JPH04193895A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト細胞間粘着分子■　（以下、ＩＣＡＭ−１
と称する）に結合することにより、ヒトＩＣ＾ト１とヒ
トリンパ球機能関連抗原−１（以下ＬＦＡ−１と称する
）との結合を阻害する活性を有する新規ペプチドに関す
る。本ペプチドは、臓器移植時の拒絶反応の予防、アレ
ルギー性疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬
として利用しうる有用な免疫抑制剤である。

［従来の技術］ 臓器移植の外科的技術が著しく向上した現在、臓器移植
手術の成否は術後の移植片拒絶反応をいかにして抑制で
きるかに換言されてきている。また、拒絶反応は、生体
が移植片を異物として認識し、それを排除するために一
連の免疫反応が惹起されることにより生じる。そこで、
従来より拒絶防止薬として、ステロイド剤、アザチオプ
リン、メトトレキセート、６−メルカプトプリンなどの
いわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬剤の投与が行われ
てきた。しかし、安全域が狭いこと、あるいは効果が弱
いことなどの理由で、移植した臓器の生着率は向上しな
かった。ところが、近年開発されたサイクロスポリンへ
の登場により、生着率は格段の向上をみるようになった
。しかしながら、サイクロスポリンＡには重篤な腎毒性
があることが明らかとなり、その使用の制限を写像なく
されてきている。したがって、より安全で、かつ効果的
な免疫抑制剤の開発が望まれてきている。

ところで、移植片の拒絶のために惹起される免疫反応は
、細胞傷害性Ｔリンパ球が移植片を異物として認識し、
攻撃する反応がその主因の一つであると考えられている
。これらの反応は、まず宿主のＴリンパ球が移植片を特
異的に認識し、両者が接着することにより開始する。従
って、これらの細胞同士の接着を阻害することができれ
ば、拒絶反応を抑制することができるものと推定される
。

細胞同士が接着するためには、それぞれの細胞表面上に
発現している接着分子と呼ばれている糖タンパク質同士
が結合することによる仲介が必須である。最近の研究に
より、接着分子として種々の分子が発見されてきており
、そのうち１組としてＩＣＡＭ−１とＬＦ＾−１が知ら
れている（Ｃｅｌ　１　、５１巻、８１３頁。

１９８７年）。拒絶反応の場合には、細胞傷害性Ｔ細抱
土のＬＦＡ−１分子と移植片の細胞上のＩＣＡＭ−１分
子とが接着することが必要であると考えられている（Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ＋８巻、６３７頁。

１９８８年）。

一方、自己の抗原に対して免疫反応が生じることにより
自己の破壊が起こる自己免疫疾患や、外来抗原に対して
過剰な免疫反応が生じることにより自己に対しても傷害
を引き起こすアレルギー性疾患は、その多くが難治性の
慢性炎症性疾患である。その治療薬としては、ステロイ
ド性の抗炎症薬が現在量も有効であるが、強力な非特異
的免疫抑制作用を持ち合わしているために生じる重篤な
副作用がしばしば現れ、その使用を制限せざるを得ない
。また、非ステロイド性の抗炎症薬は、炎症反応を仲介
する化学的仲介因子の産生阻害剤、あるいはその拮抗物
質がほとんどを占めており、慢性の炎症には効果のない
ものが多く、これらの疾患の優れた治療薬の開発が望ま
れている。これらの疾患がいかにして慢性化するかは現
在まで不明であるが、炎症部位への好中球・マクロファ
ージの集束、それに引き続いて生じるリンパ球の集束が
、慢性化の一助となっている可能性が高い。

血液中を循環しているこれらの細胞が局所へと集束する
ためには、まず、炎症部位に近い血管の内皮にこれらの
細胞が接着し、血管の内皮細胞の接合部をすり抜け、更
に基底膜を破って、炎症部位へと遊走すると考えられて
いる。

したがって、この一連の反応の第一歩である炎症性細胞
の血管内皮細胞への接着を阻止すれば、炎症の抑制、更
には炎症の慢性化を抑制することができるものと考えら
れる。炎症性細胞の血管内皮細胞への接着の場合にも、
炎症性細胞の表面上に発現しているＬＦＡ−１分子と、
血管内皮細胞の表面上に発現しているＩＣＡＭ−１分子
の結合が必須であると考えられるようになってきている
（ＣＩ　１ｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、　３６巻、６
４８八頁、　１９８８年〕。

すなわち、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合を阻害す
ることができれば細胞同士の接着が阻害され、拒絶反応
を阻止したり、炎症を抑制することができるものと想定
される。しかし、現在までこの結合を選択的に阻害する
物質は、抗ＩＣＡに一１抗体あるいは抗ＬＦＡ−１抗体
以外には知られていない。また、唯−知られているこれ
らの抗体も、ウサギやマウスなどの異種動物を免疫する
ことにより得られた異種タンパク質であり、そのままの
形でヒトに投与すると、抗体に対する免疫反応が生じて
アナフィラキシ−ショックや血清病などの重篤な副作用
が起こったり、抗体の効果が減弱してしまうことが想定
され、残念ながら直ちに臨床に応用することは不可能で
ある。

