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JPH04278088A - ビオチンシンセターゼをコードする遺伝子を含むdna断片およびその利用 - Google Patents

ビオチンシンセターゼをコードする遺伝子を含むdna断片およびその利用

Info

Publication number
JPH04278088A
JPH04278088A JP3062563A JP6256391A JPH04278088A JP H04278088 A JPH04278088 A JP H04278088A JP 3062563 A JP3062563 A JP 3062563A JP 6256391 A JP6256391 A JP 6256391A JP H04278088 A JPH04278088 A JP H04278088A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
biotin
plasmid
dna fragment
dna
synthetase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP3062563A
Other languages
English (en)
Inventor
Kazuhisa Hatakeyama
和久 畠山
Keiko Kohama
恵子 小浜
Mayumi Hosogane
細金 真由美
Miki Kobayashi
幹 小林
Yasurou Kurusu
泰朗 久留主
Hideaki Yugawa
英明 湯川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Original Assignee
Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Petrochemical Co Ltd filed Critical Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority to JP3062563A priority Critical patent/JPH04278088A/ja
Publication of JPH04278088A publication Critical patent/JPH04278088A/ja
Pending legal-status Critical Current

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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ビオチンシンタ−ゼ(
すなわちデスチオビオチンからビオチンの生合成反応に
関与する酵素)をコ−ドする遺伝子を含むコリネ型細菌
由来のDNA断片、該DNA断片を含む組換えプラスミ
ド、該組換えプラスミドで形質転換されたコリネ型細菌
及び該コリネ型細菌を用いるビオチンシンセタ−ゼの製
造法に関する。
【0002】ビオチンシンセタ−ゼは、ビオチン生合成
に関与する酵素の一つであり、ビオチン製造における産
業上有用な酵素である。
【0003】またビオチンは、ヒト、動物、植物及びあ
る種の微生物の生育に必要とされるビタミンの1種であ
り、特に皮膚代謝の調整剤として、あるいはヒトの脱毛
防止養毛剤として、あるいは、家畜飼料への添加剤とし
て用いられる有用な物質である。
【0004】従来、微生物を用いたビオチンの製造法と
しては、バチルス(Bacillus)属、エシエリヒ
ア(Escherichia)属、アグロバクテリウム
(Agrobacterium)属、クロモバクテリウ
ム(Chromobacterium)属、シユ−ドモ
ナス(Pseudomonas)属、ア−スロバクタ−
(Arthrobacter)属等の微生物を用いる方
法が知られている(特開昭56−160998号公報)
。またこれら野生株に人工的に突然変異を生起させてビ
オチン生産能を付与する方法も提案されている(例えば
 H.Yamagataet al,Agri.Bia
l.Chem.,47、1611、1983)。
【0005】しかしながら、微生物を用いてビオチンを
製造しようとする場合、野生株はビオチンによる強力な
フイ−ドバツク抑制機構のため(Y.Izumi,K.
Ogata,Adv.Appl.Microbial.
22、155−157、1977)、ビオチンは極少量
しか生成されない。また変異株を用いる方法でも生成量
は必ずしも満足し得るものではなかつた。
【0006】また、工業的利用上多くの利点を有するブ
レビバクテリウム属およびコリネバクテリウム属細菌を
含むコリネ型細菌のある種の菌株、例えばブレビバクテ
リウム・フラバム(Brevibacterium f
lavum)MJ−233、ブレビバクテリウム・ラク
トフア−メンタム(Brevibacterium l
actofermentum)ATCC13869、コ
リネバクテリウム・グルタミカム(Corynebac
terium glutamicum)ATCC318
31、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Bre
vibacterium ammoniagenes)
ATCC13745等はビオチン要求性を有しており、
ビオチンを全く生産しないことが知られている。
【0007】ビオチンの生合成に関与する遺伝子として
は、エシエリヒア・コリ(Escherichia c
oli)由来の遺伝子がよく研究されており、bioA
、bioB、bioC、bioD、bioF、bioH
遺伝子が存在することが知られている。このうち、bi
oAは7,8−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
エラ−ゼ、bioBはビオチンシンセタ−ゼ、bioC
はピメリルCoAシンテタ−ゼ、bioDはデスチオビ
オチンシンテタ−ゼ、bioFは7−ケト−8−アミノ
ペラルゴン酸シンテタ−ゼをそれぞれコ−ドすることが
知られ、bioHについては、その働きは、まだ明らか
でない(A.J.Otsuka et. al., J
.Biol.Chem.263、19577−1958
5、1988)。また、bioA、bioB、bioC
、bioD、bioF遺伝子はbioABFCDなるオ
ペロンを形成しており、その発現は、bioAとbio
B遺伝子の間に存在するオペレ−タ−により制御される
ことがわかつている。また、そのオペレ−タ−の制御は
、bioA遺伝子にコ−ドされたビオチンリプレツサ−
が、ビオチンにより活性化されることによりオペレ−タ
−に結合し、ビオチン生合成オペロンの発現を抑制する
ことが知られている(J.Biol.Chem.263
、1013−1016、1988)。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】この発明は、コリネ型
細菌のビオチン生合成に関与する遺伝子を解析・単離し
、該遺伝子を同種であるコリネ型細菌に導入し、該遺伝
子産物を効率的にコリネ型細菌から取得することを目的
としてなされたものである。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた。その結果、ビオチン要
求性の大腸菌変異株を用いる交差相補性試験により、ビ
オチン要求性のコリネ型細菌は少くともbioB、bi
oA、bioDの3種のビオチン生合成に関与する遺伝
子を保有していることが明らかとなり、該遺伝子を適当
なベクタ−プラスミドに導入して、コリネ型細菌を形質
転換し、該コリネ型細菌を培養することにより、培養物
中に効率的にビオチン生合成に関与する酵素が生成する
ことを見い出し本発明を完成するに至つた。かくして本
発明によれば、(1) コリネ型細菌由来のビオチンシ
ンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子(bioB)を含むDN
