JPH04279530A - 成長因子を投与するためのドラッグデリバリーシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、成長因子を熱傷及び創傷にデリ
バリーさせるのに有用な組成物に関するものである。特
に本発明は、塩基性の繊維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ
と略記する）からなる上記組成物に関するものである。

【０００２】最近、成長因子を創傷の治療に用いる事が
提案されている。Ｂｕｃｋｌｅｙ　等（ＰＮＡＳＵＳＡ
　８２，　７３４０　〜７３４４，　１９８５；Ｊ．Ｓ
ｕｒｇ．Ｒｅｓ．，４３　３２２〜３２８，　１９８７
）は、コレステロール、メチルセルロース及びラクトー
スからなり、上皮成長因子（ＥＧＦ）を１日に１０〜２
０μｇの割合で放出し得る除放性ペレットを提案した。 これらのペレットはポリビニルアルコールスポンジ中に
包埋されていた。

【０００３】これらのシステムを動物実験で試験したと
ころ、特に移植組織に有用であることが見出された。し
かしながら、メチルセルロース（ＭＣ）が存在するため
に問題がある。ＭＣは置換の程度により、多少生体内劣
化性であると考えられ、より正確には生体内吸収性とし
て規定され得る。しかし、ＭＣは生体親和性が低い。ま
た、ＭＣは身体に投与した際に免疫応答を誘発する（Ｍ
ｙａｍｏｔｏ　等，Ｊ．Ｂｉｏｍ．　Ｍａｔｅｒ．　Ｒ
ｅｓｅａｒｅｈ，　２３，　１２５〜１３３，　１９８
９）。

【０００４】ＥＰ−Ａ−０２６７０１５には、ＥＧＦの
ような成長因子を含有する安定化組成物が記載されてい
る。ヒトの分裂促進活性を有するポリペプチド成長因子
を含有する水性薬剤組成物に安定化量の水溶性多糖を加
えると、組成物は水分存在下での生物活性の損失に対し
て安定化される。

【０００５】傷の癒合に有用で、ヒトの分裂促進活性又
は脈管形成活性を有するポリペプチド成長因子、特にＥ
ＧＦを含有するゲル処方物がＥＰ−Ａ−０３１２２０８
に報告されている。水性ゲル処方物もまた、室温で１〜
１２×１０４　Ｐａｓ　（１０３　〜１．２　×１０７
ｃｐｓ）の粘度を有するべく水溶性又は水膨潤性の医薬
上許容し得る重合体を含む。これらのゲルはポリアクリ
ル酸（Ｃａｒｂｏｐｏｌ、商標）、ポロキサマー　（Ｐ
ｌｕｒｏｎｉｃｓ　、商標）、ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ、商標）、ヒアルロン
酸及びポリアクリルアミド（Ｃｙａｎｏｍｅｒ、商標）
からなる。しかしながら、ゲル処方物を使用した場合に
は、水の含有量が高いために、成長因子に対する安定性
に問題があり、また生成物の貯蔵期間が短くなる。ゲル
を凍結乾燥して、使用する際に再構築され得る安定な投
与形態とすることができる（ＥＰ−Ａ−０３０８２３８
）　。

【０００６】ｂ−ＦＧＦ及び他の成長因子（“ヘパリン
結合成長因子”）を安定化させる方法として、前記因子
をヘパリン、他のグリコサミノグリカン又は硫酸化及び
／又はカルボキシル化巨大分子に結合させる方法が報告
されている（Ｔｈｏｍａｓ等，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　
ａｎｄ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ａｃｉｄｉｃ　
Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　
”，　ｉｎ　Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　（ｃｕｒｒｅ
ｎｔ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ），　ｅｄｓ．：　Ｒｉｆ
ｋｉｎ　Ｄ．Ｂ．，Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ　Ｍ．，　Ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，　９−１２　（１９８７）；　Ｍｏｒｔｏｎ等，
Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　８　（
１０），　９７５−９８６　（１９８９）；　Ｓｈｉｎ
ｇ　等，　Ａｎａｌｙｔｉａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，　１８５，　１０８−１１１　（１９９０）；　
Ｌｏｂｂ，　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　１８
，　３２１−３３６　（１９８８））。この安定化作用
により、プロテアーゼの不活性化も保護される（Ｒｏｓ
ｅｎｇａｒｔ　等，　Ｆｅｄ．　Ｐｒｏｃ．，　４６，
　２１１６　（１９８７）；　Ｌｏｂｂ，　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，　２７，　２５７２−２５７８　（１
９８８））　。