また、ＩＣＡＭ−１あるいはＬＦＡ−１の結合部位を明
らかにしてその情報を基にペプチドをデザインすれば、
結合阻害物質となりうる可能性もあるが、現在までのと
ころ、ＩＣＡＭ−１分子、ＬＦＡ−１分子とも互いの結
合部位が同定されておらず、そのアプローチも不可能で
ある。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明の目的はヒ目ＣＡＭ−１に結合して、ヒ
トＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合を選択的に阻害す
る物質を提供することである。この物質は、臓器移植時
の拒絶反応の予防、アレルギー性疾患や自己免疫疾患な
どの炎症性疾患の治療薬に有効な免疫抑制剤として期待
できる。

〔課題を解決するための手段〕

本発明らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた
結果、以下の新しい概念及び方法により、目的とするＩ
ＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合を選択的に阻害するペ
プチドを見いだし、本発明を完成した。

即ち、本発明はＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合を阻
害するペプチドである。尚、ペプチド鎖を構成している
アミノ酸残基数により、ペプチドとポリペプチドを区別
して表現される場合もあるが、本発明においてはアミノ
酸残基数にこだわらず、全てペプチドという表現を用い
ることにする。従って厳密には、ポリペプチドに分類さ
れるものも本発明においては全てペプチドとして表記す
る。以下、本発明の詳細な説明する。

さて、ＩＣＡＭ−１分子を認識する抗体のうち、特にＬ
ＦＡ−１とＩＣΔＣエトの結合阻害活性を有しているも
のの中には、ＩＣＡＭ−１分子上のＬＦＡ−１分子との
結合部位そのものを認識しているものが含まれているも
のと考えられる。更に、ＩＣＡＭ−１分子上のＬＦＡ−
１分子との結合部位を認識している抗体の中には、ＬＦ
Ａ−１分子がＩＣＡＭ−１分子と結合するがごとく、Ｌ
ＦΔ−１分子上のＩＣＡＭ−１分子結合部位と同じ様な
立体構造をもって、ＩＣＡＭ−１分子に結合するものも
含まれる可能性がある。従って、ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ
−１との結合阻害活性を有している抗ＩＣ，ＡＭ−１抗
体を産生ずるハイブリドーマを多数集め、それらのハイ
ブリドーマの産生ずる抗体の可変領域（以下Ｖ　Ｎ域と
略する）のアミノ酸配列を決定すれば、ＬＦＡ−１のＩ
ＣＡＭ−１分子の結合部位のアミノ酸配列と同一あるい
は類似のアミノ酸配列が得られる可能性がある。そして
ＬＦＡ−１分子のアミノ酸配列と、抗体の■領域のアミ
ノ酸配列との間に類似の配列が得られた場合には、その
部分に当たるペプチドを合成すればそのペプチドはＬＦ
Ａ−１とＩＣＡＭ−１の結合を阻害できるものと推定で
きる。このような概念に基づき、本研究者らはまずＩＣ
ＡＭ−１に特異的でかつＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の結
合を阻害する活性を有する７ウスモノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマクローンを作製した。マウス抗
ヒトＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマクローンは、以下のようにして得られる。まず
、γ−インターフェロンで刺激してＩＣＡＭ−１分子を
高発現させたヒト大腸癌細胞株ＢＭ３１４をマウスに免
疫する。

尚、この場合、ＩＣＡＭ−１分子を元来発現している細
胞、種々の刺激によりＩＣＡＭ−１分子の発現を誘導し
た細胞など、細胞表面にＩＣＡＭ−１分子を発現してい
るヒト由来の細胞であればどんな細胞を免疫原として用
いてもかまわない。次に、その免疫されたマウスの肺臓
細胞あるいはリンパ節細胞中に存在する抗体産生細胞と
、骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作製する。骨髄腫細
胞は、融合可能な限りいかなる動物種由来のものでもよ
いが、通常同一種の細胞を用いた方が良い結果が得られ
る。本発明で得たハイブリドーマは、生理食塩水に懸濁
したγ−インターフェロン刺激ヒト大腸癌細胞株ＢＭ３
１４で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの肺臓細胞とＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウスの骨髄種細胞であるＸ６３−Ａｇ８−６．
５．３とをポリエチレングリコール存在下で融合して得
られたハイブリドーマである。骨髄種細胞としては、Ｘ
６３−Ａｇ８−６．５．３　ノほかに、Ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８−Ｕ１＋　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．　Ｐ３−ＮＳ
Ｉ／１−Ａｇ４−１．　ＭＰＣＩＩ−４，５，６，ＴＧ
、　１．７．ＳＰ２／Ｖ−Ａｇｌｌ　（以上マウス細胞
）　、２１０．ＲＣＹ、八ｇ１．２．３（ラット細胞）
　、５ＫＯ−（１０７，ＧＨ１５（１０６ＴＧ−Ａ１２
　（以上ヒト細胞）等の８アザグアニン耐性の細胞株を
用いてもよい。マウスの肺臓中の抗体産生細胞と骨髄種
細胞とが融合したハイブリドーマの選択は、細胞融合後
ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地
（ＨＡＴ培地）中で培養することにより行える。得られ
たハイブリドーマはすべて目的とする抗体を産生じてい
るわけではないので、得られたハイブリドーマクローン
の中からＩＣＡＭ−１に対する抗体を産生じているハイ
ブリドーマを選択し、その中から更にＩＣＡＭ−１とＬ
ＦＡ−１との結合阻害活性を有している抗体を産生じて
いるノ１イブリドーマを選択しなければならない。その
選択は例えば以下の様な方法を用いて行うことができる
。