A断片、(2) 該DNA断片が導入された組換えプラ
スミド、(3) 該組換えプラスミドで形質転換された
コリネ型細菌、(4) 該コリネ型細菌を培養し、培養
物中にビオチンシンセタ−ゼを生成せしめることを特徴
とするビオチンシンセタ−ゼの製造法、が提供される。
【0010】以下本発明についてさらに詳細に説明する
。本発明の「ビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子
を含むDNA断片」(以下これを「bioB断片」と略
称することがある)は、デスチオビオチンからビオチン
への変換反応を触媒する酵素、すなわちビオチンシンセ
タ−ゼをコ−ドする遺伝子(bioB)を含むDNA断
片である。
【0011】上記bioB断片の供給源となる微生物は
、コリネ型細菌であれば特に限定されるものではないが
、一般的には、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−2
33(FERM BP−1497)およびその由来株、
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevib
acterium ammoniagenes)ATC
C6871、同ATCC13745、同ATCC137
46、ブレビバクテリウム・デバリカタム(Brevi
bacterium divaricatum)ATC
C14020、ブレビバクテリウム・ラクトフア−メン
タム(Brevibacterium lactofe
rmentum)ATCC13869、コリネバクテリ
ウム・グルタミカム(Corynebacterium
 glutamicum)ATCC31831等が有利
に使用される。
【0012】これらの供給源微生物からbioB断片を
調製するための基本的操作の一例を述べれば次のとおり
である。
【0013】すなわち、bioB断片の調製は、上記コ
リネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバム(B
revibacterium flavum)MJ−2
33(FERM BP−1497)株の染色体上に存在
し、この染色体を適当な制限酵素で切断することにより
生ずる切断断片の中から以下に述べる方法で分離、取得
することができる。先ず、ブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ−233株の培養物から染色体DNAを抽出する
。この染色体DNAを適当な制限酵素、例えばSau3
AIを用いて、DNA断片の大きさが約20〜30kb
になるように部分分解する。
【0014】得られたDNA断片をコスミドベクタ−、
例えばpWE15に挿入し、このコスミドをλDNA 
in vitro Packaging Kitを用い
る形質導入により、bioBの欠損した大腸菌変異株(
Journal of Bacteriology,v
ol 94、p2065−2066、1967及びJo
urnal of Bacteriology vol
 112、p830−839、1972参照)に導入す
る。この大腸菌変異株を、ビオチンを含まない選択培地
に塗沫する。
【0015】得られる形質転換株よりコスミドDNAを
抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレ
ビバクテリウム・フラバムMJ−233株染色体由来の
bioB断片を確認・取得することができる。かくして
得られるbioB断片は、大きさが約20〜30kbと
大きく、実用的でないので、さらに短かい断片に特定化
する必要がある。
【0016】次に、上記で得られたbioA、bioD
断片を含むコスミドを適当な制限酵素を用いて切断し、
得られるDNA断片を、大腸菌で複製可能なベクタ−プ
ラスミドに挿入しこのベクタ−プラスミドを通常用いら
れる形質転換法、例えば、塩化カルシウム法、電気パル
ス法による形質転換により、前記bioBの欠損した大
腸菌変異株に導入し、この大腸菌変異株をビオチンを含
まない選択培地に塗沫する。
【0017】得られる形質転換株よりプラスミドDNA
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムMJ−233株染色体由来
のbioB断片を確認・取得することができる。
【0018】このようにして得られるbioB断片の一
つは、上記ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
株の染色体DNAを制限酵素Sau3AIの部分分解に
より切り出し、さらにそれを制限酵素Hind III
で切り出すことによつて得られる大きさが約5.5kb
のDNA断片を挙げることができる。
【0019】この約5.5kbのビオチンシンセタ−ゼ
をコ−ドする遺伝子を含むDNA断片を、各種の制限酵
素で切断したときの認識部位数及び切断断片の大きさを
下記表1に示す。
【0020】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、DNA断片又はプラスミドを、過剰
の制限酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそ
れ自体既知の方法に従い1%アガロ−スゲル電気泳動お
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能
な断片の数から決定した値を採用した。
【0021】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロ−スゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシエリヒア・コリのラムダフア−ジ(λphag
e)のDNAを制限酵素Hind IIIで切断して得
られる分子量既知のDNA断片の同一アガロ−スゲル上
での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシエリ
ヒア・コリのフアイ・エツクス174フア−ジ(φx1
74phage)のDNAを制限酵素Hae IIIで
切断して得られる分子量既知のDNA断片の同一ポリア
クリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基
づき、切断DNA断片又はプラスミドの各DNA断片の
大きさを算出する。プラスミドの大きさは、切断断片そ
れぞれの大きさを加算して求める。なお、各DNA断片
の大きさの決定において、1kb以上の断片の大きさに
ついては、1%アガロ−スゲル電気泳動によつて得られ
る結果を採用し、約0.1kbから1kb未満の断片の
大きさについては4%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によつて得られる結果を採用した。
【0022】
【表1】                          
    表  1        制限酵素    認
識部位数    切断断片の大きさ(kb)     
   KpnI           1      
       3.0 、 2.5        S
acI           1          
   1.7 、 3.8        EcoRI
          1             0
.6 、 4.9   上記表1中、3.0kbのKpnI切断断片、1.
7kbのSacI切断断片もまたビオチンシンセタ−ゼ
をコ−ドすることが確認されており、従つてこれらの切
断断片もまた、本発明のビオチンシンセタ−ゼをコ−ド
する遺伝子を含むDNA断片に包含されるものである。
【0023】かくして、ビオチンシンセタ−ゼをコ−ド
する遺伝子は、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−2
33の染色体DNAを制限酵素Hind IIIおよび
KpnIで切り出すことにより得られる大きさが約3.
