｅｕＧｌｕＧｌｕＡｓｎＬｅ
ｕＬｙｓＡｓｎＳｅｒＶａｌＬｙｓＡｓｎＩｌｅＶａｌ
ＳｅｒＧｌｎＶａｌＡｌａＬｙｓＡｒｇＴｈｒＬｅｕＴ
ｈｒＴｈｒＧｌｙＶａｌＡｓｎＧｌｙＧｌｕＬｅｕＨｉ
ｓＰｒｏＳｅｒＡｒｇＰｈｅＣｙｓＧｌｕＬｙｓＡｓｐ
ＬｅｕＬｅｕＡｒｇＶａｌＶａｌＡｓｐＡｒｇＧｌｕＨ
ｉｓＶａｌＰｈｅＡｌａＴｙｒＩｌｅＡｓｐＡｓｐＰｒ
ｏＣｙｓＳｅｒＡｌａＴｈｒＴｙｒＰｒｏＬｅｕＭｅｔ
ＧｌｎＬｙｓＬｅｕＡｒｇＧｌｎＶａｌＬｅｕＶａｌＡ
ｓｐＨｉｓＡｌａＬｅｕＶａｌＡｓｎＧｌｙＧｌｕＳｅ
ｒＧｌｕＬｙｓＡｓｎＬｅｕＡｓｎＴｈｒＳｅｒＩｌｅ
ＰｈｅＧｌｎＬｙｓＩｌｅＡｌａＴｈｒＰｈｅＧｌｕＡ
ｓｐＧｌｕＬｅｕＬｙｓＴｈｒＬｅｕＬｅｕＰｒｏＬｙ
ｓＧｌｕＶａｌＧｌｕＳｅｒＴｈｒＡｒｇＡｌａＡｌａ
ＴｙｒＧｌｕＳｅｒＧｌｙＡｓｎＰｒｏＴｈｒＶａｌＰ
ｒｏＡｓｎＬｙｓＩｌｅＡｓｎＧｌｙＣｙｓＡｒｇＳｅ
ｒＴｙｒＰｒｏＬｅｕＴｙｒＡｒｇＰｈｅＶａｌＡｒｇ
ＧｌｎＧｌｕＬｅｕＧｌｙＴｈｒＧｌｙＬｅｕＬｅｕＴ
ｈｒＧｌｙＧｌｕＬｙｓＶａｌＩｌｅＳｅｒＰｒｏＧｌ
ｙＧｌｕＧｌｕＣｙｓＡｓｐＬｙｓＬｅｕＰｈｅＴｈｒ
ＡｌａＩｌｅＣｙｓＧｌｎＧｌｙＬｙｓＩｌｅＩｌｅＡ
ｓｐＰｒｏＬｅｕＬｅｕＧｌｎＣｙｓＬｅｕＧｌｙＡｓ
ｐＴｒｐＡｓｎＧｌｙＡｌａＰｒｏＬｅｕＰｒｏＩｌｅ
Ｓｅｒ配列番号：　　２ 配列の長さ：２６０７ 配列の型：　　ＤＮＡ 配列の種類：ｃＤＮＡ 鎖の数：ニ本鎖 トポロジー：直鎖 起源：エンドウ 配列の特徴：エンドウフェニルアラニンアンモニアリア
ーゼのｃＤＮＡ 配列： ＧＡＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＧＴ
ＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴ
ＡＧＧＴＣＴＴＧＧＧＡＣＧＡＣＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡ
ＡＡＧＡＧＧＴＴＣＣＡＡＡＴＴＧＣＡＴＡＡＡＡＴＧ
ＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＡＧＡＡＧＣＡＡＣＧＴＧ
ＡＴＧＡＴＴＴＧＧＴＧＴＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＧＣＣ
ＡＴＣＡＴＣＣＣＡＴＡＧＡＡＧＧＴＡＡＡＧＴＡＧＡ
ＧＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＴＡＣＡＴＡＡＧＡＡＣＡＧＡ
ＴＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＣＡ
ＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＣＡＡＴＴＣＴＣＡＡ
ＣＡＡＡＧＡＡＡＣＡＴＴＡＧＴＴＡＣＴＴＴＡＧＴＡ
ＴＣＡＡＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＣＡＧＴＡＧＣＡＧ
ＣＡＧＣＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＣＧＧＴＴＡ
ＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＴＧＣＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣＴ
ＡＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＣＡＴＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＡ
ＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＡＴＴＧＧＧＧＴＧＴ
ＴＧＣＣＧＣＣＧＡＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧＧＡＧＴ
ＣＡＣＴＴＧＧＡＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＧ
ＴＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧＧＴ
ＣＣＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＡＣＧ
ＡＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴＴＧＣＣＧ
ＣＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＴＧＧＡ
ＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＣ
ＧＴＴＡＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＴＧＧＧＴＧＡ
ＴＧＧＡＧＡＧＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧＡ
ＣＡＧＴＴＡＣＧＧＴＧＴＴＡＣＴＡＣＣＧＧＴＴＴＣ
ＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＧＡＧＡＡＣＣＡ
ＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡ
ＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＡＴＧＣＴＧＧＡ
ＡＴＡＴＴＴＧＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＴＣＡＡ
ＧＣＣＡＴＡＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＡＣ
ＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴＧＡＧＡＡＴＣ
ＡＡＣＡＣＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＴＴＡＴＴＣＡＧ
ＧＡＡＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＴＴＧＧＡＡＧＣ
ＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣ
ＧＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＴＴＴＡＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡ
ＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＴＡＧＴ
ＣＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＴＴＡ
ＣＴＡＡＣＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧ
ＣＴＣＡＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴ
ＴＡＡＴＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＧＴＣＡ
ＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＴＧ
ＡＡＴＴＧＣＡＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＧＣ
ＡＣＴＴＧＴＴＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＴ
ＴＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＡＴ
ＴＴＧＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴＡＴＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴ
ＧＴＣＴＧＡＡＧＴＣＣＴＡＴＣＣＧＣＴＡＴＴＴＴＴ
ＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＣＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧ
ＡＧＴＴＴＡＣＴＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＣＡＣＡＴＡＡ
ＡＴＴＧＡＡＧＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＴＴ
ＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡ
ＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＴＡＴＧＴＣＡＡ
ＡＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＴＴＧＣＡＴＧＡＧＡＴＧ
ＧＡＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧ
ＡＴＡＧＡＴＡＴＧＣＡＣＴＴＡＧＡＡＣＴＴＣＡＣＣ
ＧＣＡＡＴＧＧＣＴＴＧＧＴＣＣＴＣＴＴＡＴＴＧＡＡ
ＧＴＣＡＴＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＧＴＣＡＡ
ＴＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＴＡＡ
ＴＧＡＴＡＡＣＣＣＴＴＴＧＡＴＴＧＡＴＧＴＴＴＣＡ
ＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＣＴＴＴＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡ
ＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＧＴ
ＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＴＡＣＡＣＧＴＴＴＧＧＣＴ
ＣＴＴＧＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＡＣＴＣＴＴＧＴ
ＴＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡ
ＴＧＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＣＧＧＧＴＴＧＣＣＴ
ＴＣＧＡＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＡＧＴＡＧＡＡＡＴＣ
ＣＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＴＡＴＧＧＡＴＴＣＡＡＧＧＧ
ＡＴＣＣＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＴＴＡＴ
ＴＧＴＴＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＴＡＴＣＴＴＧＣＡＡ
ＡＣＣＣＡＧＴＴＡＣＡＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＡＡＧ
ＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＴ
ＧＴＧＡＡＣＴＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＴ
ＣＴＡＧＧＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡ
ＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡ
ＴＴＣＴＴＧＡＴＴＧＣＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＣＡＧ
ＴＴＧＡＣＴＴＡＡＧＡＣＡＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡ
ＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＡＴＴ
ＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＡＡＡＡＧＧＡＣＣＣ
ＴＴＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧＴＧＡＡＴＧＧＡＧＡＡＣＴ
ＴＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＧ
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ＧＧＡＡＴＴＣ　　　配列番号：　　３ 配列の長さ：１７０７ 配列の型：　　ＤＮＡ 配列の種類：　　ｃＤＮＡ 鎖の数：ニ本鎖 トポロジー：直鎖 起源：インゲン 配列の特徴：インゲンフェニルアラニンアンモニアリア
ーゼｃＤＮＡ 配列：

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　分子中に配列番号１に示されるアミノ
   酸配列を含むポリペプチドをコードするエンドウのフェ
   ニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】　　配列番号２に示される塩基配列で表さ
   れる請求項１のエンドウのフェニルアラニンアンモニア
   リアーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】　　請求項１に記載されたエンドウのフェ
   ニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子を含む組み換え
   プラスミド。
4. 【請求項４】　　大腸菌を請求項３に記載された組み換
   えプラスミドで形質転換した形質転換体微生物。
5. 【請求項５】請求項４に記載された形質転換体を培地中
   で培養し、培養物からエンドウのフェニルアラニンアン
   モニアリアーゼをβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパ
   クとして採取することを特徴とするエンドウのフェニル
   アラニンアンモニアリアーゼの製造方法。
6. 【請求項６】　　請求項４に記載された形質転換体を培
   地中で培養し、培養物からエンドウのフェニルアラニン
   アンモニアリアーゼを採取することを特徴とするエンド
   ウのフェニルアラニンアンモニアリアーゼの製造方法。