ずなわち、ヒト調帯静脈内皮細胞をＴ−インタ一フェロ
ン存在下で３７°Ｃで一晩培養して、プラスチックプレ
ート表面に張り付ける。この場合、張り付ける細胞は表
面にＩｃＡＭ−１分子を発現しているヒト由来細胞であ
る限りどんな細胞を用いてもかまわない。この際、検体
であるハイブリドーマ培養上清をあらかじめ各穴に加え
ておく。２°７゛−ビス（カルボキシエチル）カルボキ
シフルオレセンテトラアセトキシメチルエステルにて標
識したＨＬ−６０細胞を各穴に加えて、調帯静脈内皮細
胞に結合したＨＬ−６０細胞数を蛍光強度として求め、
検体の培養上清による肛−６０細胞の調帯静脈内皮細胞
への接着阻害能を測定し、目的とするＩＣＡＭ−１分子
とＬＦＡ−１分子の接着を阻害する活性を有するＩＣＡ
Ｍ−１に対する抗体を産生ずるハイブリドーマを得る。

なお、スクリーニングのために調帯静脈内皮細胞へ接着
させる細胞は、Ｉｔ、−６０以外にも表面にＬＦ＾−１
分子を発現しているヒト由来細胞である限りいかなる細
胞を用いてもかまわない。また、細胞の標識は、蛍光色
素以外にも、アイソトープ、酵素などを用いて行っても
よい。

こうして得られたハイブリドーマクローンより全ＲＮＡ
を抽出し、モノクローナル抗体のＶ　ｐＭ域をコードす
る遺伝子（ｃＤＮＡ）を取得する。本発明のためには、
期待する構造を有するＶ領域を見いだすため、多数のハ
イブリドーマより■領域ｃＤＮＡを取得し、構造を決定
する必要がある。

そこで、本発明者らはより迅速な方法を鋭意工夫し、以
下の方法により遺伝子を取得した。すなわち、まず既に
知られているマウスＩｇＧの重鎮（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ
鎖）の、それぞれのＶ領域をコードする遺伝子の５°端
に共通性の高い２０〜３０個の塩基配列（ブライマーＤ
ＮＡ）を考案する。

この塩基配列を有するＤＮ＾オリゴマー（５″側プライ
マーＤＮＡ）、及び抗体の定常領域ｍＲＮＡに相補的な
配列を有するＤＮＡオリゴマー（３’側プライマーＤＮ
Ａ）をＤＮＡ合成機を用いて合成する。得られたいくつ
かのハイブリドーマより、常法に従って全ＲＮへを抽出
し、逆転写酵素と適当な３゛側プライマーＤＮＡを用い
て一本鎖ｃＤＮ＾を作製し、５”側プライマーＤＮＡ及
び３゛側プライマーＤＮＡを用い、Ｔａｑポリメララー
ゼによるポリメラーゼチェーンリアクシコン法（ＰＣＲ
法）　（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：　１３５０頁、　
１９８５年）にて抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域をコード
するＤＮＡ断片のみを選択的に増幅し取得する。その後
、得られたそれぞれのＤＮＡ断片を、Ｔ４ＯＮＡポリメ
ラーゼにより両端を平滑化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼにより５゛端をリン酸化する。このＤＮＡ断片を
、あらかじめクローニングサイトのＳｍａＩザイトにて
切断し、アルカリフォスファターゼにて脱リン酸してお
し）たプラスミドベクターと、Ｔ４ＤＮ八リガーゼを用
いて連結してクローニングする。クローニングされたｃ
ＤＮＡの配列は、ダイデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ＋　
　２１４巻、　１２０５頁、　１９８１年）により決定
した。この決定されたＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域の塩基配列
からアミノ酸配列を推定する。クローニング法は、ここ
に記した方法以外にも通常用いられているいかなる方法
を用いてもかまわない。

次に、得られた抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体のＨ鎖及びＩ、
鎖の■領域の塩基配列より推定したアミノ酸配列と、Ｌ
ＦＡ−１分子のそれとのホモロジーの検索を行った。抗
ヒトＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドー
マの作製、そのｖ領域のアミノ酸配列の決定、そしてヒ
トＬＦＡ−１分子とのホモロジー検索、という一連の行
程を多数のハイブリドーマについて繰り返し行った結果
、本発明の目的に沿う、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との
結合を阻害する活性を有する６種類のペプチドを見い出
した。ペプチドのアミノ酸配列を具体的に示すと以下の
通りである。