0kbのDNA断片、および同染色体DNAを制限酵素
Hind IIIおよびSacIで切り出すことにより
得られる大きさが約1.7kbのDNA断片中に含まれ
ているものと考えられる。
【0024】上記約3.0kbのDNA断片および約1
.7kbのDNA断片を、さらに各種の制限酵素で切断
したときの認識部位数および切断断片の大きさを、各々
下記表2および表3に示す。
【0025】
【表2】                          
    表  2        制限酵素    認
識部位数    切断断片の大きさ(kb)     
   SacI           1      
       1.7 、 1.3        E
coRI          1          
   0.6 、 2.4
【0026】
【表3】                          
    表  3        制限酵素    認
識部位数    切断断片の大きさ(kb)     
   SphI           1      
       0.2 、 1.5        E
coRI          1          
   0.6 、 1.1        SmaI 
          1             1
.0 、 0.7        Hinc II  
      1             1.5 、
 0.2   一方、上記したブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233の染色体DNAを制限酵素Hind IIIお
よびSacIで切り出すことにより得られる大きさが約
1.7kbのDNA断片については、その塩基配列をプ
ラスミドpUC18またはpUC19を用いるジデオキ
シヌクレオチド酵素法(dideoxy chain 
termination 法)(Sanger,F.e
t al.,Proc.Nat.Acad.Sci.U
SA 74、5463、1977)により決定すること
ができる。このようにして決定した上記約1.7kbの
DNA断片の塩基配列中のオ−プンリ−デイングフレ−
ムの存在から決定したビオチンシンセタ−ゼをコ−ドす
る遺伝子(bioB)は、次の配列を有しており、33
4のアミノ酸をコ−ドする1002の塩基対から構成さ
れる:
【0027】
【化4】
【0028】
【化5】
【0029】
【化6】
【0030】上記の塩基配列を包含して成る本発明のビ
オチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子を含むDNA断
片は、天然のコリネ型細菌染色体DNAから分離された
もののみならず、通常用いられるDNA合成装置、例え
ばベツクマン社製 System−1Plus を用い
て合成されたものであつてもよい。
【0031】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムMJ−233の染色体DNAから取得される本発
明のDNA断片は、ビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする
機能を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部
の塩基が他の塩基と置換されていてもよく又は削除され
ていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよ
く、さらに塩基配列の一部が転位されているものであつ
てもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明のビオ
チンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子を含むDNA断片
に包含されるものである。
【0032】以上に詳述した大きさが約5.5kb、約
3.0kb、約1.7kbのDNA断片の制限酵素によ
る切断点地図を図1に示す。
【0033】本発明のビオチンシンセタ−ゼをコ−ドす
る遺伝子を含むDNA断片(bioB断片)は、コリネ
型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少
くとも含むプラスミドベクタ−に導入することにより、
コリネ型細菌内でビオチンシンセタ−ゼの高発現可能な
組換えプラスミドを得ることができる。
【0034】本発明のbioB断片を導入することがで
きる、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を
少くとも含むプラスミドベクタ−としては、特願平2−
4212号明細書に開示されているプラスミドpCRY
30;特開平2−276575号公報に記載されている
プラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2
KX、pCRY3K7、pCRY3KE、pCRY3K
X;特開平1−191686号公報に記載されているプ
ラスミドpCRY2及びpCRY3;特開昭58−67
679号公報に記載のpAM330;特開昭58−77
895号公報に記載のpHM1519;特開昭58−1
92900号公報に記載のpAJ655、pAJ611
及びpAJ1844;特開昭57−134500号に記
載のpCG1;特開昭58−35197号公報に記載の
pCG2;特開昭57−183799号公報に記載のp
CG4及びpCG11等を挙げることができる。
【0035】中でもコリネ型細菌の宿主ベクタ−系で用
いられるプラスミドベクタ−としては、コリネ型細菌内
でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細
菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とをもつも
のが好ましく、例えばプラスミドpCRY30、pCR
Y21、pCRY2KE、pCRY2KE、pCRY2
KX、pCRY3K7、pCRY3KE、pCRY3K
Xが好適に使用される。
【0036】上記プラスミドベクタ−pCRY30を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス(Brevibacterium stationi
s)IFO12144(FERM BP−2515)か
らプラスミドpBY503DNAを抽出(このプラスミ
ドの詳細は特開平1−95785号公報参照)し、制限
酵素XhoIで大きさが約4.0kbのプラスミドの複
製増殖機能を司る遺伝子を含むDNA断片を切り出し、
制限酵素EcoRIおよびKpnIで大きさが約2.1
kbのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むDN
A断片を切り出す。これらの両断片をプラスミドpHS
G298(宝酒造製)のEcoRI、KpnI部位及び
SalI部位に組み込むことにより、プラスミドベクタ
−pCRY30を調製することができる。
【0037】次に、上記プラスミドベクタ−への本発明
のbioB断片の導入は、例えばプラスミドベクタ−中
に1個所だけ存在する制限酵素部位を、該制限酵素で開
裂し、そこに前記bioB断片を必要に応じてS1ヌク
レア−ゼで処理して平滑末端とするか、または適当なア
ダプタ−DNAの存在下にDNAリガ−ゼ処理で連絡さ
せることにより行うことができる。
【0038】プラスミドpCRY30への本発明のbi
oB断片の導入は、プラスミドpCRY30を制限酵素
EcoRIで開裂させ、そこに前記ビオチンシンセタ−
ゼをコ−ドする遺伝子を含むDNA断片(bioB断片
)をSlヌクレア−ゼで処理することにより平滑末端と
した後、DNAリガ−ゼで連結させることにより行うこ
とができる。
【0039】このようにして造成されるプラスミドpC
RY30に本発明のbioB断片を導入した組換えプラ
スミドは、ビオチンシンセタ−ゼの製造に好適に用いる
ことができる組換えプラスミドの一つであり、本発明者
らはこれをプラスミドpCRY30−bio2と命名し
た。プラスミドpCRY30−bio2の作成方法の詳
細については、後記実施例4及び5で説明する。
【0040】このプラスミドpCRY30−bio2の
制限酵素切断点地図を図2に示す。このようにして造成
されるビオチンシンセタ−ゼ遺伝子を含むコリネ型細菌
内で複製増殖可能なプラスミドを、宿主微生物に導入し
培養することにより、ビオチンシンセタ−ゼを安定に効
率よく生産することが可能となる。
【0041】本発明によるプラスミドで形質転換しうる
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムMJ−233(FERM BP−1
497)、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
−AB−41(FERM BP−1498)、ブレビバ
クテリウム・フラバムMJ−233−ABT−11(F
ERM BP−1500)、ブレビバクテリウム・フラ
バムMJ−233−ABD−21(FERM BP−1
499)等が挙げられる。
【0042】なお、上記のFERM BP−1498の
菌株は、FERMBP−1497号の菌株を親株として
DL−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
−ル資化性微生物である(特公昭59−28398号公
報第3〜4欄参照)。また、FERM BP−1500
号の菌株は、FERM BP−1497の菌株を親株と
したL−α−アミノ酪酸トランスアミナ−ゼ高活性変異
株である(特開昭62−51998号公報参照)。さら
に、FERM BP−1499の菌株はFERMBP−
1497の菌株を親株としたD−α−アミノ酪酸デアミ
ナ−ゼ高活性変異株である(特開昭61−177993
号公報参照)。
【0043】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス(Brevibacterium
 ammoniagenes)ATCC6871、同A
TCC13745、同ATCC13746、ブレビバク
テリウム・デバリカタム(Brevibacteriu
m divaricatum)ATCC14020、ブ
レビバクテリウム・ラクトフア−メンタム(Brevi
bacterium lactofermentum)
ATCC13869、コリネバクテリウム・グルタミカ
ム(Corynebacterium glutami
cum)ATCC31831等を宿主微生物として用い
ることもできる。
【0044】なお宿主としてブレビバクテリウム・フラ
バムMJ−233由来の菌株を用いる場合、本菌株が保
有するプラスミドpBY502(特開昭63−3678
7号公報参照)のため、形質転換が困難である場合があ
るので、そのような場合には、本菌株よりプラスミドp
BY502を除去することが望ましい。そのようなプラ
スミドpBY502を除去する方法としては、例えば、
継代培養を繰り返すことにより、自然に欠失させること
も可能であるし、人為的に除去することも可能である[
Bact.Rev.36 p.361〜405(197
2)参照]。上記プラスミドpBY502を人為的に除
去する方法の一例を示せば次のとおりである。
【0045】宿主ブレビバクテリウム・フラバムMJ−
233の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ(濃度:0.2〜50μg/ml)もしくはエチジ
ウムブロミド(濃度:0.2〜50μg/ml)等を含
む培地に、1ml当り約10細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら、約24時間約35℃で培
養する。 培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約35℃で約2日培
養する。出現したコロニ−から各々独立にプラスミド抽
出操作を行い、プラスミドpBY502が除去されてい
る株を選択する。この操作によりプラスミドpBY50
2が除去されたブレビバクテリウム・フラバムMJ−2
33由来菌株が得られる。
【0046】このようにして得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムMJ−233由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシエリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように[Cal
vin,N.M.and Hanawalt,P.C.