【０００７】培養したヒトのケラチノサイトで表面を覆
ったコラーゲン−グリコサミノグリカンメンブランから
なる熱傷治療用複合移植片に成長因子を充填させるため
に、ｂ−ＦＧＦ又は他の成長因子を使用する（ｖｅｈｉ
ｃｕｌａｔｅ）という提案がなされた（Ｈａｎｓｂｒｏ
ｕｇｈ等，ＪＡＭＡ，　２６２　（１５），　２１２５
−２１３０　（１９８９））　。この治療システムは明
らかに大規模に製造され得ず、また熱傷の治療が特定の
中心部に限定される。

【０００８】この度、我々はｂ−ＦＧＦを水不溶性・水
膨潤性ミクロスフェアに充填すると、熱傷又は創傷を癒
合の為にｂ−ＦＧＦをデリバリーさせるのに適した方法
が提供されるという知見を得た。この知見は、一般にす
べてのヘパリン結合成長因子へ適用される。

【０００９】従って、本発明は、ヘパリン結合成長因子
を充填した水不溶性・水膨潤性ミクロスフェアからなる
散剤を提供するものである。散剤はゲル形成能を有する
。典型的には凍結乾燥した散剤である。ミクロスフェア
は典型的には生体内劣化性である。

【００１０】“ヘパリン結合成長因子”という用語は、
単に自然のヒト成長因子のポリペプチドだけでなく、自
然のヒト成長因子のポリペプチドと同様の生物活性を有
するポリペプチドも包含するものである。このように、
この用語は、組み換えＤＮＡ技術で生成するか自然源か
ら誘導されたヒトのヘパリン結合成長因子、及びマウス
もしくは齧歯動物のような近い関係の哺乳動物の成長因
子を包含するものである。本発明においては組み換えＤ
ＮＡ技術で生成したヒトのヘパリン結合の成長因子を使
用するのが好ましい。

【００１１】ヘパリン結合成長因子は典型的には酸性又
は塩基性の繊維芽細胞成長因子、すなわち、ａ−ＦＧＦ
又はｂ−ＦＧＦである。ｂ−ＦＧＦを用いるのが好まし
い。例えばＷＯ　８６／０７５９５；　ＷＯ　８７／０
１７２８；　ＥＰ−Ａ−０２２６１８１；Ａｂｒａｈａ
ｍ　等，ＥＭＢＯ　Ｊ．，　５，　２５２３−２５２８
，　１９８６　；又はＬｏｂｂ．　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃ
ｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１８，　３２１−３３６，
　１９８８　に記載されているようないずれのｂ−ＦＧ
Ｆ分子も本発明において有益に使用し得る。

【００１２】ｂ−ＦＧＦ類の混合物も使用し得る。これ
は、Ａｂｒａｈａｍ　等によって報告されている　１５
５個のアミノ酸型のアミノ酸配列を有するがＮ−未満Ｍ
ｅｔ　残基のない　１５４個のアミノ酸ヒトｂ−ＦＧＦ
（この１５４　個のアミノ酸配列については本明細書の
末尾参照）と、１位にＡｌａ残基のない上記の１５４　
個のアミノ酸型からなる　１５３個のアミノ酸ヒトｂ−
ＦＧＦとの約５０：５０混合物でも良い。

【００１３】ミクロスフェアは、典型的にはセルロース
、セルロース誘導体、でんぷん、でんぷん誘導体、ゼラ
チン、アルブミン、コラーゲン、デキストラン又はデキ
ストラン誘導体から構成されている。ミクロスフェアは
水不溶性且つ水膨潤性である。デキストラン誘導体から
構成されるミクロスフェアは、好ましくはカルボキシル
化又は硫酸化デキストランのような陰イオン性誘導体又
はジエチルアミノエチルもしくは第４級アミノエチルデ
キストランのような陽イオン性誘導体からなっていても
良い。ミクロスフェアはＳｐｈｅｒｅｘ　（商標）ミク
ロスフェアのような架橋でんぷんミクロスフェア又は架
橋デキストランミクロスフェアである。