即ち、下記のアミノ酸配列［Ｉ］〜［ＶＩ］で示される
構造を有するものである。

アミノ酸配列［■］　： Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−八５ｎ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−八ｒ
ｇ アミノ酸配列［ＩＩ］： Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｙｒアミノ酸配列配列］　： Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙアミノ酸配列配列］： Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−＾５ｐ−Ｐｈｅ−八
５ｐ−Ｔｙｒアミノ酸配列［Ｖ］ニ １フ 八ｓｐ−ＩＩｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓ
ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｉｌｅ、Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−八１
ａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−八Ｉａ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−νａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓ
ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−ＧＩ
ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ
−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−
Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−八Ｉａ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−八Ｉａ−Ａｒｇ−Ｐｈ
ｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＧＩｙ
−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−
Ｔｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｐ−へ１ａ−八１ａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｃｙｓ−Ｈ１ｓ−Ｇ　１ｎ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−５ｅ
ｔ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＧＩｙ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−
１）ｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＡＩａ−へ５ｐ−Ａｌａ−八
１ａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−１）ｅ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ アミノ酸配列［ＶＩ］　： Ｇ　Ｉｕ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ　−Ｇ　
Ｉｕ−Ｓｅｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−八ｌａ−Ｓｅｒ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−’Ｌｙｓ−
＾１ａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓ
ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒ
ｐ−シａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−へｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−１）ｅ−
Ｇｌｙ−八ｓｐ−１）ｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ
ｓｎ−ｃ＋ｙ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−＾１ａ−７１）ｒ４．ｅｕ−Ｔｈｒ−シａｌ−Ａｓｐ
−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｅａ−八５ｎ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ｓｅｒ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ
−Ｔｈｒ−Ｖａ　Ｉ　−Ｖａ　Ｉ−Ａ　Ｉａ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ
−Ｇ１　ｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａ　
ｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈ
ｒ−ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−シａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ａｌａもちろん本発明のＩＣＡＭ−１とＬＦ
Ａ−１との結合を阻害するペプチドは上記［Ｉ］〜［Ｖ
Ｉ］に示した構造を有するペプチドにとどまらず、例え
ば上記［Ｉ］〜［ＶＩ］で示されるアミノ酸配列中の１
個若しくは複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され
た構造を有するもの、また、上記［Ｉ］〜［ＶＩ］で示
されるアミノ酸配列のＮ末端、及び／又はＣ末端に１個
若しくは複数個にアミノ酸が付加された構造を有するも
のもＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合を阻害する活性
を有する限り本発明のペプチドに含まれる。

更に、上記［Ｉ］〜［ＶＩ］で示されるペプチドがアミ
ド化、アセチル化又はポリエチレングリコール付加され
た構造のものもＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合を阻
害する活性を有する限り、本発明のベプチドに含まれる
。

さて、上記［Ｉ］〜［ＶＩ］で示される配列のうち、 式　［Ｉ］　　、：　］Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅ
ｒＡｓｎ−Ｌｅｕ−八ｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｒｇで表される配列は特にＩＣＡＭ
−１とＬＦＡ−１との結合を強く阻害する。この配列抗
体の■領域中に存在し、ＬＦ＾−１分子と非常にホモロ
ジーが高い部分である。

この配列は、抗体のＶ　’Ｊ域中で、いわゆる相補性決
定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、抗原との結合に直接関与す
ることが知られている部分に当る。さて、上記［Ｉ］〜
［ＶＩ］で示される配列を有するペプチドは、化学的に
合成してもよいし、遺伝子工学の手法を用い゛て調製し
てもかまわない。化学的に合成する場合には、通常用い
られる固相法で、ペプチド結合の任意の位置で部分され
る２種類のフラグメントの一方に相当する反応性カルボ
キシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当ず
る反応性アミノ基を有する原料をジシクロへキシルカル
ボジイミド法を用いて縮合させ、生成する縮合物が保護
基を有する場合、その保護基を除去させることにより製
造し得る（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＲｅＳｅｒ
ｃｈ、３０巻、７０５頁、１９８７年）、また、遺伝子
工学の手法を用いる場合には、例えば、５”、３”両端
に適当な制限酵素サイト、更にその内部に５゛側から開
始コドン（ＡＴＧ）、それに引き続き本ポリペプチドに
対応する塩基配列を含むように化学的に合成したＤＮＡ
　、あるいはＰＣＲ等を用いて調製したｃＤＮＡを、プ
ロモーター領域、ＳＤｗｉ域とターミネータ−領域を含
む適当な発現ベクタープラスミドに、組み込み、大腸菌
を形質転換し、大腸菌内に目的とするペプチドを産生さ
せればよい。発現させる宿主は大腸菌に限らず、酵母、
昆虫、動物細胞など可能な限りいかなるものを用いても
よい。本発明のペプチドは、通常の方法に従い精製され
る。具体的には、イオン交換クロマトグラフィー、逆相
液体クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラ
フィーなどを用いればよい。

さて、本発明のペプチドは、ＩＣＡＭ−１に結合してＩ
ＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合を選択的に阻害する活
性を有しており、臓器移植時の拒絶反応の予防などに対
して有効なものである。また、本発明に係る免疫抑制剤
は上記ペプチドを０．１重量％〜１（１０重量Ｚ、好ま
しくは０．５重量％〜７０重量％の割合で含有すればよ
い。したがって、本発明のペプチドをそのまま投与して
もよいし、また通常製剤用担体と混合して調製した製剤
の形で投与しでもよい。製剤用担体としては、製剤分野
において常用され、かつ本発明のポリペプチドと反応し
ない物質が用いられる。注射剤の場合には、本発明のポ
リペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じ
て生理食塩水、ぶどう９ＩＭ溶液に溶解させてもよく、
また緩衝剤、保存剤、安定化剤あるいは賦形剤を含有さ
せてもよい。また、これらの製剤は治療上価値のある他
の成分を含有していてもよい。

本発明に係る免疫抑制剤の投与方法としては、経口、注
射、直腸内などいずれの方法を用いてもかまわないが、
注射による投与が好ましい。投与量は、投与方法、患者
の症状、年齢などにより異なるが、通常１回ｏ、ｏｏｉ
〜１（１００■、好ましくは０．０１〜１０■を１日当
り１〜３回投与すればよい。