,Journal of Bacteliology,
170,2796(1988);Ito,K.,Nis
hida,T.and Izaki.K.,Agric
ultural and Biological Ch
emistry,52,293(1988)参照]、D
NA受容菌にパルス波を通電することによりプラスミド
を導入することが可能である。
【0047】上記の方法で形質転換して得られるビオチ
ンシンセタ−ゼ産生能を有するコリネ型細菌、例えばブ
レビバクテリウム・フラバムMJ−233由来株の培養
方法を以下に述べる。
【0048】培養は炭素源、窒素源、無機塩等を含む通
常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例え
ばグルコ−ス、エタノ−ル、メタノ−ル、廃糖蜜等が、
そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等
がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また無機
塩としては、例えばリン酸−水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ−ンステイ−プ
リカ−、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加することができる。
【0049】培養は、通常、通気撹拌、振盪等の好気的
条件下に、約20〜40℃、好ましくは25〜35℃の
温度で行うことができる。培養途中のpHは5〜10、
好ましくは7〜8付近で行い、培養中のpHの調整は酸
又はアルカリを添加して行うことができる。
【0050】培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは1
〜5容量%、更に好ましくは2〜3容量%である。また
、培養期間は通常1〜7日間とすることができ、最適期
間は3日間である。
【0051】このようにして得られる培養物から遠心分
離等により菌体を取得することができる。
【0052】かくして培養された菌体は、野生株を培養
した場合に比べて、ビオチンシンセタ−ゼをその菌体内
に多量含有している。菌体内に産生された、ビオチンシ
ンセタ−ゼの含量を調べる方法としては、例えば超音波
処理、酵素処理、ホモジナイズ等の通常用いられる手段
にて破砕し得られる無細胞抽出液を、SDSゲル電気泳
動法[例えば、「蛋白質・酵素の基礎実験法」南江堂刊
、314〜333頁等参照]に付することにより、菌体
内の蛋白質を分離した後、Coomassie Bri
lliant Blue R−250による染色法ある
いは、銀染色法により染色した後、例えばフアルマシア
社製 Ultro Scan XL レ−ザ−デンシト
メ−タ−を用いることにより、菌体中の各種タンパク質
量を測定することができる。かくして、菌体内に産生さ
れた、ビオチンシンセタ−ゼ含量の増加を測定すること
が可能である。
【0053】上記の如くビオチンシンセタ−ゼを高含量
含む菌体を用いることにより、少なくともデスチオビオ
チンを含有する前記通常の栄養培地で培養することによ
り、高効率でビオチンを製造することができる。
【0054】本明細書では、ブレビバクテリウム・フラ
バムMJ−233からビオチンシンセタ−ゼをコ−ドす
る遺伝子(bioB)を含むDNA断片を単離し、該D
NA断片を導入した組換えプラスミドを同じくブレビバ
クテリウム・フラバムMJ−233由来株へ導入し、該
微生物によるビオチンシンセタ−ゼの生産能の向上につ
いて主として詳述したが、ブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ−233由来株の代りに前記した他のコリネ型細
菌を用いても本発明の目的は達成される。
【0055】いわゆるコリネ型細菌は、コリネバクテリ
ウム属やブレビバクテリウム属等の種々の属名、種々の
菌名が付されているが主な菌学的性質を同じくしている
。これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やDNAの塩
基組成が画一的であり、菌種間には70〜80%のDN
Aの相同性があり、非常に近縁な微生物であることは明
らかである(Report of the Ferme
ntation Research Institut
es No.55、p1−5、1980、Intern
ational Journal of System
atic Bacteriology Vol31、p
131−138、1981参照)。
【0056】また、ビオチン要求性のコリネ型細菌、例
えばブレビバクテリウム・フラバムMJ−233(FE
RM BP−1497)、ブレビバクテリウム・ラクト
フア−メンタムATCC13869およびコリネバクテ
リウム・グルタミカムATCC31831について、ビ
オチン生合成に関与する各ステツプの遺伝子が欠損した
ビオチン要求性大腸菌変異株(Journal of 
Bacteriology、vol 112、p830
−839、1972および Journal of B
acteriology、vol 94、p2065−
2066、1967参照)との交差相補性試験(Jou
rnal Bacteriology、vol 96、
p515−524、1968参照)により、そのビオチ
ン生合成系路について検討した結果、これら3種の菌株
は同様にピメリルCoAシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝
子(bioC)および7−ケト−8−アミノペラルゴン
酸シンテタ−ゼをコ−ドする遺伝子(bioF)が欠損
しており、また少くとも7,8−ジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフエラ−ゼをコ−ドする遺伝子(bio
A)、デスチオビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝
子(bioD)およびビオチンシンセタ−ゼをコ−ドす
る遺伝子を保有していることが明らかとなつた。これら
の事実を踏まえれば、ブレビバクテリウム・フラバムM
J−233のみならず、コリネ型細菌全般から単離され
たビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子(bioB
)を含むDNA断片も本発明の範囲に含まれ、また、本
発明のプラスミドで形質転換し得る宿主微生物は、ブレ
ビバクテリウム・フラバムMJ−233に限らず、コリ
ネ型細菌が全て含まれることは明らかである。
【0057】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的に認識を得る一助とみなすべきもの
であり、本発明の範囲を限定するためのものでないこと
を理解しなければならない。
【0058】
【実施例1】コリネ型細菌とビオチン要求性大腸菌変異
株との相補性試験 (A)コリネ型細菌を含有するビオチン欠乏最少培地プ
レ−トの作製 半合成培地A培地[組成:尿素2g、(NH4)2SO
4 7g、K2HPO4 0.5g、KH2PO4 0
.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4・7H2O
 6mg、MnSO4 4〜6H2O 6mg、酵母エ
キス2.5g、カザミノ酸5g、ビオチン200μg、
塩酸チアミン200μg、グルコ−ス20g、純水1l
]1lに、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
(FERM BP−1497)を植菌して、O.D.が
約2.9になるまで培養し、菌体を集めた。得られた菌
体をBM緩衝液[組成:尿素2g、(NH4)2SO4
 7g、K2HPO4 0.5g、KH2PO4 0.