【００１４】ミクロスフェアには創傷又は熱傷の治療に
使用するのに有効な成長因子が充填されている。成長因
子の量は必要条件に応じて設定され得る。しかしながら
、典型的には、ミクロスフェアにはミクロスフェア１ｇ
当り０．２　〜５．０ｍｇ　の成長因子が充填される。 有効な量はミクロスフェア１ｇ当り０．８　〜１．５ｍ
ｇ　の成長因子である。

【００１５】更に、散剤は治療薬を全く充填してないミ
クロスフェアを含んでいてもよい。別の成長因子のよう
な他の治療薬を充填したミクロスフェアが非充填ミクロ
スフェアに加えて、又は非充填ミクロスフェアの代りに
存在していてもよい。非充填ミクロスフェアは成長因子
を充填したミクロスフェアを希釈するのに使用され得る
。他の治療薬を充填したミクロスフェアは成長因子以外
の他の薬剤を創傷又は熱傷の部位にデリバリーするのに
も使用し得る。典型的には、非充填ミクロスフェア又は
他の薬剤を充填したミクロスフェアは、成長因子を充填
したミクロスフェアと同じ組成及びサイズを有する。 それ故、これらの他のミクロスフェアも一般に生体内劣
化性である。

【００１６】本発明の散剤は、典型的には平均粒径５〜
１０００μｍ　、好ましくは２０〜２５０　μｍを有す
る。平均粒径２０〜３０μｍ　、例えば２０〜２５μｍ
　を有する散剤が適当である。実際には、平均粒径２０
〜１００　μｍ　、例えば５０〜９０μｍ　を有する散
剤もまた適している。

【００１７】散剤は、 （ｉ）　　水不溶性・水膨潤性の多糖ミクロスフェアを
ヘパリン結合成長因子の水溶液に浸漬する工程、及び（
ｉｉ）　　成長因子水溶液中のミクロスフェア分散物を
凍結乾燥する工程、からなる方法によって製造される。

【００１８】まず成長因子の水溶液中に所定量のミクロ
スフェアを浸漬することによって、成長因子をミクロス
フェアに充填する。ミクロスフェア：溶液中の成長因子
の比、ミクロスフェア：成長因子の溶液の比は広く変化
させ得る。ミクロスフェア：成長因子の比は８：１（Ｗ
／Ｗ）〜８０００：１（Ｗ／Ｗ）が好ましい。またミク
ロスフェアは成長因子の溶液に対して０．００５　％（
Ｗ／Ｖ）〜５％（Ｗ／Ｖ）の量で存在するのが好ましい
。ｐＨ及びイオン強度は、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ８及
びＩ＝０〜Ｉ＝１の範囲内で変化させ得る。

【００１９】成長因子を充填すべきミクロスフェアは、
典型的には平均粒子直径２０〜２５０　μｍ　を有する
。平均直径２０〜３０μｍ　、例えば２０〜２５μｍ　
を有するミクロスフェアは、平均粒子直径２０〜１００
　μｍ　、例えば５０〜９０μｍを有するミクロスフェ
アと同様適している。

【００２０】成長因子は陰イオン重合体で複合化するこ
とによって安定化される。陰イオン重合体は、天然の重
合体でもよい。陰イオン重合体はグリコサミノグリカン
、セルロース、シクロデキストリン、キサンタンゴムで
あっても良い。適当な重合体の例としては、ヘパリン、
ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒ
アルロナート、アルギナート、硫酸セルロース、カルボ
キシメチルセルロース、α−，β−及びδ−シクロデキ
ストリンの誘導体及びそれらの重合体が挙げられる。陰
イオン重合体による成長因子の複合化は、ミクロスフェ
アを浸漬させる溶液中で行われる。溶液中にジチオスレ
イトールのような抗酸化剤を存在させてもよい。

【００２１】浸漬の間、ミクロスフェアはその化学的組
成、非膨潤直径、架橋剤の種類及びミクロスフェアに対
する相対的含量、温度、ｐＨ、イオン強度、溶液の性質
及びミクロスフェア上の表面変性剤の存在により、ある
程度膨潤される。ミクロスフェアを、成長因子がミクロ
スフェアの上及び／又は内に吸収されるに十分な時間浸
漬させる。浸漬（培養）に必要な時間は広範囲に変化さ
せ得る。時間は室温で２分〜４８時間、好ましくは２分
〜２時間であり得る。

【００２２】浸漬工程の次に、水を除去するために凍結
乾燥を実施する。凍結乾燥方法は任意である。非常に簡
単な装置（例えばフラスコに入れた成長因子溶液中のミ
クロスフェアをフリーザーから取り出し、次にフラスコ
を真空ポンプに直接取り付ける）を用いても、種々の温
度（棚、生成物、冷却器）、真空度及び時間を制御し得
る精巧な凍結乾燥機を用いても良好な結果が得られる。

【００２３】成長因子を充填し、凍結乾燥機から散剤の
形で得られたミクロスフェアを、創傷又は熱傷の癒合に
使用する適当な容器に入れ得る。充填したミクロスフェ
アを一般に非充填ミクロスフェア、他の因子もしくは別
の治療薬を充填したミクロスフェア、又は散剤（充填も
しくは非充填）と混合することによって希釈し得る。し
かしながら、適当な量の非充填ミクロスフェアで希釈し
た成長因子充填ミクロスフェアを用いるのが好ましい。 この適当量は、散剤が熱傷又は創傷の部位を完全に覆う
という要件に依存する。

【００２４】創傷又は熱傷の治療のために、本発明の散
剤は創傷又は熱傷部位を覆うように使用される。次にミ
クロスフェアは組織から液体を排し、それにより有益な
洗浄効果のあるように膨潤する。膨潤後、ゲルがｉｎ　
ｓｉｔｕ　で得られ、成長因子が放出される。ゲルは他
の用途のための洗浄により容易に除去し得る。

【００２５】創傷又は熱傷の治療方法は、創傷又は熱傷
に治療上有効量の本発明の散剤を適用することからなる
。散剤は創傷又は熱傷の部位に散布しても良い。その部
位を覆うように包帯を適用してもよい。ゲルは自然に形
成する。例えば毎日包帯を除くと、ゲルは除去され、創
傷又は熱傷はきれいになる。次に再び散剤を投与し得る
。

【００２６】実際には、創傷又は熱傷の上に散剤を散布
するよりもむしろ、散剤を取り込んだ包帯が使用される
。包帯は創傷又は熱傷と接触する面の中又は表面の上に
散剤を含んでいる。このような包帯は必要に応じて交換
し得る。

【００２７】ヒトの患者の創傷又は熱傷に適用される散
剤の量は、創傷又は熱傷の程度、体における創傷又は熱
傷の部位、散剤を傷に散布するのかもしくは散剤を取り
込んだ包帯を使用するのか等の種々の因子によって決ま
る。しかしながら、典型的には１０ｎｇ〜１ｍｇ／ｃｍ
２　の量の成長因子をデリバリーするのに十分な量の散
剤を投与しなければならない。

【００２８】

【実施例】次の実施例は、本発明を説明するものである
。製法例も示す。

【００２９】製法実施例：ｂ−ＦＧＦ（ＦＣＥ２６１８
４）の製法 ｂ−ＦＧＦの合成ＤＮＡ配列及びこのような配列を有す
る発現プラスミドの構築を、ＥＰ−Ａ−３６３６７５　
に記載された方法で実施した。発酵及び精製工程を次の
ようにして実施した。

【００３０】（ａ）　　発酵工程 Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｐａｓｔｅｕｒ　ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎのバクテリア菌株、Ｅ．　ｃｏｌｉ　型Ｂを、ｂ
−ＦＧＦをコードするヒト遺伝子及びテトラサイクリン
耐性をコードする遺伝子の両方を有するプラスミドで形
質転換した。この形質転換菌株を組み換え非グリコシル
化ｈ−ｂ−ＦＧＦ（ヒトｂ−ＦＧＦ）の製造に使用した
。この菌株のＭａｓｔｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ（１５
個の凍結乾燥したバイアル）及びＷｏｒｋｉｎｇ　Ｃｅ
ｌｌ　Ｂａｎｋ　（Ｗ．Ｃ．Ｂ．）（７０個の−１９０
　℃で液体窒素下貯蔵したバイアル）を用意した。Ｗ．
Ｃ．Ｂ．の１個のバイアルの内容物を発酵フェーズの接
種源として使用した。