尚、本発明に係るペプチドは安全性が確認されている。

以下本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。

（実施例１、ＩＣＡＭ−１分子とＬＦＡ−１分子との結
合を阻害する活性を有するペプチドの作成）あらかじめ
２５０Ｕ／ｄの濃度のインターフェロン−Ｔ存在下で、
３７°Ｃで３日間培養したヒト大腸癌細胞株ＢＭ３１４
を、生理食塩水に懸濁し、６〜８週令の雌のＢＡＬＢ／
ｃマウスに、１匹あたり１×ＩＯ７個腹腔内投与するこ
とにより免疫した。その１０日後、同様の操作により追
加免疫し、更にその５日後、マウスの眼窩静脈より採血
して、８Ｍ３１４細胞に対する抗体価を、ＦＡＣ３ｃａ
ｎ　（ベクトンディッキンソン社製）を用いた蛍光染色
法により測定した。

すなわち、まず、１本あたり１×１０６個の８Ｍ３１４
細胞をチューブに入れ、遠心して上清を捨て、細胞をベ
レットとする。次に０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ
）　、０．１％ＮａＮ３及び０．１５　Ｍ　ＮａＣ１を
含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐｎ７．５）　（以下Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳ）にて種々の濃度に希釈したサンプル血清
を１０μβずつ加え、４°Ｃで３０分間反応させた。こ
の細胞をＢＳＡ−ＰＢＳにて３回遠心洗浄した後、細胞
ペレットにＢＳＡ−ＰＢＳにて１（１００倍に希釈した
フルオレセンインチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ
抗マウス免疫グロブリン抗体（Ｔａｇｏ社製）を１０μ
ｌずつ加えて、４°Ｃで３０分間反応させた。更にＢＳ
Ａ−ＰＢＳにて３回遠心洗浄した後、ＦＡＣ３ｃａｎに
て細胞に結合した抗体量を蛍光強度として測定した。こ
のようにして抗体価を測定し、抗体価の高かったマウス
を更に同様の操作にて最終免疫した。その３日後、肺臓
を摘出して肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞（×６３−Ａｇ
８−６．５．３）　　とを、５０％ポリエチレングリコ
ール＃４（１００　（ナカライテスク社製）存在下にて
細胞数で１０：１の割合で混合し、細胞融合させた。融
合細胞を、１０％牛脂児血清（ギブコ社製）を含むＲＰ
Ｍ１）６４０培地（ギブコ社製）にて５×１０６個／ｍ
！となるように懸濁し、１穴あたり５Ｘ１０’個のマウ
ス胸腺細胞を含有する９６穴平底プレート（コーニング
社製）に１（１０μＰずつ分注した。１日、２日、３日
、６日後に培地の半量をヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）と交換し、以後
３日ごとに同様の操作を繰り返した。融合より約２週間
後、融合した細胞（ハイブリドーマ）の増殖してきた穴
の培養上清について、後述の方法にてＩＣＡＭ−１とＬ
ＦＡ−１との結合阻害活性を測定し、阻害活性を有して
いた穴に含まれるハイブリドーマを、限界希釈法にてク
ローン化した。更にそれぞれのハイブリドーマクローン
の培養上清中の阻害活性を測定して、抗をＰＢＳにて洗
浄後、グアニジンチオシアネート、Ｎ−ラウリルサルコ
シン、ＥＤＴ＾を含むＲＮＮ油抽出用緩衝液ファルマシ
ア社製）を加えて懸濁した後、あらかじめ等容量のセシ
ウムクロライド溶液（ρ・１　、５１　ｇ　／　ｄ　、
ファルマシア社製）を入れたチューブ重層し、１２５．
（１００ｘｇにて１６時間遠心した。

上清を吸い取ったのち、１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭ
トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）　（ＴＥ）を加えて
懸濁し、新しいチューブに入れ、６５°Ｃで５分間イン
キユヘートした。更に、２Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５，０
）　（ファルマシア社製）を１／１０容量とエタノール
（ナカライテスク社製）を３倍容量加えて、−２０°Ｃ
に一晩放置した。５，（１００ｘｇにて２０分間遠心し
て、上滑を捨てた後、８０％エタノールにて遠心洗浄し
、沈澱を乾燥させた。沈澱をＴＥにて熔解してＲＮＡ画
分とした。

次に、ＲＮＡ溶液にデオキシＮＴＰ混合液、ｃＤＮＡ合
成用緩衝液（アマジャム社製）　、　ＲＮａｓｅインヒ
ビター（宝酒造社製）、及びリバーストランスクリプタ
ーゼ（宝酒造社製）を加えて４２°Ｃにて１時間反応さ
せｃＤＮＡを合成した。更に、ＰＣＲ用緩衝液（シータ
ス社製）、デオキシＮＴＰ混合液、マウス免疫グロブリ
ンＨ鎖Ｖ６Ｊｆ域ｃＤＮＡ増幅用ブライマー（５″、３
゛側それぞれ最終濃度１μＭ）あるいは、マウス免疫グ
ロブリンＬ鎖■領域ｃＤＮＡ増幅用プライマー（同濃度
）、及びＴａｑポリメラーゼ（全酒造社製）を加えＤＮ
Ａサーマルサイクラ−（シータス社製）にてＰＣＲを行
った。反応は変性３０秒（９４°Ｃ）、アニール３０秒
（５５°Ｃ）、ブライマーイクステンション１分（７２
°Ｃ）にて３０サイクル行い、各サイクル毎にプライマ
ーイクステンションの時間を１５秒ずつ延長させた。反
応後、１ｍＭＥＤＴＡを含む４０ｍＭ）リス酢酸緩衝液
（ｐｌ＋８．０）にてアガロースゲル電気泳動を行い、
該当するｃＤＮ八フへグメントを切り出し、シーンクリ
ーンキット（バイ第１０１社製）を用いて抽出・精製し
た。