5g、MgSO4 0.5g]で2回洗浄した。この菌
体を10mlのBM緩衝液に懸濁し、その内1mlを、
滅菌後、50℃に放置しておいたビオチン検定用C培地
(尿素0.2%、硫酸アンモニウム0.7%、KH2P
O4 0.05%、K2HPO4 0.05%、MgS
O4・7H2O 0.05%、FeSO4・7H2O 
6ppm、MnSO4・4〜6H2O 6ppm、チア
ミン・HCl 100μg/l、ビタミン・アツセイ用
カザミノ酸0.1%、グルコ−ス0.2%、寒天1.0
%)に添加し、撹拌後、プレ−トに流し、固化した。
【0059】同様にして、ブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ−233(FERM BP−1497)の代わり
に、ブレビバクテリウム・ラクトフア−メンタムATC
C13869、あるいは、コリネバクテリウム・グルタ
ミカムATCC31831を用いて各種のコリネ型細菌
を含んだビオチン欠乏最少培地プレ−トを作製した。 (B)ビオチン要求性大腸菌変異株との相補性試験ビオ
チン生合成系路の各ステツプの欠損したビオチン要求性
大腸菌変異株と各種コリネ型細菌との相補性試験により
、各種コリネ型細菌のビオチン生合成系路を推定するこ
とができる。
【0060】上記(A)で作製した、3種のコリネ型細
菌含有ビオチン欠乏最少培地のプレ−トに、各種ビオチ
ン要求性大腸菌変異株を線状に植菌した。用いたビオチ
ン要求性大腸菌変異株は、エシエリヒア・コリ(Esc
herichia coli)R873(bioA4)
、同R874(bioF12)、同R875(bioB
17)、同R876(bioC18)、同R877(b
ioC19)である[(  )内は各菌株の遺伝子型(
Genotype)を示す、またこれらの菌株の詳細お
よび取得方法については、Journal of Ba
cteriology、vol 94、p2065−2
066(1967)、Journal of Bact
eriology、vol 112、p830−839
(1972)参照)。
【0061】これらのビオチン要求性大腸菌変異株とコ
リネ型細菌が相補した場合は、コリネ型細菌がビオチン
欠乏最小培地のプレ−ト中に生育し、黄色いコロニ−を
形成する。各種ビオチン要求性大腸菌変異株に対応する
コリネ型細菌のコロニ−形成の有無により、コリネ型細
菌がビオチン生合成に関与する遺伝子のどの部分を欠損
し、その部分を保有しているか容易に判別することがで
きる。
【0062】本相補試験の結果、ブレビバクテリウム・
フラバムMJ−233(FERMBP−1497)、ブ
レビバクテリウム・ラクトフア−メンタムATCC13
869、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC3
1831は、各菌株共、エシエリヒア・コリR873(
bioA4)、同R875(bioB17)、同R87
7(bioD19)を相補したが、同R874(bio
F12)、同R876(bioC18)を相補しなかつ
た。即ち、各々のコリネ型細菌は、少なくとも、同様に
7,8−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラ−
ゼをコ−ドする遺伝子(bioA)、デスチオビオチン
シンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子(bioD)およびビ
オチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子(bioB)を
有していることが明らかとなつた。
【0063】
【実施例2】ブレビバクテリウム・フラバムMJ−23
3由来のビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子(b
ioB)を含むDNA断片のクロ−ン化(A)ブレビバ
クテリウム・フラバムMJ−233の全DNAの抽出 半合成培地A培地[組成:尿素2g、(NH4)2SO
4 7g、K2HPO4 0.5g、KH2PO4 0
.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4・7H2O
 6mg、MnSO4 4〜6H2O 6mg、酵母エ
キス2.5g、カザミノ酸5g、ビオチン200μg、
塩酸チアミン200μg、グルコ−ス20g、純水1l
]1lに、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
(FERM BP−1497)を対数増殖期後期まで培
養し、菌体を集めた。得られた菌体を10mg/mlの
濃度にリゾチ−ムを含む10mM NaCl−20mM
トリス緩衝液(pH8.0)−1mM EDTA−2N
a溶液15mlに懸濁した。次にプロテナ−ゼKを、最
終濃度が100μg/mlになるように添加し、37℃
で1時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最
終濃度が0.5%になるように添加し、50℃で6時間
保温して容菌した。この溶菌液に、等量のフエノ−ル/
クロロホルム溶液を添加し、室温で10分間ゆるやかに
振盪した後、全量を遠心分離(5,000×g、20分
間、10〜12℃)し、上清画分を分取し、酢酸ナトリ
ウムを0.3Mとなるように添加した後、2倍量のエタ
ノ−ルをゆつくりと加えた。水層とエタノ−ル層の間に
存在するDNAをガラス棒でまきとり、70%エタノ−
ルで洗浄した後、風乾した。得られたDNAに10mM
トリス緩衝液(pH7.5)−1mM EDTA・2N
a溶液5mlを加え、4℃で一晩静置し、以後の実験に
用いた。
【0064】(B)組換え体の創製 上記(A)項で得たブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233の全DNA90μlを制限酵素Sau3AI 
1unitを用い、37℃で20分間反応させ部分分解
した。 この部分分解DNAにコスミドpWE15(ストラダジ
−ン社製)を制限酵素BamHIで切断した後、脱リン
酸化処理したものを混合し、50mMトリス緩衝液(p
H7.6)、10mMジチオスレイト−ル、1mM A
TP、10mM MgCl2及びT4DNAリガ−ゼ1
unitの各成分を添加し(各成分の濃度は最終濃度で
ある)、4℃で15時間反応させ、結合させた。
【0065】(C)ビオチン生合成に関与する酵素をコ
−ドする遺伝子を含むコスミドの選抜 上記(B)項で得たコスミド混液を用い、前記エシエリ
ヒア・コリR875(bioB17)株を形質導入し、
アンピリシン50mgを含む選択培地[K2HPO4 
7g、KH2PO4 2g、(NH4)2SO4 1g
、MgSO4・7H2O 0.1g、カザミノ酸10g
、グルコ−ス2g及び寒天16gを蒸留水1lに溶解]
に塗沫した。なお形質導入には、宝酒造より販売されて
いるλDNA in vitro Packaging
 Kit を用いて行つた。培地上の生育株を常法によ
り、液体培養し、培養液よりコスミドDNAを抽出し、
該コスミドを制限酵素により切断し、アガロ−スゲル電
気泳動を用いて調べたところ、コスミドpWE15の長
さ8.8kbのDNA断片に加え、長さ約30kbのD
NA断片が認められた。本コスミドをpWE15−bi
o2と命名した。
【0066】(D)ビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする
遺伝子を含むDNA断片(bioB断片)のプラスミド
pHSG399へのサブクロ−ニング 上記(C)項で得たコスミドpWE15−bio2に含
まれるDNA挿入断片は約30kbと大きく、実用的で
ないので、得られた断片のうち必要な部分だけに小型化
するために、プラスミドpHSG399(宝酒造より市
販)へビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子を含む
DNA断片を下記のとおりサブクロ−ニングした。
【0067】上記(C)項で得たコスミドpWE15−
bio2を制限酵素Hind IIIで切断したものと
、プラスミドpHSG399を制限酵素Hind II
Iで切断したものを混合し、50mMトリス緩衝液(p