【００３１】発酵工程は、培養媒体４リットルを充填し
た１０リットル酵器中で実施した。菌株の選択条件を保
持するためにテトラサイクリン塩酸塩を媒体に加えた。 ３７℃で２０時間の生長後、最終的なバイオマスは４２
±２ｇ／ｌ　乾燥重量であり、比較ゲル電気泳動法によ
って測定したｂ−ＦＧＦの生成量は２５００±５００ｍ
ｇ　／ｌ　であった。

【００３２】大量のバクテリアを生長させるためには発
酵フェーズの間、純粋酸素を濃厚化することが必要であ
った。

【００３３】（ｂ）　　第１の精製 細胞（微生物）を全発酵ブイヨンから遠心分離によって
分離した。得られたペレットを塩化ナトリウムを含有す
る燐酸ナトリウム緩衝液中に再県濁させた。細胞を十分
切断するためには高圧のホモジナイザーを少なくとも３
回通過させることが必要である。得られた細胞の溶菌液
を遠心分離で清澄化し、上澄を集め、次の工程に供した
。

【００３４】（ｃ）　　精製 精澄化した上澄をＳｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標）Ｓ　Ｆ
ａｓｔ　Ｆｌｏｗ（陽イオン交換体）のカラムに充填し
、生成物を燐酸塩緩衝液（商品）中の塩化ナトリウム濃
度を連続的に上昇させて溶離した。更に生成物をＨｅｐ
ａｒｉｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂカラム上で燐酸塩
緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を連続的に上昇させて溶
離することにより精製した。最後に、緩衝液の交換をＳ
ｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ２５樹脂上で行い、バルク生
成物緩衝液（燐酸ナトリウム−ＥＤＴＡ）中の生成物を
得た。

【００３５】（ｄ）　　カラムの消毒 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｓ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　及びＳ
ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラムを、水酸化ナトリウム溶
液で洗浄して消毒した。Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　を３Ｍ塩化ナトリウムを含有するｐＨ＝８．５
　及びｐＨ＝５．５　の溶液を用いて交互に洗浄した。 この操作で、ＦＣＥ２６１８４と呼称されるｂ−ＦＧＦ
を得た。これは、Ａｂｒａｈａｍ　等によって報告され
ている　１５５個のアミノ酸型のアミノ酸配列を有する
が、Ｎ−未満Ｍｅｔ　残基のない　１５４個のアミノ酸
ヒトｂ−ＦＧＦと１位にＡｌａ　残基のない上記　１５
４個のアミノ酸型からなる　１５３個のアミノ酸ヒトｂ
−ＦＧＦとの約５０：５０混合物である。

【００３６】実施例１ 前もって０．０１Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ＝６．０　に調整
し、前もってでんぷんミクロスフェア４ｇを加えた二度
蒸留した水２００ｍｌ　に、ＦＣＥ２６１８４　５ｍｇ
及びジチオスレイトール１０ｍｇを溶解した。でんぷん
粒子は光学顕微鏡で測定した平均直径が２１±５μｍで
あるＳｐｈｅｒｅｘ　型の架橋でんぷん粒子であった。 次に懸濁液を室温で３０分間静置した後凍結乾燥した。 白色の粉末を得た。

【００３７】実施例２ 前もって０．０１Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ＝６．０　に調整
し、前もってデキストランミクロスフェア４ｇを加えた
二度蒸留した水２００ｍｌ　に、ＦＣＥ２６１８４　５
ｍｇ及びジチオスレイトール１０ｍｇを溶解した。デキ
ストランミクロスフェアは光学顕微鏡で測定した直径が
２８±７μｍ　のＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０　特級品
の架橋ミクロスフェアであった。次に懸濁液を室温で３
０分間静置した後凍結乾燥した。白色の粉末を得た。