精製したフラグメントをＴ４　ＤＮ八へリメラーゼ（全
酒造社製）を用いて両端を平滑化した後、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（全酒造社製）を用いて５゜端をリン
酸化し、あらかじめＳ…ａｌ　（全酒造社製）にて切断
後アルカリフォスファターゼ（全酒造社製）にて脱リン
酸したｐＵｃ１８ベクター（全酒造社製）と、Ｔ４　Ｄ
ＮＡリガーゼ（全酒造社製）によりう２フ イゲーションした。大腸菌ＪＭＩ０９株（全酒造社製）
に形質転換後、クローンをχブロスに接種し３７°Ｃに
て一晩培養して、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを
抽出精製した。

精製したプラスミドをシーフェンス用プライマーＭ４あ
るいはＲＶ　（全酒造社製）を用い、７−ＤＥＡＺＡシ
ークエンスキット（全酒造社製）にて以下の通り塩基配
列を決定した。

〈Ｌ鎖〉 ＧＡＣＡＴＴ　　ＣＡＧ　　ＣＴＧ　　ＡＣＣＣＡＧ　
　ＴＣＴ　　ＣＣＡ　　ＧＣＡ　　ＡＴＣＡＴＧＴＣＴ
　ＧＣＡ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＧＡＧ＾＾Ｇ　Ｇ
ＴＣＡＣＣＴＴＧ　ＡＣＣＴＧＣＡＧＴ　　ＧＣＣＡＧ
ＣＴＣＡ　　ＡＧＴ　　ＧＴＡ　　ＡＧＴ　　ＴＣＣＡ
ＧＣＴＡＣＴＴＧ　　ＴＡＣＴＧＧ　　ＴＡＣＣＡＧ　
　ＣＡＧ　　ＡＡＧ　　ＣＣＡ　　ＧＧＡ　　ＴＣＣＴ
ＣＣＣＣＣＡＡＡ　　ＣＴＣＴＧＧ　　ＡＴＴ　　ＴＡ
Ｔ　　ＡＧＣＡＣＡ　　ＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴ　Ｔ
ＣＴ　ＧＧＡ　ＧＴＣＣＣＴ　ＧＣＴ　ＣＧＣＴＴＣＡ
ＧＴ　ＧＧＣＡＧＴＧＧＧ　　ＴＣＴ　　ＧＧＧ　　Ａ
ＣＣＴＣＴ　　ＴＡＣＴＣＴ　　ＣＴＣＡＣＡ　　ＡＴ
ＣＡＧＣＧＣＣＡＴＧ　　ＧＡＧ　　ＧＣＴ　　ＧＡＡ
　　ＧＡＴ　　ＧＣＴ　　ＧＣＣＴＣＴ　　ＴＡＴ　　
ＴＴＣＴＧＣＣＡＴ　　ＣＡＧ　　ＴＧＧ　　ＡＧＴ　
　ＡＧＴ　　ＴＡＣＣＣＡ　　ＴＡＣＡＣＧ　　ＴＴＣ
ＧＧＡ　　ＧＧＧ　　ＧＧＧ　　ＡＣＣＡＡＧ　　ＣＴ
Ｇ　　ＧＡＡ　　ＡＴＡ　　ＡＡＡ　　ＣＧＧ　　ＧＣ
Ｔｃｒ　　ｃｃＴ　ＧＣＡ　　ＣＣＡ　　ＡＣＴ　　Ｇ
ＴＡ　　ＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡ　　ＣＣ八へ８ ＴＣＣ 〈Ｈ鎖〉 ＧＡＧ　　ＧＴＣＡＡＧ　　ＣＴＧ　　ＣＡＧ　　ＧＡ
Ｇ　　ＴＣＡ　　ＧＧＡ　　ＣＣＴ　　ＧＡＧ　　ＣＴ
ＧＧＴＧ　　ＡＡＧ　　ＣＣＴ　　ＧＧＧ　　ＧＣＴ　
　ＴＣＡ　　ＧＴＧ　　ＡＡＧ　　ＡＴＧ　　ＴＣＣＴ
ＧＣＡＡＧ　　ＧＣＴ　　ＴＣＴ　　ＧＧＡ　　ＴＣＣ
ＡＣＣＴＴＣＡＧＴ　　ＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧ　　
ＡＡＧ　　ＴＧＧ　　ＧＴＧ　　ＡＡＧ　　ＣＡＧ　　
ＡＧＧ　　ＣＣＡ　　ＴＧＧ　　＾ＡＡ　　ＧＡＧＣＴ
Ｔ　　ＧＡＧ　　ＴＧＧ　　ＡＴＴ　　ＧＧＡ　　ＧＡ
Ｔ　　ＡＴＴ　　ＡＧＴ　　ＣＣＴ　　ＡＡＣＡＡＴＧ
ＧＴ　　ＧＡＴ　　ＡＣＴ　　ＴＴＣＴＡＣＡＡＣＣＡ
Ｇ　　ＡＡＧ　　ＴＴＣＡＡＧ　　ＧＧＣＡＡＧ　　Ｇ
ＣＣＡＣＡ　　ＴＴＧ　　ＡＣＴ　　ＧＴＡ　　ＧＡＣ
ＡＡＧ　　ＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡ　ＧＣＣＴＡＣＡ
ＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧ　ＡＣＡ　Ｔ
ＣＴＧＡＧ　　ＧＡＣＴＣＴ　　ＧＣＡ　　ＧＴＣＴＡ
Ｔ　　ＴＡＣＴＧＴ　　ＧＣＡ　　ＡＣＴ　　ＡＣＧＧ
ＴＡ　ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＧＡＣＴＴＴ　ＧＡＣＴＡＣＴ
ＧＧ　ＧＧＣＣＡＡ　ＧＧ’ＣＡＣＣＡＣＴ　　ＣＴＣ
ＡＣＡ　　ＧＴＣＴＣＣＴＣＡ　　ＧＣＣＡＡＡ　　Ａ
ＣＧ　　ＡＣＡＣＣＣＣＣＡ　　ＴＣＴ　　ＧＴＣＴＡ
Ｔ　　ｃｃＡ　ＣＴＧ　　ｃｃｃ得られた塩基配列より
、アミノ酸配列を推定し、以下に示す配列［Ｖａ　　［
ＶＩ］を得た。