H7.6)、10mMジチオスレイト−ル、1mM A
TP、10mM MgCl2及びT4DNAリガ−ゼ1
unitの各成分を添加し(各成分の濃度は最終濃度で
ある)、12℃で15時間反応させ、結合させた。
【0068】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法(Journal of Molecular
 Biology、53、159、1970)によりエ
シエリヒア・コリR875(bioB17)株を形質転
換し、クロラムフエニコ−ル50mgを含む選択培地[
K2HPO4 7g、KH2PO4 2g、(NH4)
2SO4 1g、MgSO4・7H2O 0.1g、カ
ザミノ酸10g、グルコ−ス2g及び寒天16gを蒸留
水1lに溶解]に塗沫した。
【0069】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロ−スゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドpHSG399の長さ
2.2kbのDNA断片に加え、長さ約5.5kbの挿
入DNA断片が認められた。各種の制限で切断したとき
の、長さ約5.5kbのDNA断片の制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表1に示したとおりで
あつた。 このDNA断片の制限酵素切断点地図を図1に示す。
【0070】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表4に示す。
【0071】
【表4】   表4    プラスミドpHSG399−bioB
5.5              制限酵素    
認識部位数    切断断片の大きさ(kb)    
    HindIII       2      
     5.5 、  2.2          
SacI           2         
  6.0 、  1.7        KpnI 
          2           4.7
 、  3.0   上記の制限酵素により特徴づけられるプラスミドを
pHSG399−bioB5.5と命名した。
【0072】以上により、ビオチンシンセタ−ゼをコ−
ドする遺伝子(bioB)を含む大きさが約5.5kb
のDNA断片(Hind III断片)を得ることがで
きた。
【0073】(E)ビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする
遺伝子を含むDNA断片(bioB断片)のプラスミド
 pBluescript II へのサブクロ−ニン
グ上記(D)項で得たプラミドpHSG399−bio
B5.5は、bioBを含む長さが約5.5kbの挿入
DNA断片を有しているがさらに得られた断片のうち必
要な部分だけに小型化するために、プラスミド pBl
uescript II(ストラタジ−ン社より市販)
へビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子を含むDN
A断片を下記のとおりサブクロ−ニングした。
【0074】上記(D)項で得たプラスミドpHSG3
99−bio5.5を制限酵素Hind IIIおよび
SacIで切断したものと、プラスミド pBlues
cript IIを制限酵素Hind IIIおよびS
acIで切断したものを混合し、50mMトリス緩衝液
(pH7.6)、10mMジチオスレイト−ル、1mM
 ATP、10mM MgCl2及びT4DNAリガ−
ゼ1unit の各成分を添加し(各成分の濃度は最終
濃度である)、12℃で15時間反応させ、結合させた
【0075】得られたプラスミド混液を用い、前記の方
法に従い前記エシエリヒア・コリR875(bioB1
7)株を形質転換し、アンピシリン50mgを含む選択
培地[K2HPO4 7g、KH2PO4 2g、(N
H4)2SO4 1g、MgSO4・7H2O0.1g
、カザミノ酸10g、グルコ−ス2g及び寒天16gを
蒸留水1lに溶解]に塗沫した。
【0076】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロ−スゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミド pBluescri
pt IIの長さ2.95kbのDNA断片に加え、長
さ約1.7kbの挿入DNA断片が認められた。各種の
制限酵素で切断したときの、長さ約1.7kbのDNA
断片の制限酵素認識部位数および切断断片の大きさは前
記表3に示したとおりであつた。このDNA断片の制限
酵素切断点地図を図1に示す。
【0077】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表5に示す。
【0078】
【表5】   表5     プラスミドpBS−bioB−HS
1.7                制限酵素  
  認識部位数    切断断片の大きさ(kb)  
      Hind III      1    
           4.65        Sa
cI           1           
    4.65        HincII   
      1               4.6
5   上記の制限酵素により特徴づけられるプラスミドを
pBS−bioB−HS1.7とと命名した。
【0079】以上により、ビオチンシンセタ−ゼをコ−
ドする遺伝子(bioB)を含む大きさが約1.7kb
のDNA断片(Hind III−SacI断片)を得
ることができた。
【0080】
【実施例3】ビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子
(bioB)の塩基配列の決定実施例2の(E)項で得
られたビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子(bi
oB)を含む長さが約1.7kbのDNA断片について
、その塩基配列をプラスミドpUC18またはpUC1
9を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法(dideo
xy chain termination 法)(S
anger,F.et al.,Proc.Nat.A
cad.Sci.USA74、5463、1977)に
より図2に示した戦略図に従つて決定した。その塩基配
列中のオプンリ−デングフレ−ムの存在から、ビオチン
シンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子(bioB)は、下記
の配列を有する334のアミノ酸をコ−ドする1002
の塩基対より構成されていることが判明した。
【0081】
【化7】
【0082】
【化8】
【0083】
【化9】
【0084】
【実施例4】コリネ型細菌内で複製し安定なプラスミド
ベクタ−pCRY30の作成 (A)プラスミドpBY503の調製 プラスミドpBY503は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスIFO12144(FERM BP−2515
)から分離された分子量約10メガダルトンのプラスミ
ドであり、特開平1−95785号公報に記載のように
して調製した。半合成培地A培地[尿素2g、(NH4
)2SO4 7g、K2HPO4 0.5g、KH2P
O4 0.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4・
7H2O 6mg、MnSO4・4〜6H2O 6mg
、酵母エキス2.5g、カザミノ酸5g、ビチオン20
0μg、塩酸チアミン200μg、グルコ−ス20g及
び純水1l]1lに、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス1FO12144を対数増殖期後期まで培養し、菌体
を集めた。得られた菌体を10mg/mlの濃度にリゾ
チ−ムを含む緩衝液[25mMトリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン、10mMのEDTA、50mMグル