【００３８】ｂ−ＦＧＦを充填したデキストランミクロ
スフェアの安定性を２５℃でテストした。その結果を下
記表１に示す。表中の％の値は時間が０の時の安定性に
対する安定性をパーセントで表示したものであり、すな
わち高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によっ
て測定した時間０の時のｂ−ＦＧＦの量に対するｂ−Ｆ
ＧＦの残留量を表している。

【００３９】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表　　１　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　時　　間　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　％　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１週間　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　９６．２　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１ケ月　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　８６．３　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２ケ月　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　７８．８　 ＨＰＬＣ法 材料 ｂ−ＦＧＦバルク冷凍溶液　　　　−作業標準物質アセ
トニトリル　　　　　　　　　　　　　　−ＨＰＬＣ等
級水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　−ＨＰＬＣ等級０．９　％塩化ナトリウム注入液
　　−医薬等級のものトリフルオロ酢酸　　　　　　　
　　　　　−分析等級のもの１，４−ジチオスレイトー
ル　　−分析等級のもの装置 ・下記のものを備えた液体クロマトグラフＭｉｌｔｏｎ
　ＲｏｙモデルＣＭ４０００又はその同等物 −クロマトグラフカラム： Ｖｙｄａｃ　２１８Ｔ中　５４　３００Ａ（平均粒子サ
イズ５μｍ）を充填した（長さ２５０ｍｍ　、内径４．
６ｍｍ）、又はその同等物−注入バルブ：　１００μｌ
　試料ループを備えたＲｈｅｏｄｙｎｅモデル７１２５
、又はその同等物 −検出器：ＳｈｉｍａｄｚｕモデルＳＰＤ　　６Ａ、又
はその同等物 −積分記録計：ＳＰ４２７０（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙ
ｓｉｃｓ）、又はその同等物 ・メンブランフィルター−孔げき率０．２２μｍ，　Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｄｕｒａｐｏｒｅ　ＧＶＷＰ、又は
その同等物・高精密な実験室ガラス器具 ・プラスチックのピペットチップ（Ｇｉｌｓｏｎ）・自
動ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ） ・使い捨てのプラスチックミクロ管−容量２．５ｍｌ　
（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ） 溶液 ・メングランフィルターを介して濾過し脱気した、０．
１　％トリフルオロ酢酸（Ｗ／Ｖ）を含有する水からな
る移動相（Ａ） ・メンブランフィルターを介して濾過し脱気した、０．
１　％トリフルオロ酢酸（Ｗ／Ｖ）を含有するアセトニ
トリル９５％−水５％からなる移動相（Ｂ） ・１，４−ジチオスレイトール溶液 ＨＰＬＣ等級の水に約１ｍｇ／ｍｌ　含有する溶液を調
製・標準溶液 標準的に調整し、正確に秤量した、適当量のｂ−ＦＧＦ
の作業標準物質のバルク溶液を使い捨てプラスチックミ
クロ管に移す。

【００４０】量の１，４−ジチオスレイトール溶液で希
釈する約５０μｇ／ｍｌのｂ−ＦＧＦを含む最終溶液を
得るために適当化。標準溶液は新しく調製したものをそ
の日の内に使用しなければならない。

【００４１】・試料溶液 少なくとも５個の凍結乾燥したバイアルを用いて試料溶
液を調製する。

【００４２】ｂ−ＦＧＦを充填したミクロスフェア５０
μｇ　を加えた各バイアルの内容物を０．９　％塩化ナ
トリウム注入液１．０ｍｌ　に溶解し、次に調製した溶
液すべてをプールした。

【００４３】プールした試料を少なくとも３０分間デカ
ントし、次に液体クロマトグラフに注入する。

【００４４】クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）の条件標準溶
液と試料溶液とを次の実験条件下液体クロマトグラフに
少なくとも３回交互に注入した。