〈Ｌ鎖ニアミノ酸配列［Ｖａ〉 ＾５ｐ４１ｅ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅ
ｒ−Ｐｒｏ−＾１ａ−１）ｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−八Ｉａ
−Ｓｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ　−Ｓｅｒ−Ａ　Ｉａ
　−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａ　１−Ｓｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｎ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｙ−Ｓ
ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｉ　
１ｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ　−Ｌ
ｅｕ−八Ｉａ−Ｓｅｒ−ＧＩｙ−ＶａＩ−Ｐｒｏ−ＡＩ
ａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇ　ｌ
　ｙ−Ｓｅｒ−Ｇ　１ｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１）ｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅ
ｔ−Ｇｌｕ−へ１ａ−Ｇｌｕ−八ｓｐ−八１ａ−Ａｌａ
−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ　−Ｈｉ　ｓ−Ｇ　
ｌ　ｎ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＧＩｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−１）ｅ−Ｌｙｓ−へｒｇ
−Ａｌａ−Ａｓｐ−へＩａ−へ１ａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−
Ｖａｌ−Ｓｅｒ−１）ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓ
ｅｒ 〈Ｈ鎖ニアミノ酸配列［ＶＩ］〉 Ｇｌｕ−Ｖａ　１−　Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕ−
Ｖａ　Ｉ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｌａ−Ｓｅ
ｒ−Ｖａ　１−　Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌ
ｙｓ−＾１ａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｓｅｒ−＾ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ
−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−八ｒｇ−Ｐｒｏ−
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−１
）ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−１）ｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−＾ｓ
ｎ−八５ｎへＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ
−Δ５ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−
Ｌｙｓ−Ａ　１ａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａ　Ｉ
−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
−Ａ　Ｉａ−Ｔｙｒ−Ｍｅ　ｔ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｐ−Ｓｅｒ−八Ｉａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−シａｌ−Ａｌａ−
Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｒ＋−（ｉｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−
Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−八Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Δ１ａ本アミノ酸配列配有するペプチドの
調製は、まず、ＰＣＲにより増幅し精製したそれぞれの
ｃＤＮＡフラグメントの両端に、Ｎｃｏｌリンカ−（フ
ァルマシア社製）をＴ４　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製
）を用いてライゲーションしＮｃｏｌにより切断したも
のと、Ｎｃｏｌにより切断したｐＫＫ２３３−２ベクタ
ー（ファルマシア社製）とを更にＴ４　ＤＮＡリガーゼ
を用いてライゲーションした。次に、大腸菌ＪＭ１０５
株（ファルマシア社製）に形質転換後、クローンをＬブ
ロスに接種して一晩培養し、菌を超音波破砕後、Ｃ８結
合シリカカラム（資生堂社製）を用いた逆相液体クロマ
トグラフィーにより精製した。尚、Ｎ末端付近のアミノ
酸配列を調べた結果、上記アミノ酸配列Ｖ、及び■を有
するペプチドを得たことを確認した。

上記アミノ酸配列■、及び■とＬＦＡ−１のアミノ酸配
列とのホモロジー検索の結果、 ＩＴ］　Ｌ鎖：　５０Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ
−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ΔＩａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−へｌａ−へｒｇ［Ｉ］Ｌ鎖：　９０Ｈ４ｓ−Ｇ
ｌｎ−’Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｙｒ ［Ｉ１）］Ｈ鎖：　５ｅＴｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ［ＴＶ］　Ｈ鎖：　９９Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌ
ａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ を得た。これらのペプチドの作成は以下の様にして行っ
た。ペプチド［Ｉ］の作成は、まずＦｍｏｃ−Ａｒｇ（
Ｍｔｒ）樹脂（国産化学社製）をＭｅｒｒｉｆ　１ｅｌ
ｄの固相用反応装置（国産化学社）にとり、ジメチルホ
ルムアミド（ＤＭＦ）　（国産化学社製）に懸濁して振
盪し、樹脂を膨潤させた。樹脂をＤＭＦ中で振盪し、　
　　　　　□更に５０％ピペリジン〜Ｄ肝熔液中で振盪
後、ＤＭＦ。

イソプロパツールで洗浄してＦｍｏｃｉを除去した。

再びＤＭＦに懸濁して振盪し樹脂を膨潤させ、Ｆｍｏｃ
−Ａｌａ−ＯＨ（国産化学社製）のＤＭＦ　ｍ液を加え
て振盪した。更に、１Ｍジシクロへキシルカルボジイミ
ド塩化メチレン溶液を添加し振盪後、ＤＭＦ、イソプロ
パツールで洗浄して縮合した。このようなＦｍｏｃ基の
除去、Ｆｍｏｃ−アミノ酸縮合を繰り返して、Ｔｙｒ−
Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−八Ｉａ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｒｇ樹脂を
得た。樹脂からの脱離は、塩化メチレンで洗浄後、塩化
メチレン・アニソール・ヂオフェノール（１５：３：１
）混合液に懸濁し、トリフルオロ酢酸・塩化メチレン（
８，６：１）を加え振盪した。