コ−ス]20mlに懸濁し、37℃で1時間反応させた
。反応液にアルカリ−SDS液[0.2N NaOH、
1%(W/V)SDS]40mlを添加し、緩やかに混
和して室温にて15分間静置した。次に、この反応液に
酢酸カリウム溶液[5M酢酸カリウム溶液60ml、酢
酸11.5ml、純水28.5mlの混合液]30ml
を添加し、充分混和してから氷水中に15分間静置した
【0085】溶菌物全量を遠心管に移し、4℃で10分
間、15,000×gの遠心分離にかけ、上澄液を得た
【0086】これに等量のフエノ−ル−クロロホルム液
(フエノ−ル:クロロホルム=1:1混和液)を加え懸
濁した後、遠心管に移し、室温下で5分間、15,00
0×gの遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に2倍
量のエタノ−ルを加え、−20℃で1時間静置後、4℃
で10分間、15,000×gの遠心分離にかけ、沈澱
を回収した。
【0087】沈澱を減圧乾燥後、TE緩衝液[トリス1
0mM、EDTA1mM;HClにてpH8.0に調整
]2mlに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液[5倍
濃度のTE緩衝液100mlに塩化セシウム170gを
溶解させた液]15mlと10mg/mlエチジウムブ
ロマイド溶液1mlを加えて、密度を1.392g/m
lに合わせた。この溶液を12℃で42時間、116,
000×gの遠心分離を行つた。
【0088】プラスミドpBY503は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドpBY503を含む分画液を得た。
【0089】次いでこの分画液を等量のイソアミルアル
コ−ルで4回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去
し、その後にTE緩衝液に対して透析を行つた。このよ
うにして得られたプラスミドpBY503を含む透析液
に3M 酢酸ナトリウム溶液を最終濃度30mMに添加
した後、2倍量エタノ−ルを加え、−20℃1時間静置
した。この溶液を15,000×gの遠心分離にかけて
DNAを沈降させ、プラスミドpBY503を50μg
得た。
【0090】(B)プラスミドベクタ−pCRY30の
作成 プラスミドpHSG298(宝酒造製)0.5μgに制
限酵素SalI(5units)を37℃1時間反応さ
せ、プラスミドDNAを完全に分解した。
【0091】前記(A)項で調製したプラスミドpBY
503の2μgに制限酵素XhoI(1unit)を3
7℃で30分間反応させ、プラスミドDNAを部分分解
した。
【0092】両者のプラスミドDNA分解物を混合し、
制限酵素を不活性化するために65℃で10分間加熱処
理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々5
0mMトリス緩衝液pH7.6、10mM MgCl2
、10mMジチオスレイト−ル、1mM ATP及びT
4DNAリガ−ゼ1unitになるように各成分を強化
し、16℃で15時間保温した。この溶液を用いてエシ
エリヒア・コリJM109コンピテントセル(宝酒造製
)を形質転換した。
【0093】形質転換株は30μg/ml(最終濃度)
のカナマイシン、100μg/ml(最終濃度)のIP
TG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド
)100μg/ml(最終濃度)のX−gal(5−ブ
ロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクト
ピラノシド)を含むL培地(トリプトン10g、酵母エ
キス5g、NaCl 5g及び純水1l、pH7.2)
で37℃にて24時間培養し、生育株として得られた。 これらの生育株のうち、白いコロニ−で生育してきたも
のを選択し、各々プラスミドをアルカリ−SDS法[T
.Maniatis,E.F.Fritsch,J.S
ambrook,“Molecular clonin
g”(1982)p90〜91参照]により抽出した。
【0094】その結果、プラスミドpHSG298のS
alI部位にプラスミドpBY503由来の約4.0k
bの断片が挿入されたプラスミドpHSG298−or
iが得られた。
【0095】次に同様の方法を用い、前記(A)項で得
られたプラスミドpBY503DNAを制限酵素Kpn
I及びEcoRIにて処理して得られる約2.1kbの
DNA断片を上記プラスミドpHSG298−oriの
KpnI及びEcoRI部位にクロ−ニングし、プラス
ミドベクタ−pCRY30を調製した。
【0096】
【実施例5】プラスミドpCRY30−bio2の作成
及びコリネ型細菌への導入 実施例2の(E)項で得られたプラスミドpBS−bi
oB−HS1.75μgを制限酵素Hind III及
びSacIを各々5unitづつ用い、37℃で1時間
反応させ分解したものと、実施例4の(B)項で得られ
たプラスミドpCRY30 1μgを制限酵素EcoR
I 1unitを用い、37℃で1時間反応させ分解し
たものを混合し、S1ヌクレア−ゼで処理することによ
り平滑末端とした後、50mMトリス緩衝液(pH7.
6)、10mMジチオスレイト−ル、1mM ATP、
10mM MgCl2およびT4 DNAリガ−ゼ1u
nitの各成分を添加し(各成分の濃度は最終濃度であ
る)、12℃で15時間反応させ結合させた。このプラ
スミドを用いて、前記方法に従いエシエリヒア・コリR
875(bioB17)株を形質転換し、カナマイシン
50μg/mlを含む選択培地[K2HPO4 7g、
KH2PO4 2g、(NH4)2SO4 1g、Mg
SO4・7H2O 0.1g、カザミノ酸10g、グル
コ−ス2g及び寒天16gを蒸留水1lに溶解]に塗抹
した。
【0097】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロ−スゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドpCRY30の長さ8
.6kbのDNA断片に加え、大きさ1.7kbの挿入
DNA断片が認められた。
【0098】上記の如く調製されたプラスミドDNAを
、コリネ型細菌へ形質転換した。
【0099】形質転換は、電気パルス法を用いて行つた
ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233(FERM
 BP−1497)プラスミドpBY502除去株を1
00mlの前記A培地で対数増殖初期まで培養し、ペニ
シリンGを1ユニツト/mlになるように添加して、さ
らに2時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め、菌
体を20mlのパルス用溶液(272mM Sucro
se、7mM KH2PO4、1mM MgCl2:p
H7.4)にて洗浄した。さらに菌体を遠心分離して集
め、5mlのパルス用溶液に懸濁し、0.75mlの細
胞と、前記で得られたプラスミドDNA溶液50μlと
を混合し、水中にて20分間静置した。ジ−ンパルサ−
(バイオラド社製)を用いて、2500ボルト、25μ
FDに設定し、パルスを印加後氷中に20分間静置した
。全量を3mlの前記A培地に移し30℃にて1時間培
養後、カナマイシン15μg/ml(最終濃度)を含む
前記A寒天培地に植菌し30℃で2〜3日間培養した。 出現したカナマイシン耐性株より、前記実施例4(A)
項に記載の方法を用いてプラスミドを得た。このプラス
ミドを各種制限酵素で切断して、切断断片の大きさを測
定した。その結果を下記の表6に示す。
【0100】
【表6】   表6       プラスミドpCRY30−bi
o2                   制限酵素
    認識部位数    切断断片の大きさ(kb)
        XhoI           1 
             10.3        
BamH1          1         
     10.3        KpnI    
       1              10.