【００４５】カラム温度：室温（２２±２℃）移動相流
速：１ｍｌ／分 分析波長：２１０　±／ｎｍ 　　　　検出器感度：検出器“コンピューター”アウト
プットを最大感度の積分器につないだ 注入容量：　１００μｌ 積分記録計 減衰：２５６ チャート速度：０．５ｃｍ　／分 実施例３ 実施例１で得た粉末を、平均直径２１±５μｍ　を有す
るＳｐｈｅｒｅｘ　ミクロスフェア６ｇと１０分間回転
混合した。これらのＳｐｈｅｒｅｘ　ミクロスフェアに
は何も充填しなかった。

【００４６】実施例４ 実施例２で得た粉末を、平均直径２８±７μｍ　を有す
るＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０　特級品のミクロスフェ
ア６ｇと１０分間回転混合した。これらのＳｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ−５０　特級品のミクロスフェアには何も充填
しなかった。

【００４７】実施例５ 実施例１で得た粉末を、平均直径２８±７μｍ　を有す
るＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０　特級品のミクロスフェ
ア６ｇと１０分間回転混合した。これらのＳｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ−５０　特級品のミクロスフェアには何も充填
しなかった。

【００４８】実施例６ 実施例２で得た粉末を、平均直径２１±５μｍ　を有す
るＳｅｐｈａｄｅｘミクロスフェア６ｇと１０分間回転
混合した。これらのＳｅｐｈａｄｅｘミクロスフェアに
は何も充填しなかった。

【００４９】実施例７ 前記実施例と同様な方法で、比較的安定性な同様の処方
物を次のものを用いて得ることができる：・製法実施例
に記載した　１５３個及び　１５４個アミノ酸型ヒトｂ
−ＦＧＦ特に　１５４個のアミノ酸型が約５０〜約１０
０　％の量で存在するｂ−ＦＧＦ； ・　１４６個のアミノ酸残基、すなわちアミノ酸９から
出発する本明細書の末尾に記載したアミノ酸配列を有す
るヒトｂ−ＦＧＦ；及び ・Ａｂｒａｈａｍ　等により報告された　１５５個のア
ミノ酸残基、すなわち、Ｎ−未満Ｍｅｔ残基を有する他
は、下記に示したアミノ酸配列を有するヒトｂ−ＦＧＦ
。

【００５０】

【化１】

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ヘパリン結合成長因子を充填した水不
   溶性・水膨潤性多糖ミクロスフェアを含む散剤。
2. 【請求項２】　　成長因子が塩基性の繊維芽細胞成長因
   子（ｂ−ＦＧＦ）である請求項１に記載の散剤。
3. 【請求項３】　　ミクロスフェアがセルロース、セルロ
   ース誘導体、でんぷん、でんぷん誘導体、ゼラチン、ア
   ルブミン、コラーゲン、デキストラン又はデキストラン
   誘導体から構成される請求項１又は２に記載の散剤。
4. 【請求項４】　　ミクロスフェアが架橋でんぷんミクロ
   スフェア又は架橋デキストランミクロスフェアである請
   求項３に記載の散剤。
5. 【請求項５】　　成長因子が陰イオン重合体で複合化さ
   れている請求項１〜４のいずれか１項に記載の散剤。
6. 【請求項６】　　更に、治療薬を充填していないミクロ
   スフェアを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の散
   剤。
7. 【請求項７】　　（ｉ）　水不溶性・水膨潤性の多糖ミ
   クロスフェアをヘパリン結合成長因子の水溶液に浸漬す
   る工程、及び（ｉｉ）成長因子水溶液中のミクロスフェ
   ア分散物を凍結乾燥する工程からなる請求項１に記載の
   散剤の製造方法。
8. 【請求項８】　　工程（ｉ）　を、周囲温度下２分〜２
   時間実施する請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】　　工程（ｉ）　におけるミクロスフェア
   ：溶液中の成長因子の比が８：１〜８０００：１（Ｗ／
   Ｗ）であり、工程（ｉ）　においてミクロスフェアが成
   長因子の溶液に対して０．００５　％〜５％（Ｗ／Ｖ）
   の量で存在する請求項７又は８に記載の方法。
10. 【請求項１０】　　創傷又は熱傷の治療に使用する請求
    項１〜６のいずれか１項に記載の散剤。
11. 【請求項１１】　　請求項１〜６のいずれか１項に記載
    の散剤を含む包帯。