樹脂をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮して残渣にエー
テルを加え、更にろ過して得られた粉末を、Ｃ８結合シ
リカカラム（資生堂社製）による逆相液体クロマトグラ
フィーにより精製し、アミノ酸配列［Ｉ］を有するペプ
チドを得た。

同様の方法により、以下のペプチド■、■、■を合成し
た。

（実施例２、ペプチド■によるＩＣＡＭ−１とＬＦ＾−
１を介した細胞接着阻害効果） ＩＣＡＭ−１分子を発現しているヒト請帯静脈内皮細胞
を最終濃度で１０　Ｕ／ｄのＩＬ−１（ゲンザイム社製
）を含む培地にて５Ｘ１０’個／ｄの濃度に調製し、９
６穴平底プレートに１穴あたり１（１０μ！（５×１０
３個）ずつ、及び１０μＨの濃度に調製したペプチド■
あるいはコントロールペプチドを１（１０μβずつ分注
して、３７°Ｃで一晩培養した。

これとは別に１０％ＦＣ３を含むＲＰＭ１）６４０培地
にて２ＸＩ０７個／ｄの濃度に調製したｌ１ｌ−６０細
胞懸濁液に、最終濃度が１０μＨとなるように２”７゛
−ビス（カルボキシエチル）カルボキシフルオレセン　
テトラアセトキシメチルエステル（同位化学社製）を加
え、３７°Ｃで１時間反応させ、３回培地にて洗浄した
後、培地にて２×１０６個／　ｍｆｌの濃度に調製し、
細胞を標識した。−晩培養したｌ化−６０細胞を培地に
て２回洗浄した後、標識したＩＩＬ−６０細胞を１穴あ
たり１（１０μｎ（２×１０５個）ずつ分注して、３７
°Ｃで３０分間インキュへ−Ｉ・した。培地にて４回洗
浄した後、細胞ペレットを１％ＮＰ−４０にて可溶化し
、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５３０　ｎｍにて蛍光
リーダー（インターメッド社製）を用いて標識細胞の接
着量を測定した。その結果表Ｉに示す様に、本発明のペ
プチド添加時においてのみ、有意にＩＣＡＭ−１とＬＦ
Ａ−１分子を介した細胞接着が阻害された。

表−１ 〈発明の効果〉 本発明のペプチドを用いれば、臓器移植時の拒絶反応の
予防、アレルギー性疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾
患の治療薬として有効な、従来の免疫抑制剤とは異なっ
た選択的作用のある、副作用の少ない免疫抑制剤として
利用できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒト細胞間粘着分子−１（以下ＩＣＡＭ−１と称
   する）とヒトリンパ球機能関連抗原−１（以下ＬＦＡ−
   １）との結合を阻害する活性を有するペプチド（２）ペ
   プチドが下記のアミノ酸配列［ I ］を有するものであ
   る請求項（１）項記載のペプチドアミノ酸配列［ I ］
   ： Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａ
   ｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｒ
   ｇ （３）ペプチドが下記のアミノ酸配列［II］を有するも
   のである請求項（１）項記載のペプチドアミノ酸配列［
   II］： Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐ
   ｒｏ−Ｔｙｒ（４）ペプチドが下記のアミノ酸配列［I
   II］を有するものである請求項（１）項記載のペプチド
   アミノ酸配列［III］： Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｐ
   ｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（５）ペプチドが下記のアミノ酸
   配列［IV］を有するものである請求項（１）項記載のペ
   プチドアミノ酸配列［IV］： Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａ
   ｓｐ−Ｔｙｒ（６）ペプチドが下記のアミノ酸配列［Ｖ
   ］を有するものである請求項（１）項記載のペプチドア
   ミノ酸配列［Ｖ］： 【遺伝子配列があります】 （７）ペプチドが下記のアミノ酸配列［VI］を有するも
   のである請求項（１）項記載のペプチドアミノ酸配列［
   VI］： 【遺伝子配列があります】 （８）アミノ酸配列［ I ］、［II］、［III］、［IV］
   、［Ｖ］または［VI］で示されるアミノ酸配列において
   、該アミノ酸配列中の１個または複数個のアミノ酸が他
   のアミノ酸で置換された構造を有する請求項（１）、（
   ２）、（３）、（４）、（５）、（６）、または（７）
   記載のペプチド （９）アミノ酸配列［ I ］、［II］、［III］、［IV］
   、［Ｖ］または［VI］で示されるアミノ酸配列において
   、該アミノ酸配列のＮ末端、及び／またはＣ末端に１個
   もしくは複数個のアミノ酸が付加された構造を有する請
   求項（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）
   、または（７）記載のペプチド（１０）アミノ酸配列［
   I ］、［II］、［III］、［IV］、［Ｖ］または［VI］
   で示されるアミノ酸配列において、該アミノ酸配列中の
   １個または複数個のアミノ酸がアセチル化、アミド化ま
   たはポリエチレングリコール付加させたものである請求
   項（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、
   または（７）記載のペプチド （１０）請求項（１）、（２）、（３）、（４）、（５
   ）、（６）、（７）、（８）、（９）、または（１０）
   記載のペプチドを有効成分として含有する免疫抑制剤