3        SacI           1
              10.3       
 Sph I           2       
        8.6 、 1.7   上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをp
CRY30−bio2と命名した。このプラスミドpC
RY30−bio2の制限酵素地図を図3に示す。なお
、プラスミドpCRY30−bio2により形質転換さ
れたブレビバクテリウム・フラバムMJ−233−bi
o2は、茨城県つくば市東1丁目1番3号の工業技術院
微生物工業技術研究所に、平成3年2月26日付で:微
工研菌寄第12040号(FERM P−12040)
として寄託されている。
【0101】
【実施例6】プラスミドpCRY30−bio2の安定
性 前記のA培地100mlを500ml容三角フラスコに
分注し、120℃で15分間滅菌処理したものに、実施
例5で得た形質転換株MJ−233−bio2を植菌し
、30℃にて24時間振盪培養を行つた後、同様にして
調製したA培地100mlを500ml容三角フラスコ
に分注し、120℃で15分間滅菌したものに、1ml
当たり50cells の割合になるように植継し、同
じく30℃にて24時間振盪培養を行つた。次に遠心分
離して集菌し、菌体を洗浄後、カナマイシンを15μg
/mlの割合で添加したA培地及び無添加のA培地を用
いて調製した平板培地に一定量塗抹し、30℃にて1日
培養後生育コロニ−をカウントした。
【0102】この結果、カナマイシン添加および無添加
培地に生育したコロニ−は同数であること、さらにA培
地生育コロニ−は全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認した
【0103】
【実施例7】ビオチンシンセタ−ゼの製造培地(尿素0
.2%、硫酸アンモニウム0.7%、KH2PO4 0
.05%、K2HPO4 0.05%、MgSO4・7
H2O 0.05%、FeSO4・7H2O 6ppm
、MnSO4・4〜6H2O 6ppm、チアミン・H
Cl 100μg/l、及びビオチン200μg/l)
100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅菌(
滅菌後pH7.0)した後、ブレビバクテリウム・フラ
バムMJ−233−bio2株を植菌し、無菌的にグル
コ−スを最終濃度2%(W/V)なるように加え、30
℃にて3日間振とう培養を行つた。
【0104】対照としてプラスミドpCRY30−bi
o2を保持しないブレビバクテリウム・フラバムMJ−
233株を植菌し、同様に培養を行つた。
【0105】培養液をベツクマン遠心機 Model 
J2−21を用いて、8000rpmで10分間、遠心
し、菌体を集菌する。本試量菌体約5mgに、0.5M
 Tris−HCl(pH6.8)を0.125ml、
10%(W/V)SDSを0.200ml、β−メルカ
プトエタノ−ルを0.050mlを添加し、水で全量を
1.0mlに合わせる。この試料液を沸騰水中で約3分
間処理する。上記の試料液1mlに対して、0.05%
(W/V)BPBと70%(V/V)グリセロ−ルを含
む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)の0
.1mlを加えたものを泳動用試料液とする。
【0106】試料液を「第一化学薬品(株)」製SDS
−PAGプレ−ト10/20−1010を用い、試料を
5μlアプライした後、60mAの定電流で、約60分
間泳動する。
【0107】Coomassie Brilliant
 Blue R−250の0.25%(W/V)(正味
の濃度)を含むエタノ−ル−酢酸−水(9:2:9、V
/V)混液にゲルプレ−トを浸して分離ゲル中の試料蛋
白質の染色を行う。室温で約6時間染色した後、エタノ
−ル、酢酸、水(25:8:65、V/V)混液(脱色
液)に浸し、軽く振盪し、直ちに、新しい脱色液と交換
する。以後は、約1時間ごとに新しい脱色液と交換する
。この脱色操作を分離ゲル中の蛋白質のバンドがかなり
明瞭に見えるようになるまで繰り返す(3〜5時間)。 つぎに、分離ゲルをメタノ−ル−酢酸−水(10:15
:175、V/V)混液(保存液)に浸して、蛋白質の
存在していない部分(バツクグランド)を完全に脱色す
る。かくして、ゲル上に分子量約3万のタンパク質のバ
ンドとして染色されていることにより、ビオチンシンセ
タ−ゼが菌体内で産生されていることを確認することが
できる。このバンドの濃度を、フアルマシア社製「Ul
tro Scan XLレ−ザ−デンシトメ−タ−」を
用いて、測定した結果、ブレビバクテリウム・フラバム
MJ−233−bio2株中に含まれるビオチンシンセ
タ−ゼの含量は、pCRY30−bio2を保持しない
ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233株に比べて
、約5倍に上昇していることが明らかとなつた。
【0108】
【発明の効果】本発明の新規なDNA断片は、コリネ型
細菌のビオチン生合成に関与する酵素にうち、ビオチン
シンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子(bioB)を含むD
NA断片であり、該DNA断片を含む本発明のプラスミ
ドを用いることにより、コリネ型細菌に属する微生物の
遺伝子操作による改良が可能となる。
【0109】また、このようにして改良された本発明の
コリネ型細菌に属する微生物を培養することにより、微
生物菌体内でビオチンシンセタ−ゼの産生が増加し、該
酵素の菌体内への高度蓄積が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】  本発明のビオチンシンセタ−ゼをコ−ドす
る遺伝子(bioB)を含むDNA断片の制限酵素によ
る切断点地図。
【図2】  大きさが約1.7kbの本発明DNA断片
の塩基配列決定のための戦略図。
【図3】  本発明のプラスミドpCRY30−bio
2の制限酵素切断点地図。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】  コリネ型細菌由来のビオチンシンセタ
    −ゼをコ−ドする遺伝子を含むDNA断片。
  2. 【請求項2】  コリネ型細菌がビオチン要求性の菌株
    である請求項1記載のDNA断片。
  3. 【請求項3】  ビオチン要求性のコリネ型細菌がブレ
    ビバクテリウム・フラバム(Brevibacteri
    um flavum)MJ−233である請求項2記載
    のDNA断片。
  4. 【請求項4】  大きさが約5.5kb、約3.0kb
    または約1.7kbである請求項2記載のDNA断片。
  5. 【請求項5】  次のDNA塩基配列で表されるビオチ
    ンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子DNA断片。 【化1】
  6. 【請求項6】  次のアミノ酸配列に表されるビオチン
    シンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子DNA断片。 【化2】 【化3】
  7. 【請求項7】  請求項1〜6のいずれかに記載された
    DNA断片が導入された組換えプラスミド。
  8. 【請求項8】  請求項1〜6のいずれかに記載された
    DNA断片と、プラスミドpBY503に由来するコリ
    ネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を含むDNA断
    片及び安定化機能を司る遺伝子を含むDNA断片を保有
    する組換えプラスミド。
  9. 【請求項9】  請求項7〜8のいずれかに記載の組換
    えプラスミドで形質転換されたコリネ型細菌。
  10. 【請求項10】  請求項9記載のコリネ型細菌を培養
    し、培養物中にビオチンシンセタ−ゼを生成せしめるこ
    とを特徴とするビオチンシンセタ−ゼの製造法。
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